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CN111936623A - 用于生物合成制造庚二酸的材料与方法和合成多肽的利用 - Google Patents

用于生物合成制造庚二酸的材料与方法和合成多肽的利用 Download PDF

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CN111936623A
CN111936623A CN201980024037.9A CN201980024037A CN111936623A CN 111936623 A CN111936623 A CN 111936623A CN 201980024037 A CN201980024037 A CN 201980024037A CN 111936623 A CN111936623 A CN 111936623A
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amino acid
derived
polypeptide
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acp
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乔纳森·肯尼迪
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Abstract

本文提供了具有例如酰基‑酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)活性的新型合成多肽，包括将庚二酰基‑ACP转化为庚二酸的多肽。在一些方面，所述合成多肽相对于野生型酰基‑ACP TE具有有利的酶活性和/或改善的底物特异性。

Description

用于生物合成制造庚二酸的材料与方法和合成多肽的利用
优先权要求
本申请要求2018年3月30日提交的美国临时专利申请号62/650,629的权益，该临时专利申请以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本公开中的教导内容涉及具有例如酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)活性的新型合成多肽，包括将庚二酰基-ACP转化为庚二酸的多肽。在本公开的一些方面，所述合成多肽相对于野生型酰基-ACP TE具有有利的酶活性和/或改善的底物特异性。
背景技术
生化途径被用来产生对生物体有用的产物。参见例如LEHNINGER，A.L.，NELSON，D.L.，&COX，M.M.(2000).Lehninger principles of biochemistry.New York，WorthPublishers。产生7-氨基庚酸(7-AHA)的生化途径利用大肠杆菌(E.coli)中的生物素生物合成途径(Lin等人，“Biotin Synthesis Beings by Hijacking the Fatty AcidSynthesis Pathway，”Nat.Chem.Biol.6(9)：682-6882010)。生物素生物合成的第一个关键步骤是BioC对丙二酰基-ACP进行甲基化。这样产生的丙二酰基-ACP甲酯然后用作脂肪酸生物合成途径的起始单元。
然后发生两轮脂肪酸伸长和还原，生成庚二酰基-ACP甲酯。接着通过酯酶BioH除去甲基基团来生成庚二酰基-ACP(图1)。然后通过硫酯酶作用于庚二酰基-ACP来产生庚二酸。因此，硫酯酶(TE)在使用生物素合成途径产生7-AHA中起着至关重要的作用(图2)。
聚酰胺诸如尼龙可以通过二胺与二羧酸的缩聚或另选地通过内酰胺的缩聚来合成。尼龙6，6是通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的反应产生的普遍存在的尼龙。尼龙6是通过己内酰胺的开环聚合产生的。尼龙7代表一种与尼龙6和尼龙6，6相比具有增值特性的新型聚酰胺。合成尼龙7的关键中间体是7-AHA。然而，不存在经济上有利的石化途径来产生7-AHA。
发明内容
合成生物学被用于设计和构建新的生物部件、设备和系统，以及出于有用目的用于重新设计现有的天然生物系统。在一个方面，提出了具有酰基-ACP TE活性的合成多肽，其可用于通过生物合成途径产生7-AHA。
在一个实施方案中，本公开提供了具有酰基-ACP TE活性的各种多肽。在另一方面，所述具有酰基-ACP TE活性的多肽或其功能片段相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。
在一些实施方案中，野生型酰基-ACP TE被分类为EC 3.1.2.-。在一些实施方案中，野生型酰基-ACP TE被分类为EC 3.1.2.14。
在一些实施方案中，与位置5相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置35相对应的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置38相对应的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置64相对应的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置241相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置45相对应的氨基酸被甲硫氨酸或异亮氨酸(I)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置175相对应的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置33相对应的氨基酸被天冬氨酸(D)或等效氨基酸取代，并且与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置59相对应的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代，并且与位置90相对应的氨基酸被苯丙氨酸(F)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置40相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代，并且与位置111相对应的氨基酸被色氨酸(W)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置36相对应的氨基酸被甘氨酸(G)或等效氨基酸取代，并且与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置32相对应的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代，并且与位置40相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
在一些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽的氨基酸序列与野生型酰基-ACP TE的氨基酸序列具有至少50％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽相对于野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。在某些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽相对于野生型酰基-ACP TE对庚二酰基-ACP具有改善的底物特异性。在某些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽相对于野生型酰基-ACP TE具有至少10％的酶活性增加。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种编码具有酰基-ACP TE活性的多肽的核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码具有酰基-ACP TE活性的多肽或其功能片段，其中所述多肽相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。在另一个实施方案中，还提供了一种包含编码具有酰基-ACP TE活性的多肽的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码具有酰基-ACP TE活性的多肽的核酸，其中所述多肽相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。
在另一个实施方案中，进一步提供了一种包含本文提供的任何载体的代谢工程化生物体或宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。
在另一个实施方案中，还提供了一种包含本文所述的任何多肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含庚二酰基-ACP。
在另一个实施方案中，进一步提供了一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA的方法，所述方法包括以下步骤：在存在本文提供的多肽中的任一种多肽的情况下将庚二酰基-ACP转化为庚二酸。在另一个实施方案中，还提供了一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA的方法，所述方法包括以下步骤：在合适的培养基中培养包含编码本文所述的任何多肽的载体的宿主细胞，并回收庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA。
在另一个实施方案中，还提供了一种通过本文提供的任何方法产生的生物来源的庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA。在另一个实施方案中，进一步提供了一种包含由本文提供的任何生物来源的产物产生的化学物质的产品，其中所述产品包括药物、生物燃料、芳香剂、尼龙中间体、聚酯或食品添加剂。
还提供了一种基于生物或发酵来源的产品，其中所述产品包括：(i)组合物，所述组合物包含：至少一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，或其盐，或它们的任何组合，所述化合物或其盐是在存在本文所述的任何多肽的情况下产生的，或者是由本文所述的任何多肽催化的反应的产物产生的；(ii)生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，所述聚合物包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或化合物，或它们的任何组合；(iii)生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，所述树脂包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，或所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，或它们的任何组合；或(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或它们的任何组合；(iv)物质，所述物质是通过模制以下项获得的：(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或它们的任何组合；(v)生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，所述制剂包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或(iv)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的物质，或它们的任何组合；或者(vi)生物来源的、基于生物的或发酵来源的半固体或非半固体料流，所述半固体或非半固体料流包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，(v)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，(iv)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的模塑物质，或它们的任何组合。
附图说明
本申请包括以下附图。这些附图旨在例示组合物和方法的某些实施方案和/或特征，并补充对组合物和方法的任何描述。这些附图不限制组合物和方法的范围，除非书面描述明确表明是这种情况。
图1是由丙二酰基-ACP产生庚二酰基-ACP的生化途径的示意图。
图2是由丙二酰基-CoA产生7-AHA的生化途径的示意图。
图3描绘了从Uniprot ID No.R5FQ35获得的酰基-ACP TE的三维模型，其突出显示了催化残基。
图4A示出了酰基-ACP TE中残基的位点特异性分布。考虑了超过40％的群体。
图4B示出了结合位点处的氨基酸残基45、128和175的主要贡献。本研究中使用的残基编号是从具有Uniprot ID R5FQ35的序列中获得的。
图5示出了底物结合位点处的较高酰基-ACP-TE活性的相关残基。相关程度以热图的形式绘制(左图)，并且前5个相关残基在表中示出(中图)。相关残基表明这两个位置是偶联的，并且指示了当在位置1处存在特定残基时所偏爱的位置2处的残基。相关残基的空间占用在酶的3D模型中示出为球形(右图)。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献和它们所引用的材料全文据此以引用方式具体并入。
