CN111996290A - 基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于多重PCR的SARS‑CoV‑2全基因组核酸扩增特异性引物。本发明利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析，操作简单，成本低，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于新冠病毒全基因组核酸检测领域，特别涉及一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物。
背景技术
2020年2月12日国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)在生命科学论文预印本平台上发布了关于新型冠状病毒命名的最新论文，正式将新型冠状病毒从“2019-nCov”更名为“SARS-CoV-2"。目前，关于新型冠状病毒的研究正在热烈开展中。目前已有的SARS-CoV-2病毒核酸检测技术方案包括：qPCR技术；基于探针杂交捕获的核酸检测技术；宏基因组/宏转录组检测技术。但存在以下缺点：1)qPCR技术检测的病毒核酸区域不是全基因组；2)qPCR引物较少，病毒发生变异后可能导致无法检出；3)qPCR无法检测核酸突变；4)基于qPCR技术和探针杂交捕获的技术方法对起始模板量要求高，低峰度病毒可能无法检出；5)基于探针杂交捕获的技术方法实验周期较长，且试剂成本高；6)宏基因组/宏转录组的检测方法，费用高。
多重PCR目前已广泛用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定，其具备高效、系统、经济简便等优点。目前，关于采用多重PCR对SARS-CoV-2病毒全基因组进行核酸检测的研究还较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析。
本发明提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，包括SEQID No.1-342所示序列的特异性引物。
本发明还提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒，包括特异性引物。
所述试剂盒还包括带有SARS-CoV-2反转录产物的无核酸水、酶混合物、特异性引物以及反应试剂。
本发明还提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测方法，包括如下步骤：
(1)采用特异性引物对SARS-CoV-2反转录产物进行第一轮多重PCR反应，合并第一轮多重PCR反应产物后进行纯化；
(2)将纯化后的第一轮多重PCR反应产物采用通用引物进行第二轮接头序列PCR反应或者将纯化后的第一轮多重PCR反应产物连接通用引物进行扩增，最后对产物进行纯化，经文库定量和质检后即可。
所述步骤(1)和(2)中的纯化为磁珠纯化或过柱纯化。
本发明还提供了一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒的应用。
本发明根据UCSC公布的SARS-CoV-2的核酸组序列，设计可扩增SARS-CoV-2基因组全长的特异性PCR扩增引物，共有171对特异性引物。引物可以和目标序列结合，通过PCR反应使病毒核酸呈指数级扩增，并且，在特异性引物的末尾增加了一段通用序列，用于第二轮PCR的引物结合。第二轮PCR使用通用引物，引物序列为文库接头的通用序列，可以和第一轮扩增子的末端序列结合，通过PCR反应使第一轮扩增产物再次进行指数级扩增。
有益效果
(1)本发明利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析；
(2)本发明基于多重PCR的核酸检测技术，可以检测SARS-CoV-2的全基因组核酸序列，并给出病毒的突变位点信息，对起始模板量要求低，可以检测低峰度的SARS-CoV-2核酸序列；实验操作简单，快速，6小时即可完成文库构建工作；试剂成本远低于基于探针杂交捕获的技术方法和宏基因组的检测方法。
附图说明
图1为本发明的检测原理图。
图2为实施例1中的文库质检图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.第1轮多重PCR反应
①反应体系
第1轮多重PCR反应分为2个反应管，使用的多重引物分别为引物混合物T1，引物混合物T2。2个反应管内的其他试剂相同。
| 试剂 | 体积(μl) |
| 无核酸水 | 9-X |
| PCR缓冲液(含底物)(反应试剂1) | 3.5 |
| PCR增强剂(反应试剂2) | 2.5 |
| 引物混合物T1/T2 | 5 |
| SARS-CoV-2反转录产物 | X |
| 酶混合物 | 10 |
②反应条件(热盖105℃)
2.第1轮PCR反应产物合并
T1,T2反应管各吸取15μl产物合并，总体积为30μl。
3.磁珠纯化合并产物
1)向30μl PCR合并产物加入27μl室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
2)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；
3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μl缓冲液，用移液器轻缓吸打混匀20次；
4)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；
5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清。
7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
8)将PCR管从磁力架取下，加入24μl无核酸水，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；用移液器吸取13.5μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
4.第2轮接头序列PCR反应
①反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 多重PCR产物 | 13.5 |
| PCR缓冲液(含底物)(反应试剂1) | 2.5 |
| 无核酸水 | 2 |
| 测序接头引物1 | 1 |
| 测序接头引物2 | 1 |
| 酶混合物 | 10 |
测序接头引物1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(I5-Index)
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
测序接头引物2：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(I7-Index)
GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
根据I5-index,I7-index序列的不同，可将接头引物1,2自由组合。
| I7-Index | 序列 | I5-Index | 序列 |
| I7-1 | TCGCATCG | I5-1 | GTAGAGGA |
| I7-2 | GTCAACTG | I5-2 | CCGCCTTA |
| I7-3 | ACTCTGAC | I5-3 | ATAGTACG |
| I7-4 | CACACTCA | I5-4 | TTCTGCCT |
| I7-5 | GAGAGCAA | I5-5 | GCTCAGGA |
| I7-6 | TACTACAG | I5-6 | CATGCCTA |
| I7-7 | CTTATCCG | ||
| I7-8 | GGCTCTGC |
②反应条件(热盖105℃)
5.第2轮磁珠纯化
1)向30μl PCR合并产物加入27μl室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
2)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；
3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μl缓冲液，用移液器轻缓吸打混匀20次；
4)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；
5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清。
7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
8)将PCR管从磁力架取下，加入24μl无核酸水，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
10)用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为制备好的多重PCR文库。
6.文库定量和质检
1)定量：取1μl文库使用
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。正常文库的浓度应高于2ng/μl，文库浓度主要与cDNA起始量、病毒含量、模板的质量相关。
2)片段化质检：取1μl文库样本使用Lapchip进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在400-500bp之间。
7.检测结果
①多重PCR引物设计结果
表1 多重PCR引物设计结果
注：设计覆盖率是设计上的扩增子覆盖区域与目标区域的比值。设计覆盖率未达到100％时，可能原因为:目标区域GC含量异常；目标区域位于低复杂度区域，非特异扩增严重。
表2 171对多重PCR引物序列
注：
正向引物*，所有正向引物5’端均连接一段通用序列：ACACGACGCTCTTCCGAT，作为第二轮PCR测序接头引物序列1的模板；
反向引物#所有反向引物5’端均连接一段通用序列：CTTGGCACCCGAGAATTC，作为第二轮PCR测序接头引物序列2的模板。
②质检结果：根据以上实验操作流程，将文库进行质检。
1)定量：浓度>2ng/μl
2)片段化质检：文库大小集中在300-550bp范围内，主峰在400bp左右，如图2所示。
表3 文库质检结果
| 样本编号 | 主峰(bp) | Qubit定量(ng/μl) | 文库质检综合结果 |
| 1 | 427 | 51.6 | 合格 |
| 2 | 410 | 33.1 | 合格 |
| 3 | 425 | 49.5 | 合格 |
由表3结果可知，文库质检合格，可上机进行二代测序。
③测序结果。质检合格后，文库上NovaSeq平台进行测序。
表4 测序数据分析结果
由表4结果可知，基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒，其中特异性的引物使SARS-CoV-2基因组扩增覆盖度达到92.45％，基本实现SARS-CoV-2的全基因组核酸序列读取。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物
<130> 1
<160> 362
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtctatcttc tgcaggctgc t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctactaagcc acaagtgcca tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgagctggt agcagaactc g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcacgggtaa caccactgct a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actttgtccg aacaactgga c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctttttctt ttcaaccctt ggtt 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtggtgaaac ttcatggcag a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acacagcctc caaaggcaa 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gttccgaagg tcttaatgac aac 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctgttcacca atattccagg ca 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggccgctat aacaatacta gatg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaaccgtct ctaagaaact ctac 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttggctttgt gtgctgactc 20
