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CN111979092A - 蜂窝管 - Google Patents

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CN111979092A
CN111979092A CN202010734994.5A CN202010734994A CN111979092A CN 111979092 A CN111979092 A CN 111979092A CN 202010734994 A CN202010734994 A CN 202010734994A CN 111979092 A CN111979092 A CN 111979092A
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蒋裕民
道格·多利特
杜斯丁·狄更斯
詹妮弗·格拉斯
鲁埃尔·万埃塔
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Abstract

蜂窝管，其具有限定了第一平面表面和第二平面表面之间的流体路径的平面框架。流体界面位于所述平面框架的一个端部。所述流体界面具有流体入口以及流体出口。所述流体路径还包括井室，所述井室具有带多个井的井基板。所述井室布置在所述平面框架中位于所述第一表面或第二表面与所述井基板之间。

Description

蜂窝管
本申请是中国专利申请201380062086.4号的分案申请。本申请要求提交于2013年3月15日的美国专利申请13/843,739的优先权，该美国专利申请要求提交于2012年9月26日的美国临时申请61/706,115的利益。本申请还要求提交于2012年9月26日的美国临时申请61/706,115的利益。每个前述申请整体通过引用并入本文。
背景技术
期望同时执行多个测定以提供各种各样的大数据组。这种过程通常称为“多路测定”。因而，需要能够执行多路测定的设备。
发明内容
本发明的一些实施方案涉及蜂窝管，其能够具有限定了第一平面表面与第二平面表面之间的流体路径的平面框架。流体界面能够位于所述平面框架的一个端部。所述流体界面能够具有流体入口以及流体出口。所述流体路径还能够包括井室，所述井室具有配置有多个井的井基板，所述井室布置在所述平面框架中位于所述第一或第二表面与所述井基板之间，所述井室流体连通所述流体入口和所述流体出口。
在一些实施方案中，所述流体路径能够包括布置在所述平面框架中位于所述第一和第二平面表面之间的预扩增室。
在一些实施方案中，所述井室位于所述预扩增室与所述流体出口之间。
在一些实施方案中，不包括所述预扩增室。
在一些实施方案中，所述预扩增室是包含一种或多种化学品的窄通道。
在一些实施方案中，所述预扩增室能够包括与井室进口流体连通的室出孔。
在一些实施方案中，所述预扩增室出孔通过通路与所述井室进口隔离。
在一些实施方案中，当所述第一平面表面和第二平面表面垂直定向时，所述预扩增室出孔能够定位在所述预扩增室的最上部处。
在一些实施方案中，所述井室进口能够定位在所述井室的最下部处。
在一些实施方案中，所述井室进口能够定位在所述预扩增室下方。
在一些实施方案中，所述通路能够从所述预扩增室出孔斜向下至所述井室进口。
在一些实施方案中，所述流体路径包括弯曲通道。
在一些实施方案中，所述流体路径能够是无阀的。
在一些实施方案中，所述井基板能够具有多个大约100至大约1500个纳米井。
在一些实施方案中，所述井基板包括多个直径为大约50μm至大约500μm的井。
在一些实施方案中，所述井基板能够具有多个每个深度为大约100μm的纳米井。
在一些实施方案中，所述井基板能够具有多个纳米井，其中，所述多个纳米井中的每个井能够具有的深度范围是25μm至1000μm。
在一些实施方案中，所述井基板能够具有多个纳米井，其中，所述多个纳米井中的每个井具有的宽度范围是大约25μm至大约500μm。
在一些实施方案中，所述井基板能够具有多个纳米井，每个井具有的体积是大约8.5nl。
在一些实施方案中，所述多个井中的每个井能够具有的体积范围是大约0.1nL至500nL，
在一些实施方案中，所述平面框架的一部分能够限定用于容纳疏水物质的油室。
在一些实施方案中，所述油室能够与所述井室流体连通。
在一些实施方案中，所述平面框架能够是从底部延伸出的支架。
在一些实施方案中，所述第一平面表面和第二平面表面能够具有流体地密封所述支架的第一和第二膜。
在一些实施方案中，所述平面框架能够经由所述流体界面流体地连接至样本容器。
在一些实施方案中，所述井基板能够由镍材料构成。
在一些实施方案中，所述多个井能够包含用于扩增和/或检测特定靶标的至少一种核酸引物和/或探针。
在一些实施方案中，所述多个井能够包含用于检测特定靶标的分子，例如抗体或者核酸。
本发明的一些实施方案涉及用于提供样本流体至蜂窝管的流体界面的方法。所述蜂窝管能够具有限定了第一平面表面与第二平面表面之间的流体路径的平面框架，每个表面能够用薄的柔性膜密封。所述流体路径的井室能够填充有样本流体，样本流体包含待分析的样本材料并且可还包含用于实施测定的一种或多种化学品，使得井室中的多个井填充有所述样本流体。然后，所述样本流体能够被从所述井室排出，使得所述多个井仍然至少局部填充有所述样本流体。
在一些实施方案中，预扩增室存在于流体路径中位于所述井室之前，并且所述反应流体在填充所述井室之前在预扩增室中经历扩增步骤。
在一些实施方案中，所述预扩增室能够包括所述预扩增室的最上出孔，并且所述预扩增室能够填充至低于所述预扩增室的所述最上出孔的水平。
在一些实施方案中，从所述井室排出所述疏水物质。在一些实施方案中，在排出所述疏水物质之后将所述井室随后填充有水性流体。
在一些实施方案中，将加热和/或冷却循环施加至所述第一平面表面和第二平面表面。
在一些实施方案中，将加热和/或冷却循环施加至所述第一平面表面或者第二平面表面。
本发明的一些实施方案涉及在蜂窝管中实施多路扩增反应。
在一些实施方案中，所述样本流体沿着呈弯曲样式的所述流体路径行进。
在一些实施方案中，所述多路反应涉及巢式PCR。
在一些实施方案中，使用荧光指示剂监视所述多路反应以指示存在扩增子。
在一些实施方案中，使用熔点曲线分析检测存在扩增子。
在一些实施方案中，所述多路反应检测存在或者不存在至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，多路反应中使用的所述样本材料是体液或者从体液衍生的。
在一些实施方案中，所述样本材料是组织样本或者从组织样本衍生的。
在一些实施方案中，反应检测存在或者不存在蛋白质靶标。
在一些实施方案中，反应检测存在或者不存在核酸。
在一些实施方案中，所述核酸是DNA。
在一些实施方案中，所述核酸是mRNA。
在一些实施方案中，所述核酸是微RNA。
附图说明
图1A、1B和1C分别示出了根据本发明的一些实施方案的蜂窝管的立体图、右侧视图以及左侧视图。
图1D和1E分别是根据本发明的一些实施方案的蜂窝管的右侧视图。
图2A-2H示出了根据本发明的一些实施方案的蜂窝管的一部分的截面以示出井基板120的各种实施方案。
图3A示出了根据本发明的一些实施方案的用于向井基板120提供引物材料的方法的立体图。
图4A-4E示出了根据本发明的一些实施方案的用于用样本流体填充井基板的各种方法。
图5A-5F示出了各种传感器组件相对于根据本发明的一些实施方案的蜂窝管的位置。
图6示出了流体控制及处理系统，用于向根据本发明的一些实施方案的蜂窝管提供样本流体。
图7-13示出了根据实施例1用于执行多路PCR SNP分析的实例的步骤。
具体实施方式
I.示例性蜂窝管构造
如本文使用的，术语“蜂窝”描述了设定在固体基板表面的预定位置处的多个井。在一些实施方案中，本发明的蜂窝管包含至少100或者200个井。在一些实施方案中，蜂窝管能够包含大约100至300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500或更多个井之间任何数量的井。井能够是任何形状，它们的位置虽然预定，但是能够以任何形式或图案布置于基板上。如本文使用的，术语“蜂窝管”能够与“井室”、“多井反应室”或者“多井反应管”互换使用。
