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CN112007036B - 化合物及其组合物用于制备缓解肺上皮细胞发炎的医药品的用途 - Google Patents

化合物及其组合物用于制备缓解肺上皮细胞发炎的医药品的用途 Download PDF

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CN112007036B CN201911392119.7A CN201911392119A CN112007036B CN 112007036 B CN112007036 B CN 112007036B CN 201911392119 A CN201911392119 A CN 201911392119A CN 112007036 B CN112007036 B CN 112007036B
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Abstract

本发明涉及组合物的用途，尤其是有关于一种化合物及其组合物用于制备缓解肺上皮细胞发炎的医药品的用途。本发明提供一种组合物用于缓解肺上皮细胞发炎的用途，其中该化合物是选自于由下列所组成的群组：6‑羟基麝香草酚3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷以及一医药上可接受的载体。

Description

化合物及其组合物用于制备缓解肺上皮细胞发炎的医药品的 用途
技术领域
本发明涉及组合物的用途，尤其是有关于一种化合物及其组合物用于制备缓解肺部细胞发炎的医药品的用途。
背景技术
肺是呼吸器官也是过滤器官。肺部平时会分泌黏液以形成保护层，阻止吸10 入空气中的病原(如病毒、细菌、真菌)或悬浮微粒吸附至肺脏。但是，肺的异物清除能力有限，部分异物可能穿透此保护层而感染或损伤肺部，进而引起肺部发炎。此外，肺挫伤、败血症、出血性休克等会引起严重肺部发炎。多种参与发炎反应的免疫细胞(如巨噬细胞、嗜中性球)及被刺激分泌的促发炎细胞激素(如介白素、肿瘤坏死因子-α (TNF-α))可能造成肺部再次损伤，包括肺泡损15 伤、微血管通透性增加、微血栓，严重时甚至引发肺水肿、急性呼吸窘迫症等。前述造成肺组织损伤的因子可能连同发炎反应一起造成特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)，症状包含干咳与渐进性呼吸困难，最终可能导致呼吸衰竭及死亡。
为维持肺脏正常功能，应尽可能减少接触空气污染物与病原的机会以避免肺部细胞发炎、肺组织损伤及肺纤维化发生。可行方法包括避免吸烟、戴口罩、使用空气净化装置。另外，若肺组织损伤已经形成，应服用能够促进损伤愈合或抑制发炎的药物。然而，目前已知可有效缓解肺部细胞发炎的药物有限，且这些药物未必能缓解肺部细胞发炎。因此，开发一种能有效缓解肺部细胞发炎的新颖医药品，实有其必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的为提供一种组合物用于制备一缓解肺部细胞发炎的医药品的用途，其中该组合物包含一有效浓度的选自于由下列所组成的群组2 中的化合物：雄果酸(Ursolic acid)、香草醛(Vanillin)、山奈酚-3-葡萄糖、苯甲酸(Benzoic acid)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、二氢去氢二愈创木基醇(Dihydrodehydrodiconiferylalcohol)、6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷(6-hydroxythymol 3-O-β-D-glucopyranoside)、咖啡酸(Caffeic acid)、4,5-二-O-(4-羟基-3,5-甲氧基-苯甲酰基)-莽草酸(4,5-Di-O-(4-hydroxy-3,5-methoxy-benzoyl)-shikimic acid)、单咖啡酸甘油酯(glyceryl monocaffeate)，及其任意组合，以及一医药上可接受的载体。
在本发明的一实施例中，该化合物的有效浓度为至少10 μg/mL。
本发明的另一目的为提供一种迷迭香酸(Rosmarinic acid)用于制备一缓解肺部细胞发炎的医药品的用途。
在本发明的一实施例中，该迷迭香酸的有效浓度至少为10 μg/mL。
在本发明的一实施例中，该缓解肺部细胞发炎包括抑制一肺上皮细胞分泌一促发炎细胞激素。
在本发明的一实施例中，该促发炎细胞激素是介白素-8 (Interleukin-8, IL-8)。
在本发明的一实施例中，该医药品具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型。
在本发明的一实施例中，该医药品是呈一供非经肠道投药或口服投药的剂型。
综上所述，本发明组合物的功效在于：可通过抑制肺上皮细胞分泌促发炎细胞激素，达到缓解肺部细胞发炎的功效。
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1是紫花香茅萃取物的HPLC指纹图谱；
图2是化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15在缓解肺部细胞发炎上的效用3 的数据图，其中***表示与LPS组比较，p<0.001；###表示与对照组比较，p<0.001。
具体实施方式
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20%的范围内，较佳为在10%的范围内，最佳为在5%的范围内。
依据本发明，雄果酸(Ursolic acid)，本文代号为TCI-ES-06，具有下列化学式(I)：
Figure 47173DEST_PATH_IMAGE001
式(I)。
依据本发明，香草醛(Vanillin)，本文代号为TCI-ES-07，具有下列化学式(II)：
