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CN111979300B - 一种快速定量检测靶标dna的方法 - Google Patents

一种快速定量检测靶标dna的方法 Download PDF

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CN111979300B
CN111979300B CN201910436803.4A CN201910436803A CN111979300B CN 111979300 B CN111979300 B CN 111979300B CN 201910436803 A CN201910436803 A CN 201910436803A CN 111979300 B CN111979300 B CN 111979300B
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Abstract

本发明公开了一种快速定量检测靶标DNA的方法，包括步骤一，变性：将取样待测样本中的细胞破碎，RNA降解，且使双链DNA变性为单链DNA，获得变性后的样本；步骤二，杂交：变性后pH值为碱性的样本与保存在pH值为3.5‑4.0的核酸保存液中的单链RNA探针混合，在65℃条件下根据碱基互补配对原则杂交45min形成DNA‑RNA杂合体；步骤三，捕获：将第一抗体固定在载体上，用第一抗体对DNA‑RNA杂合体在42℃条件下捕获60min；步骤四，检测：将DNA‑RNA杂合体在42℃条件下与保存于蛋白保存液中的碱性磷酸酶标记的第二抗体进行结合，反应30min后，洗涤；在室温避光条件下静置10min，检测相对光量子数，在3小时以内即可实现对靶标DNA的快速定量检测。本发明具有检测快速且定量，检测结果更为准确的优点。

Description

一种快速定量检测靶标DNA的方法
技术领域
本发明涉及靶标DNA定量检测领域，更具体地说，它涉及一种快速定量检测靶标DNA的方法。
背景技术
靶标DNA的检测，对于判断样本中所携带的细菌或病毒的含量具有重大的意义。
传统的检测方法的操作步骤较多，容易导致检测所花费的时间较长，难以快速定量判断样本中的所携带的细菌或者病毒的DNA含量，且检测过程中涉及到靶标DNA的扩增，容易导致靶标DNA量受到影响，最终导致检测结果不够准确。
因此，一种具有快速且准确定量检测出靶标DNA的方法具有深远的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种快速定量检测靶标DNA的方法，其具有检测快速且定量，检测结果更为准确的优点。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种快速定量检测靶标DNA的方法，包括如下步骤：
步骤一，变性：将待检测样本的细胞破碎，使蛋白质变性、RNA降解，且使DNA变性分解为单链DNA，获得变性后的样本；
步骤二，杂交：将步骤一中获得的变性后的样本与保存在pH值为3.5-4.0的核酸保存液中的特异性的单链RNA探针混合，在pH值为7.0-7.4的范围内、温度为65℃的条件下杂交45min，使特异性的单链RNA探针与变性后样本中的单链DNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合体溶液；
步骤三，捕获：将第一抗体固定在载体上，再加入步骤二中获得的DNA-RNA杂合体溶液，在温度为42℃的条件下，用第一抗体对DNA-RNA杂合体溶液中的杂合体捕获60min，将液体移除；
步骤四，检测：将步骤三中获得的用第一抗体捕获的DNA-RNA杂合体与保存于蛋白保存液中的第二抗体在42℃进行反应30min后，洗涤，在室温避光条件下静置10min，进行检测；所述步骤二中，所述变性后的样本中的单链DNA与单链RNA探针形成DNA-RNA杂合体；所述步骤三中，第一抗体为特异性识别杂合体的物质，所述特异性识别杂合体的物质为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体、多克隆抗体或单克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种；