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
accagttttc aagacaactt cctc 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagaaaagta ctgtgccctt g 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acagcatctg ccacaacac 19
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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gagtctggtg agtttaaatt ggctt 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttgttgacc aacagtttgt tgac 24
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<212> DNA
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<400> 19
cagactattg aagtgaatag ttttagtgg 29
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcttaaaaca caactaccac ccac 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acttgcacca ttattatcag ctggt 25
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctctgttcaa ctgaaggttt actttca 27
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tcatccagat tctgccactc tt 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agcactgtct ttgcctcctc t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cacatgcaga agaaacacgc a 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
taccgagcag cttcttccaa at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aaccatctca cttgctggtt c 21
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cttgcgtgtg gaggttaatg tt 22
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acctaatgat gacactctac gtgtt 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gcatcttgta gagcaggtgg att 23
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgagttactt gtttcaacat gcca 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
aggtggtgct gacatcataa ca 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
actttgtatt gcatagacgg tgc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcttgcgttt ggatatggtt g 21
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
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<213> 人工序列
<400> 36
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<213> 人工序列
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<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 25
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<213> 人工序列
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tgcaactagt gttttgagtt tttcc 25
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<400> 47
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gtgtgtcagg gcgtaaactt t 21
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
agctggtgtt tgtgtatcta ctagt 25
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctacatgact gtattcacca aaagct 26
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tcttactaat gatgtttctt ttttagcac 29
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggtaatagca catcactacg caa 23
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gcttgttgtc atctcgcaaa g 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
gcatgtcttc agaggtgcag a 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gatacagcca atcctaagac acc 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
gcatgaactc cagttggtaa ttc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ttagcttggt tgtacgctgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
cactacccaa tatggtacgt cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caagggtaca caccactggt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catcacccaa ctagcaggca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gtgttactaa tccttatgac agcaagaa 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgtattacc agttatgaag aaaataggg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctacacagga gtttagatat atgaattcac a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagaatgtca ttgtgtaact ggaca 25
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<213> 人工序列
<400> 69
ctggacaaca gggcaacct 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgggtcata gcttgatcag c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caatgcaaga gatggttgtg ttc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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agcagaattg gcccttaaag c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agggaggtag gtttgtactt g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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accagcttgt agacgtactg t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgtacacac actggtactg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccataacctt tccacatacc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taagtgcagc ccgtcttaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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agcaacagct ggacaatcct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctatgcttt aaggcatttt gatgaag 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
gatcttgatt atctaatgtc agtacac 27
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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cttgaccagg gctttaactg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
tggtccaaaa cttgtaggtg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcaggatgta aacttacata gctctaga 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gtgttttaat tcaacagaac ttccttc 27
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
tgattgttac gatggtggct g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctacggtgcg agctctattc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggttggcaca acatgttaaa aact 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgatgaggt tccacctggt t 21
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<213> 人工序列
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ctactgatgg taacaaaatt gccga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gacataaaaa cattgttttg ataataaag 29
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<213> 人工序列