Figure 110157DEST_PATH_IMAGE002
式(II)。
依据本发明，山奈酚-3-葡萄糖(kaempferol-3-glucose)，本文代号为TCI-ES-08，具有下列化学式(III)：
Figure 34119DEST_PATH_IMAGE003
式(III)。
依据本发明，苯甲酸(Benzoic acid)，本文代号为TCI-ES-09，具有下列化学式(IV)：
Figure 996653DEST_PATH_IMAGE004
式(IV)。
依据本发明，迷迭香酸(Rosmarinic acid)，本文代号为TCI-ES-10，具有下列化学式(V)：
Figure 239546DEST_PATH_IMAGE005
式(V)。
依据本发明，二氢去氢二愈创木基醇(Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol)，本文代号为TCI-ES-11，具有下列化学式(VI)：
Figure 481172DEST_PATH_IMAGE006
式(VI)。
依据本发明，6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷(6-hydroxythymol 3-O-β-D-glucopyranoside)，本文代号为TCI-ES-12，具有下列化学式(VII)：
Figure 130197DEST_PATH_IMAGE007
式(VII)。
依据本发明，咖啡酸(Caffeic acid)，本文代号为TCI-ES-13，具有下列化学式(VIII)：
Figure 773668DEST_PATH_IMAGE008
式(VIII)。
依据本发明，4,5-二-O-(4-羟基-3,5-甲氧基-苯甲酰基)-莽草酸(4,5-Di-O-(4-hydroxy-3,5-methoxy-benzoyl)-shikimic acid)，本文代号为TCI-ES-14，具有下列化学式(IX)：
Figure 171151DEST_PATH_IMAGE009
式(IX)。
依据本发明，单咖啡酸甘油酯(glyceryl monocaffeate)，本文代号为TCI-ES-15，具有下列化学式(X)：
Figure 713122DEST_PATH_IMAGE010
式(X)。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或口服地(orally)投药的剂型(dosage form)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。
依据本发明的医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)以及静脉内注射(intravenous injection)。
依据本发明的医药品可包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载体。例如，该医药上可接受的载体可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载体包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它们的组合。
实施例1. 化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15的纯化
本实施例所纯化的化合物是得自于紫花香茅(Elsholtzia ciliata Hylander)，又名香薷、蜂蜜草，是一年生草本植物，主要分布于亚洲。该植物已知可用于治疗急性呕吐腹泻及中暑，且有利尿效果。
首先，制备紫花香茅萃取物，洗净及干燥紫花香茅的全植株，并使用粉碎机将其粗碎。其后，以水为溶剂对紫花香茅粗碎物进行萃取。该溶剂与该紫花香茅粗碎物混合的重量比范围为20：1至2：1。萃取温度为介于50°C至100°C，较佳为80°C至90°C，萃取时间为0.5至3小时。
经上述萃取步骤所得紫花香茅萃取物冷却至室温后，可以400目(mesh)的滤网过滤，以移除残余固体物。该过滤后的紫花香茅萃取物可进一步在45°C至70°C进行减压浓缩而获得紫花香茅萃取物，其高效能液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)指纹图谱显示于图1。
接着，取20 L的紫花香茅萃取物，以乙酸乙酯与正丁醇溶剂，进行液相-液相分配萃取，得到27.4g的乙酸乙酯可溶部(ethyl acetate fraction, EAF)(10.5%)、56.3 g的正丁醇可溶部(n-butanol fraction, BUF)(21.6%)，及178.2 g的水可溶部(waterfraction, WF)(67.9%)。
接着，依据生物活性导引分离方法(bioassay guided fractionation)，将紫花香茅萃取物的乙酸乙酯可溶部以正己烷、乙酸乙酯与甲醇作为冲提液，正相硅胶管柱层析方法(Normal-phase column chromatography)(填充材料包括Sephadex LH-20 (Pharmacia,Piscataway, NJ, USA)、Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Co.，日本)、40~63 μmMerck Kieselgel 60 (Art. 9385)、及Merck LiChroprep® RP-18 (40~63 μm)(Art.0250))由低极性至高极性依序冲提，后续利用薄层色层分析(thin-layerchromatography, TLC)(TLC铝板(aluminium sheet)(硅胶60 F254, 0.25 mm, Merck，德国)；TLC铝板(RP-18 F254S, 0.25 mm, Merck，德国))，合并相似结果的冲提物，得到13个分离部(EAF1~EAF13)。