所述第二抗体上携带有标记物，所述标记物在出现受激发光激发反应而发射荧光，或金颗粒聚集而显色，或酶催化反应而发光或显色。
通过采用上述技术方案，步骤一中，将细胞破碎后，通过浓度为1.75mol/L、与待检测样本的体积比为1∶2的氢氧化钠溶液的作用，在65℃的条件下反应30min，可使蛋白质变性，同时使RNA降解，从而减少了蛋白质、RNA对后续检测造成影响。此外，氢氧化钠溶液还可使DNA的双螺旋结构被打开，变性分解为单链的DNA。本发明中，采用化学和物理方法相结合的方法，可达到高效降解RNA和使双链DNA变性成单链DNA的作用。
步骤一中，若待检测样本中含有待测细菌或病毒，则细菌或者病毒的双螺旋结构的双链DNA被变性分解为单链DNA；而在步骤二中，将特异性的单链核酸探针置于pH值为3.5-4.0的核酸保存液中进行保存，有助于使异性的单链核酸探针在无需冻存的情况下保持稳定不被环境中的酶所降解。当pH值为3.5-4.0的特异性的单链核酸探针溶液与pH值为碱性的变性分解为单链DNA溶液的样本按一定比例混合形成pH为中性的溶液，特异性的单链核酸探针为单链RNA探针。在65℃条件下，根据碱基序列互补配对原则，变性后的样本中的单链DNA与单链RNA探针形成DNA-RNA杂合体。而之所以需要在65℃的温度下进行，这部分试验在实施例中有具体的公开。
步骤二中，以100mL核酸保存液计，核酸保存液包括如下用量的组分：
柠檬酸三钠5.8-5.95g；
生物缓冲剂19.56-20.21g；
乙二胺四乙酸二钠0.173-0.192g；
酸度调节剂8.2-9.0ml；
防腐剂28-33μL；
余量为纯水；
保存液的pH值为3.5-4.0；
缓冲液包括盐酸三乙醇胺、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸中的至少一种；
酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。
步骤二中，将特异性的单链核酸探针保存在核酸保存液中，采用该核酸保存液可在无所冷冻的情况下对单链RNA探针进行保存，并能使单链RNA探针保持组织结构稳定且不易被降解。
在步骤二中并不对裂解后的样本进行纯化，有助于缩短时间。现有技术中，如果对裂解后的样本进行纯化，则会对单链DNA造成一定的影响，甚至使单链DNA的数量降低，从而有可能使靶标DNA的量受到影响，进而造成对靶标DNA的定量不准。
虽然，步骤二中并未进行纯化，但最终并没有对后续的操作带来不利的影响。因此，不仅节约了处理的时间，还不易造成检测不准确的现象。
步骤三中，第一抗体为特异性识别杂合体的物质，特异性识别杂合体的物质为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体，多克隆抗体或单克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种。催化失活的核糖核酸酶H是将核糖核酸酶H处理后失去催化作用，有利于保留和DNA-RNA杂合体结合作用。
第一抗体的主要作用在于，可以捕获杂合体溶液中的杂合体，且在42℃的温度下反应60min，有助于使第一抗体充分捕获杂合体。第二抗体具有标记物，标记物在出现受激发光激发反应时而发射荧光，或金颗粒聚集而显色，或酶催化反应而发光或显色，从而实现检测的目的。步骤三中，第一抗体将杂合体捕获，即第一抗体与杂合体上的靶点结合，第二抗体与DNA-RNA杂合体或者杂交体进行结合，并且通过第二抗体上的标记物进行显示(该种情况为单链RNA探针上不含有修饰物)，从而获得对DNA-RNA杂合体进行检测，同时也对样本中的靶标DNA进行检测。
在步骤三的操作过程中，先将第一抗体固定在载体上，有助于增加第一抗体的在操作过程中的稳定性，且当其与杂合体形成结合/捕获时，有助于提高其捕获杂合体而获得的第一抗体和杂合体结合的产物在载体上的稳固程度。当第一抗体与杂合体进行充分结合后，将其他的杂质洗涤去除，留下第一抗体与杂合体，进行步骤四中的操作。