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tgtaccttcc ttacccagat cca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcataacaga atacatgtct aacatgtg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggggcttgt gttctttgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacacaatgg aaaactaatg ggtg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agctaacacc tgtactgaaa gac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctacactagt gccacaagag c 21
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tcacatagtg catcaacagc g 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cacataaaga caaatcagct caatg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgacatagtc atattctgag ccct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
ggcatacttt gcataatgtc tgataga 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgagtctt ctataggtca tgtcctta 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catgctacta gagaagctgt tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgtcagaga gatttttaag tgtgtca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcttttccac tgcttcagac a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacgacattg gtaaccctaa ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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catcacaacc aggcaagtta ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
ccatgtgagt ctcatggaaa acaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
aagccacatt ttctaaactc tgaagt 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
acacaaaagt tgatggtgtt gatgta 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
tggtgcacaa atcgtttcag tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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accatctgta ggtcccaaac aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
cgatatgttc gaaggcatag cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cagtacagtt aaaaactatt tcataacaga tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
gcttgactag attgtaattt tgggtaaaat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
tgtcgcaaaa tatactcaac tgtgt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
ctgtatgtac agttgcacaa tcac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
ggtttataca acaaaagcta gctcttg 27
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
gacaactgaa ttggatttgt attcctc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
ggtagactta taattagaga aaacaacaga g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caagtcctga gttgaatgta aaactg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
gagaagtcta acataataag aggctgg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aggtccataa gaaaaggctg aga 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgatctccct cagggttttt c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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agagggtcaa gtgcacagtc t 21
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
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caaccaacag aatctattgt tagatttcc 29
<210> 130
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
catcacctct aattacaaat gaatctgca 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaattctaa caatcttgat tctaaggttg 30
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
tggtgcatgt agaagttcaa aagaaa 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctttccaac aatttggcag aga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacctgtag aataaacacg ccaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
tgcgctagtt atcagactca ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgctgcattc agttgaatca c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
gtcaaacaaa tttacaaaac accacc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
gcaatcattt catctgtgag caaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
tggtattgga gttacacaga atgtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacttcagcc tcaactttgt ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcttctgcta atcttgctgc ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgttacaaa ccagtgtgtg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgaattag actcattcaa ggagg 25
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<213> 人工序列
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gcaatcaagc cagctataaa accta 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgaagacga ctctgagcca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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accttttgct cgttgctgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gacttgttgt gccatcacct g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cagactatta ccagctgtac tcaact 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
acctgtctct tccgaaacga at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
ccttcttttt acgtttactc tcgtg 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
acctattcct gttggcatag g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
ggtggaattg ctatcgcaat g 21
<210> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
cttgatgtca cagcgtccta g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttttgctgc atacagtcgc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
tgagaatatt tattctcagt tagtgactt 29
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
caagagtgtg ttagaggtac aacag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
ttgccgcaac aataagaaaa attg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
cttttggttc tcacttgaac tgc 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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aggtgctgat tttctagctc cta 23
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
tgggtagtct tgtagtgcgt t 21
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
gaaccaagac gcagtattat tgg 23
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccaatagcag tccagatgac c 21
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaagttgta gcacgattgc a 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gggaacttct cctgctagaa tg 22