接着，将EAF4、EAF5、EAF7、EAF8、EAF10及EAF11分别以逆相高效能液相层析法(high performance liquid chromatography, HPLC)(帮浦系统：Hitachi L-2310 seriespump；侦测器：Hitachi L-2420 UV-VIS detector，侦测波长为200~380 nm；分析管柱：Mightysil RP-18 GP 250 (Kanto, 250 x 4.6 mm, 5 μm)；半制备管柱：Discovery® HSC18 (SUPELCO, 250 x 10.0 mm, 5 μm)；制备级管柱：Discovery® HS C18 (SUPELCO,250 x 21.0 mm, 5μm))进行纯化，藉此得到10种化合物(TCI-ES-06~TCI-ES-15)，其中EAF4的甲醇/水=3/2；EAF5的甲醇/水=1/1；EAF7的甲醇/水=1/1；EAF8的甲醇/水=45/55；EAF10的甲醇/水=35/65；EAF11的甲醇/水=30/70。经由前述实验步骤，由EAF4分离部得到TCI-ES-07、由EAF5分离部得到TCI-ES-06、由EAF7分离部得到TCI-ES-09、TCI-ES-10、由EAF8分离部得到TCI-ES-08、TCI-ES-14、由EAF10分离部得到TCI-ES-10、TCI-ES-13、及由EAF11分离部得到TCI-ES-12、TCI-ES-15。
之后，TCI-ES-06经氢-核磁共振光谱(1H-NMR)(1D与2D光谱使用400MHz Varian400 FT-NMR；以δ表示化学位移(chemical shift)，单位为 ppm；以四甲基硅烷(tetramethylsilane, TMS ; δ = 0)作为内部标准品，偶合常数(J)以Hz为单位，并以s窗体峰(singlet)，d表二重峰(doublet)，t表三重峰(triplet)，q表四重峰(quartet)，p表五重峰，m表多重峰(multiplet)，brs表宽峰)与电喷洒离子化质谱(ESIMS)(串联质谱-二维离子阱串联傅立叶变换质谱及ESI-MS/MS：使用Bruker amaZon SL system and ThermoOrbitrap Elite system测定，单位为m/z)分析其化学结构后，确认其为雄果酸(Ursolicacid)具有式(I)结构。
TCI-ES-07经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为香草醛(Vanillin)具有式(II)结构。
TCI-ES-08经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为山奈酚-3-葡萄糖(kaempferol-3-glucose)具有式(III)结构。
TCI-ES-09经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为苯甲酸(Benzoic acid)具有式(IV)结构。
TCI-ES-10经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为迷迭香酸(Rosmarinicacid)具有式(V)结构。
TCI-ES-11经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为二氢去氢二愈创木基醇(Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol) 具有式(VI)结构。
TCI-ES-12经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷(6-hydroxythymol 3-O-β-D-glucopyranoside) 具有式(VII)结构。
TCI-ES-13经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为咖啡酸(Caffeic acid)具有式(VIII)结构。
TCI-ES-14经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为4,5-二-O-(4-羟基-3,5-甲氧基-苯甲酰基)-莽草酸(4,5-Di-O-(4-hydroxy-3,5-methoxy-benzoyl)-shikimicacid) 具有式(IX)结构。
TCI-ES-15经1H-NMR与ESIMS分析其化学结构后，确认其为单咖啡酸甘油酯(glyceryl monocaffeate) 具有式(X)结构。以上各化合物亦可由SIGMA购得。
图1是紫花香茅萃取物的HPLC指纹图谱，使用溶剂为甲醇(A)与水(B)，并额外添加0.1%甲酸，流速为1 mL/分钟，冲提条件：0分钟时A:B=2:98；10分钟时A:B=2:98；40分钟时A:B=70:30；50分钟时A:B=100:0；60分钟时A:B=100:0。定量分析结果发现TCI-ES-10迷迭香酸为含量最多的化合物，其含量为881.2 ppm。
实施例2. 化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15在缓解肺部细胞发炎上的效用评估
本实施例使用购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)的人类正常肺上皮细胞株BEAS-2b(ATCC CRL-9609)。该细胞培养于杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(添加有1%青霉素/链霉素(Gibco)及10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)(Gibco))中。于24孔培养盘的每孔中加入500 μL的培养基，使每孔具有5 x 104个BEAS-2b细胞。在37℃下培养24小时后，移除培养基并不干扰贴附的细胞。
