CN111979261A - 创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法，该多基因编辑载体采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系，能够实现同时对番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因进行精确编辑，利用农杆菌介导的转化技术快速得到相关变异材料，丰富番茄育种资源，为番茄品种选育提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种创制番茄果实色泽育种材料的多基因编辑载体及方法。
背景技术
番茄(Solanumlycopersicum)是全球广泛种植的蔬菜作物之一，营养丰富，可以用作烹饪和调料，受到广大消费者的喜爱。我国是世界上番茄生产和出口大国，番茄产量居世界第一。
我国番茄育种工作开始较晚，但经过科研者三十多年的努力也取得了丰富的成果，先后育成了一系列优良品种。传统的植物遗传育种方法一般是基于现有的种质资源，后代优良农艺性状的选择效率偏低且周期较长，遗传改良的效率偏低。目前研究人员通过现代生物技术与传统育种方法结合，创新种质资源，提高了遗传改良效率、缩短了育种年限，在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力，成为现代作物育种的主要方向。如何培育优质高产多抗的番茄品种受到广大研究者的关注。
分子育种主要分为两类：一类是分子标记育种，又称分子标记辅助选择(MAS)，通过构建分子遗传图谱实现基因/QTL定位甚至克隆，获得与目标基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记作为选择标记，在育种选育过程中，以标记信息为辅助信息，通过分子标记的筛选快速、准确地完成目标性状的选择并用于遗传改良；另一类是基因工程育种，主要以转基因、定向诱导基因组局部突变(TILLING)和基因组编辑等技术为代表，可以打破传统育种存在的生殖隔离、连锁累赘等因素的限制，实现对目标性状的高效精准遗传改良。近年来，基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑日益受到重视。由于编辑效率高、操作简便、成本低等特点，CRISPR/Cas9迅速成为当前最为主流的基因组编辑技术。目前CRISPR/Cas9系统已经在动物、植物、微生物及各种细胞中实现了应用。
在针对番茄的研究中，研究人员大部分采用CRISPR/Cas单基因编辑系统，多基因编辑技术应用较少，难度较大。如何创建一个系统简单、操作便捷且编辑效率高的多基因编辑系统，以达到利用一个载体同时敲除多个基因的目的，在基因家族、通路的研究、作物改良等方面发挥着重要作用，因此多基因编辑系统的建立及优化对植物的研究具有重要意义。
果实颜色是影响番茄外观品质的重要因素，番茄果实颜色的改良是番茄品种选育的最重要目标之一。目前，南方番茄市场绝大部分栽培番茄为红色，北方粉果番茄较多，难以满足消费者对果实颜色的多样性需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法，经一次试验可同时获得多种色泽的番茄育种材料，丰富番茄种质资源，实现番茄果色的高效遗传改良，满足番茄果实颜色的多样性需求。
发明人团队通过研究发现利用番茄体内的内含子剪切系统和tRNA加工系统，构建串联排列的tRNA-gRNA构架，能够高效、精确串联多个gRNA指导Cas9蛋白进行多基因编辑，并应用于番茄育种和基础研究中。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体，其采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系实现同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种创制番茄果实色泽材料的方法，包括如下步骤：构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示；利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得番茄果实色泽材料。
在其中一个实施例中，构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的多基因编辑载体包括如下步骤：以pGTR质粒为模板，采用如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示的引物序列进行PCR扩增，扩增反应后挖胶回收目的基因片段，经酶切后连接pKSE401，转化大肠杆菌感受态，选取大肠杆菌阳性克隆进行质粒抽提，导入农杆菌感受态细胞培养，获得农杆菌阳性克隆。
优选地，PCR扩增反应的程序依次为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃复性15s，72℃延伸30s，循环38次；72℃延伸5min。
在其中一个实施例中，鉴定阳性克隆所采用引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQID NO.16所示。
在其中一个实施例中，鉴定番茄果色材料编辑位点所采用的引物序列分别如SEQID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。
在其中一个实施例中，所述番茄遗传转化采用的受体材料为MicroTOM番茄。
本发明的有益效果是：
本发明构建了一个可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的多基因编辑系统，可经一次试验同时获得果实为黄色、棕色、粉色等多种色泽的番茄育种材料，便于加快育种进程，突破了传统番茄育种手段的障碍和缺点，具有广泛应用价值。
附图说明
图1为农杆菌克隆的PCR检测鉴定胶图。
图2为多基因编辑载体pKSE401-3G的结构示意图。
图3为番茄遗传转化示意图。
图4为转基因番茄阳性植株的PCR鉴定胶图。
图5为PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的靶点扩增鉴定胶图。
图6为基因编辑番茄材料的植株表型图。
图7为基因编辑番茄的果实颜色图。
图8为PCR转基因成分的去除状况鉴定胶图。
具体实施方式
以下对本发明进行举例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。实施例中未注明具体条件的实验方法，在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。
实施例1