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtctgccgaa agcttgtgtt a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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cattggcatg gaagtcacac c 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccaaatctgc agcaggaaga ag 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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cacacaaggc agatgggct 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcttccata taggcagctc tc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttcccagg taacaaacca a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
acctagatgt gctgatgatc g 21
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
tcgtacgtgg ctttggagac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
tgagggacaa ggacaccaag 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
gcttggcact gatccttatg aa 22
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<213> 人工序列
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agcagtatac acccctctta gt 22
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caccttcaat ggggaatgtc c 21
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
tcagtgccac aaaattcgca a 21
<210> 179
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
ctggcttgaa aaccattctt cg 22
<210> 180
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
gtcaccaaca atattgatgt tgacttt 27
<210> 181
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
gcattcaaac aaattgttga atcctgt 27
<210> 182
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
catcaatgag tctcagtgaa tactgtg 27
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
cgtccttgat tggcttgaag a 21
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
agtgcgtgac aaatgtttca c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
gagggagaaa cacttcccac a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
tgctctgcct atacagttga act 23
<210> 188
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
cacaatcacc ttcttcttca tcct 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
tctgctgctc ttcaacctga a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
agcttcttcc acaatgtctg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
gctactaaca atgccatgca agtt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
ctcttaaaga atgtataggg tcagcac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagattccta aagaggaagt taagcca 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
catcacccac tatatatgga gcatctt 27
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
ccgggtcagg gtttaaatgg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tacgctgtat agttgaaact atggc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
gccacttggc tatgtaacac at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
tgtgtagatt gtccagaata ggac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
cttctttctt tgagagaagt gaggac 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
ggatcagttg tgtggtagta ctcaa 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
tcttgccact gcattgttaa ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
gtctgctgtt gtccacaagt tt 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
gttcagatac cttgtacgtg tggt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
cgtaatagga cctttgtatt ctgagg 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
cacagagcaa ccaattgatc ttgta 25
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
agctcctttc ttaaaagagg gtgt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 207
tctttggagc acaaaaccag tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 208
agcagccatt agatctgtgt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 209
agtgtccctt gggatactat agc 23
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaagcctcta gacaaaattt accga 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctactcaacc gctgctttag g 21
<210> 212
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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accactctgc aactaagcca a 21
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<213> 人工序列
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cttggcttat gtggttaata attaatctt 29
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<212> DNA
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gtgtagtttg caaaagcctt tacc 24
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cctactgacc agtcttctta catc 24
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<213> 人工序列
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ctgactgtag taaacagacg ctg 23
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ggaagttgca gttaaaatgt ttgatg 26
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatgcgcagg tagcaaaaag t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgtaacaga tgttaccaac tgca 24
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<213> 人工序列
<400> 223
ccaatgtact agaaggttct gttg 24
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<213> 人工序列
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ctacaccaca gaaaactcct gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 225
tcgtagtaac atgccttgcc ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 226
tccagaaagg tactaaaggt gtgaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 227
cttttgaaga agctgcgctg 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cggtctttgg cttgatgacg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttaatggt tcatgtggta gtgtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 232
gagttgtggt aaatcgattg agaaac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 233
tgccgtttta gatatgtgtg ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacaaagac cattgagtac tctg 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 235
tgttaccttc tcttgccact gta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 236
gagtgtcaag acattcataa gtgtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 237
tgtcatgttt ttggccagag g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 238
catctatgct attcttgggt ggga 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 239
ctctcagttt tgcaacaact caga 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 240
agctgcatat gatggaaggg aa 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 241
tgatgcagcc atgcaacg 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 242
gacaaccatt agtttggctg ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 243
tcacctaatt tagcatggcc tc 22
<210> 244
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 244
accagttcca tcactcttag gg 22
<210> 245
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 245
caacctaaat agaggtatgg tacttggt 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 246
ttggcttccg gtgtaactgt tat 23
<210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 247
acaacttgtg ctaatgaccc tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 248
agcaaaacca gctactttat cattgta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacactttct ctaactacca acatgaa 27
<210> 250
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 250
catcatcaca acaattgtat gtgacaa 27
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 251
cgccaagctt tgttaaaaac agta 24
<210> 252
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 252
aaggctttgt taagtcagtg tcaa 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 253
tggatgacag atgcattctg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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taccagaagc agcgtgcata 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 255
tgactttgct gtgtctaagg gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accagctgat ttgtctaggt tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 257
tcgcatatac aaaacgtaat gtcatc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaggtgaggg ttttctacat cac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgagtgtgct caagtattga gtg 23
<210> 260
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 260
tcacaaagtc tgtgtcaaca tct 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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tctcaaggtc tagtggctag ca 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 262
cgatatcatc tacaaaacag ccg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggagtatgct gatgtctttc atttgta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcatttaca acataagaat ggtctac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgatgtcac agatgtgact caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtagctttga gcgtttctgc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaccact taaccgaaat tatgt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagtgttggg tataagccag taatt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctagctctct actacccttc tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caactatatc tgctgtcgtc tcag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacattgcta actaagggca ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcagatgaa acatcatgcg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcctcaaaga ttttgggact acc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttgccacat tcctacgtgg a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gtacagcaac taggttaaca cctgt 25
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<213> 人工序列
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acttatgtac aaaggacttc cttgga 26
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<213> 人工序列
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acgtaatcaa atccaataga atgatgc 27
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<213> 人工序列
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tgcaatcatg actaggtgtc tag 23
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<213> 人工序列
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tcactacaag gctgtgcatc ata 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcaatgtcg atagatatcc tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 282
acgtagcaga ctttagtggt ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 283
gatgatctca gctggcttta gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 284
tagcccaaag ctcaaatgct ac 22
<210> 285
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 285
agagatgctc cagcacatat atcta 25
<210> 286
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 286
ctgtgttttt acggcttctc caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctatggatg aattcattga acggt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacacacac acttagatga acct 24
<210> 289
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gctttggtgt aaagatggcc at 22
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<213> 人工序列
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actctcatat tatagggtac agctaatg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcttaatgac tttgtctctg atgcag 26
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ccatgagctt ataaagatca gcattc 26
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<213> 人工序列
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accacgcgaa caaatagatg g 21
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<213> 人工序列
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cacacgtggt gtttattacc ctg 23
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gtagggactg ggtcttcgaa tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acaaaagttg gatggaaagt gagtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctattggca aatctaccaa tggtt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctggtgctgc agcttattat gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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tctggtggcg ttaaaaactt ca 22
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<213> 人工序列
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tgtctcctac taaattaaat gatctctg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 302
tctcaaaagg tttgagatta gacttcc 27
<210> 303
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 303
ggtttccaac ccactaatgg tg 22
<210> 304
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 304
tggatcacgg acagcatcag t 21
<210> 305
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 305
aactgcacag aagtccctgt t 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 306
tgcaccaagt gacatagtgt ag 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 307
cagtgtctat gaccaagaca tcag 24
<210> 308
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 308
tgcttggttt tgatggatct gg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 309
ccttggtgat attgctgcta gag 23
<210> 310
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 310
ggttggcaat caatttttgg ttct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 311
gctccaattt tggtgcaatt tcaa 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 312
ggaaggacat aagatgatag ccctt 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 313
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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atacaagcct cactcccttt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 318
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<213> 人工序列
<400> 319
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 321
agcacaagct gatgagtacg a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 322
cgtttagacc agaagatcag gaac 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 323
agctccttga acaatggaac cta 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 324
aagcaatgaa gtagctgagc c 21
<210> 325
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 325
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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agcaatattg tcactgctac tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 327
tttggaatct tgattacatc ataaacctc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 328
ggatgaaatg gtgaattgcc ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 329
cctaaactgt tcatcagaca agagg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 330
cgtttaggcg tgacaagttt cat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 331
tgacccgtgt cctattcact t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 332
caacacgaac gtcatgatac tc 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 333
cattacgttt ggtggaccct c 21
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 334
taccgtcacc accacgaatt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 335
actgagggag ccttgaatac a 21
<210> 336
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<213> 人工序列
<400> 336
agcagcatca ccgccat 17
<210> 337
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 337
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<210> 338
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 338
atggcacctg tgtaggtcaa 20
<210> 339
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 339
gaagaaggct gatgaaactc aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 340
catctacttg tgctatgtag ttacgag 27
<210> 341
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 341
agtgtgtaac attagggagg actt 24
<210> 342
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 342
cctaagaagc tattaaaatc acatggg 27
<210> 343
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 343
acacgacgct cttccgat 18
<210> 344
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 344
cttggcaccc gagaattc 18
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 345
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 346
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 346
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 347
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 347
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 348
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 348
gtgactggag ttccttggca cccgagaatt cca 33
<210> 349
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 349
tcgcatcg 8
<210> 350
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 350
gtcaactg 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 351
actctgac 8
<210> 352
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 352
cacactca 8
<210> 353
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 353
gagagcaa 8
<210> 354
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 354
tactacag 8
<210> 355
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 355
cttatccg 8
<210> 356
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 356
ggctctgc 8
<210> 357
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 357
gtagagga 8
<210> 358
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 358
ccgcctta 8
<210> 359
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 359
atagtacg 8
<210> 360
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 360
ttctgcct 8
<210> 361
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 361
gctcagga 8
<210> 362
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 362
catgccta 8
Claims (6)
1.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，其特征在于：包括SEQ IDNo.1-342所示序列的特异性引物。
2.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括带有SARS-CoV-2反转录产物的无核酸水、酶混合物、特异性引物以及反应试剂。
4.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测方法，包括如下步骤：
(1)采用如权利要求1所述的特异性引物对SARS-CoV-2反转录产物进行第一轮多重PCR反应，合并第一轮多重PCR反应产物后进行纯化；
(2)将纯化后的第一轮多重PCR反应产物采用通用引物进行第二轮接头序列PCR反应或者将纯化后的第一轮多重PCR反应产物连接通用引物进行扩增，最后对产物进行纯化，经文库定量和质检后即可。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的纯化为磁珠纯化或过柱纯化。
6.一种如权利要求2所述的基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010848252.5A CN111996290A (zh) | 2020-08-21 | 2020-08-21 | 基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物 |
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Family
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|---|---|---|---|
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Cited By (6)
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2020
- 2020-08-21 CN CN202010848252.5A patent/CN111996290A/zh active Pending
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