之后，将BEAS-2b细胞分成12组，其中包括10个实验组(亦即实验组1~10)、1个LPS组以及1个对照组。将1 μg/mL脂多醣(LPS)(Sigma)添加至LPS组及实验组1~10的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-06添加至实验组1的细胞中，将10μg/mL化合物TCI-ES-07添加至实验组2的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-08添加至实验组3的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-09添加至实验组4的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-10添加至实验组5的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-11添加至实验组6的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-12添加至实验组7的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-13添加至实验组8的细胞中，将10 μg/mL化合物TCI-ES-14添加至实验组9的细胞中，及将10 μg/mL化合物TCI-ES-15添加至实验组10的细胞中，而对照组的细胞则添加500 μL的DMEM。各组细胞(三重复试验)于37°C培养2小时后，更新DMEM再培养24小时，即收集其上清液120 μL以进行IL-8定量分析。
利用酵素结合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)套组(Human CXCL8/IL-8 ELISA kit；R&D systems)测定IL-8的蛋白质含量。依据厂商使用说明，在不含载体蛋白(carrier protein)的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)中将捕捉抗体稀释至工作浓度，立即在4℃下，用每孔100 μL稀释的捕捉抗体涂布96孔微孔盘过夜。之后，用200 μL洗涤缓冲液(0.05% Tween 20配于PBS中)洗涤96孔微孔盘3次。接着，以1%牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)(配于PBS中)作为阻断缓冲液于37°C下阻断(blocking) 3小时，再以200 μL洗涤缓冲液洗涤96孔微孔盘3次。之后，在试剂稀释液(0.1% BSA配于PBS中)中加入100 μL的样品和标准品，并在37°C反应2小时。之后，用200μL洗涤缓冲液洗涤96孔微孔盘3次，然后添加100 μL的侦测抗体并在37°C反应2小时。之后，用200 μL洗涤缓冲液洗涤96孔微孔盘3次，接而添加100 μL的链霉亲和素-山葵过氧化酶(Streptavidin-Horseradish peroxidase (HRP))工作稀释液并在室温反应20分钟。之后，用200 μL洗涤缓冲液洗涤96孔微孔盘3次，接而添加100 μL的受质溶液并在室温进行呈色反应20分钟，然后添加50 μL的终止溶液，利用ELISA读取仪(BioTek)侦测96孔微孔盘在450nm的吸光值。各组之间的统计学显著差异是藉由Excel软件以史徒登氏t-试验来决定。本实施例的结果显示于图2及表1。
图2是化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15在缓解肺部细胞发炎上的效用的数据图。由图2可见，与对照组相较之下，LPS组的相对IL-8分泌量有显著的提升，这表示LPS会诱发肺上皮细胞的发炎。而与LPS组相较之下，实验组1~10的相对IL-8分泌量有显著的降低。而表1显示化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15抑制肺上皮细胞株BEAS-2b分泌IL-8的相对表现量，其中对照组的相对表现量为100，LPS组的相对表现量为173。
表1
化合物 TCI-ES-06 TCI-ES-07 TCI-ES-08 TCI-ES-09 TCI-ES-10
IL-8表现量 100.4 101.2 105.0 106.2 111.2
化合物 TCI-ES-11 TCI-ES-12 TCI-ES-13 TCI-ES-14 TCI-ES-15
IL-8表现量 111.6 113.7 123.7 125.7 126.1
综上所述，本发明化合物TCI-ES-06~TCI-ES-15可藉由抑制肺上皮细胞分泌促发炎细胞激素(即IL-8)，达到缓解肺部细胞发炎的功效。

Claims (5)

1.一种组合物用于制备缓解肺上皮细胞发炎的医药品的用途，其中所述组合物包含一有效浓度的6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷，以及一医药上可接受的载体；
所述6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷具有下列化学式：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述缓解肺上皮细胞发炎包括抑制肺上皮细胞分泌促发炎细胞激素。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述促发炎细胞激素是介白素-8。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述6-羟基麝香草酚3-O-β-D-葡萄糖苷的有效浓度至少为10 μg/mL。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述医药品具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型。
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