与此同时，筛第一抗体和第二抗体是自行筛选(在实施例部分具体提出)，主要是为了尽量减少特异性的单链核酸探针和靶标DNA的错配，以及尽量避免第一抗体和第二抗体出现失活的现象。其中，当筛选第一抗体和第二抗体所采用的温度设置在42℃，此时获得的第一抗体和第二抗体的性能好，且所需的反应时间较短。42℃的温度与25℃、37℃的温度相比，较高的温度加快了分子热运动，从而有助于缩短反应所需的时间；第二抗体、第一抗体与杂合体进行结合，而温度较高可有效增加第二抗体、第一抗体与杂合体之间的结合，从而更为准确地显示出信噪比。在42℃的温度与45℃、50℃、65℃的温度相比，随着温度越升越高，导致第一抗体、第二抗体的活性逐渐下降甚至失活，最终导致难以通过第二抗体上携带的标记物而准确检测出信噪比。
然而，步骤四中，用标记物标记的第二抗体工作液中的浓度含量极低，为10-50ng/ml级别，而将第二抗体保存在蛋白保存液中，可使第二抗体达到较好的稳定性，并达到使检测结果较为准确的效果。且该保存法无需在冷冻条件下进行，大幅降低了保存的难度，并且有助于使标记物以及第二抗体保持原始状态，从而使获得的检测结果更为准确。
且在步骤四中，蛋白保存液以100mL保存液计，包括如下用量的组分：
氯化钠2.535-3.501g；
Tris-HCl缓冲液6-7mL；
酪蛋白溶液20-28mL；
防腐剂28-31μL；
余量为纯水；
Tris-HCl的pH值为7.4-7.5。
在步骤四中，引入了第二抗体，且第二抗体上还标记有标记物，而标记物通常为蛋白质类物质，采用该蛋白液保存，不仅不需要置于极低的温度下进行保存操作，还可使第二抗体以及其上所标记的标记物保持良好的活性，从而使检测效果更为准确和真实。
进一步优选为：所述步骤二中，所述特异性的单链RNA探针可以为针对靶标DNA的全长单链RNA探针或者针对部分靶标DNA的片段单链RNA探针；当特异性的单链RNA探针为针对靶标DNA的全长单链RNA探针时，针对靶标DNA的全长单链RNA探针为连续的针对靶标DNA的全长单链RNA探针或者分段的针对靶标DNA的全长单链RNA探针。通过采用上述技术方案，无论是针对靶标DNA的全长单链核酸探针或者针对部分靶标DNA的片段单链RNA探针，其上面能与单链DNA形成结合的碱基具有一定的特异性，从而可使特异性的单链RNA探针与单链DNA上的碱基形成配对并实现特异性的单链RNA探针与单链DNA的杂合，获得DNA-RNA杂合体。
进一步优选为：所述分段的针对靶标DNA的全长单链RNA探针的长度大于100bp。
通过采用上述技术方案，关于分段的针对靶标DNA的全长单链核酸探针的长度的选取，可以举个例子：HPV靶标DNA的长度为8000bp，而单链RNA探针可以选择长度为8000bp的全长单链RNA探针；也可以选择100-2000bp的片段单链RNA探针，如选择2000bp长度的片段单链RNA探针时，需要有4段单链RNA探针组合使用，分别是1-2000bp、2001-4000bp、4001-6000bp以及是6001-8000bp的长度。
且无论是连续的还是分段的，都可以使全长单链RNA探针与单链DNA产生杂合效果，从而获得DNA-RNA杂合体。
此外，分段的优点是便于在每段分段的特异性的单链核酸探针的首尾引入标记物，比如生物素，后续可以用与生物素特异性结合的亲和素去特异性捕获生物素并进行后续的检测，可获得更好的标识效果。
而经研究发现，只要分段的针对靶标DNA的全长单链核酸探针的长度大于100bp时，比如长度在100-2000bp时，均可与单链DNA形成碱基配对，进而使单链DNA与分段的针对靶标DNA的全长单链核酸探针形成杂合。若分段的针对靶标DNA的全长单链核酸探针的长度小于100bp，则容易引起杂合过程不够稳定而导致最终的检测效果不够准确。
进一步优选为：所述步骤四中，所述第二抗体为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体，多克隆抗体或单克隆抗体或其片段，蛋白质，催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种。
通过采用上述技术方案，当杂合体为DNA-RNA杂合体时，用有标记物的特异性识别杂合体的物质(即第二抗体)为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体，多克隆抗体或单克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种，因此，第二抗体得以与DNA-RNA杂合体形成结合，进而使最终获得的检测结果更为准确。
进一步优选为：所述步骤二中，特异性的单链RNA探针携带修饰物；所述步骤四中，采用能与修饰物结合并且出现特异性显色的物质代替第二抗体。
通过采用上述技术方案，当单链RNA探针上携带有修饰物，且该修饰物为生物素，当采用亲和素代替第二抗体时，亲和素与生物素形成结合，也会出现较好且较快的对特异性的显色效果，从而达到快速检测靶标DNA的目的。
进一步优选为：所述修饰物为生物素；所述能与修饰物结合并且出现特异性显色的物质为亲和素。
通过采用上述技术方案，亲和素能与生物素进行结合，并且出现特异性显色，因此，采用亲和素代替第二抗体，也能达到快速检测靶标DNA的目的。
进一步优选为：所述步骤二中，特异性的单链核酸探针与变性后的样本的体积比为1∶3。
通过采用上述技术方案，在本发明中尽可能过量加入特异性的单链核酸探针，从而可使其与变性后的样本中的单链DNA形成充分的杂合，配合后续的操作，进而有助于提高检测靶标DNA的准确性。若待测样本中的细菌或者病毒的靶标DNA的浓度最高在1ng/ml，变性后的细菌或者病毒的靶标DNA的浓度最高也为1ng/ml，本发明所用特异性的单链核酸探针的浓度为500-1000ng/ml，为靶标DNA的500-1000倍，根据分子动力学原理，这种操作方法可使99.8％以上的变性后单链DNA与RNA探针结合。
进一步优选为：所述步骤三中的载体为固相载体或是非固相载体。
通过采用上述技术方案，固相载体和非固相载体，均可为第一抗体提供附着的环境。
进一步优选为：所述固相载体为平板、微孔板、载玻片、皿、磁珠、微球、芯片、膜、微阵列、试管、硅、玻璃、陶瓷、金属或者塑料中的至少一种；所述非固相载体为在第一抗体上标记荧光共振能量转移探针。
通过采用上述技术方案，而固相载体具有固定的环境，稳定性较好；非固相载体更方便操作，可以有效减少反应步骤，因此，选择在第一抗体和第二抗体上标记荧光共振能量转移探针，主要是为了当有DNA-RNA杂合体时，第一抗体会捕获DNA-RNA杂合体，且第二抗体会与第一抗体形成结合从而出现发光的现象，达到检测DNA-RNA杂合体的目的。
进一步优选为：所述步骤四中，标记物为荧光标记物、金标记物、酶标记物中的一种。
通过采用上述技术方案，荧光标记物、金标记物、酶标记物在检测过程中，均可出现发光的效果，从而可使获得的检测情况更为直观和准确。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一，本发明中，无需将变性后的样本进行纯化处理，步骤减少，缩短了检测时杂交步骤所需时间，提高了操作的效率。
第二，在步骤二中，不对变性后的样本进行靶标DNA的提取纯化处理，从而使其中存在的单链DNA的数量不受到任何影响，将待测样本中的细菌或者病毒的靶标尽可能保留，即不经过纯化处理的变性后的样本中所含有的所有单链DNA均可以被用于检测靶标DNA，对后续会产生的检测的信号进行放大，进而使检测的结果更为真实和准确。
第三，在检测过程中，没有对靶标DNA进行模板扩增，只是单纯采用信号放大的方法，所添加的特异性的单链核酸探针与单链DNA结合形成杂合体(DNA-RNA杂合体)，所添加的第一抗体进会与杂合体进行结合，再加入第二抗体，而第二抗体则与杂合体进行结合，因此，通过第二抗体上的标记物与杂合体上相互配合，有助于直接、准确地反应出发光的情况，从而得知靶标DNA的检测结果。在这过程中，所采用的特异性的单链核酸探针、第一抗体、第二抗体均根据该类靶标DNA而筛选获得，未添加其他干扰信号、背景信号、非特异性信号，有助于使检测的结果定量更为准确。
具体实施方式
前期准备：
(一)第一抗体的筛选：
当杂合体为DNA-RNA杂合体时，第一抗体为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体，其筛选包括如下板块：
DNA-RNA杂合体制备：在2ml反应体系中，采用120μg噬菌体Φ174的单链DNA为模板，300单位DNA依赖的RNA聚合酶，85mMpH为8.0的Tris-HCl缓冲液，50mM KCl，10mM DTT，10mM MgCl2，0.8mM的四种NTP(ATP，CTP，GTP，UTP)在37℃的温度下反应2小时，然后加5MNaCl至0.3M，加RNase I至0.5μg/ml，在37℃的温度下反应30分钟，加等体积的Tris-苯酚∶氯仿(1∶1)，涡旋振荡20秒，13000g离心5分钟，上清转移，加入2ml反应体系的2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M的醋酸钠(pH5.2)，-20℃过夜放置，13000g离心5分钟，并且用20μl纯化水重悬，用OD260测试DNA-RNA杂合体浓度，放于-20℃保存。
DNA-RNA杂合体免疫原制备、免疫：以100μg/ml DNA-RNA杂合体和100μg/ml甲基化的牛血清白蛋白按质量比1∶1在10mM TE缓冲液中进行混合，按每只Balb/c小鼠30μg DNA-RNA杂合体的量与弗氏完全佐剂乳化，腹部皮下注射，第14天和第28天分别加强免疫(采用同初次免疫同样的剂量和弗氏不完全佐剂乳化)一次；第35天小鼠尾巴取血进行检测。
血清效价检测：用0.1μg/ml的poly(A)-oligo(dT)120在ELISA板上进行4℃包被过夜，用明胶进行封闭，在常温下检测小鼠血清效价，效价大于2000的小鼠按每只Balb/c小鼠30μg DNA-RNA杂合体的量进行冲击免疫，3天后取小鼠脾脏。
细胞融合以及第一抗体的制备：无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按10∶1比例混合，用PEG进行融合，用HAT培养基筛选7天后换成HT培养基，当孔中有明显可见的细胞团时进行筛选，用和检测血清效价一致的方法进行筛选，筛选出来的阳性孔经3次有限稀释法制备单克隆细胞株，并对其进行扩大培养后进行小鼠腹水制备，用ProteinA纯化得到第一抗体。
第一抗体的验证：
验证方法一：用0.1μg/ml的不同的核酸(DNA-RNA杂合体、双链DNA、单链DNA、单链RNA)重复2孔进行4℃包被过夜，用明胶37℃进行封闭2小时，在常温条件(23±2℃)下用不同的抗体浓度(1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、0)反应1个小时，加入1：5000稀释后的HRP标记的羊抗鼠二抗，常温反应1小时，PBS洗板3次后加HRP显色底物TMB，10分钟后加0.5M H2SO4进行终止后在酶标仪上进行读数。
验证结果：不同的核酸与不同抗体浓度作用后在酶标仪上的读数情况如表1所示。
表1不同的核酸与不同抗体浓度作用后在酶标仪上的读数情况
Figure BDA0002070626800000081
由表1中的检测结果可知，第一抗体与DNA-RNA杂合体之间的结合效果好，但与DNA-RNA杂合体以外的其他核酸(双链DNA、单链DNA、单链RNA)基本上没有结合，说明该第一抗体的特异性较好。
验证方法二：用不同的抗体反应温度验证抗体对DNA-RNA杂合体的最佳反应条件，用0.1μg/ml DNA-RNA杂合体包被，不同浓度(1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、0)的抗体检测，重复2孔检测，用不同的抗体反应温度(25℃、37℃、42℃、45℃、50℃、65℃)进行测试，用不同的抗体反应温度验证第一抗体对DNA-RNA杂合体的最佳反应条件的结果如表2所示。
表2用不同的反应温度验证第一抗体对DNA-RNA杂合体的最佳反应条件的结果
Figure BDA0002070626800000082
由表2可知，在反应温度为42℃的温度下，获得的数据最佳，表明第一抗体与DNA-RNA杂合体在42℃的条件下两者之间的包被或结合效果最佳。
(二)特异性的单链核酸探针的制备(此处以HPV16 RNA探针为例)
高危型人乳头状瘤病毒(HPV)是一种长度为8000bp左右的双链DNA病毒，是导致宫颈癌的罪魁祸首，目前明确的导致宫颈癌的高危型HPV有18种，具体为HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型。其中和宫颈癌相关性最大的为HPV16型。
根据NCBI查询HPV16基因序列，用常规方法合成基因，将其克隆至pUC18载体中以质粒形式保存。
全长连续的HPV16 RNA探针的制备：根据合成的基因序列首尾设计一对引物，其中，上游引物的5’端引入T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，以HPV16质粒为模板，进行PCR扩增，扩增后的PCR产物即为全长连续的HPV16 RNA探针的模板，用T7 RNA聚合酶和NTP(ATP、CTP、GTP、UTP)在37℃的温度条件下反应4小时后加入DNase I再处理15分钟，纯化得到的即为全长连续的HPV16 RNA探针。