本实施例提供一种多基因编辑载体pKSE401-3G的构建方法，包括如下步骤：
S1，获取PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的序列信息。根据数据库CRISPR-P2.0设计目的基因的靶位点。
其中，PSY1基因的序列如下：
gatttcactatattgtaatattaacttgaggtcactataggagctcaaaaacttctaattttgaatcaatgtctggttatactttttttgtcataactgtatctcaaatgtggtgtttggtttatctcattttgcagaagtcaagaaacaggttactcctgtttgagtgaggaaaagttggtttgcctgtctgtggtctttttataatctttttctacagaagagaaagtgggtaattttgtttgagagtggaaatattctctagtgggaatctactaggagtaatttattttctataaactaagtaaagtttggaaggtgacaaaaagaaagacaaaaatcttggaattgttttagacaaccaaggttttcttgctcagaatgtctgttgccttgttatgggttgtttctccttgtgacgtctcaaatgggacaagtttcatggaatcagtccgggagggaaaccgtttttttgattcatcgaggcataggaatttggtgtccaatgagagaatcaatagaggtggtggaaagcaaactaataatggacggaaattttctgtacggtctgctattttggctactccatctggagaacggacgatgacatcggaacagatggtctatgatgtggttttgaggcaggcagccttggtgaagaggcaactgagatctaccaatgagttagaagtgaagccggatatacctattccggggaatttgggcttgttgagtgaagcatatgataggtgtggtgaagtatgtgcagagtatgcaaagacgtttaacttaggttagcttcttcaatctattcattcgtttaccaaatattatttggtaagcactaattatgaatatatatatgttcatgttattgatgaagacaaaatttgatctttgtttgtttattcaggaactatgctaatgactcccgagagaagaagggctatctgggcaatatatggtgaggtttctagccatttaataacagttacgcgcacaaacacatatgattaatcggggacgagaaaaaaagaaatgaagtttgagttttgagggtcatatgtaataggtaaatccgagcttgactagcttgagatgtttattgtcatatcatgctcaatactaaccaaaacactgaaaaagaacttgattatatttacatactaatattttcatttgcgttgctgttcacatttttacctatggaactggtttttgtgatttgttatacttcatattcgatgttaataaaatatatcattcctccctttttctccacttcaagctttactgtagtgttgaaaggggaaactccttttaatgattgcatatataaacgaacttcttgagttgaatagtttctcattatgatctgtttaaacagtatggtgcagaagaacagatgaacttgttgatggcccaaacgcatcatatattaccccggcagccttagataggtgggaaaataggctagaagatgttttcaatgggcggccatttgacatgctcgatggtgctttgtccgatacagtttctaactttccagttgatattcaggttagtctaccaattctatggtctttatatttgttcaatttgcgtttgatgtcacttttgctgagggcttttctaatagcttacttcagcctagcggaaatgtttgtagttgaatctctagttctgtctcctatatctgtttctctcgtcctagatactacacatacttcatttctgttttaacattttattcgtcttttggtgttgttttgtatgtgaatcatatatttggaacagaatcattattagttcacatgatttcatttgctttcttcaatagcgtaattgtctaaccttccaatatatgttgcagccattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaacttcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttccaattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctttggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagagtaagtacaaagctgtgttttacgcacataattttttttgctaatatttacatatcaaaatataggaaaatgagctcttcggttatccggtttatattttttttatgtcaacataatagtataaagtaattagtatcagtcgttctgggaataaaattgcagaactcaatttagccgtgttgtgaaatcctgcttgttttgagagcttaaagctcattagttagtcgttagagacgaagaaattcttcgttgtccatctttattccaccttaaagttgtgatattttcattattggtacatttggcaaaaacacctgaacaaatttatgacggatgccttttgaaagtcactatacctgtctagtcggcgtttatcacatttctttgacatattgaactttgaaacatgatatcagctctagacagtgacgagccatgatcaatttctttcctttattctttctttggaagtgccgtatttaggcttccgttgttcttatatattgctttccctgcagtgccagaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaagatatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacatagggcaagaaagttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccctgtaagcattcgtaaactctttagttttatgaaatgattcttttttcgcgttattagatgaatatggttgcttgtgttgagtatttctaggtcgatgaagttgagacaagggtttttaagttttaacgacttttacggggtgccatgttatctgctacctaatcttaggtagttgaccggaagggctagaattttaacctcatgttcaccctaccaaccaagaaatgaacctcgcatagagctcgtagttatgaatatttgctttggcatgacattgtgcggatcatgaaatgtcttagattatatggaaaaatcattctattacatcgaatagatacattagatctaagaagcacgccgtgttgtaaatgagaaattctatagctcagatctttagttttctctgaacgacctacaaaccaacggataaccttgtattgagcttgtcgttctcagtatttgcactaacattacgtcgtgtggatcctgaaatggcttggattgctattattctggatatggcaaaaccattttattagtactagatatcgaataactacatttgaccctacaagtaccctgggttggagttacaatatcccatacctcgtatctttagtgttctcttatttatcacctttgtctactattctggcaaaataacctcactcgttactcggtgttttccaggtatgggcatctttggtcttgtaccgcaaaatactagatgagattgaagccaatgactacaacaacttcacaaagagagcatatgtgagcaaatcaaagaagttgattgcattacctattgcatatgcaaaatctcttgtgcctcctacaaaaactgcctctcttcaaagataaagcatgaaatgaagatatatatatatatatatatagcaatatacattagaagaaaaaaaggaagaagaaatgttgttgtattgatataaatgtatatcataaatattaggttgtagtaacattcaatataattatctcttgtagttgttgtatcttcactttatctcaactcctttgagagaactttccgtagttatctgctttgcacttggttactcagaattttactgtgggcatgataattgatataccaaattcagttttgattctatcgaaaaatttgttattacatttttttggggggaaaggaa(SEQ ID NO.1)。
SGR基因的序列如下：
tgagccaaacgggctcttaaataaacttcttcccaactctctgtgaggacttttatcaaacagctaacttgcaatttcttttatatacttttaacattcaacaagattgttttattactggaaatttccagtaatattggaactccaagattcaaggagttttgggtacccaatttcttgtagaaaaaatgggaactttgactacttctctagtggttccatctaagctcaacaatgaacaacagagctctatttttatacacaaaactagaaggaaatgcaagaagaatcaatccatagtacctgtaattaatttccaccatcttttttcttcttcttaagattcttctattggtttgatattgtttacttaatagtttttatttgtttgttgaatgaaaataggtggcaaggttatttggaccagctatatttgaagcttcaaaattgaaggtactttttttgggagttgatgaagaaaagcatccaggaaagttgccaagaacatatacactgactcatagtgatattacttctaaacttactttggctatctcccaaaccatcaataattctcaggtaatcaaatatttctctttagaaattttgatgacatattattctgtgtgagaaatagtcgaggtctatcagaaactctcttttaaggtaggactaaggttgcgtaaacaccactctcttcatactttagagtctagccctttaatttaaattttgagtttatttctccaatgatcactcaaataataatagttattatctcggaaaattatttttcttgtcgattccaattttcttcggcaaagaaagttaataagataataattactattagagtgaaccctttaaatttggtggcaataagaatatggaggtccttgattagttgatcattcttctcgaattattagttgaatgactatttgaaaaatcaaatctttaatttggtggcaataagaatatggagttccttgattagttgatcatacttctctattccaatttcctttggcaaagaaagtgactttacgagatactagtaattattagttgaatggttatttgaaaaatcaactctttaaatttgatggcaataagaatatggaggtccttgataagttgatcgttcttctcgatttcaatttccttcagcaaagaaagtgatctgatgagataataattattagttgaataaccattagagaaatcaacttcttacacttggtggcaataagaatatgggattcttgattagttgatcttcatctattgctgattcggagtataggcgaattcaagatttgatctttatgagttttgaattttaggacagcaaactcaagtactagtaacttggaatttgaatttgattcttgtacatatttaatgaatttctaaacatagggtctgggccaaaactactaaattctacattcggtggataatggatccgtgccgtctattgttctcaacttaaatactattatctaaagcaatatcaagctcatgacgcatgtcgaaatcccacacatcacatgctatacttttaccactaaattattagctgcatattcatttagagaagttcgaaaatatgttttttttaaatcttgaatctgcatctacatcgtagtagaacttctgttgagaaaagtggaaatggtatgtttgatttgcagttgcaaggttggtataacagacttcaaagagatgaagttgttgcagagtggaagaaagtaaaagggaagatgtcacttcatgtccattgccacattagtggaggccattttatgttagacttatttgctagactcagaaactacatcttctgcaaagaactccctgtggtaagttcataataaattgccaccatatctatgtatgtatgtcgttcgaacttcccaaaattgttattggtcctgtgtcagatccttcttttggaggatcaaacacacaaccataggttaatagtaccatattttcataacttgtgtttttattttgtttgcattaggttctcaaggcttttgttcatggagatgagaatttactaaggaattatccagagttacaagaagctttagtttgggtatattttcattcaaacattcaagaattcaacaaagtagaatgttggggtccactcagagatgcaacttccccctcatcttcttctggtggggtaggtggggtgaagagtacaagttttacaagcaatagcaacaaaaaatgggaattaccaaagccttgtgaagaggcttgtgcctgttgctttcccccagtgagtgttatgccttggctttcttcaaatcttgatggggtaggtgaggaaaatgggaccatccaacaaggcttgcaagagcagcaaagttgaaaaaaatgagatagtgattatgtttggtttattatgtgatttgatgtaattaactatttaattagttgtcattatagggtttgtggaagcagcattatttatttggttgaaatgtaaataagaattcagaggtcatgattaaagacaagaacatcaagtttaggatggtgatacataactatacaattattgtaagttgggttgtgcctaaatcaatgttaaatttttttcatgatt(SEQ ID NO.2)。
SlMYB12基因的序列如下：
taattttcattgccttttgcttctccattttgtgataataataataatgggaagaacaccttgttgtgaaaaagtgggcatcaagagaggcagatggactgcagaagaagatcaaattctcactaattatattatttctaatggagaaggctcttggaggtcgttacctaaaaatgccggtacgattacctactaatcttttattttaatttgaaatttaaaatttttttcttcgtttaacagtttttttataatattttatttcgaaggattattgagatgcggaaagagttgtagactacgatggattaattatttgaggtctgatctcaagagagggaacattacttctcaagaggaagatataattataaagttacatgcaactttgggtaacaggtaattagtcaattacttgattggactttttagcttgctaattaaaccactcattttgtttctttttagtctaggtccagaaaaaaatgtctcctttaaaatcaagtactttcttcgtttaaaaaataataattttatttttatttagtctgttttataaagaatgactttttttttagtaatatgttaaatttaatttttcacatgacatctttaaaattataaaattagagatagtttgatacatttgacataactttaatttagaatcacttctttcttttcttaaaatccgtttcaagtcaaataggtcattcttttttatacgcaagaagtatttttttctttaaaaataaatctgaaactcattttaggttataaacattgtcacaataatttggtgcccgatctaacaacacttcttatatcattttagtgtgtgaatagtgttacaccaaatttaatacaacaaaattactcatcaaaattattactattcatgataacatagtgtaatggattcgagctagagaaagaataaataatatgttttaggtaaataatattaatggattcgagctagagaaagaataaataatatgttttaggtaaataatattccatttgcttaaaaaaataatctttttttttaaaaaaagaatgatttcttttactttcagatatattttaatctcagctgttgttcgtgtgataagtttaatatcatataatactttgctttatttgacataattttaatttagatttataaaattaataattttttttattttcttaaatatcgtgttaaattaaactaggtcaatggtataattgattgaagtagatgccctaataaataaaagtgagatcaatgcaattataattaacttaaattcatcacttcttttttactacttgaattcatcacataaaacaaatgaatttttcttcttcttttatttcatgtttactccagtacttaatagtttatagttatgtttgcctggaaaaaggagaaaagttttggtcactttaatttgtagggtattattttctacattcattatttgtgctaatgaattaataagttaattaaattggtcccctcgagtaagttcaatattactcttttttttttctttttcatatgacgagtgacatattcatgctttaaaaacaattcatcctttctattattagtcatataccaagtctagaaaataaaacagtgacaatttaaagtattttttcaaactagaaaacgtatcttaagttggatgtatacacaaatatatcaaataatttcaacaaagaaaaaatttagaaaagatgtgttagttgtgagttgtgacattaaatatgattgattaatacaatataccatcgatctagtttctaacattttctagtatcatcgactttttaaaattacagatggtctcttatagcagaacatttatcaggtagaacagacaatgagataaaaaactattggaactctcatctaagtcgaaaagttgatagcttaaggataccaagcgatgagaagttacctaaagccgtagttgatttggctaaaaaaggtataccgaagccaattaaaaaatcatcgattagtcgaccaaaaaataaaaagtcaaacttattagaaaaagaagcattgtgttgtacaaatatgccagcttgtgatagtgccatggaattaatgcaagaagatctagcaaagatagaggtgccaaattcttgggcaggacctatagaggccaagggaagccttagttcaggtacaaatttcgatgttttgactattttttattgtgaaatttgattttaaaaaatattttttgatattaaagtgaaaaataatattcaaaatttatttaagttgtgtttggttatgaatatgaattagagttgtttttttcattttttcctcaattatttcgagtaaacctttttttttctttaaagaattgaaattttattgtcaaatatgattctctgagttttaactatcgaaaaaagcgaaaaagatcaaacaccctctaatagtttttattaatcaattaaatacattttcaatagtgactatgacgacataatatttatatattgaaatatatgattattttatcaaaaaacttaaaatttaattttcacgtctttcttttcttttgaaacgtcattttttatatgtaccttttagatccaatatctatctatggatagacgttgcgaagtactttttgttattttcaattattaggcacaaataattgaatctagcacctcttgtatgtacaaaattttaaactgtagcaataaataaatatattttttaatttttttaaatttttatttttttttgtctgagcagatagtgatatcgaatggccaagactcgaggagattatgccagacgtggtgattgatgatgaagataagaacacaaatttcatattgaattgtttcagagaagaagtaacgagcaataatgtagggaatagttattcatgtatcgaggaaggtaataaaaagatatcaagcgacgatgaaaaaatcaaattattaatggattggcaagataatgatgagttagtatggccaacgttaccatgggaattagaaacggatatagttcccagttggccacaatgggacgatactgacactaacttacttcaaaattgcaccaatgataataataattatgaagaagcaacaacaatggaaattaataaccaaaatcatagtaccattgtatcttggcttttgtcttagaaatataataatatgacattatatattgcttttgaatatattactcaactctttttgtttcgttttatatttggaatgtgggaattagaatgactagttt(SEQ ID NO.3)。
设计引物SGRT1-F、SGRT2a-R、SGRT2b-F、PSY1T3a-R、PSY1T3b-F、PSY1T4a-R、PSY1T4b-F、MYB12T5a-R、MYB12T5b-F和MYB12T6-R，引物序列分别见下表1。
S2，以pGTR(Xieet al.ProcNatlAcadSciUSA,2015,112:3570-3575)质粒为模板，用设计的引物通过Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶扩增克隆含有靶位点、tRNA和guide RNA的序列，各个目的片段分别命名为：SGRT1-SGRT2a、SGRT2b-PSY1T3a、PSY1T3b-PSY1T4a、PSY1T4b-MYB12T5a、MYB12T5b-MYB12T6，PCR扩增反应的程序详见下表2。
目的片段扩增完成之后进行凝胶电泳检测，挖胶并用胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收纯化各目的片段，用限制性内切酶BsaI(NEB公司)和T7连接酶(NEB公司)进行酶切-连接循环反应，将目的片段连接到pKSE401(Xinget al.BMC Plant Biol,2014,14:327)中，连接反应体系详见下表3。
取2μL反应液转化大肠杆菌感受态TOP10(武汉擎科伟业生物有限公司)，采用卡那霉素抗性平板筛选。挑选抗性菌落培养后，利用PCR进行阳性克隆检测，检测引物的序列详见表1，鉴定PCR反应程序详见下表4。
PCR扩增完成之后，进行凝胶电泳检测，阳性菌落的PCR扩增片段大小需考虑总靶点数，其中包含pKSE401载体片段454bp，扩增片段大小约为1414bp。
对测序结果正确的阳性克隆菌液进行质粒抽提，送公司测序，检测扩增片段是否存在变异，正确的片段序列如下：
在SEQ ID NO.4所示的串联片段序列中，下划线部分为各个靶点序列，小写字母为番茄U6启动子序列，波浪下划线为gRNA序列，gRNA和靶点之间为tRNA序列。
将片段大小及序列完全正确的质粒转入农杆菌GV3101的感受态细胞，在含有卡那霉素和利福平的抗性平板中进行培养，挑取单克隆菌落培养后，再次利用PCR技术进行阳性检测(检测方法和引物与大肠杆菌检测方法一致)，进行凝胶电泳检测，结果如图1所示。
对检测为正确克隆的菌液进行保存，用于后续的番茄遗传转化。通过上述过程构建获得的多基因编辑载体命名为pKSE401-3G，结构见图2。
表1引物列表
表2 PCR反应程序
表3酶切—连接反应体系
表4阳性克隆鉴定的PCR反应程序
实施例2番茄遗传转化
通过农杆菌介导的转化方法，将实施例1获得的多基因编辑载体pKSE401-3G转化到MicroTOM(南京丰硕园艺科技有限公司)的子叶中，遗传转化过程参见图3，番茄遗传转化方法参考(Ouyang et al.JHorticSciBiotechnol,2005,80:517-522)，获得转基因再生植株。
实施例3转基因植株阳性鉴定
用CTAB法提取转基因番茄再生植株的基因组DNA，通过扩增载体上的Cas9基因对转基因植株进行阳性检测，检测引物为Cas9-F和Cas9-R，引物序列参见上表1，鉴定结果如图4所示。发明人团队对一个批次41株番茄再生植株进行了检测，其中35株为阳性，阳性率为85％。
对于经过PCR检测为阳性的转基因番茄植株，进一步针对各个靶点的附近序列设计横跨该靶点前后100-200bp的检测引物。本发明针对3个目的基因所设计的检测引物分别命名为PSY1-Seq-F、PSY1-Seq-R，SGR-Seq-F、SGR-Seq-R和MYB12-Seq-F、MYB12-Seq-R，引物序列分别参见上表1。
实施例4阳性转基因植株的编辑结果分析及表型鉴定
优先选取含有纯合或杂合缺失片段的阳性番茄植株的扩增产物送公司测序，通过测序峰图及SnapGene软件综合分析编辑情况。