图1A、1B和1C分别示出了蜂窝管100的立体图、右侧视图以及左侧视图。蜂窝管100(可与多井反应室互换使用)包括平面框架102，平面框架102在一些实施方案中是由通常PCR相容的聚合物(例如，聚丙烯/丙烯酸基板)或者金属材料形成的桁架状结构。平面框架102能够形成为开口桁架或者支架，在开口侧由第一平面基板104和第二平面基板106限定。
第一平面基板104和第二平面基板106能够由粘附或者以其他方式结合至平面框架102的相对薄的聚合物膜形成。在一些实施方案中，第一平面基板104和第二平面基板106之一的所有或者部分能够与平面框架102一体地形成(例如，通过3D打印、模制、共模制或者机加工基板之一与平面框架102)。在一些实施方案中，第一平面基板104和第二平面基板106由本文将描述的透明材料制成。第一平面基板104和第二平面基板106的每个包括面向内部的表面以及面向外部的表面。这些面向内部的表面与平面框架102的内部腔室形成了流体通道。
平面框架102的一个部分形成了流体界面108。流体界面108是平面框架102的大部分悬臂的结构构件。流体界面108能够与平面框架102一体地形成。流体界面108还用作与盒设备的机械联接，本文它处将描述。流体界面108包括流体入口110以及流体出口112，它们提供了与盒设备或者样本容器的流体界面。流体入口110以及流体出口112中的每个流体地联接至流体路径114，流体路径114形成在平面框架102中，位于第一平面基板104与第二平面基板106之间。应该理解的是，使用术语“入口”以及“出口”并不限制流体入口110以及流体出口112的功能。因而，流体能够从它们二者或它们之一引入及排出。在一些实施方案中，流体路径114是无阀的，因而压力的外部增加或者减小能够经由流体入口110以及流体出口112通过外部系统施加以移动流体路径114内的流体，流体路径114从流体入口(110)延伸至流体出口(112)。流体路径114的截面能够是圆形或者矩形，并且能够具有的直径或者宽度范围为大约50μm至大约2mm。典型地，直径或者宽度范围是大约250μm至大约1mm。
流体路径114包括流体地连接至井室118的预扩增室116。井室118容纳井基板120(本文还称为蜂窝)，井基板120具有多个井(本文还称为纳米井)。井基板120能够由金属(例如，金、铂、或者镍合金)、陶瓷、玻璃或者其他PCR相容的聚合物材料或者复合材料制成。井基板120包括多个井。在一些实施方案中，井基板120能够包括100-1000个井或更多。井能够作为盲孔或者通孔形成在井基板120中。井能够通过以下创建在井基板120内，例如，通过激光钻孔(例如，准分子激光器或固态激光器)、超声波压印、热压印光刻、电铸镍模具、喷射模制以及喷射压缩模制。在一些实施方案中，井基板120粘附或者共模制至平面框架102中，在一些实施方案中，井基板120是平面框架102的模制特征。在一些实施方案中，单个井体积的范围能够是0.1至1500nL，典型地是0.5至200nL，优选是0.5至50nL。例如，在一些实施方案中，每个井能够具有的体积是大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、15、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或者500nL。井尺寸能够具有任何形状，例如，圆形、椭圆形、正方形、矩形、空穴形、六边形、八边形、锥形以及本领域技术人员公知的其它形状。此外，井形状可以具有沿着轴线变化的截面积。例如，正方形孔可以从第一尺寸缩窄至是第一尺寸一部分的第二尺寸。在一些实施方案中，井尺寸能够是方形的，即直径以及深度大约相等。在一些实施方案中，井直径以及深度是不相等的。在一些实施方案中，限定井的壁是不平行的。在一些实施方案中，限定井的壁会聚于一点。井尺寸能够由井基板120的总体积容量推出。在一些实施方案中，井深度的范围能够是25μm至1000μm。在一些实施方案中，例如，井能够具有的深度是25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或者1000μm。在一些实施方案中，井直径的范围能够是大约25μm至大约500μm。在一些实施方案中，例如，井能够具有的宽度是25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或者500μm。
Figure BDA0002604665460000071
表I-示例性井基板尺寸(米制)
井基板120的一部分和/或第一平面基板104和/或第二平面基板106的内部能够修饰以促使或阻止流体粘附。例如，限定了井的表面能够涂覆有亲水性材料(或者修饰为亲水性的)，因而促使流体停留。此外，平面表面(围绕限定了井的内表面)能够涂覆有疏水材料(或者修饰为疏水的)，因而阻止流体停留在其上。能够执行其他表面处理，使得流体优选容纳在井内而不是在上表面上，以便促使流出多余流体。
井基板120的井能够图案化为具有成对准的行和列的简单几何学图案，或者对角地或六边形地布置的图案。在一些实施方案中，井基板120的井能够图案化为具有复杂的几何学图案，诸如无序图案或者等几何设计图案，如Schillinger等人2012年1月22日的“应用机械工程中的计算机方法”中描述的。井能够在几何上彼此隔离和/或特征为大的深宽比，以助于防止在填充过程期间试剂的交叉污染。在一些实施方案中，能够使用本文公开的方法和本领域技术人员公知的方法来防止试剂交叉污染。
如图1A所示，井基板120的一部分能够连接至第二平面基板106，使得在井基板120的前部分与第一平面基板104之间形成间隙(以便允许流体通过)。当存在预扩增室116时，其包括预扩增室出孔122，预扩增室出孔122位于预扩增室116的最上部处(处于图示的方位)。井室进口124位于井室118的最下部处。向下倾斜的中间通路126分隔开预扩增室出孔122和井室进口124。最低入口通路128以及最上出口通路130构成了流体路径114的剩余部分。
在一些实施方案中，平面框架102包括一个或多个(即，至少一个)辅助室132，辅助室132能够用于将处理流体(诸如油或者其他化学溶液)提供至预扩增室116、井室118和/或流体路径114的任何其他部分。这种辅助室132能够经由一个或多个膜、阀和/或压力切断基板(即当从辅助室或流体路径114的相邻部件内的流体受到预定量压力时断裂的材料)(诸如金属箔或者薄膜)流体地连接至流体路径114的一部分。
在一些实施方案中，流体路径114能够包括如图1D所示的蜿蜒部分(torturousportion)。入口通路128和井室118之间的蜿蜒路径能够有助于控制以及操纵流体处理。已经发现的是，蜿蜒路径能够有助于减少气泡的形成，气泡会干扰油流过流体路径。图1D示出的蜂窝管100'在很大程度上与图1A-1C示出的蜂窝管100相同，但是，中间通路126'包括以弯曲样式连接的多个细长通道部分。此处，示出了三个细长通道部分，但是，能够使用更多或更少的部分。通常，使用至少2个通道部分，在一些实施方案中，使用2-10个细长通道部分。
在一些实施方案中，流体路径114包括延伸的蜿蜒部分，如图1E所示。此处示出的蜂窝管100”在很大程度上与图1A-1C示出的蜂窝管100相同，但是，中间通路126”延伸通过蜂窝管100”的结构的大部分。以这种方式，中间通路126'的细长通道部分能够制造得相对宽以类似能够进行扩增的细长室。此处，示出了四个细长通道部分，但是，能够使用更多或更少的部分。通常，使用至少2个通道部分，在一些实施方案中，使用2-10个细长通道部分。限定细长通道之间的中间通路126'的锐角内部曲线是球状的，以降低细长通道之间的截面积。拐角周围的降低的截面积有助于降低该曲线的外径处的流体与该曲线的内径处的流体之间的流量差。如果这种流量差太大，则会导致引起形成泡的不想要的气穴。此处，转弯处的宽度是细长通道部分的宽度的约50％。在一些实施方案中，转弯处的宽度的范围是细长通道部分的宽度的10-90％。在一些实施方案中，各转弯处的宽度相对于彼此变化。