全长不连续的HPV16 RNA探针的制备：将长度为8000bp左右的HPV16做4条长度为2000bp的全长不连续的HPV16 RNA探针，根据合成的基因序列每2000bp就设计一对引物，共四对，每对引物的上游引物均引入T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)，以HPV16质粒为模板，进行PCR扩增，扩增后的PCR产物即为全长不连续的HPV16 RNA探针的模板，共有四条；每条模板分别与T7 RNA聚合酶、NTP(ATP、CTP、GTP、UTP)在37℃的温度条件下反应4小时后加入DNase I再处理15分钟，纯化得到的即为全长不连续的HPV16 RNA探针。
验证过程：将同一浓度(0.5μg/ml)的四条全长不连续的HPV16 RNA探针混合，用于对HPV16质粒检测和0.5μg/ml全长连续的HPV16 RNA探针对HPV16质粒检测的效果基本没有差异。
同时，将HPV16 RNA探针分成8段或16段全长不连续的HPV16 RNA探针时和全长连续的HPV16 RNA探针，所达到的效果基本没有差异。只有当HPV16RNA探针的长度小于100bp时，检测信号急剧下降，可能当RNA探针长度小于100bp时不能有效形成结构特异性的抗原决定簇。
用不同的HPV16质粒浓度(500pg/ml、50pg/ml、5pg/ml)和0浓度做比值，即为信噪比(S/N)。当S/N大于2，说明HPV16质粒能检测到；当S/N小于2，说明此时的HPV16质粒浓度和0浓度时的差异不大，即HPV16质粒检测不到。
HPV16 RNA探针长度、HPV16质粒浓度对信噪比(S/N)的影响如表3所示。
表3 HPV16 RNA探针长度、HPV16质粒浓度对信噪比(S/N)的影响
Figure BDA0002070626800000091
由表3可知，在一定HPV16质粒浓度的前提下，当HPV16 RNA探针的长度在500bp及以上时，无论是HPV16RNA探针为全长连续的HPV16 RNA探针(长度为8000bp)，还是HPV16RNA探针为全长不连续的HPV16 RNA探针(长度由4段2000bp组成，或8段1000bp组成，或16段500bp组成)，横向比较所测出的信噪比相差不大。
因此，对浓度为5-500pg/ml的HPV16质粒进行检测时，HPV16 RNA探针与HPV16质粒之间具有非常好的结合效果，而且检测过程中不涉及核酸的提取纯化，也没有涉及到核酸的扩增，即可作为定量检测，并且检测获得的数据更为准确和真实。
表4 RNA探针长度、HPV16质粒浓度对信噪比(S/N)的影响
Figure BDA0002070626800000101
由表4可知，在一定HPV16质粒浓度的前提下，当HPV16 RNA探针的长度在100bp及以上时，无论是HPV16RNA探针为全长连续的HPV16 RNA探针(长度为500bp)，还是HPV16RNA探针为全长不连续的HPV16 RNA探针(长度由4段125bp组成，或5段100bp组成)，横向比较所测出的信噪比相差不大；但当全长不连续的HPV16 RNA探针(长度由6段83bp组成)时，信噪比与前几种情况相差非常大。
快速定量测定多靶标：
用与制备全长连续的HPV16 RNA探针一样的方法制备全长连续的HPV18 RNA探针，用同浓度的HPV16 RNA探针(0.5μg/ml)、HPV18 RNA探针(0.5μg/ml)、以及HPV16 RNA探针(0.5μg/ml)和HPV18 RNA探针(0.5μg/ml)混合分别检测不同浓度的HPV16质粒、HPV18质粒、以及HPV16和18质粒的混合物。同浓度的HPV RNA探针、不同质粒情况对信噪比的影响如表5所示。
表5同浓度的HPV RNA探针、不同质粒情况对信噪比的影响
Figure BDA0002070626800000111
由表5可知，HPV16 RNA探针对不同浓度的HPV16质粒的检测具有较好的线性范围，对HPV18质粒无交叉反应；HPV18 RNA探针对不同浓度的HPV18质粒的检测具有较好的线性范围，对HPV16质粒无交叉反应；HPV16和18RNA混合探针对不同浓度的HVP16、HPV18质粒的检测均具有较好的线性范围，并且对HPV16和18的混合质粒有信号叠加效果。
实施例1：一种快速定量检测靶标DNA的方法，包括如下步骤：
步骤一，变性：将氢氧化钠溶液与子宫颈脱落细胞样本在65℃的条件下反应30min，且氢氧化钠溶液的浓度为1.75mol/L，氢氧化钠溶液与待检测样本的体积比为1∶2，将待检测样本的细胞破碎，使蛋白质变性、RNA降解，且使DNA变性分解为单链DNA，获得变性后的样本；步骤二，杂交：将步骤一中获得的变性后的样本与保存在pH值为3.5-4.0的核酸保存液中的HPV16 RNA探针(为针对靶标DNA的全长单链核酸探针，长度为8000bp)混合，HPV16 RNA探针与变性后的样本的体积比为1∶3，在pH值为7.0-7.4的范围内、温度为65℃的条件下杂交45min，使HPV16 RNA探针与变性后样本中的单链DNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合体溶液，其中含有DNA-RNA杂合体；
步骤三，捕获：将采用上述筛选方法获得的第一抗体固定在载体(平板)上，再加入步骤二中获得的DNA-RNA杂合体溶液，在温度为42℃的条件下，用第一抗体对DNA-RNA杂合体溶液中的杂合体捕获60min，将液体移除；
步骤四，检测：将步骤三中获得的用第一抗体捕获的DNA-RNA杂合体与保存于蛋白保存液中的第二抗体在42℃进行反应30min后，洗涤，在室温避光条件下静置10min，进行检测，获得信噪比。
步骤二中所采用的核酸保存液包括的组分及其用量如表6所示；步骤四中所采用的蛋白保存液包括的组分及其用量如表7所示。
表6实施例1的步骤二中所采用的核酸保存液包括的组分及其用量
Figure BDA0002070626800000121
表7步骤四中所采用的蛋白保存液包括的组分及其用量
组分 用量
柠檬酸三钠 5.8g
盐酸三乙醇胺 9g
N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸 10.71g
乙二胺四乙酸二钠 0.192g
冰乙酸 4.4ml
聚丙烯酸 4.3ml
Proclin-300 28μl
实施例2：一种快速定量检测靶标DNA的方法，与实施例1的区别在于，HPV16 RNA探针由4段全长不连续的HPV16 RNA探针，且全长不连续的HPV16 RNA探针的长度为2000bp。
实施例3：一种快速定量检测靶标DNA的方法，与实施例1的区别在于，HPV16 RNA探针由80段全长不连续的HPV16 RNA探针，且全长不连续的HPV16 RNA探针的长度为100bp。
实施例4：一种快速定量检测靶标DNA的方法，与实施例3的区别在于，HPV16 RNA探针由100段全长不连续的HPV16 RNA探针，且全长不连续的HPV16 RNA探针的长度为80bp。
实施例5：一种快速定量检测靶标DNA的方法，与实施例1的区别在于，步骤四中，HPV16 RNA探针上携带修饰物，其中，HPV16 RNA探针上有修饰物且修饰物为生物素，且采用亲和素与生物素结合。
其中，实施例1-5中的采用的样本均为同一批中的质粒样本，且第一抗体、第二抗体均为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体。
试验：靶标DNA检测试验
根据实施例1-5中的方式进行检测，获得的信噪比记录如表8中所示，并进行分析。
表8实施例1-5中获得的信噪比
针对10pg/ml HPV16质粒 信噪比
实施例1 100.12
实施例2 99.23
实施例3 98.03
实施例4 50.43
实施例5 10.27
由表8可知，实施例1-3获得的信噪比高于实施例4-5中的信噪比，说明采用第一抗体和第二抗体一同进行相互配合时，获得的信噪比的结果更好。实施例4中，虽然跟实施例1-3相比，全长不连续的HPV16 RNA探针的长度低于100bp，虽然检测获得的信噪比的效果没有采用实施例1-3获得的信噪比的效果那么好，但是，依然能够达到检测的目的。
实施例5中，之所以信噪比的检测结果会比实施例1-4中的要低，是因为实施例5的检测方法中，未采用第二抗体，而是采用亲和素与生物素结合，相比较第二抗体与杂合体之间的结合点更少，因此，获得的信噪比的数值较低。
对比实施例4和实施例5，是否采用亲和素和生物素进行相互配合，跟是否采用长度为100bp以上的HPV16 RNA探针进行检测相比，会对检测的灵敏性产生更大的影响。
因此，采用本申请中的方法进行靶标DNA检测时，可达到更灵敏、更快速的检测效果。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种非疾病诊断目的的快速定量检测靶标DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，变性：将待检测样本的细胞破碎，使蛋白质变性、RNA降解，且使DNA变性分解为单链DNA，获得变性后的样本；
步骤二，杂交：将步骤一中获得的变性后的样本与保存在pH值为3.5-4.0的核酸保存液中的特异性的单链RNA探针混合，在pH值为7.0-7.4的范围内、温度为65℃的条件下杂交45min，使特异性的单链RNA探针与变性后样本中的单链DNA进行杂交，形成DNA-RNA杂合体溶液；
步骤三，捕获：将第一抗体固定在载体上，再加入步骤二中获得的DNA-RNA杂合体溶液，在温度为42℃的条件下，用第一抗体对DNA-RNA杂合体溶液中的杂合体捕获60min，将液体移除；
步骤四，检测：将步骤三中获得的用第一抗体捕获的DNA-RNA杂合体与保存于蛋白保存液中的第二抗体在42℃进行反应30min后，洗涤，在室温避光条件下静置10min，进行检测；
所述步骤二中，所述变性后的样本中的单链DNA与单链RNA探针形成DNA-RNA杂合体；
所述步骤三中，第一抗体为特异性识别杂合体的物质，所述特异性识别杂合体的物质为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体、多克隆抗体或单克隆抗体或其片段、蛋白质、催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种；
所述第二抗体上携带有标记物，所述标记物在出现受激发光激发反应而发射荧光，或金颗粒聚集而显色，或酶催化反应而发光或显色；
所述步骤二中，所述特异性的单链RNA探针可以为针对靶标DNA的全长单链RNA探针或者针对部分靶标DNA的片段单链RNA探针；当特异性的单链RNA探针为针对靶标DNA的全长单链RNA探针时，针对靶标DNA的全长单链RNA探针为连续的针对靶标DNA的全长单链RNA探针或者分段的针对靶标DNA的全长单链RNA探针；
所述分段的针对靶标DNA的全长单链RNA探针的长度大于100bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，所述第二抗体为DNA-RNA杂合体结构特异性抗体，多克隆抗体或单克隆抗体或其片段，蛋白质，催化失活的核糖核酸酶H、核酸、核酸适配体或与DNA-RNA杂合体特异性结合形成三链体结构的寡核苷酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，特异性的单链RNA探针携带修饰物；所述步骤四中，采用能与修饰物结合并且出现特异性显色的物质代替第二抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述修饰物为生物素；所述能与修饰物结合并且出现特异性显色的物质为亲和素。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，特异性的单链RNA探针与变性后的样本的体积比为1:3。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中的载体为固相载体或是非固相载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固相载体为平板、微孔板、载玻片、皿、磁珠、微球、芯片、膜、微阵列、试管、硅、玻璃、陶瓷、金属或者塑料中的至少一种；所述非固相载体为在其他抗体上标记荧光共振能量转移探针。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，标记物为荧光标记物、金标记物、酶标记物中的一种。
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