根据检测结果图4和图5，发明人团队挑选了SlMYB12有大片段缺失的8株阳性转化植株(-3、-4、-10、-14、-18、-22、-23和-38)进行靶基因的扩增和测序分析，这8株编辑植株的编辑结果汇总见表5。
另外，这8个编辑植株营养生长正常，与MicroTom无明显差异，可正常开花结果。其中，部分编辑植株的表型见图6，MCR18番茄植株的果色为粉红色，3个基因同时缺失的MCR23番茄植株的果色呈棕红色，MCR35植株的果实呈现亮黄色，部分编辑材料的果实性状见图7。
表5部分转基因单株的编辑结果
另外，T0代番茄编辑材料自交收种后得到T1代，通过扩增Cas9基因对T1代植株进行检测，判断是否含有转基因成分。其中，Cas9检测引物序列参见上表1，检测结果详见图8。确认已获得了一批不含转基因成分的番茄果色变异材料，如MCR18-6、-10，MCR23-9、-10等。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征的所有可能组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体及方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3994
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatttcacta tattgtaata ttaacttgag gtcactatag gagctcaaaa acttctaatt 60
ttgaatcaat gtctggttat actttttttg tcataactgt atctcaaatg tggtgtttgg 120
tttatctcat tttgcagaag tcaagaaaca ggttactcct gtttgagtga ggaaaagttg 180
gtttgcctgt ctgtggtctt tttataatct ttttctacag aagagaaagt gggtaatttt 240
gtttgagagt ggaaatattc tctagtggga atctactagg agtaatttat tttctataaa 300
ctaagtaaag tttggaaggt gacaaaaaga aagacaaaaa tcttggaatt gttttagaca 360
accaaggttt tcttgctcag aatgtctgtt gccttgttat gggttgtttc tccttgtgac 420
gtctcaaatg ggacaagttt catggaatca gtccgggagg gaaaccgttt ttttgattca 480
tcgaggcata ggaatttggt gtccaatgag agaatcaata gaggtggtgg aaagcaaact 540
aataatggac ggaaattttc tgtacggtct gctattttgg ctactccatc tggagaacgg 600
acgatgacat cggaacagat ggtctatgat gtggttttga ggcaggcagc cttggtgaag 660
aggcaactga gatctaccaa tgagttagaa gtgaagccgg atatacctat tccggggaat 720
ttgggcttgt tgagtgaagc atatgatagg tgtggtgaag tatgtgcaga gtatgcaaag 780
acgtttaact taggttagct tcttcaatct attcattcgt ttaccaaata ttatttggta 840
agcactaatt atgaatatat atatgttcat gttattgatg aagacaaaat ttgatctttg 900
tttgtttatt caggaactat gctaatgact cccgagagaa gaagggctat ctgggcaata 960
tatggtgagg tttctagcca tttaataaca gttacgcgca caaacacata tgattaatcg 1020
gggacgagaa aaaaagaaat gaagtttgag ttttgagggt catatgtaat aggtaaatcc 1080
gagcttgact agcttgagat gtttattgtc atatcatgct caatactaac caaaacactg 1140
aaaaagaact tgattatatt tacatactaa tattttcatt tgcgttgctg ttcacatttt 1200
tacctatgga actggttttt gtgatttgtt atacttcata ttcgatgtta ataaaatata 1260
tcattcctcc ctttttctcc acttcaagct ttactgtagt gttgaaaggg gaaactcctt 1320
ttaatgattg catatataaa cgaacttctt gagttgaata gtttctcatt atgatctgtt 1380
taaacagtat ggtgcagaag aacagatgaa cttgttgatg gcccaaacgc atcatatatt 1440
accccggcag ccttagatag gtgggaaaat aggctagaag atgttttcaa tgggcggcca 1500
tttgacatgc tcgatggtgc tttgtccgat acagtttcta actttccagt tgatattcag 1560
gttagtctac caattctatg gtctttatat ttgttcaatt tgcgtttgat gtcacttttg 1620
ctgagggctt ttctaatagc ttacttcagc ctagcggaaa tgtttgtagt tgaatctcta 1680
gttctgtctc ctatatctgt ttctctcgtc ctagatacta cacatacttc atttctgttt 1740
taacatttta ttcgtctttt ggtgttgttt tgtatgtgaa tcatatattt ggaacagaat 1800
cattattagt tcacatgatt tcatttgctt tcttcaatag cgtaattgtc taaccttcca 1860
atatatgttg cagccattca gagatatgat tgaaggaatg cgtatggact tgagaaaatc 1920
gagatacaaa aacttcgacg aactatacct ttattgttat tatgttgctg gtacggttgg 1980
gttgatgagt gttccaatta tgggtatcgc ccctgaatca aaggcaacaa cagagagcgt 2040
