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CN111978379B - 一种对人黑色素瘤抗原a3蛋白具有结合亲和力的多肽及其用途 - Google Patents

一种对人黑色素瘤抗原a3蛋白具有结合亲和力的多肽及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对人黑色素瘤抗原MAGE‑A3具有结合亲和力的多肽及其用途。首次揭示了一种对MAGE‑A3蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽的在诊断检测中的应用，并作为靶向载体在药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽及其 用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白(MAGE-A3)具有结合亲和力的多肽及其应用。
背景技术
肿瘤是全球的多发病和常见病，恶性肿瘤死亡率均位居全部疾病死亡之首，其中肺癌的发病率和死亡率在全球范围内均居首位，胃癌位居恶性肿瘤死亡的第二位，乳腺癌则是女性死亡的首位因素。目前，我国肺癌发病率已呈现爆发式增长的趋势，而胃癌每年的发病率持续上升，且呈现显著的年轻化趋势。MAGE基因首先在黑色素瘤细胞系中发现，是一个包括 A、B、C、D、E和F六个亚家族组成的大家族，其中MAGE-A3基因不仅表达于以黑色素瘤为主的恶性肿瘤组织中，还以较大比例表达于多种组织类型的各种肿瘤,如肺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤和卵巢肿瘤等，尤其消化道肿瘤如胃癌、食道癌、结肠直肠癌等均可呈高表达。MAGE-A3在除睾丸和胎盘组织外的正常组织细胞均不表达，由于睾丸和胎盘组织的固有生理屏障可避免由MAGE-A3被识别产生的自身免疫损伤。因此，目前认为MAGE-A3是肿瘤特异性免疫治疗和诊断的理想靶抗原。
靶向治疗是目前肿瘤治疗中最具希望的方法和策略，主要以表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤血管生成为靶点进行治疗，如EGFR单克隆抗体(HER2单抗)、小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂(赫赛汀，Herceptin和西妥昔单抗等)、贝伐单抗(rhuMAb-VEGF)及舒尼替尼等，通过特异性阻断肿瘤细胞的信号传导或是通过封闭受体阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞生长或促使肿瘤细胞凋亡。但基于抗体分子的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如渗透性差、成本昂贵、具有较强的免疫原性和毒副反应严重等有待进一步研究改善。尤其毒副作用产生的毒性效应已经成为发展针对癌症治疗性抗体的主要障碍，产生肝、肾及神经系统毒性而使其功能降低。如与HER2靶向抗体trastuzumab(Herceptin)相关的心脏毒性效应。用同位素标记抗体进行放射性免疫治疗也会导致骨髓抑制等。
基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗MAGE-A3表达阳性相关肿瘤疾病的新药物或新方法，以改善目前临床现状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽及其用途。
本发明的第一方面，提供一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽，该多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，序列如SEQ ID NO:1所示，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的：
第9位氨基酸突变为P或T；
第10位氨基酸突变为P或L；
第11位氨基酸突变为C或I；
第13位氨基酸突变为R或L；
第14位氨基酸突变为W或F；
第17位氨基酸突变为M或S；
第18位氨基酸突变为A或F；
第24位氨基酸突变为R或P；
第25位氨基酸突变为Q或A；
第27位氨基酸突变为H或V；
第28位氨基酸突变为L或G；
第32位氨基酸突变为P；
第35位氨基酸突变为L或G；
第43位氨基酸突变为E。
在一优选例中，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2-3任一所示。
在另一优选例中，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽与人黑色素瘤抗原A3蛋白相互作用的KD值为1.03×10-5M至3.28×10-6M。
在本发明的另一方面，提供一种靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，偶联物优先的与多肽偶联，所述的偶联物包括但不限于：半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人黑色素瘤的药物，或可检测标记物，可检测标记物包括但不限于如荧光标记，酶，生物素或放射性同位素。
在一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。
在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签，优选为6×His，Myc标签， GST标签，Flag标签。
在另一优选例中，所述的抑制人黑色素瘤的药物包括但不限于：毒素；较佳地，所述毒素是具有抑制人黑色素瘤抗原A3蛋白阳性肿瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述毒素的功能性片段；且，所述的肿瘤是人黑色素瘤抗原A3蛋白阳性的肿瘤。
在另一优选例中，所述的毒素是绿脓杆菌外毒素A，或所述毒素的功能性片段是绿脓杆菌外毒素A的活性片段PE38KDEL。较佳地，该绿脓杆菌外毒素A或其功能性片段连接于所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的羧基末端，优选连接在多肽的C末端。
在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括但不限于：(Gly4Ser)3。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。
在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的用途，用于制备检测人黑色素瘤抗原A3蛋白的检测试剂中的应用，或者在制备诊断人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂的应用，所述多肽是以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽。
在一个优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32， 35，43位上发生氨基酸突变。
在另一优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，序列如SEQ ID NO:1所示，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的：
第9位氨基酸突变为P或T；
第10位氨基酸突变为P或L；
第11位氨基酸突变为C或I；
第13位氨基酸突变为R或L；
第14位氨基酸突变为W或F；
第17位氨基酸突变为M或S；
第18位氨基酸突变为A或F；
第24位氨基酸突变为R或P；
第25位氨基酸突变为Q或A；
第27位氨基酸突变为H或V；
第28位氨基酸突变为L或G；
第32位氨基酸突变为P；
第35位氨基酸突变为L或G；
第43位氨基酸突变为E。
在另一优选例中，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-3任一所示。
在本发明的另一方面，提供所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子的用途，
所述偶联物是抑制人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的药物，用于制备治疗人黑色素瘤抗原A3表达阳性肿瘤的药物；
或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测人黑色素瘤抗原A3蛋白的检测试剂或用于制备诊断人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子中，所述的偶联物是抗肿瘤药物(如毒素)，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子用于治疗人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤包括：肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤、卵巢肿瘤，及消化道肿瘤如胃癌、食道癌、结肠直肠癌等宫颈癌、头颈部肿瘤或外生殖器肿瘤等。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对人黑色素瘤抗原A3 蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断或治疗人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，或所述的药物组合物。
在一个优选例中，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子是有效量的。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1、各ZMAGE-A3以及Zwt序列的对比。本发明的ZMAGE-A3多肽中被修饰的氨基酸位点在图中己用下划线标出(SEQ ID NO：2-3)。
图2、实施例1中产生的一个融合多肽的重组质粒构建图(A)和全长蛋白氨基酸序列组成示意图(B)。
ZMAGE-A3代表具有选自SEQ ID NO：2-3任一序列的MAGE-A3结合结构域，6xHis代表六个组氨酸标记，HM代表NdeI(CATATG)翻译的氨基酸，LE代表XhoI(CTCGAG)翻译的氨基酸。
图3、pET21a(+)/affibody的重组质粒电泳图。
M：DNA marker；1-3分别为pET21a(+)/ZMAGE-A3172、pET21a(+)/ZMAGE-A3770、及pET21a(+)/Zwt的重组质粒。
图4、MAGE-A3重组蛋白原核表达鉴定及制备兔血清抗体的分析
A：MAGE-A3重组蛋白原核表达的SDS-PAGE电泳分析M Marker，1.pET21(+)空载体转染的E.coli Rosetta菌株；2.pET21a(+)/MAGE-A3转染的E.coli Rosetta菌株未诱导；3-6. pET21a(+)/MAGE-A3转染的E.coli Rosetta菌株诱导后；
B：MAGE-A3重组纯化蛋白SDS-PAGE电泳分析M Marker，1.MAGE-A3蛋白纯化后；
C：MAGE-A3蛋白Western Blot分析：M.Marker，1.pET21(+)空载体转染的E.coliRosetta 菌株；2.pET21a(+)/MAGE-A3转染的E.coli Rosetta菌株诱导后(一抗为鼠His-tag单抗)；
D：MAGE-A3蛋白Western Blot分析：M.Marker，1.pET21(+)空载体转染的E.coliRosetta 菌株；2.pET21a(+)/MAGE-A3转染的E.coli Rosetta菌株诱导后(一抗为制备的兔抗MAGE-A3 血清抗体)；
E:MAGE-A3蛋白免疫后兔血清抗体的反应；
F:MAGE-A3蛋白免疫后兔血清抗体的效价。
图5、Affibody重组蛋白原核表达(A)及纯化(B)的SDS-PAGE电泳分析
A：M：蛋白marker；1-2分别为BL21(DE3)菌株和pET21(+)空载体转染的BL21(DE3)菌株，3-5分别为pET21a(+)/ZMAGE-A3172、pET21a(+)/ZMAGE-A3770及pET21a(+)/Zwt的重组质粒转染的BL21(DE3)菌株。
B：M：蛋白marker；1-3分别为纯化后ZMAGE-A3172，ZMAGE-A3770，及Zwt affibody重组融合蛋白。
图6、ZMAGE-A3结合多肽在ProteOn XPR36仪器上的SPR检测
A、B、C、分别为ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770及Zwt蛋白与靶蛋白MAGE-A3的亲和力分析。
图7、MAGE-A3在人黑色素瘤及胃癌细胞株中表达的RT-PCR检测。
图8、ZMAGE-A3结合多肽与MAGE-A3天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光共定位方法鉴定。
A：ZMAGE-A3172结合多肽的间接免疫荧光共定位检测；B：ZMAGE-A3770蛋白的间接免疫荧光共定位检测；
图9、Dylight755标记的ZMAGE-A3结合多肽SDS-PAGE电泳及荧光分析。
A：为ZMAGE-A3172多肽和ZwtSDS-PAGE电泳分析；B：为Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽和Zwt SDS-PAGE电泳的荧光分析。M:Marker，1-2.Dylight755未标记的ZMAGE-A3172纯化蛋白；3.Dylight755标记的ZMAGE-A3172纯化蛋白；4.为Dylight755标记的Zwt纯化蛋白。
图10、Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向的成像分析。A:Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽在健康裸鼠体内各时间点的荧光成像和肾脏分布, 及B:肾脏与肌肉组织荧光信号强度的比值；C:Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽各时间点分别在负载A-375、SGC-7901、和MGC-803细胞荷瘤裸鼠体内肿瘤组织各时间点的荧光成像，及D:肿瘤与肌肉组织荧光信号强度的比值。
图11、Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽在荷瘤裸鼠各脏器和肿瘤组织中的成像分析， A1-C1为在注射Dylight755标记的ZMAGE-A3172多肽24h后，在荷载肿瘤的裸鼠各主要组织脏器中的荧光分布；A2-C2为相应肿瘤组织及各脏器的平均荧光信号的强度。
图12、ZMAGE-A3affitoxin蛋白SDS-PAGE电泳鉴定和WB鉴定
A：pET21a(+)/ZMAGE-A3affitoxin重组质粒构建图；
B：ZMAGE-A3affitoxin原核表达蛋白SDS-PAGE电泳图。M:Marker；1，BL21(DE3)菌株；2，pET21a(+)载体转化的BL21(DE3)；3-5分别为pET21a(+)/MAGE-A3affitoxin172,ZMAGE-A3affitoxin770,和Zwt affitoxin重组质粒转染的BL21(DE3)菌株；
C：ZMAGE-A3affitoxin纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。M:Marker；1-3分别为ZMAGE-A3affitoxin172,ZMAGE-A3affitoxin770和Zwt affitoxin；
D、E、F：一抗分别为His单抗、兔抗Zwt多抗及鼠抗PE38KDEL多抗。M:Marker；1-3:分别为ZMAGE-A3affitoxin172，ZMAGE-A3affitoxin770，Zwt affitoxin。
图13、ZMAGE-A3affitoxin与MAGE-A3天然蛋白亲和力的细胞免疫荧光共定位鉴定。A： ZMAGE-A3affitoxin172蛋白；B：ZMAGE-A3affitoxin770蛋白
图14、ZMAGE-A3affitoxin172对肿瘤细胞生长的影响
A、B:ZMAGE-A3affitoxin172对A-375和SGC-7910肿瘤细胞的IC50分析；C、D:
ZMAGE-A3affitoxin172对A-375和SGC-7910肿瘤细胞生长抑制作用；E:ZMAGE- A3affitoxin172 对A-375、SGC-7910和MGC-803肿瘤细胞生长抑制作用
图15、ZMAGE-A3affitoxin172对Balb/c荷瘤裸鼠的抑瘤作用效应
Balb/c裸鼠分别在接种A375细胞(A),SGC7901(B)和MGC-803(C)后，待肿瘤长至100～ 200mm3大小时，尾静脉注射4mg/kg浓度的ZMAGE-A3affitoxin172、ZMAGE-A3172 affibody和Zwt affitoxin、PE38KDEL对照蛋白及PBS，每隔3天注射一次，共10次，图中箭头所示。观察至 36天后，解剖肿瘤组织，各组荷瘤裸鼠的肿瘤分别拍照为、测量体积和称重。A1-A3:为A375、 SGC7901和MGC-803荷瘤裸鼠各实验组在各时间段测量的肿瘤体积大小；B1-B3:为各实验组的三种肿瘤解剖后的拍照观察；C1-C3:为三种肿瘤的各实验组的解剖肿瘤质量比较。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
如本文所用，所述的“对MAGE-A3具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合 MAGE-A3、具有极少或没有非特异性结合。
如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对MAGE-A3具有结合亲和力的多肽”、“MAGE-A3 结合多肽”、“ZMAGE-A3affibody多肽”、“ZMAGE-A3affibody”、“ZMAGE-A3”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“ZMAGE-A3重组蛋白”可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使用。
如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对MAGE-A3具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向MAGE-A3的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制人黑色素瘤抗原A3的药物，酶或可检测标记物等。
如本文所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对 MAGE-A3具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向MAGE-A3的分子。
本发明人选择MAGE-A3作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQ ID NO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变文库，以MAGE-A3作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于MAGE-A3具有高度亲和力的多肽。
本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A 蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35， 43位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2-3任一所示的氨基酸序列，如表1所示。
本发明还涵盖了在所述MAGE-A3结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合MAGE-A3时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His6)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。
所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、 MAGE-A3结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。
本发明也包含在所述的MAGE-A3结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
本发明也包含在本发明的MAGE-A3结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的MAGE-A3结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的MAGE-A3结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。
在“异源”融合多肽中，所述MAGE-A3结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合MAGE-A3外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了MAGE-A3外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个MAGE-A3结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。
本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上。作为本发明的优选实施方式，将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL通过柔性肽连接于MAGE-A3 结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶) 而进行“ADEPT"(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzymeprodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、 TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125I)用于诊断或放射性核素 (如90Y、131I、211At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。
本发明还涵盖了在所述的MAGE-A3结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达MAGE-A3阳性肿瘤的目的。
“MAGE-A3结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(surfaceplasmonresonance)技术如
Figure RE-GDA0002138646800000072
装置进行检测的一种多肽特性。MAGE-A3结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将MAGE-A3固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有MAGE-A3 的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的MAGE-A3结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD 值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用
Figure RE-GDA0002138646800000071
2000装置(Biocore AB) 进行测定。MAGE-A3固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到1.03×10-5M至3.28×10-6M。
本发明还提供了编码本发明的MAGE-A3结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。
本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。
此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E. coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
生产本发明的MAGE-A3结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。
当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
本发明还涉及所述的MAGE-A3结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
本发明的MAGE-A3结合多肽可作为MAGE-A3抗体在不同应用中的一种替代物。
作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以MAGE-A3表达为特征的疾病，例如肿瘤(如黑色素瘤，肺癌，胃癌)等。通过结合胞内MAGE-A3以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向MAGE-A3蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。
在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合MAGE-A3能力的该多肽的片段。
本发明多肽的MAGE-A3结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达MAGE-A3的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的MAGE-A3结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达MAGE-A3的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。
这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到MAGE-A3结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP 10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、 calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如90Y、131I、211At等)，这种同位素可与MAGE-A3结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与MAGE-A3结合多肽结合。
在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达MAGE-A3细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与MAGE-A3结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。
本发明还包括使用所述的与MAGE-A3结合的多肽检测样品中的MAGE-A3蛋白。
例如，这种检测可以用来诊断特征为表达MAGE-A3的疾病情况。检测MAGE-A3的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与MAGE-A3的抗体，这种方法可以适用于本发明的与MAGE-A3结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与MAGE-A3的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与MAGE-A3蛋白的表达。为了检测MAGE-A3，
本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等。
本发明还包括将所述的MAGE-A3结合多肽应用于检测生物学液体样品中MAGE-A3。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的MAGE-A3结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何MAGE-A3结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的MAGE-A3 量相关。在步骤(2)中，MAGE-A3结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当MAGE-A3结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或MAGE-A3结合多肽存在于溶液中。
所述的MAGE-A3结合多肽的其它应用还包括：检测样品中MAGE-A3的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有MAGE-A3的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的MAGE-A3结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何MAGE-A3结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的MAGE-A3的量相关。
本发明还提供了一个诊断组织样品中MAGE-A3表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的MAGE-A3结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。
本发明还提供了一个诊断组织样品中MAGE-A3表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的MAGE-A3结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。
诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的MAGE-A3结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。
如上所述，本发明涵盖了本发明的MAGE-A3结合多肽将活性物质靶向表达MAGE-A3的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的MAGE-A3结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是90Y、131I、211At)，以及用于分析掺入效率的试剂。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对人黑色素抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向人黑色素抗原A3蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对人黑色素抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克 /千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1、MAGE-A3结合多肽的文库构建及筛选研究
构建噬菌体展示MAGE-A3结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选MAGE-A3结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
1、MAGE-A3结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定
根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987；1(2):107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。按分子克隆常规方法，通过Sfi I和NotI位点将 SPA-N编码序列克隆至pCANTAB5E载体构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli TG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。随机挑取平板上长出的28个单克隆菌落，将提取质粒用Sfi I和Not I双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。
结果：根据测序结果，送测序的20个克隆中有测序结果的为16个克隆，其中连接成功15 个克隆，随机性完全不同，故重组率为15/20＝75％；多样性为15/15＝100％。取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1:10，1:102……)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×106个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35和43位具有随机的氨基酸残基。
2、MAGE-A3结合多肽的筛选和滴度测定
将纯化的MAGE-A3蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coli TG1 37℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算MAGE-A3结合噬菌体滴度；结果平板可见菌落，滴度是103；此时完成第一轮淘洗，另部分菌液加1010辅助噬菌体 M13KO7和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得MAGE-A3分子亲和筛选后的噬菌体文库，为一级库。重复上述4轮富集筛选，分别获得MAGE-A3分子亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度分别为1×106；在二级库的基础上再重复上述4轮富集筛选，为三级文库，滴度为1×108。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。
3、MAGE-A3结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定
ELISA用于筛选表达MAGE-A3结合affibody分子的噬菌体。将MAGE-A3蛋白以20μg/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用2％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取四轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1:10000稀释的 HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，200μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD 显色液200μl/孔，37℃，15min；2M H2SO4 50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD490值。
在四轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这四轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其MAGE-A3结合活性，用高于0.5的OD490的ELISA值为选择标准，鉴定编码MAGE-A3结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的100个克隆，并与另外随机挑选12个无ELISA值的克隆进行DNA序列分析。
4、MAGE-A3亲和体分子的序列检测及筛选
共100个单克隆送中国上海生工公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAATT CAACAAAGAA(SEQ ID NO:8)。测序结果用DNA STAR软件分析对标准序列SPA-Z与 SPA-N进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获68个完全正确克隆序列，有部分序列完全重复，兼并重复序列后获得45个序列完全正确的克隆。
根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的45个克隆中，选择与MAGE-A3蛋白结合活性最强的2个单克隆噬菌体(即呈现MAGE-A3亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA 序列(分别为ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770)作为靶目标进行研究，氨基酸序列为SEQ ID NO:2、 3如图1，它们的编码序列如SEQID NO:4、5。下一步用于MAGE-A3结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。
实施例2、MAGE-A3结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化
如前选择了具有较高ELISA读数的2个克隆(图1中的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770)，及Zwt作为MAGE-A3结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。
1.pET21a(+)/affibody的重组质粒构建和鉴定
参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物
Figure RE-GDA0002138646800000111
Figure RE-GDA0002138646800000112
斜体和下划线表示Ned I 酶切位点)，下游引物
Figure RE-GDA0002138646800000113
斜体和下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确四级库单克隆affibody ZMAGE-A3172、 ZMAGE-A3770为模板，通过PCR扩增affibody目的基因(SEQ ID NO:4、5)，同时将affibody Zwt (SEQ ID NO:1)经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO:6)合成作为阴性对照。将PCR扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/ZMAGE-A3的重组质粒，并经测序鉴定(图2，图3)。
2.原核蛋白生产
将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的 ZMAGE-A3affibody及Zwt affibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体 (Ni-NTA Agarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/ZMAGE-A3重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770、及Zwt affibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析(图 5)证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7.8kDa，与预期ZMAGE-A3affibody多肽的分子质量大小一致。本发明选择pET21a(+)载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位点为NdeI (CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用原核表达系统表达的蛋白即为全长的目的蛋白ZMAGE-A3而不带载体蛋白片段，避免了载体蛋白对实验结果的干扰。
实施例3、ZMAGE-A3affibody多肽与MAGE-A3重组蛋白的结合
为鉴定ZMAGE-A3affibody多肽与MAGE-A3蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770affibody分子及其对照Zwt affibody与靶蛋白MAGE-A3的特异性结合。
1.MAGE-A3蛋白的制备
将实验室构建并保存的pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经 IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化制备蛋白，并常规免疫日本大耳白兔制备血清抗体。结果，SDS-PAGE电泳显示一明显蛋白条带出现在相对分子质量(Mr)约48kDa 的位置，与预期蛋白Mr大小相符(图4A)，以实验室保存的pET32a(+)/MAGE-A3重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)。经用亲和层析柱纯化后，经SDS-PAGE分析在Mr 48kDa的位置处出现一条较为单一的的蛋白条带(图4B)。分别以小鼠抗6×His mAb为一抗及制备的兔血清抗体进行 Western blot分析，可见在Mr 48kDa处出现信号反应带(图4C，D)，表明此条带为MAGE-A3 蛋白。经ELISA检测，兔MAGE-A3蛋白免疫后出现了高效价的抗体反应，表明成功制备高效价的特异性兔血清抗体(图4E，F)。
2.ZMAGE-A3多肽的传感器分析
在ProteOn XPR36系统仪器(Bio-Rad公司)进行MAGE-A3蛋白和ZMAGE-A3多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770及Zwt affibody分子(作为对照)与MAGE-A3之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将MAGE-A3重组蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第6个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行5个不同梯度浓度稀释与MAGE-A3重组蛋白结合，即ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770及 Zwtaffibody分子的浓度均为2.0nM、4.0nM、8.0nM、16.0nM、32.0nM。所有的分析在25℃进行，流速为30μl/min，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用 100mMHCl(BIO-RAD)洗涤6min(解离)，利用ProteOn ManagerTM软件(BIO-RAD)的1：1 朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。
结果范围随着ZMAGE-A3亲和体分子浓度浓度升高，其与靶蛋白MAGE-A3相互作用的能力增强。分析重复检测结果，亲和力平衡解离常数KD均值，ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770及Zwt 亲和体分子分别的为1.03×10-5mol/L、3.28×10-6mol/L及3.91×10-1mol/L。ZMAGE-A3172和ZMAGE-A3770蛋白分子较Zwt affibody分子解离常数KD值相差10000至100000倍。经筛选获得的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770均能与MAGE-A3重组蛋白结合的亲和力均已经达到nmol/L 级水平，与此同时野生型的Zwt affibody分子和MAGE-A3重组蛋白几乎没有结合力。表明筛选出的2个affibody分子与MAGE-A3重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时表明原核诱导表达的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770affibody分子与MAGE-A3重组蛋白均具有生物活性。
因此，本发明的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770蛋白分子与MAGE-A3靶蛋白分子具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770分子与MAGE-A3靶蛋白之间的亲和力。
实施例4、ZMAGE-A3affibody多肽与表达MAGE-A3蛋白细胞的结合
为进一步验证筛选的ZMAGE-A3affibody多肽与MAGE-A3靶蛋白的亲和力，利用表达MAGE-A3的肿瘤细胞作为研究对象，即人黑色素瘤细胞系A-375和人胃癌细胞系SGC-7901,并利用MAGE-A3表达阴性的人胃癌细胞系MGC-803作为对照，进一步验证ZMAGE-A3affibody分子与MAGE-A3蛋白分子之间的结合。
1.肿瘤细胞系MAGE-A3表达的验证
A-375细胞、SGC-7901细胞及MGC-803细胞分别培养于RPMI 1640培养基(10％胎牛血清，2.05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)。利用QRT-PCR进行 MAGE-A3表达检测，即将细胞在37℃含有5％C02的培养箱中培养至24h，收集培养细胞，分别提取各细胞系的总RNA并进行逆转录，逆转录产物经过PCR扩增获得目的基因 MAGE-A3。设计并合成PCR引物：上游引物为：5′-ATGAGCTCATGCCTCT TGAGCAGAGGAG-3′，下游引物为：5′-GAGAGAGGGGGAAGAGTGA-3′。QRT-PCR扩增结果如图7所示。表明，人黑色素瘤A-375细胞株和胃癌SGC-7901细胞株为MAGE-A3表达阳性细胞株，而胃癌MGC-803细胞株为MAGE-A3低表达或不表达细胞株。
2.细胞免疫荧光共定位分析和鉴定
将灭菌的盖玻片放入六孔板中，将培养至24h的A-375、SGC-7901和MGC-803细胞调整数目为1×106/孔，5％CO2 37℃培养24h至单层细胞。加入终浓度为50μg/ml ZMAGE-A3
affibody多肽于上述含10％FBS培养基中，5％CO2 37℃培养2h，吸出培养液，用预冷PBS洗涤；采用4％多聚甲醛固定单层细胞15min，PBST洗涤3次，加入0.3％Triton X-100打孔 10min，洗涤后加入含10％FBS的1640培养基，37℃封闭1h，洗涤；分别加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)置37℃30min，加入MAGE-A3兔血清抗体(1:2000)，4℃过夜，洗涤后分别加FITC标记羊抗兔IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和dylight 594羊抗鼠IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)，37C孵育1h,PBST洗涤。加入Hoechst(联科生物技术公司，中国)30μl/孔染核5分钟，洗涤后吸干，加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP2microscope德国)观察并拍片(400×)。
结果在荧光荧显微镜下观察到(图8A，B)，经ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770蛋白处理的 A-375细胞及SGC-7901细胞，经MAGE-A3兔血清抗体(识别细胞表达的天然MAGE-A3蛋白)孵育后细胞浆内可见多个绿色的点状或团块状强荧光信号，而与His-tag单抗(识别ZMAGE-A3蛋白上的His标签)孵育的上述细胞胞浆内可见多个红色的点状或团块状强荧光信号，两者叠加结果显示，ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770蛋白和MAGE-A3兔血清抗体识别位点一致，表现为黄色的点状或团块状荧光信号，而人胃癌细胞株MGC-803未见明显的荧光信号。表明， ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770重组蛋白能特异性识别细胞中天然表达MAGE-A3蛋白，并与 MAGE-A3兔血清抗体的识别位置一致。
由此可知，筛选出的ZMAGE-A3172、ZMAGE-A3770蛋白均能特异性识别细胞中天然表达的MAGE-A3蛋白，从细胞水平验证了筛选出的Affibody蛋白与细胞表达的MAGE-A3具有特异性结合的亲和力。
实施例5、ZMAGE-A3affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性
在本实施例的实验中，选择ZMAGE-A3172 affibody多肽作为检测对象，用近红外荧光染料 DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美国，货号62278)标记ZMAGE-A3172affibody多肽，并将其注射到携带A-375、SGC-7901及MGC-803细胞移植肿瘤的小鼠体内，进行ZMAGE-A3172 affibody多肽生物分布研究，并对裸小鼠成像定位以研究标记多肽的生物分布和肿瘤靶向特性。
1.动物肿瘤模型的制备
选择6-7周龄BALB/c-nu小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证
SCXK(沪)2012-0002)，体重为15-18g)。将培养至对数生长期，生长状态良好的A-375、 SGC-7901及MGC-803用EDTA(胰酶)消化后，用含10％血清细胞培养液进行吹打、收集，常温1000rpm离心3min，将离心细胞用不含血清的培养液重悬并计数，配制成1×106/ml，取0.2ml 于背部近右前臂皮下注射接种裸鼠。每隔3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。
结果显示，裸鼠皮下接种上述细胞均可见明显的肿瘤生长，40只裸鼠全部成瘤。2周后，肿瘤最大直径达到约300-500mm3时开始实验。
2.近红外荧光染料Dylight755(Dy755)标记及鉴定
按照说明书步骤对ZMAGE-A3172及对照蛋白Zwt affibody进行Dylight755的标记并鉴定。即取91μg DyLight 755NHS-Ester染料溶解入273μl DMF有机溶剂后，加入透析后的ZMAGE-A3172 affibody蛋白(300μg/ml，共1ml)溶液中，避光，4℃条件下反应1h，将反应后的溶液避光透析，每隔半小时更换透析液(磷酸盐缓冲液，pH7.2-7.4)，2h后收集Dy755-ZMAGE-A3 172荧光蛋白，取样测蛋白浓度为100μg/ml，采用SDS-PAGE电泳进行鉴定。分别取Dy755未标记的ZMAGE-A3172及Dy755标记的ZMAGE-A3172(Dy755-ZMAGE-A3172)1μg，用磷酸盐缓冲液稀释至10μl，，分别加入10μl蛋白loading buffer中，于冰上避光条件下电泳，并将凝胶放于活体成像仪(CRi Maesro 2.10)中，激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用 8bit和2×2模式，用730-950nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，用Maesro 25软件进行图像处理及分析。经鉴定的Dy755-ZMAGE-A3172分装于棕色离心管，-20℃保存备用。
结果显示，标记蛋白Dy755-ZMAGE-A3172经SDS-PAGE电泳分析，在相对分子质量为7.8 kDa处出现单一的染色条带(图9A)；经小动物活体成像仪扫描，在Dylight755标记ZMAGE-A3 172 affibody多肽相应位置处均出现单一的荧光条带，但Dylight755染料未标记的ZMAGE-A3 172无条带出现(图9B)。表明，近红外荧光染料Dylight755标记ZMAGE-A3172affibody多肽成功。
3.ZMAGE-A3172 affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性
(1)Dy755-ZMAGE-A3172在健康裸鼠体内的生物分布
为分析Dy755-ZMAGE-A3172在正常裸鼠体内的代谢，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50μg/100μL Dy755-ZMAGE-A3172蛋白，置于小动物活体成像仪(CRi Maesro 2.10)中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在注射前和注射后的5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h、48h和72h连续成像观察。成像的激发光滤片为671-705nm，发射光滤片为750longpass，采用8bit和2×2模式，730-950nm波长间隔10nm每次曝光5000ms收集图像信息，并用Maesro软件进行图像处理及分析，分别显示背景自发荧光和目标荧光信号，然后测量其荧光值，将背景自发荧光设置为黑色，目标荧光信号设置为红色，最后将两种色彩相叠加。所得数据用GraphPad软件进行处理。
结果可见双侧肾脏出现了最大的荧光信号，将其与腿部肌肉处的荧光信号比值进行分析，即肾脏/正常组织率(K/N ratio＝[肾脏ROI的背景信号/正常ROI的组织(肌肉)背景信号]}。结果表明，Dy755-ZMAGE-A3172主要分布于肾脏，在注射后肾脏的荧光信号逐渐增强，并于8小时达到高峰，此后逐渐减弱，并于72小时荧光信号完全消失。表明，Dy755-ZMAGE-A3172蛋白主要分布于正常裸鼠的肾脏，即经肾脏排泄，并于72小时内完全排泄(图10A、B)。
(2)ZMAGE-A3172 affibody多肽在荷瘤裸鼠中的肿瘤靶向特性
待裸鼠的肿瘤长至300-500mm3时将裸鼠带出SPF屏障系统，用10％水合氯醛腹腔注射诱导麻醉，待其进入深度麻醉状态后经尾静脉注射50μg Dy755-ZMAGE-A3172荧光蛋白，置于小动物活体成像仪中成像，并用0.8-1.0μl/g水合氯醛维持麻醉状态，以保证小鼠在成像过程中处于深度麻醉，在注射前和注射后的5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、 48h和72h连续成像观察图11A1-C1。取每组的三只裸鼠在注射后的10h后处死并解剖，取肿瘤组织、肝脏、脾脏、肾脏、和大脑等组织脏器置于成像系统扫描。
结果，A-375和SGC-7901荷瘤裸鼠在尾静脉注射50μg Dy755-ZMAGE-A3172荧光蛋白30min后，肿瘤部位即出现明显的荧光信号，1h-8h荧光信号最完整，之后逐渐降低，分别至6h和8h左右信号强度最为明显，与肿瘤大小对应，12h时后肿瘤的荧光成像明显变小， 24h时仍有荧光成像。MGC-803对照组观察期间均未检测到有明显的荧光信号。肾脏在静脉注射后Dy755-ZMAGE-A3172荧光蛋白后30min直至24h～48h，可见最强的荧光信号，至24h～ 72h(图10A、B)逐渐消失。在尾静脉注射50μg Dy755-ZMAGE-A3172荧光蛋白10h时解剖小鼠，取实验组和对照组的肿瘤、肾脏、肺、脾脏、肝脏及肌肉等重要组织器官进行成像，图 11所示，肿瘤、肾脏、脑、胃肠、肺、肌肉和皮肤等组织中荧光信号分布与强度与活体成像结果基本相一致，肿瘤组织的荧光强度与其他各脏器的荧光强度有显著性差异(p<0.05)，而在MGC-803荷瘤小鼠肿瘤组织的荧光强度与其他各脏器的荧光强度无显著性差异(p>0.05)。荷瘤小鼠在观察期间状态良好，未见明显毒性反应。
结果表明，标记Dy755-ZMAGE-A3172多肽具有靶向结合MAGE-A3表达阳性肿瘤的特性，且没有严重的毒副作用。
实施例6、ZMAGE-A3affitoxin蛋白对MAGE-A3阳性细胞荷瘤裸鼠的保护作用
在本实施例中，利用ZMAGE-A3172的靶向作用，携带经改构具有细胞毒作用的绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作为细胞毒分子。构建ZMAGE-A3/PE38KDEL原核表达载体，并利用原核表达系统制备并纯化了ZMAGE-A3/PE38KDEL 蛋白，即affitoxin 172，对affitoxin与靶蛋白MAGE-A3的特异性结合，及靶向作用进行和验证，并对MAGE-A3表达阳性的肿瘤细胞的体内生长的抑制作用进行验证。
(1)ZMAGE-A3affitoxin蛋白的制备和鉴定
选择ZMAGE-A3172 affibody作为MAGE-A3的靶向分子，利用柔性肽(Gly4Ser)3在其C末端连接PE38(KDEL)，将柔性肽C端连接经原核密码子优化的PE38(KDEL)的全序列(SEQ IDNO:7)，构成ZMAGE-A3affitoxin分子。即将PE38(KDEL)的全序列DNA合成并经EcoRI和 XhoI位点克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/PE38(KDEL)载体，通过分子克隆方法将 ZMAGE- A3172经NedI和EcoRI克隆至pET21a(+)/PE38(KDEL)载体重组质粒(图12A)并测序鉴定，进一步将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。同时构建并原核表达Zwt affitoxin 作为对照蛋白。
结果，成功构建了pET21a(+)/ZMAGE-A3affitoxin 172及pET21a(+)/Zwt affitoxin重组质粒；该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的ZMAGE-A3affitoxin172及Zwtaffitoxin重组蛋白，SDS-PAGE电泳提示在相对分子质量(Mr)约48kDa的位置出现一明显条带，与预期理论值大小相符(图12B、C)；由于重组pET21a(+)/ZMAGE-A3/PE38KDEL蛋白(即ZMAGE-A3affitoxin) 的C端含有His标签，所以用亲和层析柱纯化后，进一步通过WesternBlot分析鉴定，结果(图 12D、E、F)显示，His-tag鼠单抗、兔抗Zwt(SPA-Z)多抗及兔PE38KDEL多抗作为一抗，在分子质量约为48kDa均处出现单一条带，提示ZMAGE-A3affitoxin172重组蛋白能被His-tag、 SPA-Z多抗及兔PE38KDEL血清抗体特异性识别和结合。表明，ZMAGE-A3affitoxin 172及Zwt affitoxin重组纯化蛋白制备成功。
(2)ZMAGE-A3affitoxin蛋白与细胞表达靶蛋白结合特性
为验证ZMAGE-A3affitoxin 172蛋白与MAGE-A3结合的特性，采用细胞共定位免疫荧光方法进一步验证。选择MAGE-A3表达阳性的A-375、SGC-7901肿瘤细胞株作为靶细胞，及MGC-803作为阴性对照细胞。方法同实施例4。简述为将细胞调整数目培养至单层细胞，加入终浓度为50μg/ml ZMAGE-A3affibody共孵育2h，用预冷PBS洗涤后固定，打孔，封闭1h，洗涤；分别加入鼠抗His单克隆抗体(1：2000)置37℃1h，加入MAGE-A3兔血清抗体 (1:2000)，4℃过夜，洗涤后分别加FITC标记羊抗兔IgG二抗和dylight 594羊抗鼠IgG二抗， 37℃孵育1h,PBST洗涤。加入Hoechst染核5分钟，洗涤后吸干，封片，置共聚焦荧光显微镜观察并拍片。
结果在荧光荧显微镜下观察到(图13)，经ZMAGE-A3affitoxin172蛋白处理的A-375细胞及 SGC-7901细胞，与MAGE-A3兔血清抗体(识别细胞表达的天然MAGE-A3蛋白)孵育后细胞浆内可见多个绿色的点状或团块状强荧光信号，而与His-tag单抗(识别ZMAGE- A3affitoxin172 蛋白上的His标签)孵育的细胞胞浆内可见多个红色的点状或团块状强荧光信号，两者叠加结果显示，ZMAGE-A3affitoxin172蛋白和MAGE-A3兔血清抗体识别或结合位点一致，表现为黄色的点状或团块状荧光信号，而人胃癌细胞株MGC-803未见明显的荧光信号。表明，ZMAGE-A3 affitoxin172重组蛋白能特异性识别细胞中天然表达MAGE-A3蛋白，并与MAGE-A3兔血清抗体的识别位置一致。
表明，ZMAGE-A3affitoxin172蛋白均能特异性识别细胞中天然表达的MAGE-A3蛋白，从细胞水平验证了其与细胞表达的MAGE-A3具有特异性结合的亲和力。
(3)ZMAGE-A3affitoxin蛋白体外细胞生长抑制作用
为研究ZMAGE-A3affitoxin体外细胞生长抑制作用，选择ZMAGE-A3affitoxin172蛋白作为研究对象。同样选择选择MAGE-A3表达阳性的A-375、SGC-7901肿瘤细胞株作为靶细胞。方法同实施例6。即制备细胞悬液并计数接种于96孔细胞培养板，培养24h后，加入ZMAGE-A3affitoxin172蛋白，分别设置0.160μmol/L、0.312μmol/L、0.625μmol/L、1.250μmol/L、2.500 μmol/L、5.000μmol/L、10.000μmol/L、20.000μmol/L浓度组，并以Zwt affibody为对照组，采用CCK-8试剂盒检测细胞的生存率。同时在加样后1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h，检测细胞的生存率。每组均设置3个复孔，并进行3次重复实验。计算细胞生长存活的IC50值及细胞在各时间段的生存率。
结果如图14(A、B)，经GraphPad primer 5.0软件来计算A-375和SGC-7901细胞生长存活的IC50值，分别为0.229±0.085μM和1.300±0.084μM。图14(C、D、E)显示，ZMAGE- A3affitoxin 172对MAGE-A3表达阳性的A-375和SGC-7901生长具有较强的抑制作用，而对MAGE-A3 表达阴性的MGC-803细胞生长则无明显的抑制作用。图14显示，ZMAGE-A3affitoxin172作用于A-375、SGC-7901细胞至72h，其细胞生存率与MGC-803细胞比较，均有显著性差异
(p<0.05)，而A-375、SGC-7901细胞生存率之间比较也存在显著性差异(p<0.05)。
以上结果表明，ZMAGE-A3affitoxin 172具有抑制A-375和SGC-7901细胞生长的特性，进一步验证了ZMAGE-A3affitoxin 172具有体外MAGE-A3靶向结合特异性。
(4)ZMAGE-A3affitoxin蛋白的半数致死量LD50分析
为研究ZMAGE-A3affitoxin172蛋白急性毒性作用，选择BALB/c雌鼠作为实验对象，并计算其半数致死量。选择4w龄BALB/c雌鼠，18-20g，分为8个剂量组，每组4-7只，见表1。每只小鼠尾静脉仅一次给药，注射200μl相应剂量的ZMAGE-A3affitoxin172蛋白。给药后观察指标：外观，体征、体重及各剂量组小鼠死亡时间，持续观察至14天，并用Graphpad Primer5.0法计算LD50，重复三次检测。结果ZMAGE-A3affitoxin172蛋白致小鼠半数死亡的LD50为：16.007±2.899mg/kg。
表1.ZMAGE-A3affitoxin172蛋白急性毒性作用
剂量(mg/kg) 30 25 20 15 10 5 2.5 0
死亡率(1) 4/4 4/4 6/7 5/7 4/7 2/7 1/7 0/7
死亡率(2) 5/5 3/5 5/7 4/7 2/7 1/7 0/7 0/7
死亡率(3) 5/5 5/5 4/5 3/5 1/5 1/5 0/5 0/5
(5)ZMAGE-A3affitoxin蛋白的保护作用
为检测ZMAGE-A3affitoxin172蛋白对肿瘤细胞致瘤作用的保护作用，本实施例采用MAGE-A3表达阳性的人黑色素瘤A-375和人胃癌细胞SGC-7901细胞及MAGE-A3表达阴性的人胃癌MGC-803细胞制备BALB/c裸鼠的荷瘤模型，具体方法同实施例5，即选择4-5 周龄BALB/c-nu小鼠，体重为12-15g，饲养于温州医科大学实验动物中心屏障系统(SPF级) 内，三种肿瘤细胞荷瘤裸鼠分别分成5组，即ZMAGE-A3affitoxin172、ZMAGE-A3 172、 PE38KDEL、Zwtaffitoxin及PBS对照组。每组5～7只。将培养48h至对数生长期的上述三种细胞，分别配制成所需的细胞数即1x106/ml，取0.1ml于裸小鼠的背部近左前臂皮下注射，同时将各组蛋白(均为4mg/kg)稀释于0.1ml的PBS中，在裸小鼠肿瘤细胞后，待肿瘤体积长至50～100mm3左右，按组别经尾静脉注射0.1ml对应蛋白，PBS组仅注射0.1ml的 PBS。首先每只荷瘤裸鼠连续注射3天(每天1次)，之后每隔1天注射1次，共10次。每3天观察裸小鼠生活和精神状态等，测量肿瘤大小并拍照记录，观察至36天。处死荷瘤鼠。取出肿瘤组织及裸鼠各重要脏器，并对肿瘤组织予以称重，然后用4％多聚甲醛浸泡，室温下保存，以备后续实验所用。
结果见图15(A1-A2)所示，ZMAGE-A3affitoxin172蛋白对MAGE-A3阳性的A-375、SGC-7901肿瘤细胞的致瘤作用具有较强的保护作用，在A-375、SGC-7901荷瘤裸鼠中，ZMAGE-A3affitoxin172蛋白组肿瘤的体积大小与各对照组分别在第12天开始出现有显著性差异(p<0.01)，随着时间的延长，肿瘤体积大小在各组别之间，差异明显变大，直至36天。而对于MAGE-A3阴性的MGC-803肿瘤细胞,ZMAGE-A3affitoxin172、Zwt affitoxin蛋白及PBS 组之间无差异(p>0.05)(图15A3)。小鼠观察结束后处死，解剖分离肿瘤组织并进行拍照(图15B1-B3)和称重(图15C1-C3)，结果与上述肿瘤在体测量体积结果相一致。
上述结果表明，ZMAGE-A3affitoxin172蛋白具有保护或抑制肿瘤细胞的生长作用，即 ZMAGE-A3affitoxin172蛋白具有对MAGE-A3靶向抑瘤作用。且毒副作用不明显。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽及其用途
<130> 12
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Pro Pro Cys Ala Arg Trp Glu Ile
1 5 10 15
Met Ala Leu Pro Asn Leu Asn Arg Gln Gln His Leu Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(58)
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Thr Leu Ile Ala Leu Phe Glu Ile
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Asn Leu Asn Pro Ala Gln Val Gly Ala Phe Ile Pro
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 4
gttgacaaca aattcaacaa agaacccccg tgcgctaggt gggaaatcat ggcgctgccg 60
aacctgaacc gacaacagca cctcgctttc atccaatctc tgctcgacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 5
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 5
gttgacaaca aattcaacaa agaaacgttg atcgctctct tcgaaatctc gttcctgccg 60
aacctgaacc ccgcccaggt tggagctttc atcccctctc tgggggacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 6
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(174)
<400> 6
gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gcacctgccg 60
aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120
tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 7
<211> 1029
<212> DNA
<213> 多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1029)
<400> 7
ggtggttctc tggctgctct gaccgctcac caggcttgcc acctgccgct ggaaaccttc 60
acccgtcacc gtcagccgcg tggttgggaa cagctggaac agtgcggtta cccggttcag 120
cgtctggttg ctctgtacct ggctgctcgt ctgtcttgga accaggttga ccaggttatc 180
cgtaacgctc tggcttctcc gggttctggt ggtgacctgg gtgaagctat ccgtgaacag 240
ccggaacagg ctcgtctggc tctgaccctg gctgctgctg aatctgaacg tttcgttcgt 300
cagggtaccg gtaacgacga agctggtgct gctggtccgg ctgactctgg tgacgctctg 360
ctggaacgta actacccgac cggtgctgaa tttctgggta acggtggtga cgtttctttc 420
tctacccgtg gtacccagaa ctggaccgtt gaacgtctgc tgcaggctca ccgtcagctg 480
gaagaacgtg gttacgtttt cgttggttac cacggtacct tcctggaagc tgctcagtct 540
atcgttttcg gtggtgttcg tgctcgttct caggacctgg acgctatctg gaggggcttc 600
tacatcgctg gcgacccgga actggcttac ggttacgctc aggaccagga accggacgcg 660
cgtggtaggt tctgcaacgg tgcgctcctg cgtgtctacg tcccgcgttg gaacctgccg 720
ggtttctacc gtaccggtct gaccctggct gctccggaag ctgctggtga agttgaacgt 780
ctgatcggtc acccgctgcc gctgcgtctg gacgctatca ccggtccgga agaagaaggt 840
ggtcgtctgg aaaccatcct gggttggccg ctggctgaac gtaccgttgt tatcccgtct 900
gctatcccga ccgacccgcg taacgttggt ggtgacctgg acccgtcttc tatcccggac 960
aaagaacagg ctatctctgc tctgccggac tacgcttctc agccgggtaa accgccgaaa 1020
gacgaactg 1029
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<400> 8
catatggttg acaacaaatt caacaaagaa 30
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<400> 9
gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa 38
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 10
ccggaattcc gtttcggagc ctgagcgt 28

Claims (12)

1.一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2-3 任一所示。
2.如权利要求1 所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，该多肽与人黑色素瘤抗原A3蛋白相互作用的KD 值为1.03×10-5M 至3.28×10-6M。
3.一种靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1-2 任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基；多肽标签；抗癌活性的物质；或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素。
4.如权利要求3所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的偶联物包括抗癌活性的物质，该抗癌活性的物质包括用于ADEPT应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞的蛋白； 毒素：蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、 calcheamicin、美登木素生物碱； auristatin或阿霉素或放射性同位素。
5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-2 任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽。
6.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求6所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽的用途，其特征在于，用于制备检测人黑色素瘤抗原A3蛋白的检测试剂中的应用，或者在制备诊断人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂的应用，所述多肽包括权利要求1-2任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽。
9.权利要求3所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子的用途，其特征在于，
所述偶联物是抗癌活性药物，用于制备治疗人黑色素瘤抗原A3表达阳性肿瘤的药物；
或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素，用于制备检测人黑色素瘤抗原A3蛋白的检测试剂或用于制备诊断人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1-2任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
11.一种用于诊断人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，包括：权利要求 1-2 任一所述的对人黑色素瘤抗原A3蛋白具有结合亲和力的多肽;
或权利要求3所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素;
或权利要求10所述的药物组合物，所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，所述可检测标记物包括荧光标记，酶，生物素或放射性同位素。
12.一种用于治疗人黑色素瘤抗原A3蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，包括：权利要求3所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物；
或权利要求4 所述的靶向人黑色素瘤抗原A3蛋白的靶向性分子；
或权利要求10所述的药物组合物，所述靶向性分子的偶联物是抗癌活性药物。
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US7049413B2 (en) * 2001-05-18 2006-05-23 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A3 peptides presented by HLA class II molecules
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