本文陈述的公开内容所属领域的技术人员将想到这些公开内容的许多修改和其他实施方案，这些修改和其他实施方案具有以上和以下描述以及相关附图中呈现的教导内容的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。
单位、前缀和符号可以其SI接受形式表示。除非另外指明，否则核酸分别以5′至3′取向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左至右书写。数值范围包括限定范围的数值。氨基酸在本文中可用它们通常已知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可用它们通常接受的单字母代码来指代。通过整体参考说明书，可以更充分地定义以下定义的术语。
在本说明书和权利要求书中，使用了氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。包括取代的编号在内的所有编号均参考本文陈述为SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的对应氨基酸残基。SEQ ID NO：1是以Uniprot ID No.R5FQ35保藏的爱格氏菌属(Eggerthella sp.)酰基-ACP TE的全长氨基酸序列。在本说明书和权利要求书中，所要求保护的多肽的活性相对于野生型酰基-ACP TE的活性进行测量，除非另外说明。
与另一个序列(例如，区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)(例如，SEQ ID NO：1)的对应性基于以下惯例：根据核苷酸或氨基酸位置编号进行编号，然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列。因为并非给定“对应区域”内的所有位置都必须相同，所以对应区域内的非匹配位置可被视为“对应位置”。
定义
除非另外明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除非另外提及，否则本文采用或考虑的技术是本领域的普通技术人员众所周知的标准方法。除非另外指明，否则本公开的实践将采用微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。材料、方法和实施例仅是例示性的而不是限制性的。下文通过例示的方式呈现，并非旨在限制本公开的范围。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本公开的某些实施方案的表示试剂数量、特性、反应条件和结果等的数值在一些情况下应理解为被术语“约”修饰。在一些实施方案中，说明书(权利要求书全部并入其中)中陈述的数值参数是近似值，其可以根据具体实施方案寻求获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数值参数应按照报告的有效数位的数量并通过应用惯常的四舍五入法来解释。尽管陈述本公开的一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实施例中陈述的数值应尽可能精确地报告。在本公开的一些实施方案中呈现的数值可包含某些误差，这些误差必然是由于在它们各自的测试测量中发现的标准偏差产生的。本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落在该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值都并入说明书中，好像它在本文中被单独列举一样。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。
“氨基酸”是指可以结合到肽、多肽或蛋白质中的任何单体单元。如本文所用，术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。这二十种天然氨基酸的结构在例如Stryer等人，Biochemistry，第5版，Freeman and Company(2002)中示出。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。
如本文所用，术语“生物来源的”是指来源于生物体或由生物体合成，并且可以被认为是可再生资源，因为其可以由生物体生成。这种生物体(具体是本文公开的微生物体)可以利用原料或生物质，诸如从农业、植物、细菌或动物来源获得的糖或碳水化合物。另选地，这种生物体可以利用大气中的碳。如本文所用，术语“基于生物的”是指全部或部分由本公开的生物来源的化合物构成的如上所述的产品。基于生物的或生物来源的产品与石油来源的产品(其中这种产品来源于石油或石化原料或者由石油或石化原料合成)形成对比。
对于含有羧酸基团的化合物，诸如有机一元酸、羟基酸、氨基酸和二元羧酸，当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代或与有机碱配位时，可将这些化合物形成或转化为它们的离子盐形式。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可以按原样作为盐从体系中分离，或者通过添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低至pKa以下来转化为游离酸。
对于含有胺基团的化合物，诸如但不限于有机胺、氨基酸和二胺，这些化合物可通过将酸性质子添加到胺中以形成铵盐来形成或转化为它们的离子盐形式，该铵盐是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的；或者是与有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸或粘康酸形成的。可接受的无机碱是本领域中已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可以按原样作为盐从体系中分离，或者通过添加碱或用碱性离子交换树脂处理将pH升高至pKb以上来转化为游离胺。
对于含有胺基团和羧酸基团两者的化合物，诸如但不限于氨基酸，这些化合物可通过以下方式形成或转化为它们的离子盐形式：1)与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成酸加成盐；或者与有机酸诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-酸)、羧酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸形成酸加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等，或者2)将母体化合物中存在的酸性质子用金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替代；或与有机碱配位。可接受的有机碱是本领域中已知的，并且包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱是本领域中已知的，并且包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。盐可以按原样从体系中分离，或者通过添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降低至pKa以下来转化为游离酸。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个动词的任何形式或时态诸如“包含”、“具有”和“包括”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那些一个或多个步骤，并且还可以覆盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物不限于仅拥有那些一个或多个特征，并且可以覆盖其他未列出的特征。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。关于本文的某些实施方案提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开，并不构成对本公开原本要求保护的范围的限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本公开的实践是必要的。
如本文所用，“基本上由......组成”是指在本文提供的多核苷酸或多肽序列中包含另外的序列，其中所述另外的序列不会实质性地影响所要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。就组合物而言，一般来讲，术语“基本上由......组成”是指给定实施方案所需的那些要素，并且还允许存在不会实质性地影响本公开的该实施方案的基本特性和新颖或功能特性的要素。
如本文所用，术语“由......组成”是指本文所述的组合物、方法以及它们各自的组分不包括未在该实施方案的描述中列举的任何要素。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于具体的核酸序列，保守修饰的变体是指编码氨基酸序列的相同变体或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的每个位置，可以将密码子改变为所描述的任何对应密码子，而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，代表一种保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了该核酸的每个可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可以对核酸中的每个密码子(AUG除外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是鲁宾斯微球菌(Micrococcus rubens)，对其而言，GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，(1993)J.Gen，Microbiol.139：425-32))进行修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本公开的多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个描述的多肽序列中并以引用方式并入本文。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到，当改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代时，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸的各个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”。因此，可以如此改变任何数量的氨基酸残基。保守修饰的变体通常提供与它们来源的未修饰的多肽序列等效的生物活性。提供功能上相似的氨基酸(在本文中也称为“等效氨基酸”)的保守取代表是本领域众所周知的。
如本文所用，“密码子优化”是以如下方式修饰核苷酸序列的过程：提高其在真核细胞中的表达、G/C含量、RNA二级结构和翻译，而不改变其编码的氨基酸序列。改变的密码子使用通常用于改变翻译效率和/或优化编码序列以在所需宿主中表达，或者优化异源序列中的密码子使用以在特定宿主中表达。可以使用可商购获得的软件包诸如可从University of Wisconsin Genetics Computer Group获得的“Codon Preference”对本公开的多核苷酸的编码区中的密码子使用进行统计分析。参见Devereaux等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395或Mac Vector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因此，本公开提供了本公开的至少一种多核苷酸的编码区的密码子使用频率特性。可以用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数量(每个氨基酸3个核苷酸)可以是3至本文提供的本公开的多核苷酸数量的任何整数。任选地，多核苷酸将是全长序列。用于统计分析的示例性序列数量可以是至少1、5、10、20、50或100。
术语“来源于”包括术语“源自”、“得自”或“可得自”和“分离自”。
“等效氨基酸”可以基于它们与它们所取代的氨基酸的结构同源性或基于可能生成的各种变体之间的生物活性的比较测试结果来确定。作为非限制性示例，以下列表汇总了通常可能进行的但不会导致对应变体的生物活性显著改变的可能取代：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)和脯氨酸(P)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)，以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还可参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)。
在进行这种改变/取代时，还可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性是本领域普遍理解的(Kyte和Doolittle；(1982)JMol Biol.157(1)：105-32)。公认的是，氨基酸的相对亲水性质有利于所得蛋白质的二级结构，继而限定了蛋白质与其他分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中已知的是，某些氨基酸可被具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍然获得生物学功能上等效的蛋白质。已经基于每种氨基酸的疏水性和电荷特性分配了其亲水指数(Kyte和Doolittle，同上)。它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在进行这种改变时，亲水指数在+2内的氨基酸的取代是优选的；亲水指数在+1内的氨基酸的取代是特别优选的，并且亲水指数在+0.5内的氨基酸的取代是甚至更特别优选的。
本领域中还应理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利号4,554,101指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(受其相邻氨基酸的亲水性控制)与蛋白质的生物特性有关。
如美国专利号4,554,101中所详述，已经将以下亲水性值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+0.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
关于多核苷酸或蛋白质的“内源”是指宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。
如本文所用，酶分类(EC)号(EC号)由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(IUBMB)建立，其描述可在万维网上的IUBMB酶命名网站获得。EC号根据催化的反应对酶进行分类。例如，分类为EC 3.1.2.-或EC 3.1.2.14的酶是在存在水的情况下从酰基-载体蛋白上裂解硫酯键的酰基-ACP水解酶。在一些实施方案中，酶是被分类为EC 3.1.2.-的酰基-ACP TE。在一些实施方案中，酶是被分类为EC 3.1.2.14的酰基-ACP TE。被分类为EC3.1.2.14的示例性序列是来自柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)的以UniProt IDNo.B1MVT0陈述的序列，其据此以引用方式整体并入。在其他实施方案中，酶是被分类为EC3.1.1.1、EC 3.1.1.2或EC 3.1.1.5的酰基-ACP TE。在具体的实施方案中，酰基-ACP TE催化庚二酰基-ACP转化为厌二酸。
如本文所用，“表达”是指基于基因的核酸序列生产多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
如本文所用，“表达载体”是指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列可操作地连接到能够影响DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
常规使用的“表达系统”的示例包括重组杆状病毒、慢病毒、原生动物(例如，真核寄生虫蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae))、微生物表达系统(包括基于酵母(例如，毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)真菌)的表达系统和基于细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽胞杆菌(Brevibacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))的表达系统)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHOK1SVNSO(Lonza，Basel，Switzerland)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、PerC.6或Per.C6细胞(例如，Percivia，Cambridge，MA；Crucell，Leiden，Netherlands)、HEK 293的不同细胞系、Expi293F.TM.细胞(Life Technologies，Carlsbad，CA)、GenScript的YeastHIGH.TM.技术(GenScript，Piscataway，NJ)、人类神经元前体细胞系AGE1.HN(Probiogen(Berlin Germany))以及其他哺乳动物细胞、植物(例如，玉米、苜蓿和烟草)、昆虫细胞、禽卵、藻类和转基因动物(例如，小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、牛)。这些各种系统的优点和缺点已经在文献中进行了综述，并且是本领域的普通技术人员已知的。
“基因”是指涉及产生多肽的DNA片段，并且包括编码区域之前和之后的区域以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是指用于表达载体或DNA构建体的合适宿主，所述表达载体或DNA构建体包含编码根据本公开的多肽的多核苷酸。具体地，宿主菌株可以是细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和其他克隆或“表达系统”。在本公开的一个实施方案中，“宿主细胞”是指细胞和由微生物菌株的细胞产生的原生质体。应当理解，这些术语旨在不仅指特定的受试细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在随后的世代中可能发生某些修饰，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
关于多核苷酸或蛋白质的“异源”是指在宿主细胞中不会天然存在的多核苷酸或蛋白质/多肽。在一些实施方案中，蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。该术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指当在比较窗口或指定区域内比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或者具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定区域上具有60％同一性，任选地具有65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)，如使用以下序列比较算法中的一种算法或通过手动比对和目视检查测量的。如果序列为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％相同，则它们彼此“基本上相同”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更典型地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域上。
如本文所用，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中比较窗口中的序列部分与参考序列相比(不包括添加或缺失)可以包括添加或缺失(即，缺口)，以实现两个序列的最佳比对。该百分比是通过以下过程计算的：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定另选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性或相似性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括提及选自由以下项组成的组的连续位置数量中的任一种的片段：其中可在对两个序列进行最佳比对后将一个序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较的20至600个，通常约50至约200个，更通常约100至约150个。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过以下算法进行：Smith and Waterman的局部同源算法(Adv.Appl.Math.2：482，1970)、Needleman和Wunsch的同源比对算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)、这些算法的计算机实现(例如，WisconsinGenetics软件包(Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手动比对和目视检查(例如，参见Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
当关于蛋白质使用序列同一性百分比时，应当认识到，不同的残基位置通常因保守的氨基酸取代而不同，在保守的氨基酸取代中，氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可向上调节序列同一性百分比以校正取代的保守性质，这一过程导致“序列同源性”为例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。进行这种调节的手段是本领域的技术人员众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是全部错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1并且非保守取代的评分为零的情况下，保守取代的评分在0和1之间。例如，根据Meyers和Miller的算法((1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17)计算保守取代的评分，例如，该算法在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)中实现。
在将核酸序列插入细胞中的上下文中，“引入”包括“转染”或“转化”或“转导”并且包括提及将核酸序列结合到真核或原核细胞中，其中可将核酸序列结合到细胞的基因组(例如，染色体，质粒，质体或线粒体DNA)中、转化为自主复制子或使其瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语还可以指核酸序列从细胞外易位到细胞内。在一些情况下，引入是指核酸从细胞外易位到细胞核内。
就酶活性而言，“Kcat(s-1)”是酶的整体催化速率，或每秒催化的最大酶促反应数。该常数也称为酶的“转换数”或每个酶位点每单位时间转化为产物的底物分子数。“Km”是酶促反应以Vmax的一半或其最大速率的一半发生时所需的底物浓度。
如本文所用，代谢工程化微生物体是通过将遗传物质引入所选宿主或亲本微生物体中从而修饰或改变微生物体的细胞生理学和生物化学而产生的生物体。
术语“突变体”是指多肽和核酸两者。术语“突变体”可与术语“变体”或“合成体”互换使用。突变体或变体包括亲本序列分别在氨基酸或核苷酸序列的一个或多个位置处进行的改变、插入、取代、易位、截短和/或倒位。在本公开的合成酰基-ACP TE的上下文中，突变型酰基-ACP TE是指通常为重组的多肽，该多肽相对于对应的酰基-ACP TE(例如，野生型酰基-ACP TE)包含一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，本公开的突变型酰基-ACP TE是非天然存在的。
如本文所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列以及它们的变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源的，并且可以是双链或单链的，无论代表有义链还是反义链。如本文所用，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。
术语“核酸”包括能够编码多肽的DNA、cDNA、RNA、异源双链体和合成分子。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化RNA。核酸可以是单链或双链的，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码具有简并性，所以可使用多于一种密码子来编码具体氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列通常包括包含A、G、C、T或U碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可包括其他碱基，诸如但不限于肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫代尿苷，但不限于此。除非明确限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指明，否则具体的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。核酸可以是或可以包括例如染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物，或者聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。除非另外指明，否则除了明确指示的任何序列外，具体的核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“可操作地连接”及其变体是指化学融合或键合或具有足够稳定性的缔合，以承受以下项所利用的核苷酸结合方法中遇到的条件：不同化合物的组合之间；分子或其他实体，诸如但不限于：蛋白质和报告分子部分(例如，荧光染料或纳米颗粒)之间；核苷酸和报道分子部分(例如，荧光染料)之间；或者启动子和编码序列(如果它控制序列的转录)之间。
“启动子”是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本文所用的示例性启动子是T7启动子，其是诱导型启动子。
“周质标签”或“周质前导序列”是在附接到/存在于蛋白质/肽的N末端时将蛋白质/肽引导到细菌周质的氨基酸序列，其中该序列通常由信号肽酶去除。蛋白质/肽分泌到周质中可以增加重组表达的蛋白质/肽的稳定性。周质标签的一个示例是来源于胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)果胶裂解酶基因的PelB前导序列，在本文中公开为SEQID NO：2(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMG)。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
当关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，“重组”表示已经通过引入“异源核酸”或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质对该细胞、核酸、蛋白质或载体进行了修饰，或者该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在细胞的天然(非重组)形式内发现的基因，或者表达原本表达异常、表达不足或根本不表达的天然基因。一般来讲，可以通过核酸内切酶(通常在自然界中不存在的形式)对核酸进行操纵最初在体外形成重组核酸。因此，出于本公开的目的，分离的突变型酰基-ACP TE核酸(线性形式)或通过连接通常不连接的DNA分子在体外形成的表达载体都被认为是重组的。应当理解，一旦制成重组核酸并将其重新引入宿主细胞中，它将非重组地复制，即使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操纵；然而，这种核酸一旦重组产生，尽管随后非重组地复制，但出于本公开的目的，仍然被认为是重组的。可以使用重组技术(即通过表达如上所述的重组核酸)来制成重组蛋白。重组蛋白通常与天然存在的蛋白质的区别在于至少一个或多个特征。
“信号序列”或“信号肽”是指与蛋白质的N末端部分结合从而促进蛋白质的成熟形式分泌到细胞外的氨基酸序列。信号序列的定义是功能性的。细胞外蛋白的成熟形式缺乏在分泌过程中被裂解的信号序列。
“选择标记”是指能够在宿主中表达从而允许容易选择那些含有引入的核酸或载体的宿主的基因。选择标记的示例包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(诸如营养优势)的基因。
“底物”是指酶结合并将其转化为产物的分子。庚二酰基-ACP是被本文所述的多肽转化为庚二酸的底物的一个示例。
“在转录控制下”是本领域众所周知的术语，表示多核苷酸序列(通常为DNA序列)的转录取决于其可操作地连接到有助于转录启动或促进转录的元件。
“在翻译控制下”是本领域众所周知的术语，表示在已经形成mRNA之后发生的调节过程。
如本文所用，“转化的细胞”包括已经通过使用重组DNA技术转化或转导的细胞。转化通常通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞而发生。插入的核苷酸序列可以是“异源核苷酸序列”，即对于要转化的细胞不是天然的序列，诸如融合蛋白。
如本文所用，关于细胞使用的“转化的”、“稳定地转化的”、“转导的”和“转基因的”是指细胞具有整合到其基因组中或作为游离型质粒维持多代的非天然(例如，异源)核酸序列。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指可将另外的DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中可将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般来讲，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，要求保护的实施方案旨在包括具有等效功能的此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。载体还包括克隆载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
在核苷酸序列或多肽序列的上下文中，术语“野生型”是指序列的主要或最常见等位基因，如其在自然界中存在的那样。野生型序列也可以称为未经修饰的天然存在的典型或正常序列。
合成多肽
已经发现，改变具有酰基-ACP硫酯酶活性的多肽中特定位置处的氨基酸残基可以改善酶活性和/或底物特异性，例如对庚二酰基-ACP的底物特异性。
本公开提供了具有酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)活性的多肽。在一些实施方案中，所述具有酰基-ACP TE活性的多肽是相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代的多肽或其功能片段，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。
还提供了包含突变型酰基-ACP TE、基本上由突变型酰基-ACP TE组成或者由突变型酰基-ACP TE组成的多肽或其功能片段。在一些实施方案中，突变型酰基-ACP TE相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。SEQ ID NO：1是来自爱格氏菌属(Eggerthella sp.)CAG：1427(UniprotID No.R5FQ35)的野生型酰基-ACP TE的多肽序列。在一些实施方案中，酶是被分类为EC3.1.2.-的酰基-ACP TE。在一些实施方案中，野生型酰基-ACP TE被分类为EC 3.1.2.14。在其他实施方案中，野生型酰基-ACP TE被分类为EC 3.1.1.1、3.1.1.2或3.1.1.5。野生型酰基-ACP TE的示例包括但不限于表1中列出的野生型酰基-ACP TE。
表1
Figure BDA0002710752070000191
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在一些实施方案中，与位置5相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置35相对应的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置38相对应的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置64相对应的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置241相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置45相对应的氨基酸被甲硫氨酸或异亮氨酸(I)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置175相对应的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置33相对应的氨基酸被天冬氨酸(D)或等效氨基酸取代，并且与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置59相对应的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代，并且与位置90相对应的氨基酸被苯丙氨酸(F)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置40相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代，并且与位置111相对应的氨基酸被色氨酸(W)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置36相对应的氨基酸被甘氨酸(G)或等效氨基酸取代，并且与位置128相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。在一些实施方案中，与位置32相对应的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代，并且与位置40相对应的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
在一些实施方案中，如上所述的与位置5、35、38、64和241相对应的一个或多个氨基酸的取代增加了酶活性和/或改善了底物特异性。在一些实施方案中，如上所述的底物结合位点中的一个或多个氨基酸(例如，与位置45、128和175相对应的一个或多个氨基酸)的取代增加了酶活性和/或改善了底物特异性。在一些实施方案中，如上所述的底物结合位点处的氨基酸残基对(例如，与位置33和128、位置59和90、位置40和111、位置36和128、位置32和40相对应的一个或多个氨基酸)的取代增加了酶活性和/或改善了底物特异性。
应当理解，可以用所述氨基酸取代的任何组合来突变任何野生型酰基-ACP TE，以获得酶活性增加和/或底物特异性改善的多肽。在一些实施方案中，突变型酰基-ACP TE在占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或者十个或更多个取代。
如上所述，突变型酰基-ACP TE相对于野生型酰基-ACP TE但不限于相对于被分类为EC 3.1.2.-或EC 3.1.2.14的野生型酰基-ACP TE可以具有例如一个或多个上述氨基酸取代。在一些实施方案中，突变型酰基-ACP TE具有一个或多个另外的修饰。蛋白质修饰包括氨基酸序列修饰。氨基酸序列的修饰可作为等位基因变异天然产生(例如，由于遗传多态性)，可由于环境影响(例如，通过暴露于紫外线)产生，或者可通过人工干预(例如，通过克隆的DNA序列的诱变)产生，诸如诱导点、缺失、插入和取代突变体。编码酰基-ACP TE的核酸中的修饰可能导致氨基酸序列发生变化，提供沉默突变，修饰限制位点，或者提供其他特定突变。氨基酸序列修饰通常属于三类中的一种或多种：取代修饰、插入修饰或缺失修饰。插入包括氨基和/或末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常将是比氨基或羧基末端融合的插入小的插入，例如为大约一至四个残基。缺失的特征在于从蛋白质序列中移除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白质分子内的任一位点缺失不超过约2至6个残基。氨基酸取代通常是单个残基，但是可以一次在多个不同位置发生；插入通常将为大约1至10个氨基酸残基；并且缺失将在约1至30个残基的范围内。缺失或插入优选地在相邻对中进行，即缺失2个残基或插入2个残基。可将取代、缺失、插入或它们的任何组合进行组合以获得最终的构建体。取代修饰是其中至少一个残基已被移除并且在其位置插入不同残基的修饰。在一些实施方案中，进行保守或等效取代。保守取代导致氨基酸被化学上和/或功能上相似的氨基酸取代。修饰(包括特定的氨基酸取代)通过已知方法进行。
通过示例的方式，修饰通过对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变进行，从而产生编码该修饰的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的，例如PCR诱变、引物延伸或反向PCR诱变。
还提供了包含本文所述的任何多肽的融合多肽。所述多肽可以与异源序列(例如但不限于，被设计成促进重组表达的蛋白的表达、纯化和/或检测的标签或序列)融合。非限制性示例包括周质标签、聚组氨酸标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、蛋白A、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光蛋白序列(例如，GFP)和表位标签(诸如myc、FLAG和血凝素标签)。
在一些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽(例如，突变型酰基-ACP TE)的氨基酸序列与野生型酰基-ACP TE的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的氨基酸序列同一性，并且具有酶活性。在某些实施方案中，具有酰基-ACP TE活性的多肽(例如，突变型酰基-ACP TE)的氨基酸序列与野生型酰基-ACP TE的氨基酸序列具有至少90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性，并且具有酶活性。在某些实施方案中，酶活性对庚二酰基-ACP具有特异性。
本文还提供了本文所述多肽的片段。这些片段优选地包括至少20个连续氨基酸，更优选地至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含本文所述的突变型酰基-ACP TE的片段。
还提供了本文所述的任何突变型多肽的衍生物。在一些实施方案中，衍生多肽是已经进一步改变的多肽，例如通过与其他化学部分缀合或复合，通过翻译后修饰(例如，磷酸化、乙酰化等)、糖基化修饰(例如，添加、移除或改变糖基化)和/或本领域中将理解的其他氨基酸序列的包含/取代。如上所述，衍生物还包括融合蛋白。实施方案考虑的其他衍生物包括但不限于在肽或蛋白质合成以及使用交联剂和对多肽及其片段施加构象限制的其他方法中对侧链进行修饰、结合非天然氨基酸和/或其衍生物。
核酸和载体
在另一个实施方案中，提供了一种编码本文所述的具有酰基-ACP TE活性的任何多肽的核酸。在一些实施方案中，核酸编码具有酰基-ACP TE活性的多肽，其中该多肽相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中该一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。在一些实施方案中，核酸编码包含突变型酰基-ACP TE的多肽或其功能片段。在一些实施方案中，核酸编码包含突变型酰基-ACP TE的多肽或其功能片段，其中该突变型酰基-ACP TE相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中该一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。在一些实施方案中，酶是被分类为EC 3.1.2.-的酰基-ACP TE。在一些实施方案中，野生型酰基-ACP TE被分类为EC 3.1.2.14。还提供了包含本文公开的任何核酸序列的载体或遗传构建体，包括表达载体。
在一些实施方案中，编码具有酰基-ACP-TE活性的多肽(例如，突变型酰基-ACPTE)的核酸与编码野生型酰基-ACP TE的核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，编码具有酰基-ACP-TE活性的多肽(例如，突变型酰基-ACP TE)的核酸与编码野生型酰基-ACP TE的核酸具有至少90％、95％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性。
实施方案还涵盖作为这些编码多肽的核酸序列的片段的核酸分子。所谓“片段”，是指编码多肽的一部分的核酸序列的一部分。在一些实施方案中，核酸已被密码子优化以表达本文所述的多肽中的任一种多肽。
一些实施方案涉及基本上由编码如上所述和本文其他地方所述的多肽的核酸序列组成或者由该核酸序列组成的核酸。在一些实施方案中，核酸序列是DNA序列，例如cDNA序列。在其他实施方案中，核酸序列是RNA序列。在一些实施方案中，核酸是编码本文所述的任何多肽的cDNA。编码多肽的核苷酸序列可通过本领域的技术人员众所周知的任何合适的技术(包括但不限于重组DNA技术和化学合成)来制备。合成多核苷酸可使用可商购获得的自动化多核苷酸合成仪制备。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码本文描述的多肽中的任一种多肽的序列，该序列可操作地连接到编码另一种蛋白的序列，该另一种蛋白可以是融合蛋白或被接头分开的另一种蛋白。在一些实施方案中，接头具有蛋白酶裂解位点，诸如Xa因子或凝血酶的裂解位点，该裂解位点允许相关的蛋白酶部分地消化本文所述的融合多肽，由此从中释放重组多肽。然后可以通过例如随后的色谱分离从融合伴侣中分离出释放的多肽。
如本领域众所周知的，一些实施方案提供了质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体形式或者包含质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的遗传组分的遗传构建体。遗传构建体可适合于在细菌或其他宿主细胞中维持和繁殖分离的核酸，以便通过重组DNA技术和/或如本文所述的核酸或编码多肽的表达(表达载体)进行操纵。
一些实施方案涉及包含编码本文所述多肽中的一种或多种多肽的DNA序列的重组表达载体。在一些实施方案中，表达载体包含可操作地连接到启动子的所述DNA序列中的一个或多个DNA序列。合适地，表达载体包含编码可操作地连接到一个或多个其他序列的本文所述多肽中的一种多肽的核酸。在一些实施方案中，表达载体可以是自我复制的染色体外载体(诸如质粒)，或者是整合到宿主基因组中的载体。病毒表达载体的非限制性示例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。例如，腺病毒载体可以是第一代、第二代、第三代和/或第四代腺病毒载体或无肠腺病毒载体。腺病毒载体可以产生非常高滴度的感染颗粒，感染多种细胞，有效地将基因转移到未分裂的细胞中，并且很少整合到宿主基因组中，从而避免了由于插入诱变产生细胞转化的风险。载体还可包括产生RNA的侧接多核苷酸的序列，所述侧接多核苷酸的序列包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这将允许将本文所述的多核苷酸引入宿主细胞的基因组中。
整合克隆载体可随机或在预定靶基因座处整合到其将要整合到宿主细胞的染色体中。
多肽的表达
可以使用本领域的技术人员已知的常规方法表达本文公开的任何多肽，包括突变体或变体多肽。一般来讲，对于在大肠杆菌中产生酰基-ACP TE，可以使用T7表达系统。可以将酰基ACP TE的基因在T7启动子的控制下克隆到载体中，并转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。然后可以通过向培养基中添加1mM IPTG来诱导表达。在一些实施方案中，可以使用通常包括以下项的表达载体来表达编码本文公开的任何多肽的核酸序列(例如，DNA序列)：编码启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号的控制序列以及任选的阻遏基因或各种激活基因。在一些实施方案中，表达载体任选地包含合适的转录终止子。在一些实施方案中，可操作地连接到编码多肽的DNA序列的聚腺苷酸化序列用于在真核细胞中表达。终止和聚腺苷酸化序列可合适地来源于或并非来源于与启动子相同的来源。本领域的技术人员将明白表达载体的哪种组合(包括载体的特定元件)可以与一种或多种宿主细胞一起使用以产生所需的多肽。在一些实施方案中，载体包含选择标记。选择标记是本领域众所周知的，并且将随所用宿主细胞而变化。合适的选择标记可以包括例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，这些基因使得用这些载体转化的细胞能够在存在这些抗生素的存在下生长。
在一些实施方案中，培养包含本文所述的载体的宿主细胞。在达到所需的细胞密度或多肽滴度后，停止培养并使用已知程序回收多肽。另选地，直接使用宿主细胞(例如，细胞团、悬浮液)，即不分离重组蛋白。
携带编码如本文所述的多肽的DNA序列的重组表达载体可以是任何载体，该载体可方便地经受重组DNA程序，并且载体的选择将通常取决于其要引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体，这些载体的复制与染色体复制无关。另选地，载体可以是在引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。
在载体中，DNA序列通常可操作地连接到合适的启动子序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示出转录活性的任何DNA序列，并且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。特别是在细菌宿主中指导编码本文所述的多肽的DNA序列的转录的合适启动子的示例是大肠杆菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、解芳烃卡斯特兰尼氏菌(Castellaniella defragrans)的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的示例是来源于编码以下项的基因的启动子：米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性LDH、黑曲霉酸稳定LDH、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。可以基于期望的结果选择启动子。核酸可以与组成型、组织优选型、诱导型或其他启动子组合，以在宿主细胞或生物体中表达。上述启动子列表并不意味着是限制性的。在实施方案中可以使用任何适当的启动子。
在一些实施方案中，所述表达载体还可包含合适的转录终止子，并且在真核生物中还可包含可操作地连接到编码本文所述多肽的DNA序列的聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可合适地来源于或并非来源于与启动子相同的来源。
在一些实施方案中，载体还可包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的示例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起始点。上述复制起始点列表并不意味着是限制性的。在实施方案中可以使用任何适当的复制起始点。
在一些实施方案中，载体还可包含选择标记。选择标记基因用于选择转化的细胞或组织，例如其产物与宿主细胞中的缺陷互补的基因，诸如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的dal基因，或者赋予抗生素抗性(诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记，诸如amdS、argB、niaD和sC，这些标记可产生潮霉素抗性，或者可通过共转化来完成选择。上述选择标记基因列表并不意味着是限制性的。在实施方案中可以使用任何选择标记基因。
用于上述宿主细胞的适当的培养基和条件是本领域已知的。虽然细胞内表达在一些方面可能是有利的，例如，当使用某些细菌作为宿主细胞时，但是可能优选的是表达是细胞外的或周质的。
酶活性和底物特异性
在一些实施方案中，本文所述的任何多肽与野生型酰基-ACP TE相比具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。在一些实施方案中，本文所述的任何多肽包含突变型酰基-ACP、基本上由突变型酰基-ACP组成或者由突变型酰基-ACP组成，突变型酰基-ACP相对于野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。在一些实施方案中，本文所述的任何多肽包含突变型酰基-ACP、基本上由突变型酰基-ACP组成或者由突变型酰基-ACP组成，突变型酰基-ACP相对于野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性。在一些实施方案中，本文所述的任何多肽包含突变型酰基-ACP TE、基本上由突变型酰基-ACP TE组成或者由突变型酰基-ACP TE组成，突变型酰基-ACP TE相对于野生型酰基-ACP TE具有改善的底物特异性。在一些实施方案中，本文所述的任何多肽包含突变型酰基-ACP、基本上由突变型酰基-ACP组成或者由突变型酰基-ACP组成，突变型酰基-ACP相对于野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性和/或对庚二酰基-ACP具有改善的底物特异性。
在一些实施方案中，多肽(例如，包含突变型酰基-ACP TE的多肽)相对于野生型酰基-ACP TE的活性具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或至少500％的酶活性增加。在某些实施方案中，酶活性是比活性，即突变型酰基-ACP TE与特定底物(例如，庚二酰基-ACP)的反应的酶活性。在一些实施方案中，如本文所述，当多肽在宿主细胞或生物体中表达时，酶活性增加使得7-AHA产生增加。
在一些实施方案中，多肽(例如，突变型酰基-ACP TE)的底物特异性相对于野生型酰基-ACP TE的底物特异性改善使得多肽可以以大于野生型酰基-ACP TE的kcat(s-1)将至少一种底物转化为至少一种产物。
在一些实施方案中，多肽(例如，突变型酰基-ACP TE)的底物特异性相对于野生型酰基-ACP TE的活性改善使得多肽可以以低于野生型酰基-ACP TE的Km将至少一种底物转化为至少一种产物。在一些实施方案中，改善的底物特异性是对庚二酰基-ACP的改善的底物特异性。
宿主细胞和生物体
可以使用已建立的技术将本文公开的任何核酸稳定地或瞬时地引入生物体(诸如宿主细胞)中，所述技术包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、与纳米线或纳米管接触、原生质球化、PEG 1000介导的转化、基因枪、乙酸锂转化、氯化锂转化等。
为了稳定转化，受试核酸通常将还包括选择标记，例如几种众所周知的选择标记(诸如新霉素抗性等)中的任何一种。一些实施方案涉及包含编码如本文所述的多肽的外源DNA分子(即野生型对应细胞中原本不存在的分子)的宿主细胞。在一些实施方案中，这些宿主细胞可以被描述为表达系统。用于表达的合适宿主细胞可以是原核或真核的。非限制地，合适的宿主细胞可以是哺乳动物细胞(例如，HeLa、HEK293T、Jurkat细胞)、酵母细胞(例如，酿酒酵母)、与或不与杆状病毒表达系统一起使用的昆虫细胞(例如，Sf9、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))或细菌细胞(诸如，大肠杆菌(Origami2(DE3)、BL21(DE3)))或牛痘病毒宿主。将遗传构建体引入宿主细胞(无论是原核还是真核)中是本领域众所周知的，例如，如Ausubel等人编辑的Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，Inc.，当前更新于2014年7月2日)中所述。
另一个实施方案涉及一种转化或转导的生物体或微生物体(即，工程化生物体)，诸如选自植物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫、藻类和转基因哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪)的生物体。微生物体包括来自古细菌、细菌和真核生物域的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物”与术语“微生物体”可互换使用。转化的生物体包括实施方案的DNA分子、包含DNA分子的表达盒或包含公开的实施方案的表达盒的载体，这些物质可稳定地结合或不稳定地结合到转化的生物体的基因组中。其他合适的生物体还包括合成细胞或如Venter等人的美国专利公开号2007/0264688中所述的通过合成基因组产生的细胞，以及如Glass等人的美国专利公开号2007/0269862中所述的细胞样系统或合成细胞。
在某些实施方案中，宿主是选自由以下项组成的组的原核生物：埃希氏杆菌(Escherichia)；梭菌(Clostridia)；棒状杆菌(Corynehacteria)；贪铜菌(Cupriavidus)；假单胞菌(Pseudomonas)；代尔夫特菌(Delftia)；芽孢杆菌(Bacillus)；乳杆菌(Lactobacillus)；乳球菌(Lactococcus)；以及红球菌(Rhodococcus)，或者选自由以下项组成的组的真核生物：曲霉属(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、耶氏酵母(Yarrowia)、伊萨酵母(Issatchenkia)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、Arxula和克鲁维酵母(Kluyveromyces)。
在一些实施方案中，宿主微生物体是原核生物。例如，原核生物可以来自细菌属埃希氏杆菌，诸如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)；来自细菌属梭菌，诸如扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌(Clostridium kluyveri)；来自细菌属棒状杆菌，诸如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；来自细菌属贪铜菌，诸如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自细菌属假单胞菌，诸如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonasoleavorans)；来自细菌属代尔夫特菌(Delftia)，诸如食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)；来自细菌属芽孢杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；来自细菌属乳杆菌，诸如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或者来自细菌属乳球菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
在一些实施方案中，宿主微生物体是真核生物(例如真菌，诸如酵母)。例如，真核生物可以来自真菌属曲霉属，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；来自酵母属酵母菌，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；来自酵母属毕赤酵母，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；来自酵母属耶氏酵母，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；来自酵母属伊萨酵母，诸如东方伊萨酵母(Issathenkia orientalis)；来自酵母属德巴利氏酵母，诸如汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)；来自酵母属Arxula，诸如Arxulaadenoinivorans；或者来自酵母属克鲁维酵母，诸如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。
酵母或真菌物种的示例性物种包括选自以下项的任何物种：酵母目酵母科，包括酵母属、克鲁维酵母属和毕赤酵母属；酵母目双足囊菌科，包括耶氏酵母属；裂殖酵母目裂殖酵母科，包括裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属；散囊菌目发菌科，包括曲霉属；以及毛霉菌目毛霉菌科，包括根霉(Rhizopus)属。宿主酵母或真菌的非限制性物种包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉、巴斯德毕赤酵母、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、解脂耶氏酵母等。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物体，因为它是适用于基因工程的特征明确的微生物体。其他特别有用的宿主生物体包括酵母，诸如酿酒酵母。应当理解，任何合适的微生物宿主生物体都可以用于引入代谢和/或遗传修饰以产生期望的产物。
本公开的另一个实施方案包括一种由本文公开的重组核酸序列制备多肽的方法，所述方法包括：a)提供宿主细胞或生物体的群体；以及b)在表达由本公开的核酸编码的多肽的条件下培养细胞或生物体的群体；以及c)分离所得的多肽。
可以使宿主细胞发酵以产生本文所述的具有酰基-ACP TE活性的多肽，或催化由本文所述的多肽催化的反应。发酵广义上是指由宿主细胞将有机物质转化为目标物质，例如通过使重组宿主细胞的培养物在包含碳源的培养基中繁殖由重组宿主细胞将碳源转化为脂肪酸或其衍生物。如本文所用，允许产生的条件是指允许宿主细胞产生所需产物(诸如脂肪酸或脂肪酸衍生物)的任何条件。类似地，表达载体的多核苷酸序列的条件是指允许宿主细胞合成多肽的任何条件。合适的条件包括例如发酵条件。发酵条件可以包括许多参数，包括但不限于温度范围、通气水平、进料速率和培养基组成。这些条件中的每一个单独地或组合地允许宿主细胞生长。发酵可以是需氧的、厌氧的或其变型(诸如微需氧)。示例性培养基包括肉汤或凝胶。一般来讲，培养基包括可以被宿主细胞直接代谢的碳源。另外，可以在培养基中使用酶以促进碳源的动员(例如，淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。对于小规模生产，可以使工程化宿主细胞以例如约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L的批次生长；发酵；并且诱导其表达所需的多核苷酸序列，诸如编码本文公开的包含突变型酰基-ACP TE的多肽的多核苷酸序列。对于大规模生产，可以使工程化宿主细胞以约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大的批次生长；发酵；并且诱导其表达所需的多核苷酸序列。另选地，可进行大规模补料分批发酵。
方法
本文所述的多肽、核苷酸和细胞/生物体可用于许多不同的应用。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在存在本文所述的多肽中的任一种多肽的情况下将庚二酰基-ACP酶促转化为庚二酸。
在相关的实施方案中，还提供了一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在合适的培养基中培养包含编码本公开的突变型多肽的核酸序列的宿主细胞，并回收庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA。在一些实施方案中，宿主细胞还可以包含编码在7-AHA的生物合成途径中催化不同反应的酶(例如，在产生7-AHA的途径中催化反应的酶，如图2所示)的核酸。可以使用的示例性重组酶包括但不限于催化庚二酰基-ACP甲酯转化为庚二酰基-ACP的庚二酰基-ACP甲酯酯酶(bioH)、催化庚二酸转化为庚二酸半醛的羧酸还原酶(CAR)以及将庚二酸半醛转化为7-AHA的转氨酶。
另一个实施方案涉及本文所述的多肽在产生合成聚合物中生产中间体(例如，7-AHA)的用途。在一些实施方案中，本文所述的多肽用于产生尼龙生产中的中间体。在某些实施方案中，本文所述的多肽用于产生尼龙7生产中的中间体。
产品
其他实施方案涉及通过本文公开的方法产生的生物来源的或发酵来源的产物，例如生物来源的庚二酸、庚二酸半醛和7-氨基庚酸或图2的任何产物。在相关的实施方案中，还提供了包含由使用本文公开的方法产生的任何生物来源的产物产生的化学品的产品。在一些实施方案中，所述产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、芳香剂或食品添加剂。
其他实施方案包括基于生物或发酵来源的产品，其中所述产品包括：(i)组合物，所述组合物包含：至少一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，或其盐，或它们的任何组合，所述化合物或其盐是在存在本文所述的任何多肽的情况下产生的，或者是由本文所述的任何多肽催化的反应的产物产生的；(ii)生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，所述聚合物包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或化合物，或它们的任何组合；(iii)生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，所述树脂包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物或生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，或它们的任何组合，或(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或它们的任何组合；(iv)物质，所述物质是通过模制以下项获得的：(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或它们的任何组合；(v)生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，所述制剂包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或(iv)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的物质，或它们的任何组合；或者(vi)生物来源的、基于生物的或发酵来源的半固体或非半固体料流，所述半固体或非半固体料流包含：(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，(i)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，(ii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，(iii)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，(v)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，或(iv)的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的模塑物质，或它们的任何组合。
组合物
一些实施方案涉及单独或组合(包括与野生型酰基-ACP TE组合)包含一种或多种公开的多肽或核苷酸的组合物。在一些实施方案中，组合物包含具有改善的酶活性和/或底物特异性的一种或多种公开的多肽。在一些实施方案中，组合物包含具有用于将庚二酰基-ACP转化成庚二酸的改善的比活性的一种或多种多肽。在一些实施方案中，组合物包含庚二酰基-ACP以及本文所述的一种或多种多肽。
在一些实施方案中，组合物由来自以下项的一种或多种公开的多肽构成：(1)商业供应商；(2)表达所述多肽的克隆基因；(3)复杂肉汤(诸如由于微生物菌株或任何其他宿主细胞在培养基中生长，其中菌株/宿主细胞将公开的多肽分泌到培养基中)；(4)如在(3)中生长的菌株/宿主细胞的细胞裂解物；和/或(5)表达公开的多肽的任何其他宿主细胞材料。组合物中公开的不同多肽可得自不同来源。
实施方案
设想了以下实施方案。设想了特征和实施方案的所有组合。
实施方案1：一种具有酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)活性的多肽或其功能片段，其中所述具有酰基-ACP TE活性的多肽相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。
实施方案2：根据实施方案1所述的实施方案，其中所述野生型酰基-ACP TE是被分类为EC 3.1.2.-的酰基-ACP TE。
实施方案3：根据实施方案1或2所述的实施方案，其中所述野生型酰基-ACP TE是被分类为EC 3.1.2.14的酰基-ACP TE。
实施方案4：根据实施方案1至3中的任何实施方案所述的实施方案，其中与位置5相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
实施方案5：根据实施方案1至4中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置35处的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。
实施方案6：根据实施方案1至5中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置38处的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代。
实施方案7：根据实施方案1至6中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置64处的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代。
实施方案8：根据实施方案1至7中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置241处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
实施方案9：根据实施方案1至8中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置45处的氨基酸被甲硫氨酸或异亮氨酸(I)或等效氨基酸取代。
实施方案10：根据实施方案1至9中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
实施方案11：根据实施方案1至10中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置175处的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。
实施方案12：根据实施方案1至11中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置33处的氨基酸被天冬氨酸(D)或等效氨基酸取代，并且位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
实施方案13：根据实施方案1至11中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置59处的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代，并且位置90处的氨基酸被苯丙氨酸(F)或等效氨基酸取代。
实施方案14：根据实施方案1至11中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置40处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代，并且位置111处的氨基酸被色氨酸(W)或等效氨基酸取代。
实施方案15：根据实施方案1至11中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置36处的氨基酸被甘氨酸(G)或等效氨基酸取代，并且位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
实施方案16：根据实施方案1至11中的任何实施方案所述的实施方案，其中位置32处的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代，并且位置40处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
实施方案17：根据实施方案1至16中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述多肽的氨基酸序列与所述野生型酰基-ACP TE的氨基酸序列具有至少50％的氨基酸序列同一性。
实施方案18：根据实施方案1至17中的任何实施方案所述的实施方案，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。
实施方案19：根据实施方案18所述的实施方案，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE对庚二酰基-ACP具有改善的底物特异性。
实施方案20：根据实施方案18所述的实施方案，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE具有至少10％的酶活性增加。
实施方案21：一种核酸序列，所述核酸序列编码根据实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽。
实施方案22：一种载体或遗传构建体，所述载体或遗传构建体包含根据实施方案21所述的核酸序列。
实施方案23：一种生物体或宿主细胞，所述生物体或宿主细胞包含根据实施方案22所述的载体或遗传构建体或其功能片段。
实施方案24：根据实施方案23所述的宿主，其中所述宿主是原核细胞。
实施方案25：一种组合物，所述组合物包含：根据实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽或其功能片段，或者编码实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽的核酸序列或其功能片段，或者包含实施方案21所述的核酸序列的载体或遗传构建体，或者包含实施方案22所述的载体或遗传构建体的生物体或宿主。
实施方案26：根据实施方案25所述的实施方案，所述组合物还包含庚二酰基-ACP。
实施方案27：一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-氨基庚酸(7-AHA)或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在存在根据实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽或其功能片段中的任一种的情况下将庚二酰基-ACP酶促转化为庚二酸。
实施方案28：一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在合适的培养基中培养根据实施方案23所述的宿主细胞，并回收所述庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物。
实施方案29：一种生物来源的庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物，所述生物来源的庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物是通过根据实施方案27或28所述的方法产生的。
实施方案30：一种产品，所述产品包含由根据实施方案29所述的生物来源的产物产生的化学品，其中所述产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、芳香剂或食品添加剂。
实施方案31：一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的产品，其中所述产品包含：i.组合物，所述组合物包含：至少一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，或其盐，或它们的任何组合，所述化合物或其盐是在存在根据实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽的情况下产生的，或者是由根据实施方案1至20中的任何实施方案所述的实施方案的多肽催化的反应的产物产生的；ii.生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，所述聚合物包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或化合物，或它们的任何组合；iii.生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，所述树脂包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物或生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或它们的任何组合，或ii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或它们的任何组合；iv.物质，所述物质是通过模制以下项获得的：ii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或它们的任何组合；v.生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，所述制剂包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，ii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或iv.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的物质，或它们的任何组合；或者vi.生物来源的、基于生物的或发酵来源的半固体或非半固体料流，所述半固体或非半固体料流包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，ii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，v.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，或iv.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的模塑物质，或它们的任何组合。
虽然已经详细描述了本公开，但在本公开的实质和范围内的修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。应当理解，上文和/或所附权利要求中列举的本公开的各方面以及各种实施方案和各种特征的各部分可整体或部分组合或互换。在各种实施方案的前述描述中，如本领域的普通技术人员将理解的，涉及另一个实施方案的那些实施方案可与其他实施方案适当地组合。此外，本领域的普通技术人员将理解，前述说明仅通过示例的方式，并非旨在限制本公开。本文引用的所有美国专利和出版物全文以引用方式并入。
实施例
以下实施例仅通过例示的方式而不是通过限制的方式提供。本领域的技术人员将容易地认识到可以改变或修饰以产生基本上相同或相似结果的各种非关键参数。
酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)在控制通过FAS途径的代谢流中起着至关重要的作用。具体地，酰基-ACP TE水解酰基-ACP的硫酯键以释放游离脂肪酸，从而在控制由脂肪酸合成(FAS)途径产生的脂肪酸的量和组成中起重要作用。该酶家族在代谢工程方面也引起了极大的兴趣，最近，酰基-ACP TE由于对产生脂肪酸作为生物燃料或生物可再生化学品的兴趣增加而吸引了甚至更多的关注。
先前提出了酰基-ACP TE利用由Cys、His和Asn组成的木瓜蛋白酶样蛋白酶催化三联体。然而，在研究的TE的活性位点附近未发现具有催化活性的Cys残基。对油酰基-ACP-TE(Pdb 20WN)的晶体学研究表明，残基Asp173、Asn175、His177和Glu211对硫酯酶活性起着至关重要的作用。这些残基对应于SEQ ID NO：1(Uniprot ID No.R5FQ35)(研究排名最前的一种TE)中的Asp167、Asn169、His171和Glu203。另外，Tyr177也被视为催化残基中的一个，因为其存在于提出的催化残基附近。活性和非活性酰基-ACP-TE的多序列分析表明，Asp167和His171是高度保守的。从Uniport Id No.R5FQ35获得的酰基-ACP-TE的三维模型显示了催化残基(图3)。分析还表明，Tyr177是保守的，并且该残基被脂肪族疏水残基取代会导致酶功能的大量丧失。另一方面，Glu203对酶的催化活性影响较小。最令人惊讶的是，这三个序列(Uniprot No.B1ZXQ1、D4KXX4和H7FRY9)显示了对于限定催化残基具有限制性的活性谱。该结果表明，除了这些残基外，其他残基也可能在催化中起重要作用。如下所述，本文所述的研究识别了酰基-ACP TE中可以增加酶活性和/或影响底物特异性的特定残基和特定残基分布。
硫酯酶的测试
在该研究中测试了171个TE的7-AHA合成。美国专利申请公开号20180023103中描述了体外和体内筛选硫酯酶活性的方法。发现54％的测试酶具有活性。基于TE酶的活性对TE酶进行排名，并进行多序列比对(MSA)。由MSA构建的系统树显示了TE在序列空间上的分布。前3个TE(来自体外数据)被分为3个簇。基于这种聚类，很难识别用于更高活性的明确参数。然而，分析表明，总活性TE中有63％是属于酰基-ACP水解酶类的酰基-ACP-TE(图4)，或更具体地是油酰基-ACP TE(EC 3.1.2.14)。该酶家族可以在存在水的情况下从酰基-载体蛋白上裂解硫酯键。
计算活性和非活性酰基-ACP-TE的位点特异性氨基酸分布。对所有酰基-ACP-TE进行MSA，并计算每个位置处每个单残基的分布。氨基酸种群表明，残基数5、35、38、64、175和241可能在TE的选择性和活性中起着至关重要的作用。分布曲线表明，与非活性酶相比，活性酶更倾向于在位置5、35和175处有极性更大的残基。有趣的是，活性酶中位置241处的氨基酸的电荷与非活性酶中该位置处的电荷相反，可以对酶活性产生重大影响(图4A)。
底物结合位点内的残基分布表明，三个残基可以显著有利于酶的活性。位置45处的残基Met和Ile以及位置128和175处的残基Tyr和Ser分别可能在决定硫酯酶活性中起重要作用(图4B)。除了结合位点内的残基分布外，还计算了这些位置之间的相关程度。
统计偶联分析(SCA)提供了相互偶联元素之间的相关性。该方法用于识别在进化过程中相互进化的两个残基之间的相关程度。例如，参见Shulman等人，“Structuraldeterminants of allosteric ligand activation in RXR heterodimers，”Cell 2004；116：417-429。另外，该方法提供了序列内具体位置的氨基酸统计分布。给定MSA，该算法可识别在蛋白质分子内观察到的相关残基。SCA方法通过选择位置y处最主要的残基来计算两个位置x和y的评分，并且定义仅由在位置y处具有该特定氨基酸的序列组成的子比对。使用完全比对的氨基酸(aa)分布与子集之间的差异来计算评分。
ΔG＝GI-GII
Figure BDA0002710752070000711
GI＝Nx/Ny(在y处存在特定aa的情况下，位置x处的aa分数)
GII＝Nx/N(总MSA)(位置x处的aa分数)；F＝每个aa对的观测频率
为了计算底物结合残基之间的相关性，将酰基-ACP-TE分为三个区段：高活性(＞100)、中活性(＞0且＜100)和非活性(低于0)。从高活性、中活性和非活性TE中选择前5个相关残基表明，每个系统的相关残基显著不同(图5)。然而，当将高活性酶的相关残基与其他两个系统进行比较时，获得了更好的图片。首先，发现这些残基在中活性酶中具有较低的相关性，并且在非活性酶中观察到这些残基的相关性显著丧失。具体地，在高活性酶中，残基Asp33和Tyr128高度相关，但在中活性酶中，Tyr128变为Met。此外，这两个位置在非活性酶中被两个不同氨基酸(Glu33和Leu128)占据(图5)。这些结果清楚地表明，酶结合位点中的残基相关性可以在酶的活性中起重要作用。考虑到位置相关性对更高活性的潜力，表3中所示的残基对可能在增加酶活性和/或改善酰基-ACP TE的底物特异性方面起重要作用。
总之，活性和非活性TE中的残基分布表明，位置5、35、38、64、175和241处的氨基酸以及位置45和128处的底物结合残基可能潜在地影响酰基-ACP TE的活性。Met45、Tyr128和Ser175是对底物特异性和活性重要的残基。此外，发现活性酶在几个残基中具有高度的相关性，这几个残基能够区分活性酶和非活性酶。残基对Asp33-Tyr128、Va159-Phe90、Glu40-Trp111、Gly36-Tyr128和Gln32-Glu40可能会对针对7-AHA的生物合成所研究的TE的底物特异性和催化活性有影响。
因此，在给定野生型酰基-ACP-TE的情况下，一个或多个特定位置处残基的改变会产生针对特定底物(例如，庚二酰基-ACP)的高活性酶。
这基于以下发现。具体位置处特定残基的较高出现率会对酶活性具有显著影响。给定位置处的特定残基也会影响酶活性，例如增加酶活性。具体位置处的优选残基的汇总在表2中提供。
Figure BDA0002710752070000721
底物结合也对具体位置处的残基具有显著偏好，如表3中提供。
Figure BDA0002710752070000722
还识别了底物结合位点处的相关残基。发现表4中提供的残基对高度相关。这表明在某个位置处存在一个残基可以优先地偏爱不同位点处的另一个特定残基。考虑了前5个高度相关的残基。对于非活性酶，发现这些残基之间的相关程度大大降低。
Figure BDA0002710752070000723
Figure BDA0002710752070000731
可以使用本领域的技术人员可用的定点诱变方法来改变一个或多个特定位置处的残基。

Claims (31)

1.一种具有酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)活性的多肽或其功能片段，其中所述具有酰基-ACP TE活性的多肽相对于野生型酰基-ACP TE包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个氨基酸取代位于占据与SEQ ID NO：1的位置5、32、33、35、36、38、40、45、59、64、90、111、128、175和241相对应的位置的氨基酸处。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述野生型酰基-ACP TE是被分类为EC 3.1.2.-的酰基-ACP TE。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述野生型酰基-ACP TE是被分类为EC3.1.2.14的酰基-ACP TE。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中与位置5相对应的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中位置35处的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中位置38处的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中位置64处的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中位置241处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中位置45处的氨基酸被甲硫氨酸或异亮氨酸(I)或等效氨基酸取代。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中位置175处的氨基酸被丝氨酸(S)或等效氨基酸取代。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中位置33处的氨基酸被天冬氨酸(D)或等效氨基酸取代，并且位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中位置59处的氨基酸被缬氨酸(V)或等效氨基酸取代，并且位置90处的氨基酸被苯丙氨酸(F)或等效氨基酸取代。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中位置40处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代，并且位置111处的氨基酸被色氨酸(W)或等效氨基酸取代。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中位置36处的氨基酸被甘氨酸(G)或等效氨基酸取代，并且位置128处的氨基酸被酪氨酸(Y)或等效氨基酸取代。
16.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中位置32处的氨基酸被谷氨酰胺(Q)或等效氨基酸取代，并且位置40处的氨基酸被谷氨酸(E)或等效氨基酸取代。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与所述野生型酰基-ACP TE的氨基酸序列具有至少50％的氨基酸序列同一性。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE具有增加的酶活性和/或改善的底物特异性。
19.根据权利要求18所述的多肽，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE对庚二酰基-ACP具有改善的底物特异性。
20.根据权利要求18所述的多肽，其中所述多肽相对于所述野生型酰基-ACP TE具有至少10％的酶活性增加。
21.一种核酸序列，所述核酸序列编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽。
22.一种载体或遗传构建体，所述载体或遗传构建体包含根据权利要求21所述的核酸序列。
23.一种生物体或宿主细胞，所述生物体或宿主细胞包含根据权利要求22所述的载体或遗传构建体或其功能片段。
24.根据权利要求23所述的宿主，其中所述宿主是原核细胞。
25.一种组合物，所述组合物包含：根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或其功能片段，或者编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽的所述核酸序列或其功能片段，或者包含根据权利要求21所述的核酸序列的所述载体或遗传构建体，或者包含根据权利要求22所述的载体或遗传构建体的所述生物体或宿主。
26.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物还包含庚二酰基-ACP。
27.一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-氨基庚酸(7-AHA)或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在存在根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或其功能片段中的任一种的情况下将庚二酰基-ACP酶促转化为庚二酸。
28.一种用于产生庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的任何产物的方法，所述方法包括以下步骤：在合适的培养基中培养根据权利要求23所述的宿主细胞，并回收所述庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物。
29.一种生物来源的庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物，所述生物来源的庚二酸、庚二酸半醛或7-AHA或图2的其他产物是通过根据权利要求27或权利要求28所述的方法产生的。
30.一种产品，所述产品包含由根据权利要求29所述的生物来源的产物产生的化学品，其中所述产品包括尼龙中间体、聚酯、药物、生物燃料、芳香剂或食品添加剂。
31.一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的产品，其中所述产品包含：
i.组合物，所述组合物包含：至少一种生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，或其盐，或它们的任何组合，所述化合物或其盐是在存在根据权利要求1至20中任一项所述的多肽的情况下产生的，或者是由根据权利要求1至20中任一项所述的多肽催化的反应的产物产生的；
ii生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，所述聚合物包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或化合物，或它们的任何组合；
iii.生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，所述树脂包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物或生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物或它们的任何组合，或ii的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或它们的任何组合；
iv.物质，所述物质是通过模制以下项获得的：ii的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，或iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或它们的任何组合；
v.生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，所述制剂包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，ii的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，或iv.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的物质，或它们的任何组合；或者
vi.生物来源的、基于生物的或发酵来源的半固体或非半固体料流，所述半固体或非半固体料流包含：i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的组合物，i.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的化合物，ii的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的聚合物，iii.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的树脂，v.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的制剂，或iv.的所述生物来源的、基于生物的或发酵来源的模塑物质，或它们的任何组合。
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