atataatgct gctttggctc tggggatcgc aaatcaatta actaacatac tcagagatgt 2100
tggagaagag taagtacaaa gctgtgtttt acgcacataa ttttttttgc taatatttac 2160
atatcaaaat ataggaaaat gagctcttcg gttatccggt ttatattttt tttatgtcaa 2220
cataatagta taaagtaatt agtatcagtc gttctgggaa taaaattgca gaactcaatt 2280
tagccgtgtt gtgaaatcct gcttgttttg agagcttaaa gctcattagt tagtcgttag 2340
agacgaagaa attcttcgtt gtccatcttt attccacctt aaagttgtga tattttcatt 2400
attggtacat ttggcaaaaa cacctgaaca aatttatgac ggatgccttt tgaaagtcac 2460
tatacctgtc tagtcggcgt ttatcacatt tctttgacat attgaacttt gaaacatgat 2520
atcagctcta gacagtgacg agccatgatc aatttctttc ctttattctt tctttggaag 2580
tgccgtattt aggcttccgt tgttcttata tattgctttc cctgcagtgc cagaagagga 2640
agagtctact tgcctcaaga tgaattagca caggcaggtc tatccgatga agatatattt 2700
gctggaaggg tgaccgataa atggagaatc tttatgaaga aacaaataca tagggcaaga 2760
aagttctttg atgaggcaga gaaaggcgtg acagaattga gctcagctag tagattccct 2820
gtaagcattc gtaaactctt tagttttatg aaatgattct tttttcgcgt tattagatga 2880
atatggttgc ttgtgttgag tatttctagg tcgatgaagt tgagacaagg gtttttaagt 2940
tttaacgact tttacggggt gccatgttat ctgctaccta atcttaggta gttgaccgga 3000
agggctagaa ttttaacctc atgttcaccc taccaaccaa gaaatgaacc tcgcatagag 3060
ctcgtagtta tgaatatttg ctttggcatg acattgtgcg gatcatgaaa tgtcttagat 3120
tatatggaaa aatcattcta ttacatcgaa tagatacatt agatctaaga agcacgccgt 3180
gttgtaaatg agaaattcta tagctcagat ctttagtttt ctctgaacga cctacaaacc 3240
aacggataac cttgtattga gcttgtcgtt ctcagtattt gcactaacat tacgtcgtgt 3300
ggatcctgaa atggcttgga ttgctattat tctggatatg gcaaaaccat tttattagta 3360
ctagatatcg aataactaca tttgacccta caagtaccct gggttggagt tacaatatcc 3420
catacctcgt atctttagtg ttctcttatt tatcaccttt gtctactatt ctggcaaaat 3480
aacctcactc gttactcggt gttttccagg tatgggcatc tttggtcttg taccgcaaaa 3540
tactagatga gattgaagcc aatgactaca acaacttcac aaagagagca tatgtgagca 3600
aatcaaagaa gttgattgca ttacctattg catatgcaaa atctcttgtg cctcctacaa 3660
aaactgcctc tcttcaaaga taaagcatga aatgaagata tatatatata tatatatagc 3720
aatatacatt agaagaaaaa aaggaagaag aaatgttgtt gtattgatat aaatgtatat 3780
cataaatatt aggttgtagt aacattcaat ataattatct cttgtagttg ttgtatcttc 3840
actttatctc aactcctttg agagaacttt ccgtagttat ctgctttgca cttggttact 3900
cagaatttta ctgtgggcat gataattgat ataccaaatt cagttttgat tctatcgaaa 3960
aatttgttat tacatttttt tggggggaaa ggaa 3994
<210> 2
<211> 2629
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagccaaac gggctcttaa ataaacttct tcccaactct ctgtgaggac ttttatcaaa 60
cagctaactt gcaatttctt ttatatactt ttaacattca acaagattgt tttattactg 120
gaaatttcca gtaatattgg aactccaaga ttcaaggagt tttgggtacc caatttcttg 180
tagaaaaaat gggaactttg actacttctc tagtggttcc atctaagctc aacaatgaac 240
aacagagctc tatttttata cacaaaacta gaaggaaatg caagaagaat caatccatag 300
tacctgtaat taatttccac catctttttt cttcttctta agattcttct attggtttga 360
tattgtttac ttaatagttt ttatttgttt gttgaatgaa aataggtggc aaggttattt 420
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gaaattttga tgacatatta ttctgtgtga gaaatagtcg aggtctatca gaaactctct 660