如上述，图1E示出的通道几何形状能够有利于控制以及操纵流体处理。虽然未示出预扩增室，但是取决于蜂窝管100”的具体应用，可以包括一个或多个预扩增室。应该理解的是，在所示的几何形状的情况下，如果样本包括非常少的靶标拷贝(即1个或者2个)，那么在扩增之后，被扩增的靶标可能不会混合以及均匀分布，这是因为弯曲通道的线性性质。因而，需要将流体移回盒(洗涤管或者单独的室)以在填充井室的井之前混合以及均匀地分布扩增子。
图2A-2G示出了蜂窝管的一部分的截面以示出井基板120的各种实施方案。
图2A示出了一实施方案，其中井基板120的井是经由制造在平面框架102中的盲孔构成的。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102一体地形成，使得它们基本上是一个材料件。引物/探针材料134示出为放置在井基板120的每个井中。
图2B示出了一实施方案，其中井基板120的井是经由制造在基板(诸如聚合物膜)中的通孔构成的，该基板结合至平面框架102上。例如，单独的基板能够被钻孔以形成具有通孔的井基板，随后粘附或者焊接至平面框架102上。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102一体地形成，使得它们基本上是一个材料件。在一些实施方案中，盲孔能够形成在第二平面基板106内，第二平面基板106能够结合至平面框架102上。
图2C示出了一实施方案，其中井基板120的井是经由形成在平面框架102的一部分内的通孔构成的。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102是一体的，井基板120是单独的部件，该部件粘附或者焊接至平面框架102内的凹陷中。
图2D示出了一实施方案，其中井基板120的井是经由形成在平面框架102的一部分内的通孔构成的，如图2C所示。但是，在该实施方案中，气体可透膜136位于平面框架102和第二平面基板106之间。膜136使得气体能够通过该膜从井排出，但是不允许流体通过。该气体可透膜能够通过气体可透粘着剂粘附至井基板。在一些实施方案中，膜136由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，并且具有的厚度范围为20-1000μm，在一些实施方案中具有的厚度范围为100-200μm。
图2E示出了一实施方案，其中井基板120的井是经由形成在平面框架102的一部分内的盲孔构成的。在该实施方案中，第二平面基板106与平面框架102是一体的，井基板120是单独的部件，该部件粘附或者焊接至平面框架102内的凹陷中。
井基板120的所有或者一部分能够包含传导性金属部分(例如，金)以使热能够从金属传递至井。例如，井基板120的放置成抵靠第二平面基板106的部分能够是金属板或者涂层。在一些实施方案中，井的内表面能够涂覆有金属以实现热传递。
图2F示出了一实施方案，其构建成类似图2D的实施方案。但是，此处，井基板定位在第一和第二基板之间的中点。气体可透膜136能够通过气体可透粘着剂粘附至井基板。如图2D示出的实施方案，空气能够在液体填充期间通过气体可透膜到达井的后面。在PCR缓冲液填充了井以及再水合井中的干燥引物组之后，隔离油或者导热液体能够填充井基板120的两侧以防止交叉串扰。
图2H示出了一实施方案，其构建成类似图2F的实施方案。但是，此处，不包括膜。因而，处理流体能够暴露于井基板120的两侧。在PCR缓冲液填充了井以及再水合井中的干引物组之后，隔离油或者导热液体能够填充井基板120的两侧以防止交叉串扰。
图2H示出了井基板120的实施方案，能够与本文公开的例如图2A-2F所示的图示任何实施方案一起使用。此处，井基板120的井121定形为从较大直径缩窄至较小直径，类似于锥体。已经发现的是，锥形井在引物应用期间提供了优势，因为井的倾斜壁使得能使用非接触沉积方法(例如，喷墨)用于沉积包含引物材料的液体试剂。此外，锥形井使得更容易应用液体试剂以用于液体试剂应用的接触方法以及非接触方法，因为锥形形状辅助于干燥。还已经发现的是，锥形井有助于当存在气体可透膜136时防止泡及泄漏。
图3A示出了用于向井基板120提供引物材料的方法。如示出的，商用打印针能够用以向井填充液体引物，液体引物能够在井中被干燥，或者填充了液体的井能够在填充之后被密封。在一些实施方案中，在井基板120被提供有液体形式的引物之后，引物材料能够被干燥，使得仅引物残余仍粘附在每个井上用于随后的液化。这种针(以及关联系统)的实例包括来自位于美国CA94089森尼韦尔市524东威德尔驱动的ArrayIt公司的946MP(x)系列针。还能够使用Hasan等人的美国公开申请号2009/0054266公开的方法，以及Hess等人的美国专利6,716,629公开的方法来提供引物材料。在应用处理期间，打印针能够构造为接触井基板120。在一些实施方案中，非接触处理能够用来提供液体试剂(例如引物)至井，从而导致干燥的试剂位于限定井的一个或多个壁上，例如滴方法(诸如喷墨打印)或者本领域技术人员公知的其他合适非接触处理。
II.样本加载于蜂窝管
图4A和图4B示出了用样本流体填充井基板120的方法。在图4A中，样本流体前进(例如，经由压力)到井基板120和第一平面基板104之间。随着流体通过井基板120之上，每个井变得填充有流体，流体主要经由表面张力保持在井内。如上述的，井基板120的一部分(诸如限定了井的壁)能够涂覆有亲水性物质或者被处理以变得相对更亲水性的，因而随着样本流体流过而促使井的完整且均匀的填充。此外，井基板120的其他表面(诸如围绕井表面的顶表面)能够涂覆有疏水物质或者被处理以变得相对更疏水，使得流体样本仅保持在井中而不会位于相邻表面上，从而降低了不一致的测试结果。此外，第一平面基板120的内表面能够被涂覆或者处理以用于疏水效应。在图4B中，可见的是，在样本流体后退之后仅填充井。在一些实施方案中，流体样本能够如图4B'所示前进，之后是一串空气，因而无需像图4B所示的示例性实施方案那样抽出样本。填充方法(诸如“不连续湿润”)还能够使用Jackman等人的《分析化学》(1998年，70，2280-2287)公开的方法，以及Hatch等人的《用于数字生物学的多层高密度3D纳米井阵列》(化学和生活科学的小型化系统第15次会议，2011年10月2日至6日，第269-271页)公开的方法。通常，井基板120应该尽可能快地去湿以避免井内的不同引物的交叉污染。
图4C和图4D示出了用样本流体填充井基板120的另一方法。在图4C中，根据图4A和图4B所示的技术的组合来填充井基板120。但是，样本流体之后有一袋油。虽然图4C中的油示出为直接接触样本流体，但是空气间隙能够设置在油盖和样本流体之间。
如图4D所示，在每个井填充有样本流体之后，油能够“盖住”每个井，这能够辅助于当井基板120受到热循环时降低蒸发。在一些实施方案中，在已经填充井之后，油能够从室的顶部引入并且从图4D'所示的室进口124抽出。在图4D和图4D'所示的实施方案中，在井已经用油盖住之后，水性溶液能够填充室118以改善传热性。在一些实施方案中，静止的水性溶液能够在室118内被加压以停止流体以及任何泡的移动。
在一些实施方案中，在已经填充井之后，在热循环期间，油能够在室内保持静止，如图4D”所示。在一些实施方案中，静止的油能够在室118内被加压以停止流体以及任何泡的移动。
油(诸如矿物质油)能够用来隔离每个井以及提供传热性。但是，本发明的实施方案并不限于"油"。能够使用任何导热液体，诸如氟化液体(例如，3M FC-40)。因此，该公开中提到的“油”应该理解为包括这些替换物。
在一些实施方案中，在如图4C所示井已经填充样本流体之后，油能够跟随样本流体以盖住井以及维持在井室118内。如实施例3中描述的以及如图4E所示执行详述该实施方案的实验。
图5A和图5B示出了示例性传感器组件，其定位成用于检测井基板120处的反应。在一些实施方案中，传感器组件A定位成直接邻近或者抵靠第一平面基板104。在一些实施方案中，第二传感器组件B定位成直接邻近或者抵靠第二平面基板106。每个传感器组件能够包括用于PCR测试的激发设备和/或检测设备。在一些实施方案中，传感器是用于激发以及检测荧光的光学传感器。
图5C示出了示例性传感器组件构造，其能够用以代替图5A和图5B的构造，或者与图5A和图5B的构造组合使用。此处，传感器组件A定位成沿着蜂窝管100的前边缘。在一些实施方案中，包括第二传感器组件B。在一些实施方案中，图5A和图5B的传感器组件A以及B中的一个或者所有与图5C的一个或者所有传感器组件组合使用。
图5D示出了示例性传感器组件构造。在一些实施方案中，该传感器组件构造能够结合图5A-5C所示的构造一起使用。传感器组件包括联接至纤维光学面板(FOFP)的CCD/CMOS检测器。过滤器堆放在FOFP顶部并且放置成抵靠或者邻近目标，此处目标是井基板120。在一些实施方案中，过滤器能够直接堆放(结合)在CCD的顶部，FOFP放置在顶部，如图5E所示。
图5F示出了另一示例性传感器组件构造。在一些实施方案中，该构造能够结合图5A-5C所示的一个或多个构造一起使用。此处，CCD/CMOS检测器联接至双透镜构造，过滤器放置在它们之间。在一些实施方案中，过滤器能够结合至CCD/CMOS检测器。
III.使用方法
在一些实施方案中，将样本流体引入流体入口110并且通过入口通路128。然后能够用样本流体填充预扩增室116。预扩增室116能够包括一种或多种化学品以引起期望的化学反应，从而扩增其中的流体。在一些实施方案中，流体能够维持在预扩增室116内，直到但是不通过预扩增室出孔122，直到发生期望的反应。然后，流体通过预扩增室出孔122到达向下倾斜的中间通路126。然后，流体通过井室进口124并且填充井室118。在一些实施方案中，在扩增预扩增室中的流体之后，流体从预扩增室通过流体入口被抽出进入流体处理盒中的单独室以用于混合，然后通过流体入口返回以通过预扩增室进入井室。然后例如根据图4A-4D”所示的方法能够填充井基板120的井。一旦井基板120的井被填充，流体能够从井室118排出，通过出口通路130或者返回入口通路128。在一些实施方案中，油(诸如矿物质油)能够涂覆经填充的井以在热循环期间防止蒸发。在一些实施方案中，将范围为5至20psi的压力施加至井室118。因而，PCR缓冲液以及任何导热液体(油)处于压缩之下以保持PCR液体及在干燥的引物再水合期间可能产生的任何小泡。压力的该应用能够引起任何生成的泡的固定，使得不会发生因泡和液体移动而产生的光学干涉。在一些实施方案中，水合流体(诸如蒸馏水)能够在预扩增室116或者一个辅助室132内加热，使得井室118具有100％湿度或者足够的湿度，以防止热循环期间过渡蒸发。在填充完成之后，能够通过外部设备加热井基板120，该外部设备热接触蜂窝管100以执行用于PCR的热循环。在一些实施方案中，能够采用非接触加热方法，诸如RFID、居里点、感应或者微波加热。这些和其他非接触加热方法是本领域技术人员公知的，能够容易应用于本文公开的蜂窝管。在热循环期间，能够经由图5A-5E描述的传感器布置监控蜂窝管的化学反应。
使用蜂窝管100能够执行各种生物学测定，典型的目的是指示至少一个目的分析物存在于测试样本中。这些测定包括但不限于，基于预先选择的一对分子(例如抗体-抗原结合对，或具有足够互补性的两个多核苷酸序列)之间的特异性结合亲和力的结合测定；依靠某些预定核苷酸序列为基础的标准的核酸扩增反应；以及指示预定义的活性分子(如酶)存在的化学反应。
在一些实施方案中，以预定布置沉积在蜂窝管中的分析剂或者探针(例如“饵”蛋白质或者核酸)直接固定在固体基板的表面上，对该基板表面进行最小结构改变或修饰。换句话说，分析剂或者探针基本“点样”在表面上，并且布置以及约束在2维空间内。在一些实施方案中，基板能够制造成形成多个井布置或者形成具有确定尺寸的凹进以收纳分析剂或者探针，分析剂或者探针能够在测定时间持续期间内永久地固定在井内或者凹进内，或者暂时约束在井内或者凹进。换句话说，分析探针将被约束在3维空间内。
适于用作蜂窝管的分析探针的材料包括选择的蛋白质(例如，全长蛋白质，例如抗体，蛋白质片段，或短肽)，核酸(例如，DNA，RNA，微RNA)，碳水化合物，脂质，组织，细胞，或几乎任何及所有化学性质的分子。换句话说，在本发明的蜂窝测定管中可以使用公知用于使微阵列用于多路实验的任何材料/分子。
IV.检测目的分析物
本发明的一个方面涉及(使用图5A-5E的传感器构造)监控光学信号，该光学信号指示测试样本中存在至少一个目的分析物，目的分析物例如是靶标蛋白(例如，特定抗原性的抗体)、靶标细胞、靶标基因、基因的靶标序列、靶标mRNA转录本、或靶标核酸。这种靶标分析物可以是任何来源：病毒、细菌、真菌、寄生虫(例如，来自原生动物)、动物或人类来源。例如，病毒蛋白质、针对病毒抗原的抗体、或者从细菌或病毒基因组得到的DNA/RNA序列可以是测试样品中用于检测的目的分析物。示例性的非限制性靶标分析物可以包括核酸序列(诸如微RNA)；哺乳动物基因；哺乳动物基因的遗传变异体，如在致癌基因、肿瘤抑制基因或已经暗示为与某些疾病和病症相关的任何其他基因内发生的各种遗传突变、等位基因变异、或者表观遗传变异(在甲基化状态下表现出不同的轮廓)，它们可以是本发明的蜂窝测试管应用中检测的焦点。基因和/或蛋白质可作为目的靶标的示例性病毒可以包括但不限于：人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、人巨细胞病毒(CMV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、肠道病毒、水痘带状疱疹病毒；黄病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、诺如病毒、正粘病毒、细小病毒、乳多空病毒、副粘病毒、瘟病毒、细小核糖核酸病毒和流感。基因和/或蛋白质可作为检测靶标的典型细菌是：结核杆菌(TB)、炭疽杆菌、嗜肺军团菌、单核细胞增多性李氏菌、淋球菌、沙眼衣原体、脑膜炎李氏菌、金黄色葡萄球菌(xtaphylococcus aureus)、幽门螺旋杆菌、粪肠球菌。潜在目的的典型人类基因是P53、BRCA1和BRCA2、HER2/Neu和其他EGFR族成员、BCR-ABL、PTEN、RAS、RAF、Src、RB、Myc、VEGF、拓扑异构酶和APOEε4等位基因。
检测和/或定量各种目的分析物的基本技术可以见于：例如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第三版2001)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual(1990)；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(1994)；以及Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)。
为了检测存在任何特定同一性的蛋白质的目的，人们能够采用各种基于结合亲和力的测定，诸如免疫学测定。在一些实施方案中，通过用抗体(其固定至呈蜂窝形式的预定点，或者约束在蜂窝的预定井内)从测试样本捕获靶标蛋白质，能够执行夹心测定形式，该抗体具有对于多肽的特异性结合亲和力。然后能够用附接至可检测标签(诸如荧光生成分子)的第二抗体来指示蛋白质的存在。
为了检测存在目的核酸的目的，典型地使用探针或者含有多核苷酸序列的分子，它们与靶标核酸序列基本上互补并且能够基于沃森-克里克碱基配对而杂交到靶标序列。再次，探针能够固定或者点样至固体基板的表面上位于预定位置，或者在一些实施方案中，探针能够被约束至井，位于基板上的预定图案内的预定位置。取决于待检测的靶标多核苷酸的性质(例如，是双链还是单链)，检测探针能够是序列基本上相同于靶标序列，或者序列基本上相同于靶标序列的互补序列。换句话说，探针能够特异性结合到靶标核苷酸序列中。在一些情况下，探针能够包含靶标核苷酸的一个结合片段以及非结合片段，只要非结合片段的存在不会妨碍结合片段和靶标核酸之间的特异性结合。典型地，结合片段将具有与靶标多核苷酸序列的任一链互补的至少8个、通常至少10、12、15、20、25、30或甚至更多个连续核苷酸，以确保特异性识别靶标序列。在一些实施方案中，探针可以包括用于易于检测的发光部分，例如荧光分子或发光分子，例如荧光素、若丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、羟基香豆素、氨基香豆素、瀑布蓝、太平洋橙、荧光黄、别藻蓝蛋白、TruRed、FluorX、或镧系。
在一些实施方案中，采用不同的荧光指示剂来指示存在不同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用通用荧光指示剂时，熔点检测方法能够有效的用于检测存在不同的靶标多核苷酸序列。
除了其中直接基于分析物对蜂窝管中提供的分析剂的结合亲和力来进行目的分析物的检测的结合测定形式之外，用于目的核酸的检测和/或定量的基于扩增的测定系统提供了广泛的应用范围。在基于扩增的该系统中，根据完成的序列特异性扩增反应对一种或多种目的核酸进行检测和/或定量。此外，为了通过基于扩增的方法检测靶标核酸的目的，在每个井中可以包括多组引物以允许执行巢式PCR形式的检测，例如，第一组引物可以定义靶标序列的一部分并且产生扩增子，该扩增子允许由一组或多个随后组引物进一步扩增。
在一些实施方案中，目的核酸是DNA分子。序列特异性扩增是这样执行的：在蜂窝形式的每个孔中提供至少一组引物、游离核苷酸和适当DNA或RNA聚合酶，然后使蜂窝管受到适当温度和持续时间以实现任何靶标多核苷酸序列的合成和扩增。
每个引物典型的是寡核苷酸(其可以是天然的或合成的)，当通过碱基配对与多核苷酸模板形成双链时，其能够作为核酸合成的起始点并且从它的3'端沿该模板延伸，从而形成延伸的双链。引物的延伸通常是用核酸聚合酶(诸如DNA或RNA聚合酶)来进行的。在延伸过程中添加的核苷酸的序列是由模板多核苷酸的序列确定的。在大多数实施方案中，引物通过DNA聚合酶延伸。通常情况下，引物具有的长度范围是6至40个核苷酸，通常为约12至约20个核苷酸。引物被采用在各种核酸扩增反应中，例如，使用单个引物的线性扩增反应或采用两个或更多引物的聚合酶链式反应(PCR)。用于选择对于特定应用的引物长度和序列的准则是本领域技术人员公知的，例如，见Dieffenbach作为编辑的《PCR引物：实验室手册，第2版》(冷泉港出版社，纽约，2003年)。
在核酸扩增反应(诸如PCR)的上下文中，靶标多核苷酸序列的扩增产物称为“扩增子”。扩增子是源自引物延伸的多核苷酸的群体，通常呈双链多核苷酸的形式。扩增子可以通过多种扩增反应产生，这些反应的产物是一种或多种靶标核酸的多次扩增后的复制品。通常，产生扩增子的扩增反应是在反应物的碱基配对中被模板驱动的：核苷酸和寡核苷酸引物都在模板多核苷酸或靶标多核苷酸序列中具有互补。这种互补性是用于生产反应产物或扩增子所必需的。在某些情况下，模板驱动的反应是通过核酸聚合酶的引物延伸或通过核酸连接酶的寡核苷酸连接。这些反应包括但不限于：聚合酶链反应(PCR)，线性聚合酶反应，连接酶链反应(LCR)，链置换反应(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，滚环扩增等，例如见：Mullis等人的美国专利4,683,195、4,965,188、4,683,202和4,800,159(PCR)；Gelfand等人的美国专利5,210,015(使用Taq Man探针的实时PCR)；Wittwer等人的美国专利6,174,670；Landegren等人的美国专利4,988,617(LCR)。Birkenmeyer等人的美国专利5,427,930(间隙-LCR)；Kacian等人的美国专利5,399,491(NASBA)；Walker的美国专利5,648,211和5,712,124(SDA)；Lizardi的美国专利5,854,033；Aono等人的日本专利申请公开JP4-262799(滚环扩增)；等等。在一些实施方案中，一种或多种靶标核酸的扩增子是通过在本发明的蜂窝管中执行的一轮或多轮的PCR(例如，巢式PCR)产生的。
聚合酶链反应或PCR是通过DNA互补链的多轮同时引物延伸对特定DNA序列进行体外扩增的酶介导反应。换言之，PCR是用于制备引物结合点侧翼的靶标核酸的多个拷贝或复制品的反应，这类反应包括一个或多个以下重复步骤：(i)使靶标核酸变性；(ⅱ)将引物退火到引物结合点；和(iii)在三磷酸核苷存在的情况下用核酸聚合酶延伸引物。该反应通常是在对于变性、退火和延伸这些每个步骤优化的不同温度下循环。特定温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化率取决于本领域技术人员公知的许多因素，例如，见McPherson等人作为编辑的《PCR：实用方法》和《PCR2：实用方法》(IRL出版社，牛津，分别于1991年和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，双链靶标核酸可在>90℃的温度进行变性，引物退火在温度范围50-75℃下进行，并且引物延伸在温度范围72-78℃下进行。
术语“PCR”包括反应的衍生形式，包括但不限于：逆转录(RT)-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR以及其他类似的变形。对于这些不同的PCR测定，典型的反应体积的范围可以从纳升(例如，约0.1至约500nL)至微升(例如约1至约5μl)，并且可以容易地包含在本发明的蜂窝测试管的井内，从而允许快速的多路分析。在一些非限制示例性实施方案中，蜂窝管的每个井内的反应体积是大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6。0.7、0.8、0.9.1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100nL。
逆转录PCR或RT-PCR是用于检测和分析样品中的RNA的特别有用的工具。RT-PCR是之前具有将靶标RNA转换为互补单链DNA的逆转录反应的PCR，然后将互补单链DNA在常规PCR过程中扩增，例如，见Tecott等人的美国专利5,168,038。
实时PCR是这样的PCR过程，在该过程期间，在反应进行的同时监控反应产物(即扩增子)的量。存在许多形式的实时PCR，主要区别在于用于监测该反应产物所使用的检测手段，例如，见Gelfand等人的美国专利5,210,015(TaqMan探针)；Wittwer等人的美国专利6,174,670和6,569,627(嵌入染料)；Tyagi等人的美国专利5,925,517(分子信标)。实时PCR的检测化学物见于Mackay等人的Nucleic Acid Research,30:1292-1305(2002)。
巢式PCR是这样的PCR过程，该过程涉及至少两个阶段的扩增，其中，使用第一组引物的第一阶段PCR的扩增子成为使用第二组引物的第二阶段PCR的模板。第二组引物中的至少一个引物与靶标多核苷酸序列具有序列互补性并且可以在一位置处杂交到靶标多核苷酸序列，该位置位于第一组中的两个引物的杂交位点之间，即在位于第一阶段PCR的扩增子的序列内的位置处。
多重PCR是这样的PCR过程，在该过程中，在相同的反应混合物中同时进行多个潜在靶标多核苷酸序列的扩增，例如，见Bernard等人的Anal.Biochem，273：221-228(1999)(双色实时PCR)。本发明的蜂窝测定形式适合于进行多重PCR。独特引物组包含在预期用于扩增和检测独特靶标多核苷酸序列的井中。典型地，存在很多包含相同引物的重复井，它们作为蜂窝井布置中的复井。例如，在非限制性示例性实施方案中，一个完整的蜂房井布置可以包括不同的预制反应混合物，每个预制反应混合物包含选自总共多达8、16、25、50或甚至100个不同引物组中的独特引物组，为包含独特引物组的每个反应混合物提供8个重复井的集群。
定量PCR是这样的PCR过程，该过程允许人们测量样品中的一种或多种特定靶标序列的丰度。定量PCR能够涉及测量靶标序列的绝对定量和相对定量二者。使用一种或多种参考序列进行定量测量，这些参考序列可与靶标序列单独测定或一起测定。参考序列可以是样品的内源(天然存在的)或外源(人为添加的)，在后一种情况下可以包括一种或多种竞争模板。典型的内源参考序列包括下述基因的转录物的片段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等。定量PCR技术是本领域技术人员公知的，例如，见Freeman等人的Biotechniques，26:112-126(1999)；Becker-Andre等人的Nucleic Acid Research，17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人的Biotechniques，21:268-279(1996)；Diviacco等人的Gene，122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人的Nucleic Acid Research，17:9437-9446(1989)。
扩增反应可以是“实时”扩增，此时存在检测机构，检测机构允许在扩增反应进行的同时测量反应产物，例如上述的实时PCR，或者描述于例如Leone等人的Nucleic AcidResearch，26:2150-2155(1998)的实时NASBA。如本文使用的，“扩增”是指进行扩增反应。“反应混合物”是包含执行反应所有必要的反应物的溶液(或这种溶液的冻干版)，可以包括但并不限于缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。在一些实施方案中，干燥的试剂是在制造过程中沉积在蜂窝管的井中。在一些实施方案中，干燥的试剂包含用于扩增一种或多种靶标多核苷酸序列的至少一组引物、核苷酸三磷酸、酶和/或检测部分，该检测部分指示一种或多种扩增子的存在和/或量。在一些实施方案中，检测部分是荧光指示剂。实时PCR中扩增子的检测或定量通常涉及使用荧光共振能量转移探针或FRET探针，诸如
Figure BDA0002604665460000211
探针、分子信标探针或蝎型探针。
如本文使用的，荧光指示剂是分子(例如，染料或探针)，其在存在扩增反应的产物(即，扩增子)的情况下能够产生荧光信号，使得至少在扩增子浓度的预定范围内，荧光指示剂的信号随着扩增子在反应混合物中积累而增加。
若干类型的荧光指示剂可以用在本发明的蜂窝管中所执行的扩增反应中：第一，可以使用荧光染料。此类合适的染料对于扩增子的多核苷酸序列是非特异性的，例如结合于双链DNA产物的嵌入染料，例如溴化乙锭、SYBR绿I和II、SYBR金、YO(恶唑黄)、TO(噻唑橙)、和PG(PicoGreen)，例如见Ishiguro等人，Anal.Biochem.，229：207-213(1995)；Tseng等人，Anal.Biochem.，245：207-212(1997)；Morrison等人，Biotechniques，24：954-962(1998)。适用于本发明的其它荧光指示剂是本领域的技术人员公知的。
第二，在一些情形下，一种或多种引物能够设计为具有发夹结构，即荧光猝灭剂保持为接近荧光分子，使得荧光被猝灭剂猝灭，直到发夹结构被引物延伸被迫分开，例如见Whitecombe等人，Nature Biotechnology，17：804-807(1999)(AmplifluorTM引物)。合适的荧光分子包括前面部分提到的那些。
第三，荧光指示剂也可以特异于靶标核酸的多核苷酸序列。通常被称为荧光探针，这种类型的指示剂通常包括接近荧光猝灭剂的荧光部分，直到它们所附接的寡核苷酸部分特异性地结合至扩增产物，例如，见Gelfand等人的美国专利5,210,015(TaqMan探针)；Nazarenko等人的Nucleic Acids Research，25：2516-2521(1997)(蝎型探针)；Tyagi等人的Nature Biotechnology，16：49-53(1998)(分子信标)。荧光指示剂可以与实时PCR结合使用，或者它们可被用于测量反应完成时反应产物的总量。对于观察各种分子信标和其它发夹探针，可见Broude的《诊断基因组学和蛋白质组学之百科全书》，2005年，第846-851页。
典型地，对于本发明的蜂窝管中所执行的每个反应，不管其性质是基于结合亲和力还是基于扩增，都将存在至少一个正对照和至少一个负对照，使得这些对照将确认成功的反应：检测到的任何正信号不是由于系统范围的污染，检测到的任何负信号不是由于测定系统的失败。在一些实施方案中，能够包括内标物。内标物是参与相同反应的已知分子(例如，在与靶标多核苷酸相同的扩增反应中被扩增的核酸序列)，从而允许对分析样本中的靶标分析物进行定量(无论是相对定量还是绝对定量)。内标物可以是内源性的，即已知其预先存在于样品中；或是外源性的，即在测试之前添加在样本中。
V.设计适应反应条件的分析剂
因为本发明的蜂窝管中执行的多路测定通常是大约在相同时间在大约相同的条件下进行的，所以必须仔细设计位于蜂窝管的各点上或每个井内的分析剂，以便在一组预定反应参数下实现最优或接近最优的反应结果。在一个实例中，8个不同的多核苷酸探针被点样或固定在基板表面上，用于依靠基于序列互补性的杂交来检测样本中的8个不同靶标核酸。本领域技术人员可很好地设计和优化每个靶标探针序列以落入用于特定测定的预定反应参数内。在设计和优化探针时，非限制性的参数包括探针长度、靶标序列内的相对位置、和GC含量，这些将导致在对于特定测定的给定反应条件下探针和其靶标之间的特异性杂交。
在另一实例中，预期用于扩增8个不同靶标多核苷酸序列的8组不同反应混合物被布置成4膜片形式，每个膜片包含用于每个反应混合物的8个重复点。这些8组不同反应混合物中的每组包括用于扩增不同靶标序列的至少一组寡核苷酸引物。这8组引物能够设计为使得变性、退火和延伸步骤对于8个不同靶标序列在相同温度下并且在同一时间帧期间都可以充分地完成。
本领域技术人员将能够通过调整探针或引物的长度、GC-含量来完成必要的设计。在某些情况下，用修饰的或人工的核苷酸替代天然存在的核苷酸有效地进一步微调探针和引物的退火/变性行为。例如，见Leconte等人的J Am Chem Soc.2008：130(7):2336-2343；美国专利8,268,978。一些已知类似物包括：1-甲基腺嘌呤、1-甲基腺苷、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2-硫胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、2-硫尿嘧啶、2,2-二甲基鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-甲硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N-尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、氧基丁氧苷(oxybutoxosine)、假异胞嘧啶、假尿嘧啶、假尿嘧啶、Q核苷、尿嘧啶-5-乙醇酸、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸等。许多核苷酸类似物通过诸如Sigma和应用生物系统公司(Applied Biosystems)等的供应商是商业上可获得的。
图6示出了流体控制及处理盒10，其包括壳体12，壳体12具有多个室13。位于内部的流体控制设备(未示出)和蜂窝管100与壳体12的不同部分连接。盒10通过流体地联接流体界面108向蜂窝管提供样本流体以及其他所需流体。典型地，包括蜂窝管的该盒使用在美国加州桑尼维尔的
Figure BDA0002604665460000231
的
Figure BDA0002604665460000232
系统中。在一些实施方案中，包括蜂窝管的该盒使用在非均相系统的一种或多种模块中，如美国专利申请序列号61/639820公开的，该申请通过引用并入本文并且作为附件A的一部分。系统10的其他细节以及使用方法描述于美国专利8,048,386、8,187,557和8,119,352以及美国专利公开2008-0038737，它们均通过引用并入本文，并且作为附件A。
VI.实施例
这些实施例是通过举例说明的方式提供，而不是作为限制的方式。本领域技术人员将容易认识到非关键参数的变化，这些参数可以改变或修改以产生基本上相同或相似的结果。
实施例1：分析K-Ras SNP的第12和13密码子
在该单核苷酸多态性分析中，使用GeneXpert盒反应管建立“8探针、8复制、4膜片”的形式。具体而言，整个探针布置由位于固体基板的表面上的8×8预定点的4膜片组成，其是包围反应管的框架一侧的薄膜。在每个贴片中，具有不同核苷酸序列的8个寡核苷酸探针中的每个被沉积(管中共256个点，每点直径为100μm，点密度为50μM，点体积为0.5nL)并固定到8个预选定点的集群，从而产生用于每个不同探针的8个重复点。
8个寡核苷酸探针中的每个的核苷酸序列设计为，使得其将仅与K-Ras序列的一个版本杂交。在这个特定的研究中，1个探针设计为与第12和13密码子周围的野生型(WT)K-Ras序列杂交；1个探针与12Val突变体杂交；1个探针与12Asp突变体杂交；1个探针与12Arg突变体杂交；1个探针与12Cys突变体杂交；1个探针与12Ser突变体杂交；1个探针与12Ala突变体杂交；并且1个探针与13Asp突变体杂交。基板表面上的8探针布置示于图7，表1提供了探针序列。表2提供了探针的熔点温度。
表1：KRAS探针序列
Figure BDA0002604665460000241
Figure BDA0002604665460000251
表格2：KRAS探针Tm(Visual Omp)
Figure BDA0002604665460000252
为了将探针固定至基板表面上，首先用羟基化处理来清洁该表面，使得在约60°的接触角时该表面能量不小于38达因/厘米，并且表面反应性和湿润性为后续官能化而改善。
官能化处理涉及使用缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷作为前体向基板表面引入缩水甘油基(环氧)基团。在点样过程中，在官能团和寡核苷酸探针的3'端之间建立共价键。
在薄膜基板的官能化以及探针进行点样之后，通过将第二薄膜放置在框架的与官能化的固体基板相反的一侧来密封包含点样的探针阵列的反应管。图7示出了包含8探针形式的密封的反应管，该管然后填充有液体样本，从而完全浸没基板表面上的所有点。通过非对称的TaqMan扩增反应开始对样本中存在的K-Ras序列的密码子12/13SNP的分析，该扩增反应涉及CF4标记的正向引物以及未标记的反向引物，这些引物将与K-Ras序列杂交以跨越该SNP区域。反应混合物中还包含：(1)TaqMan探针，其用CF5标记，并且包括与正向引物和反向引物之间的K-Ras序列的一个片段对应的序列，目的是指示PCR的进展；以及(2)未标记的BlockMelt探针，目的是抑制野生型扩增子。
在这个具体研究中，对于PCR处理和随后的杂交处理，对反应室一侧提供了加热/冷却。正向引物(5'CF4)使用的浓度为1000nM。反向引物使用的浓度为100nM。TaqMan探针(5'CF5)使用的浓度为50nM。未标记的±K-Ras WT阻断探针使用的浓度为100nM。在60周期的PCR之后，将反应室的温度设定在大约54℃达1-2小时，用于探针和扩增子在PCR洗脱缓冲液(pH8的Tris缓冲液)中杂交。然后用洗涤缓冲液(Tube Wash ArrarIt“洗涤缓冲液2”)洗涤反应室至少一次、至多5次以除去非特异性残余CF4信号。
分析三种不同的样品：K-Ras WT细胞系(纯合正常)，K-Ras CCL细胞(杂合)以及阻断的K-Ras CCL细胞(纯合突变体)。图8示出了在60周期的PCR期间的荧光信号曲线。图9A-9C示出了来自WT、杂合13Asp突变体和纯合13Asp突变体细胞样本的预测结果。图10A-10C示出了样品的实际结果。图11示出了整个探针点样图案的全局视图。图12示出了激发之后整个探针点样图案在集成显微镜下的全局视图。
实施例2：试剂加载在干井中
该研究中使用的蜂窝管100是通过喷射模制产生的。该部件在PCR区域中模制有一个支撑井的基板120。通过193nm的准分子激光钻孔产生了纳米井。该研究中使用的纳米井的尺寸是直径150μm、深度约150μm、间距250μm。这些井是盲孔并且能够容纳高达2.6nL。
如图3A所示，然后使用
Figure BDA0002604665460000261
的
Figure BDA0002604665460000262
用微点样针(模型号#946MP3，针的末端的直径为100μm)印刷绿色食品染料。针的每滴具有的体积是0.7nL。
Figure BDA0002604665460000263
是
Figure BDA0002604665460000264
的商用微阵列打印机，可编程用于不同的间距，并且当使用946MP3时能够输送多路0.7nL量的液体。存在可选的针选择。最小的微点样针能够每滴仅输送0.35nL。在实际情况下，绿色食品染料将是引物组，或者引物组和用于PCR过程的酶。各纳米井中的每个能够具有用于在PCR过程期间待扩增的特定核酸靶标的不同引物组。在点样之后，能够进行冷冻干燥或冻干处理以用于存储。
实施例3：用于样本填充以及密封的非连续除湿
该实施例(以及实施例4)中使用的蜂窝管100是由聚丙烯构成的。蜂窝管100在PCR区域中模制有一个支撑井的基板120。通过193nm波长的准分子激光产生了多个纳米井。该实施例中使用的纳米井的尺寸是直径150μm、深度约250μm、间距250μm。这些井是通孔并且能够容纳高达4.4纳升。然后，蜂窝管100在该管的两侧用聚丙烯膜密封。不是密封每个单独的井，而是密封用于PCR的整个菱形区域(25μL区域)。将蜂窝管100联接至盒10，如图6所示。
因为聚丙烯的疏水性，所以PCR缓冲液(50mMTris，PH8.6)首先与表面活性剂(0.1％Tween)混合以增强聚丙烯表面的湿润。少量黄色食品染料滴到PCR缓冲液中以增强可视化。然后将该PCR缓冲液添加至图6示出的盒10中的一个室13中。将矿物质油(CAS#8042-47-5)添加至另一室。使用
Figure BDA0002604665460000272
的商用
Figure BDA0002604665460000273
系统控制盒10以驱动液体填充蜂窝管100。
Figure BDA0002604665460000271
系统被编程为以1μL/s的速度输送PCR缓冲液通过流体通道进入井室118。PCR缓冲液填充井室118中的每个纳米井，一些多余的PCR缓冲液经由顶部的流体通道流出。在蜂窝管100的PCR室被填充之后，然后使管100中的PCR缓冲液以5μL/s的速度从井室的底部流出至流体通道。缓冲液从顶部的流体通道返回至入口通路128(流体通道的最底部)。在流出之后，PCR缓冲液经由毛细管力保持在每个各纳米井中。尽管有流出程序，但是每个纳米井中的PCR缓冲液并未流走。在PCR缓冲液经由入口通路128完全流出之后，将矿物质油以1μL/s引入井室118。用矿物质油填充密封膜和具有纳米井的聚丙烯基板之间的间隙，如图4E所示。
实施例4：用于样本填充以及密封的连续湿润
使用与实施例3中相同的蜂窝管100，使用实施例3讨论的非连续除湿方法向纳米井填充PCR缓冲液。但是，在各纳米井填充有PCR缓冲液之后，将矿物质油引入蜂窝管的井室118从而以5μL/s的速度从入口通路128继续填充PCR室(而不是像实施例3那样流出PCR缓冲液)。矿物质油置换了纳米井顶部的井室118(即聚丙烯基板和顶部密封膜之间)中的PCR缓冲液。该方法称为“连续湿润”，因为两种液体连续地湿润表面。第一种液体(PCR缓冲液)湿润表面并且填充纳米井。第二种液体(矿物质油)连续地湿润表面，但并不填充“入”每个纳米井中，因为表面张力和毛细管力将第一种水性液体保持在纳米井中。
实施例3和4所使用的方法将期望的PCR缓冲液成功引入纳米井中，并且使用矿物质油来隔离每个各纳米井中的PCR缓冲液。矿物质油盖具有的进一步优势是，其能够防止在热循环过程期间纳米井中的水性液体蒸发。
本申请中列出的所有专利、专利申请以及其他公开(包括蛋白质序列号)通过引用整体并入用于所有目的。

Claims (34)

1.反应管，其包括：
平面框架，其限定了第一平面表面和第二平面表面之间的流体路径；以及
流体界面，其位于所述平面框架的一个端部，所述流体界面包括流体入口以及流体出口，其中所述流体界面被配置为与含有流体样品的样品盒连接，从而使所述流体入口和流体出口与所述样品盒的对应流体端口进行流体连接；
其中，所述流体路径还包括界定于所述第一平面表面和第二平面表面之间的所述平面框架中的井室，所述井室包括平面井基板，仅在所述平面井基板的一侧配置有多个开口于所述井室的井，所述井室在所述流体入口和所述流体出口之间流体连通，
其中所述流体路径包括入口通路和出口通路，所述入口通路从所述流体入口延伸并与所述井室流体连通，所述出口通路与所述井室流体连通并延伸至所述流体出口，
其中所述井室和所述多个井被配置为在所述第一平面表面和第二平面表面是垂直定向的情况下由所述流体样品填充。
2.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述流体路径包括布置在所述平面框架中位于所述第一平面表面和第二平面表面之间的预扩增室。
3.根据权利要求2所述的反应管，其中，所述预扩增室包括与井室进口流体连通的预扩增室出孔。
4.根据权利要求3所述的反应管，其中，所述预扩增室出孔通过通路与所述井室进口隔离。
5.根据权利要求4所述的反应管，其中，当所述第一平面表面和第二平面表面垂直定向时，所述预扩增室出孔定位在所述预扩增室的最上部处，使得所述流体出口位于所述流体入口之上。
6.根据权利要求5所述的反应管，其中，所述井室进口定位在所述井室的最下部处。
7.根据权利要求6所述的反应管，其中，所述井室进口定位在所述预扩增室下方。
8.根据权利要求7所述的反应管，其中，所述通路从所述预扩增室出孔斜向下至所述井室进口。
9.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述流体路径包括弯曲通道。
10.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述流体路径是无阀的。
11.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述井基板包括100-1000个纳米井。
12.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述井基板包括多个深度大约100μm至大约500μm的井。
13.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述井基板包括多个直径大约50μm至大约500μm的井。
14.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述井基板包括多个0.8nl的井。
15.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述平面框架的一部分限定了容纳疏水物质的油室。
16.根据权利要求15所述的反应管，其中，所述油室与所述井室流体连通。
17.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述平面框架包括从底部延伸出的支架。
18.根据权利要求17所述的反应管，其中，所述第一平面表面和第二平面表面包括流体地密封所述支架的第一膜和第二膜。
19.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述样品盒是样品准备盒。
20.根据权利要求1所述的反应管，其中，所述井基板包括镍材料。
21.用于填充反应管的方法，所述方法包括：
提供与含有流体样品的流体样品盒连接的反应管，其中，所述反应管包括平面框架，所述平面框架限定了第一平面表面和第二平面表面之间的流体路径，其中所述流体路径包括流体界面和界定于所述第一平面表面和第二平面表面之间的所述平面框架中的井室，所述井室包括平面井基板，仅在所述平面井基板的一侧具有多个开口于所述井室的井，所述流体界面具有位于所述平面框架的一个端部的流体入口和流体出口，所述井室沿着所述流体路径位于所述流体入口和流体出口之间，其中所述流体界面与所述样品盒连接，从而使所述流体入口和流体出口与所述流体样品盒的对应流体端口进行流体连接；
通过借由所述流体界面施加压力，从所述样品盒将所述流体样品引入通过所述反应管的流体界面的流体入口；
在所述反应管的第一平面表面和第二平面表面垂直定向的情况下，通过借由所述流体界面施加压力，用所述样本流体填充井室，使得所述井室的多个井至少局部填充有所述样本流体；以及
在所述反应管的第一平面表面和第二平面表面垂直定向的情况下，从所述井室排出多余的样本流体，使得所述多个井仍然至少局部填充有所述样本流体。
22.根据权利要求21所述的方法，其还包括用所述样本流体填充所述流体路径的预扩增室，并且在填充所述井室之前扩增所述预扩增室中的样本流体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述预扩增室包括预扩增室出孔，当所述反应管垂直定向具有所述流体出口位于所述流体入口之上时，所述预扩增室出孔位于所述预扩增室的最上部处，并且其中，将所述预扩增室填充至低于所述预扩增室出孔的水平。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述预扩增室出孔通过通路流体地连接至井室进口，所述通路从所述预扩增室出孔斜向下至所述井室进口。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述流体路径是无阀的。
26.根据权利要求21所述的方法，其还包括在多余的样本流体从所述井室排出之后，用疏水物质填充所述井室。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，从所述平面框架的油室供给所述疏水物质，所述油室与所述井室流体连通。
28.根据权利要求21所述的方法，其中，所述样本流体沿着呈弯曲样式的所述流体路径行进。
29.根据权利要求21所述的方法，其还包括向所述第一平面表面和第二平面表面施加加热以及冷却循环。
30.根据权利要求1所述的反应管，其中所述第一和/或第二平面表面由透明材料制成，从而允许由邻近或抵靠所述反应管的第一和/或第二表面设置的一个或多个传感器装置激发和/或检测所述多个井内样本流体的荧光。
31.根据权利要求1所述的反应管，其中所述平面框架沿着所述井室的一个或多个前边缘配置，从而允许由沿着所述平面框架的一个或多个前边缘设置的一个或多个传感器装置激发和/或检测所述多个井内样本流体的反应。
32.根据权利要求1所述的反应管，其中所述多个井包括用于扩增和/或检测特定靶标的至少一种核酸引物和/或探针。
33.根据权利要求32所述的反应管，其中所述至少一种核酸引物和/或探针被设置于所述多个井内，并且所述第一和第二表面作为第一和第二基板流体密封所述平面框架，从而便于对经由所述流体入口引入所述多个井内的样本流体进行生物学分析。
34.根据权利要求1所述的反应管，其中所述井基板抵靠第二平面表面或者位于井基板和第二平面表面之间的膜放置。
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