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gtatgtttga tttgcagttg caaggttggt ataacagact tcaaagagat gaagttgttg 1740
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ggttaatagt accatatttt cataacttgt gtttttattt tgtttgcatt aggttctcaa 2040
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tcattatagg gtttgtggaa gcagcattat ttatttggtt gaaatgtaaa taagaattca 2520
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<210> 3
<211> 3283
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taattttcat tgccttttgc ttctccattt tgtgataata ataataatgg gaagaacacc 60
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cactaattat attatttcta atggagaagg ctcttggagg tcgttaccta aaaatgccgg 180
tacgattacc tactaatctt ttattttaat ttgaaattta aaattttttt cttcgtttaa 240
cagttttttt ataatatttt atttcgaagg attattgaga tgcggaaaga gttgtagact 300
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tatttagtct gttttataaa gaatgacttt ttttttagta atatgttaaa tttaattttt 600
cacatgacat ctttaaaatt ataaaattag agatagtttg atacatttga cataacttta 660
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 19
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<400> 23
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<400> 24
gagcctagcg gacaggatag 20
Claims (7)
1.一种创制番茄果实色泽材料的多基因编辑载体，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑体系可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体，所述PSY1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SGR基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SlMYB12基因的序列如SEQ ID NO.3所示；
利用农杆菌介导番茄遗传转化，获得番茄果实色泽材料。
3.根据权利要求2所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，构建可同时编辑番茄PSY1基因、SGR基因和SlMYB12基因的CRISPR/Cas9多基因编辑载体包括如下步骤：以pGTR质粒为模板，采用如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物序列进行PCR扩增，扩增反应后挖胶回收目的基因片段，经酶切后连接到pKSE401，转化大肠杆菌感受态，选取大肠杆菌阳性克隆进行质粒抽提，导入农杆菌感受态细胞，获得农杆菌阳性克隆。
4.根据权利要求3所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，PCR扩增反应的程序依次为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃复性15s，72℃延伸30s，循环38次；72℃延伸5min。
5.根据权利要求3所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，鉴定阳性克隆所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
6.根据权利要求3所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，鉴定番茄果实色泽材料编辑位点所采用的引物序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。
7.根据权利要求2至6任一项所述的创制番茄果实色泽材料的方法，其特征在于，所述番茄遗传转化采用的受体材料为MicroTOM番茄。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430000 2-202, No. 517 Luoshi South Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province Applicant after: Wuhan Chuwei Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: HUAZHONG AGRICULTURAL University Address before: 430000 2-202, No. 517 Luoshi South Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province Applicant before: WUHAN CHUWEI BIO-TECH Co.,Ltd. Applicant before: HUAZHONG AGRICULTURAL University |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201124 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |