CN111926025A

CN111926025A - 一株经过密码子替换的基因ⅶ型新城疫病毒的拯救方法

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Publication number: CN111926025A
Application number: CN202010346610.2A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 王楠楠; 刘定祥; 黄梅; 杜倩茹; 叶俊贤; 罗琼
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: CN111926025B

Abstract

本发明涉及反向遗传操作技术领域，公开了一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。分别将新城疫病毒的NP、P和L基因以及表达T7 RNA聚合酶的DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40‑NP、pXJ40‑P、pXJ40‑L和pXJ40‑DE3；将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进pBR322质粒中得到pBR322‑DHN3；将NP基因编码区部分密码子统一替换成使用频率最高的密码子，替换到pBR322‑DHN3质粒上，形成新质粒pBR322‑mNPDHN3；采用上述5种质粒共转染BHK‑21细胞，得到拯救病毒rDHN3‑mNP。本发明方法更利于病毒的拯救和病毒致病机制的研究。

Description

一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法

技术领域

本发明涉及反向遗传操作技术领域，具体为一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种主要侵害鸡、火鸡、野禽及观赏鸟类的高度接触传染性、致死性疾病，俗称鸡瘟。属高度接触性、急性、烈性传染病。人类偶会感染，表现为结膜炎。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国农业部也将其列为必须通报的一类动物疫病。因其传播速度快且发病和病死率均可达100％，一旦波及将严重危害家禽业，造成不可估量的损失。

据流行病学调查，NDV的流行基因型随时间和地理环境而变化。上世纪20-50年代主要流性I-IV型，70年代首次发现V型主要在南美和中美以致全欧洲。80年代出现VI型并盛行于中东、亚洲和欧洲。85年VII型开始蔓延，并与VIII型流行于世界多个国家并在90年代导致在亚洲、非洲和中东的大流行。V-VIII型均为强毒。IX和X型尚局限在局部散发状态。由于针对IV型的疫苗得到了广泛应用，IV型NDV已得到良好控制。但针对其它基因型的疫苗尚欠缺从而均有流行的趋势。因此利用反向遗传克隆技术迅速开发针对实时流行株的高效、广谱、安全甚至多价的弱毒苗势在必行。此外，由于疫苗的广泛使用使疫检更加困难。因为无法甄别被感染鸡携带的是疫苗株还是野生毒株。通过重组方式可引入人工标签，使其能与野毒有效鉴别。

鸡新城疫病毒(NDV)属于单股负链RNA目，副粘病毒科副粘病毒属。该病毒具有一个双脂层囊膜，内衬一层M蛋白。膜外被具有纤突的糖蛋白(HN和F)包被使之外形呈花穗状。囊内含有由壳蛋白和一条负链RNA组成的长螺旋状核衣壳。新城疫病毒有6组基因，分别用于编码6个病毒蛋白，即具血凝素和神经氨酸酶活性的糖蛋白(HN)、具融合功能的糖蛋白(F)、非糖基化内膜蛋白(M)、核壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和高分子量蛋白(L)。 NDV基因全长为15186nt到15198nt。

已有研究表明将NDV的cDNA克隆作人工突变、更换，或在其中插入外源序列并不会阻碍该病毒的复制，装配和释放。NDV的cDNA克隆已用于基础研究和疫苗开发。NDV的 cDNA克隆可作为载体表达其它病原菌的抗原蛋白从而获得抗多种病原菌的多价疫苗。如1999年Peeters等将F基因裂解点作碱基突变使La Sota株弱毒变成了强毒(ref1)；2004 年Huang等将强度和弱毒株的HN基因互换也获得了不同毒力的新毒株(ref2)。2002年， Mebatson等用肝炎病毒的S2糖蛋白抗原表位基因取代NDV的NP蛋白优势抗原表位，成功获得了既抗NDV又抗肝炎病毒的杂合病毒(ref3)；2006年，Man等将H7禽流感病毒的 HA基因，插在NDVB1株的P-M基因之间也成功获得了既抗NDV又抗H7禽流感病毒的杂合病毒(ref4)。最近Abzeid等又成功将埃及当前流行的IBV S蛋白组装进重组NDV，获得了既针对原NDV又针对相应的IBV免疫保护的杂合病毒(ref5)。我国学者也用LaSota 株为载体先后获得多个具二价功能的杂合病毒。如既抗NDV又抗IBDV5杂合病毒(ref6)；既抗NDV又抗H5N1的杂合病毒(ref7)；既抗NDV又抗鸡支原体TM1病毒的杂合病毒(ref8)。由于NDV只有一个血清型，因此它的遗传性能相对稳定。虽然NDV的感染性cDNA克隆在国际上早有建立，但国内基本上仅限于Latasa株，且基本局限在基础和临床的研究层面。

在众多的科学研究中，与NDV致病性相关密切的HN基因、F基因研究的较为深入。但在众多的研究中NDV的NP基因的功能作用却寥寥。在NDV中，NP基因是病毒的核衣壳蛋白，与NDV病毒的复制和表达密切相关。在病毒粒子组装中NP基因又是参与数量最多的蛋白，故NP基因的正常复制和表达对于NDV病毒的复制和繁殖意义非凡，一旦NP基因的复制和表达变快或是变慢，对于NDV整个的病毒会产生什么影响，是需要探讨的问题。

现有的关于NDV的病毒拯救方案中多使用基因组的简单拼接，将拼接产物体外转录成 RNA，再将转录产物RNA通过电转或脂质体等方式转染进细胞中进行病毒的拯救。这种方式可能会导致：(1)每次拯救病毒都需要抽提大量的质粒，然后进行酶切拼接得到病毒全长基因组，通过这种酶切连接的方式不仅费时费力而且可能会产生一定的碱基缺失，最终无法获得病毒。(2)将拼接后的病毒基因组全长体外转录，在体外转录过程无法将环境完全模拟成细胞内环境，即便转录产物再次转染进细胞，次转录产物的工作效率无法估算。另外DNA 在体外转录成RNA后极不稳定，容易降解和突变，大大降低病毒的拯救效率。另外，现有的 NDV拯救方案中多数先感染禽痘病毒，以此在细胞中表达T7RNA Polymerase即T7RNA聚合酶，帮助病毒拯救。但此方法的弊端在于禽痘病毒的病毒同时存在细胞中，即便成功拯救出病毒在后期仍需要花费大量的时间精力纯化病毒。

NP基因是NDV基因组3’端编码的第一个基因，NP基因的翻译速度直接影响其后基因的翻译效率。本发明统计NP基因编码区密码子的使用频次，将编码同一氨基酸的密码子统一为一个密码子，以此将NP基因翻译过程中密码子的使用数量降为最小，改变NDV的翻译速度。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的改建和拯救方法。本发明的方法将病毒的基因组整合在pBR322质粒中，经验证整合了病毒全基因组的质粒能够稳定复制和表达。这样就省去了体外拼接的繁琐工作并大大降低了碱基缺失的可能性。且通过构建的质粒pXJ40-DE3能够在细胞中表达T7 RNA聚合酶，帮助病毒拯救。这样就不需要禽痘病毒的感染，后期也会省去大量的时间和经历在去除禽痘病毒上。并通过统计NDV基因组中NP基因编码区每个氨基酸密码子的使用频次，然后将NP基因部分编码区密码子统一替换成该区使用频率最高的密码子，将NP基因在翻译过程中使用的密码子种类降至最低。此种方法有两个优点：1.尽量避免因病毒基因组成分变化太大导致病毒拯救不出。2.在病毒蛋白表达不变的情况下，减少某些密码子的使用，改变病毒的翻译速度。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，包括如下步骤：

(1)将新城疫病毒的NP基因、P基因和L基因分别克隆进pXJ40载体，获得辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L；

(2)将能够在细胞中表达T7RNA聚合酶的DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40-DE3；

(3)将新城疫病毒的全基因组克隆进质粒pBR322-Base中，获得全基因组表达载体pBR322-DHN3；

(4)统计新城疫病毒NP基因中各密码子的使用频次，然后将NP基因编码区部分区域密码子统一替换成使用频率最高的密码子，得到替换后的NP基因序列，将替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上，形成新的质粒pBR322-mNPDHN3；

(5)采用步骤(1)的三种辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L，步骤(2)的质粒pXJ40-DE3和步骤(4)的质粒pBR322-mNPDHN3共转染BHK-21细胞，得到拯救病毒 rDHN3-mNP。

进一步地，所述新城疫病毒是指基因Ⅶ型新城疫病毒，其全基因组序列如序列表SEQ ID NO：1；NP基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-15192nt。

本发明所使用的载体质粒pXJ40是一个应用非常广泛的载体质粒，其具有丰富的酶切位点，在大量的质粒构造过程中采用pXJ40。本发明所用的载体质粒pXJ40来源于华南农业大学的群体微生物中心刘定祥教授实验室，其质粒示意图、序列表以及相应的制备来源均已在专利CN 110592108A予以公布。

进一步地，所述辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P通过如下方法获得：

(1)使用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pXJ40质粒，将切下的片段作为构建pXJ40-NP和pXJ40-P的质粒片段；

(2)使用引物pXJ40-NP-F和pXJ40-NP-R扩增NP基因，使用引物pXJ40-P-F和pXJ40-P-R 扩增P基因，然后将扩增出的产物再用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切；

(3)将步骤(1)的质粒片段分别与步骤(2)中酶切后的NP基因和P基因连接，得到辅助质粒pXJ40-NP和pXJ40-P；

两对引物序列分别如下：

pXJ40-NP-F：ACCGGAATTCGCCACCATGTCGTCTGTTTTTGACGAATACGAGC；

pXJ40-NP-R：ATATCTCGAGTCAGTACCCCCAGTCAGTGTCG；

pXJ40-P-F：ATATGAATTCGCCACCATGGCTACCTTTACAGATGCGGAG；

pXJ40-P-R：TATACTCGAGTCAACCATTCAGCGCAAGG。

进一步地，所述辅助质粒pXJ40-L通过如下方法获得：

(1)使用BamHI和PstI双酶切pXJ40质粒，将切下的片段作为构建pXJ40-L的质粒片段；

(2)设计四对带同源重组序列的特异性引物，分别扩增覆盖L基因完整序列的基因片段 L1、L2、L3和L4，其中片段L1的5’末端带有与pXJ40 BamHI端同源的同源臂，片段L4 的3’末端带有与pXJ40 PstI端同源的同源臂；

(3)将步骤(2)的L1、L2、L3和L4基因片段与步骤(1)双酶切后的载体pXJ40质粒片段添加在一起，在重组酶的作用下作同源重组，得到辅助质粒pXJ40-L；

所述L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表 SEQID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为 12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt；

所述四对带同源重组序列的特异性引物序列分别如下：

pXJ40-L1-F：5’-ACTCACTATAGGGCGAATTCGGATCCGGATGGTTGGGAGGACGACATTG-3’；

pXJ40-L1-R：5’-GGACAGTTGACTCATTGCTAACATA-3’；

pXJ40-L2-F：5’-TATGTTAGCAATGAGTCAACTGTCC-3’；

pXJ40-L2-R：5’-GTGAATGTAAGGCGACACTCTGTAG-3’；

pXJ40-L3-F：5’-CTACAGAGTGTCGCCTTACATTCAC-3’；

pXJ40-L3-R：5’-CGAATATCAGGTAACACTCCATATC-3’；

pXJ40-L4-F：5’-GATATGGAGTGTTACCTGATATTCG-3’；

pXJ40-l4-R：5’-TAAGATCTGGTACCGAGCTCCTGCAGGCGCACCAAACAGAGATTTGGT-3’。

进一步地，所述质粒pXJ40-DE3通过如下方法获得：

(1)使用BamHI和PstI双酶切pXJ40质粒，将切下的片段作为构建pXJ40-DE3的质粒片段；

(2)设计引物pXJ40-DE3-F和pXJ40-DE3-R从大肠杆菌BL21上扩增出能够表达T7RNA 聚合酶的基因序列DE3；

(3)将步骤(1)切下的质粒片段与步骤(2)的DE3基因在重组酶的作用下作同源重组，得到质粒pXJ40-DE3；

所述引物序列如下：

pXJ40-DE3-F：ACTCACTATAGGGCGAATTCGGATCCGCCATGAACACGATTAACAT CGC；

pXJ40-DE3-R：TAAGATCTGGTACCGAGCTCCTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTCCG ACTC；

所述DE3基因的序列见序列表SEQ ID NO：32。

进一步地，所述全基因组表达载体pBR322-DHN3通过如下方法获得：

(1)建立pBR322-Base载体：人工合成含有HC-1、T7启动子、HDV核酶、T7终止子和HC-2的基因片段，并插入到pBR322质粒中，获得基础质粒pBR322-Base；T7启动子下游的序列HC-1对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为15159-15192nt，HDV核酶上游的序列 HC-2对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为1-141nt，以提供重组所需的两个同源臂；

(2)构建过渡载体：所述过渡载体为质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3；所述质粒pBR322-PNP由片段NP、MINI、P构成；所述质粒pBR322-PDP由片段P、PD1、PD2、PD3构成；所述质粒pBR322-LPD3由片段PD3、L1、L2、L3、L4构成；

(3)构建病毒全基因组DHN3-A：将质粒pBR322-PNP、质粒pBR322-PDP、质粒pBR322-LPD3酶切得到片段PNP、PDP和LPD3，将片段PNP、PDP和LPD3通过T4链接酶连接得到病毒全基因组DHN3-A；

(4)构建带同源臂的质粒片段：以步骤(1)中的pBR322-Base载体为模板，使用含同源臂的引物A2-F和A2-R进行扩增，得到带同源臂的质粒片段；

所述引物序列如下：

A2-F:ATCGGTAGAAGGTTCCCTCAGGTTC；

A2-R:GGTCCTATAGTGAGTCGTATTAATG；

(5)构建全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤(4)中的质粒片段和步骤(3)中的病毒全基因组DHN3-A进行同源重组，得到全基因组表达载体pBR322-DHN3；

所述MINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置 14214-15192nt。

进一步地，步骤(4)中所述的部分替换是指替换NP基因编码区的第1-245位氨基酸，共735nt，对应序列表SEQ ID NO：1上的位置为122-856nt。以避免基因序列改变太大导致病毒不能有效拯救。

进一步地，步骤(4)中所述的部分替换过程中，若替换后会在序列在起始编码区附近产生新的起始密码子则不替换，以避免编码意外多肽，从而改变病毒的特征。

进一步地，步骤(4)中所述将替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上的步骤为：

(1)将pBR322-DHN3使用BsiWI和XbaI双酶切，回收目的片段；

(2)人工合成包含替换后的NP基因序列和BsiWI和XbaI双酶切位点之间序列的片段；

(3)将步骤(1)的目的片段与步骤(2)人工合成的片段进行连接，得到pBR322-mNPDHN3 质粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的方案将病毒的基因组整合在pBR322质粒中，经验证整合了病毒全基因组的质粒能够稳定复制和表达。这样就省去了体外拼接的繁琐工作并大大降低了碱基缺失的可能性。

(2)本发明中构建的质粒pXJ40-DE3能够在细胞中表达T7 RNA聚合酶，帮助病毒拯救。这样就不需要禽痘病毒的感染，后期也会省去大量的时间和经历在去除禽痘病毒上。

(3)本发明所采用的质粒共转染拯救病毒方法只需要一次转染，对细胞的损伤小，病变快，拯救效率高。

(4)本发明所应用的密码子替换方式为“亲”病毒本身而非“亲”某种细胞，这种替换方式是基于病毒本身的特点，更利于病毒的拯救和病毒功能的研究。

(5)本发明方法通过统计DHN3基因组NP基因编码区每个氨基酸的密码子的使用频次，然后将NP基因编码区部分区域密码子统一替换成使用频率最高的密码子。此种方法有两个优点：1.尽量避免改变病毒基因组原有的氨基酸序列导致病毒拯救不出。2.在病毒蛋白成分不变的情况下，改变密码子序列，观察其对病毒复制和宿主的影响。

附图说明

图1为实施例中提取病料RNA的鉴定结果图。

图2为实施例中纯化后的实验株病毒感染BHK-21细胞结果图。

图3为实施例中测序引物将DHN3基因组不等的分为10个部分的结构示意图。

图4为实施例中DHN3与NCBI上已发表的NDV序列进化树比较结果图。

图5为实施例中使用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pXJ40质粒的结构示意图。

图6和图7分别为实施例中pXJ40-NP和pXJ40-P的质粒示意图。

图8和图9分别为实施例中pXJ40-DE3质粒的PCR鉴定结果图(Marker:5000bp，目的片段2743bp)和酶切鉴定结果图(Marker:5000bp，目的片段4264bp,2671bp)。

图10为实施例中所得pXJ40-DE3的质粒示意图。

图11为实施例中所得pXJ40-L的PCR鉴定结果图。

图12为实施例中所得pXJ40-L的PstI酶切鉴定结果图。

图13为实施例中所得pXJ40-L的质粒示意图。

图14为实施例中BtgZI将DHN3不等的分为3个部分的结构示意图。

图15为实施例中用Hind III和NheI作双酶切质粒pBR322示意图。

图16～18分别为实施例中pBR322-PNP、pBR322-PDP和pBR322-LPD3的质粒示意图。

图19为实施例中pBR322-Base的质粒示意图。

图20为实施例中DHN3基因组设计图。

图21为实施例中pBR322-DHN3质粒阳性菌PCR鉴定结果图(Marker:2000bp；引物C-pBR322-R/C-NP-F；目的片段1698bp)。

图22为实施例中pBR322-DHN3 PCR鉴定阳性菌A1质粒的SacI酶切鉴定结果图(Marker:8000bp；目的片段：8482bp,7065bp,3132bp,908bp,32bp)。

图23为实施例中pBR322-DHN3的质粒示意图。

图24为实施例中病毒液rDHN3-mNP-P1感染BHK-21细胞结果图。

图25为实施例中NP基因编码区1-45nt与密码子替换后的序列二、序列三1-45nt比较结果图。

图26为实施例中待替换的合成序列在pBR322-DHN3上的位置示意图。

图27为实施例中合成序列克隆到质粒pUC57后的XbaI/HindIII双酶切验证结果图(Marker:4500bp，目的片段1440bp,2673bp)。

图28为实施例中Y0016495-1的质粒示意图。

图29为实施例中SacI酶切鉴定质粒pBR322-mNPDHN3图(Marker:1kb；目的片段：8482bp,7065bp,3132bp,908bp,32bp)。

图30为实施例中pBR322-mNPDHN3的质粒示意图。

图31为实施例中在BHK-21细胞上拯救病毒rDHN3-mNP 2天后细胞病变结果图。

图32为实施例中测序第十代rDHN3-mNP的NP基因和F基因结果图。

图33为实施例中所得NDV各毒株(DHN3、rDHN3、rDHN3-mNP)在不同时间点的TCID50曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例与附图对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例中所使用的主要仪器及试剂如下：

THZ-100型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；A17105653型洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；DK-8D型三孔电热恒温水槽购自上海一恒科学仪器有限公司；THZ-100型恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；BCD-579WE型海尔冰箱购自海尔；5424R型离心机、Eppendorf PCR仪、Thermo1300SERIES A2生物安全柜，均购自Eppendorf。

DNA/RNA共提试剂盒(AP-MN-BF-VNA-250G)购自AXYGEN；TIAN prep Mini PlasmidKit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Random 6primer (3801)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)， DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Streppenicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Primer star GXL(R050)购自TAKARA；BtgZ1(R0703S)，T4DNA Ligase(M0202M)购自NEB；其它限制性内切酶、链接酶均购自TAKARA；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113)购自诺维赞。

本实施例的一种经过密码子优化的新城疫病毒的拯救方法，包括如下步骤：

1.实验株病毒的选取、鉴定及纯化

1.1 实验株病毒的选取、鉴定

我们从广东某养鸡场获取一例嗜睡，精神萎靡，排黄绿色稀粪不久后死亡的鸡只，剖检其内脏，将肝脏碾磨后提取病料RNA，用特异性引物(JF-F：CCTTGCAGCTGCAGGAATT G，(SEQ ID NO：2)；JF-R：GCTCTATACAGTATGAGGTGTCAAG，(SEQ ID NO：3)；产物长度：913bp)检验后初步鉴定为NDV(鉴定结果如图1所示；图中M：2000bp marke r；1：鸭病毒性肝炎；2：鸡传染性支气管炎；3：鸡传染性法式囊炎；4：鸡新城疫；5：禽白血病；6：禽流感)。

1.2 实验株纯化

在剩余病料中添加适量生理盐水后碾磨充分，然后将混合液通过0.4μm滤器过滤，将滤液中添加1％双抗后接种到鸡胚绒膜尿囊腔中，添加量为100μl每枚，48h后收胚。将第一次收获的尿囊液以1000倍稀释，继续繁毒。继续繁毒过程不再添加双抗，(原毒第一次繁毒未做稀释处理)待鸡胚死亡后收获尿囊液。再将第二次繁毒收获的尿囊液稀释1000倍，以每胚 100ul接种。按此法反复盲传三代后收集尿囊液作为毒种置-20℃保存备用。

将盲传后的病毒在BHK-21细胞上进行噬斑纯化，纯化后的病毒命名为DHN3。具体操作如下：

使用双蒸水配置3％琼脂糖溶液，高压后置4℃备用。使用前用微波炉加热2～3分钟融化并按3％琼脂糖(2ml)+2％FBS DMEM(24ml)配制成琼脂糖液，将其置40℃干浴待用。配置2％FBS+DMEM+1％SP抗生素培养液备用。将反复繁毒后得到的第三代尿囊液病毒用DMEM培养液按1：10稀释成6个梯度，制得感染液10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6备用。将BHK-21细胞置6孔板中培养，待细胞长至90％后用PBS洗三次，然后分别加入上述感染液200μl，另补DMEM培养液800μl，使每孔终体积为1ml。轻轻摇匀后置37℃孵育2h。弃去孵育液，再用PBS洗三次，弃取清洗液，每孔加入琼脂糖液2.5ml。4-6天后观察噬斑。挑选一颗大小均匀的噬斑重新感染BHK-21细胞，结果如图2所示，待细胞完全病变后反复冻融细胞三次，收获病毒，并将收获的病毒命名为DHN3。

2.实验株病毒的全基因组测序

2.1 将实验株病毒不等分为10个片段进行扩增：

提取纯化后病毒DHN3的RNA，用非特异性引物(Random6primer(3801))作逆转录，获得第一条cDNA。再分以此cDNA为模板用特异性引物和Ex Taq酶作PCR扩增。这些特异性引物(从NCBI上下载已发布的NDV病毒基因序列，选取其同源区设计引物扩增DHN3 基因组序列)共10对，将DHN3病毒基因组不等的分为10个部分(如图3所示)，我们将经这10对引物扩增出的片段分别命名为：NP、MINI、P、PD1、PD2、PD3、L1、L2、L3、 L4。将这10对引物扩增出的片段做琼脂糖凝胶电泳回收，然后将回收的片段与pMD19载体连接，再进行测序。(各部分对应的质粒名称和对应的引物序列以及扩增片段大小见表1；各质粒名称及其扩增反应条件以及扩增片段在DHN3基因组中的位置见表2)。

表1 DHN3全基因扩增引物

表2 DHN3全基因扩增各片段反应程序

通过NCBI Blast软件将测序结果与已发表的所有NDV序列比对(如图4所示)，其结果显示此DHN3全基因组全长15192nt，相应序列表见SEQ ID NO：1，属II类VII型NDV。

为了保证序列准确无误，上述实验从病毒感染到测序结果分析反复重做了3次。其测序结果均相同，证实由这个噬斑获得的是一株纯化的DHN3病毒株。

3.构建辅助性质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L及质粒pXJ40-DE3

下面首先对构建辅助性质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L及表达表达T7RNAPolymerase 的质粒pXJ40-DE3的原因进行说明。

i.NDV为负链RNA病毒，负链RNA病毒的基因组不像正链RNA病毒的基因组能够在宿主酶的作用下进行复制增殖。负链RNA病毒在进入宿主细胞后需要辅助蛋白的协助才能启动转录和翻译，故而在做反向遗传拯救病毒时我们需要提前构建能够表达蛋白的质粒。对于NDV，其辅助蛋白为NP蛋白，P蛋白，L蛋白。

ii.DNA转录成RNA，RNA再翻译成多肽。我们在做反向遗传病毒拯救时是把环形的质粒DNA转染进细胞内，环形DNA质粒在细胞中转录成RNA，再在辅助蛋白的帮助下形成有活性的能够在宿主系统中复制增殖的病毒粒子。我们在含有DHN3基因组的质粒 pBR322-DHN3中添加有T7启动子启动转录(质粒pBR322-DHN3的具体组成将在下文详细描述)，这个T7启动子需要T7RNA聚合酶作用才能启动转录。故而我们构建了能够表达T7RNA聚合酶的质粒pXJ40-DE3.

iii.将NP、P和L基因分别克隆进pXJ40载体中获得辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L。pXJ40质粒含CMV启动子和T7启动子以及SV40多聚腺嘌呤A片段，因此外源基因可在细胞DNA聚合酶II或T7RNA聚合酶的作用下被有效转录，然后翻译成用以组装活性病毒粒子的蛋白NP、P、和L蛋白。

3.1 pXJ40-NP、pXJ40-P质粒的构建

3.1.1 使用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pXJ40质粒(如图5所示)，将切下的片段(4288bp) 作为构建pXJ40-NP,pXJ40-P的质粒片段。

3.1.2 使用pXJ40-NP-F/pXJ40-NP-R扩增NP片段(R050，60℃退火温度，1min30s延伸时间)。使用pXJ40-P-F/pXJ40-P-R扩增P基因(R050，退火60℃，延伸1min15s)。扩增 NP、P基因的两对引物中引物pXJ40-NP-F和引物pXJ40-P-R中已包含EcoR Ⅰ的酶切序列；引物pXJ40-NP-R和引物pXJ40-P-R序列中已包含有Xho Ⅰ序列。这样，使用这两对引物分别扩增NP和P基因，扩增出的产物在两端便分别含有EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点。将使用这两对引物扩增出的产物再经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，这样酶切后的产物便含有EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 的粘性末端。相应质粒、模板及引物对应表如表3所示。

3.1.3 将3.1.1制备的质粒片段分别与EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的NP、P片段连接转化进 DH5α中，挑菌验证。如此便构建成了质粒pXJ40-NP、pXJ40-P(pXJ40-NP、pXJ40-P质粒图谱见图6和图7)。

表4为质粒pXJ40的酶切过程及NP、P基因扩增产物的酶切过程。表5为NP、P基因的酶切产物与pXJ40质粒的酶切产物的连接过程。需要指出的是NP、P基因的PCR产物和酶切产物以及pXJ40质粒的酶切产物都是经过了琼脂糖电泳胶回收后再进行的下一步操作。

表3 质粒pXJ40-P、pXJ40-NP构建引物

表4 质粒pXJ40及NP、P基因扩增产物的酶切过程参数表

表5 质粒pXJ40-NP、pXJ40-P连接体系

3.2 构建质粒pXJ40-DE3

3.2.1 设计引物扩增DE3片段

已知大肠杆菌BL21能够表达T7 RNA聚合酶，我们设计引物pXJ40-DE3-F和pXJ40-DE3-R将能够表达T7 RNA聚合酶的序列扩增下来(pXJ40-DE3-F：ACTCACTATAGGGCGA ATTCGGATCCGCCATGAACACGATTAACATCGC，(SEQ ID NO：30)；pXJ40-DE3-R:T AAGATCTGGTACCGAGCTCCTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC，(SEQ ID NO： 31))。使用上述引物从大肠杆菌BL21上扩增出能够表达T7 RNA Polymerase的基因序列 (该段基因简称为DE3，相应基因序列见SEQ ID NO：32)，再利用同源重组的方法把扩增下的片段插入到质粒pXJ40中。DE3片段的扩增使用的是GXL酶(R050)，退火温度60℃，延伸时间2min36s，片段大小为2652bp。

3.2.2 使用PstI，BamHI酶切质粒pXJ40，相应酶切程序如表6所示。将切下的目的片段 (4270bp)与从大肠杆菌中扩增下的DE3片段进行同源重组(已知在设计引物扩增DE3片段时引物的序列中已经加入了质粒pXJ40的同源区)，构建的同源重组体系如表7所示。

表6 质粒pXJ40酶切程序

表7 质粒pXJ40-DE3质粒同源重组体系

将片段同源重组后转化入DH5α中，在具有氨苄抗性的平板中筛选。至第二日从平板上挑选8个阳性菌落使用PCR的方法验证。验证引物为pXJ40-F:GCAACGTGCTGGTTATTGTG，(SEQ ID NO：33)；DE3-R:GAAGTCCGACTCTAAGATGTCACG，(SEQ ID NO： 34)；使用Ex Taq酶(RR902)，退火温度57℃，延伸2min42s(目的片段大小为2723bp)。 PCR和酶切鉴定结果显示获得3个阳性菌(如图8和图9所示)，将其扩大培养后提取质粒，将测序结果无误的质粒pXJ40-DE3及其菌液保存留用(pXJ40-DE3质粒图谱如图10所示)。

3.3 构建辅助质粒pXJ40-L

前述测序质粒pMD19-L1、pMD19-L2、pMD19-L3和pMD19-L4覆盖了完整的DHN3 的L基因。通过设计4对带同源重组序列的特异性引物(见表8)，分别以pMD19-L1， pMD19-L2，pMD19-L3和pMD19-L4为模板，扩增出能将L完整序列克隆进pXJ40载体的4 个片段L1、L2、L3和L4。片段L1的5’末端同时带有与pXJ40 BamHI端同源的同源臂，片段L4的3’末端则带有与pXJ40PstI端同源的同源臂。将载体pXJ40用BamHI和PstI双酶切，再通过胶纯化回收目的片段(4270bp)。将上述4个片段和BamHI/PstI双酶切后的载体pXJ40 片段添加在一起，在重组酶(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113))的作用下作同源重组，得到重组产物pXJ40-L(重组成分表如表9所示)。

将重组产物转化进DH5α细胞，经单菌落PCR筛选。用引物PXJ40-F(pXJ40-F:GCAACGTGCTGGTTATTGTG，(SEQ ID NO：33))/pXJ40-L1-R(pXJ40-L1-R:GGACAGTTGACTCATTGCTAACATA，(SEQ ID NO：35))扩增出正确的PCR产物为2110bp，检测8 个菌落，8个阳性菌均产生了正确分子量的PCR产物(如图11所示)；进一步将其中一株菌培养扩增，提取质粒DNA。再经PstI酶切，正确的酶切产物应为6230bp和5081bp(酶切鉴定结果见图12)，经测序再次验证后证实该质粒序列与目的序列一致(pXJ40-L质粒图谱见图13)。

表8 用于建立pXJ40-L的PCR引物

表9 质粒pXJ40-L重组体系

本实施例中主要使用的两种酶(R050/RR902)的使用说明如下表10所示。

表10 本发明中两种PCR反应使用酶的使用说明

所涉及到的PCR反应体系的配制及反应程序的设定均按照下述方法进行：

1.R050PCR反应程序

2.RR902PCR反应程序

在RR902使用过程中退火温度将根据具体引物调整，延伸时间也将根据具体片段大小按照1kb/min的比例实施；R050酶在使用过程中，本发明中延伸温度全部为60℃(根据酶的性质决定)，而延伸时间则按照1kb/min根据具体情况实施。

本发明中在DHN3全长测序中使用的酶均为RR902(除MINI片段扩增使用的酶为R050)，在构建质粒过程中使用的酶均为R050。下面将不再详述PCR反应的过程。

4.构建体三个过渡性质粒pBR322-PNP、pBR322-PDP、pBR322-LPD3及包含病毒DHN3全基因组的质粒pBR322-DHN3

4.1 构建过渡性质粒pBR322-PNP、pBR322-PDP、pBR322-LPD3

DHN3全基因组共15192nt，如将全长cDNA一次性通过RT-PCR获得，一是困难，(一般市场可买到的DNA聚合酶很难合成大过10k的DNA片段)，二是容易在PCR过程中引入随机突变。因此将DHN3全基因组分成3个片段，将其分别克隆到pBR322载体。片段的大小是基于DHN3基因组本身所持有的BtgZI酶切位点来确定的(BtgZI将DHN3不等的分为3个部分的结构示意图如图14所示)，以利于随后的体外DNA片段连接。

具体构建方法如下：

A.制备质粒片段：将pBR322载体用Hind III和NheI作双酶切(如图15所示)，然后经胶回收备用，双酶切后回收的pBR322质粒目的片段大小为4161bp。

B.制备目的基因片段：分别用带同源臂的引物和相应的模板(见下表11)在高保真R050的作用下扩增带同源臂的DNA片段，经跑DNA胶验证后回收备用。

C.将获取目的片段与酶切后pBR322的质粒片段用重组酶重组(见下表12)。经感受态细胞DH5α转化，单菌落PCR初选，扩增质粒DNA，酶切质粒DNA后跑DNA胶复选，最后测序验证。

参与构建pBR322-PNP质粒的基因组片段包括NP、MINI和P。

参与构建pBR322-PDP质粒的基因组片段包括P、PD1和PD2，PD3。

参与构建pBR322-LDP质粒的基因组片段包括L1、L2、L3、L4和PD3。

以上3个中间质粒分别图16～18所示，其中图16为pBR322-PNP质粒示意图；图17为pBR322-PDP质粒示意图；图18为pBR322-LPD3质粒示意图。

表11 目的片段所涉及的模板和引物表

表12 各质粒的重组体系

备注：

1.在分别扩增完构建pBR322-PNP质粒、pBR322-PDP质粒、pBR322-LPD3质粒所需要的目的片段后，根据上表12的重组体系进行混合，之后按照同源重组的步骤进行操作，构建相应质粒。

2.由pBR322-DHN3质粒构建策略可知，病毒基因组中包含两个BtgZI酶切位点，根据这两个酶切位点将病毒全基因组分成3个大片段，此即我们构建pBR322-PNP、pBR322-PDP、 pBR322-LPD3三个质粒中所包含的三个大片段。同时在对病毒基因组进行基础测序时将病毒全基因组分成10个小片段(NP,P,PD1,PD2,PD3,L1,L2,L3,L4)，BtgZ Ⅰ酶切位点刚好处于P片段和PD3片段的重叠区，故在构建pBR322-PNP、pBR322-PDP、pBR322-LPD3质粒时扩增P 片段和PD3时以P左、P右、PD3左、PD3右来代称。

3.由于L蛋白是NDV病毒的核衣壳蛋白，所以在完成质粒pMD19-L1、pMD19-L2、pMD19-L3、pMD19-L4后首先构建了质粒pXJ40-L，用作拯救病毒的辅助性蛋白。故而在构建pBR322-LPD3质粒时使用的模板之一是pXJ40-L，此质粒已经包括了L基因的全部序列。

在构建pBR322-LPD3过程中将L基因分作2段扩增，称之为L1-2、L3-4，(其中L1-2是指小片段L1和L2的连续序列，其由引物C-L1-R、pXJ40-L2-R，模板为pXJ40-L；L3-4 是指小片段L3和L4的连续序列，由引物pXJ40-L3-F、C-HindBtNot-L4-F模板pXJ40-L扩增得到)。并且需要指出的是在扩增L3-4的引物C-HindBtNot-L4-F中包含构建pBR322-DHN3 质粒时所需的同源区以及一个BtgZ Ⅰ酶切序列，这样便可以通过BtgZ Ⅰ将pBR322-LPD3中的病毒基因组序列完整切下，并且切下的片段直接用于pBR322-DHN3质粒的构建。

4.上表12中pBR322-PNP质粒、pBR322-PDP质粒、pBR322-LPD3质粒的构建过程中所涉及到的PCR扩增反应使用到的酶全部为Prime STAR GXL DNA Polymerase(R050,TAKARA)，反应体系参考前面所述。

5.本发明中涉及到的所有同源重组方法，使用的试剂盒均为Clon ExpressMultis One Step Cloning Kit(C113，诺维赞)，将不再赘述。

4.2 构建pBR322-Base载体

为获得重组病毒，首先需建立1个能获得全基因组单股负链RNA的基础质粒(pBR322-Base)。为了获得较高的转录水平且保证由此转录的RNA不含任何外源核糖核酸，在pBR322质粒上分别引入1个T7启动子，1个T7终止子以及1个HDV核酶，使之最终能在外源的T7RNA聚合酶的作用下准确合成DHN3全基因组负链全长RNA。我们在设计合成pBR322-Base质粒时，在T7启动子的下游和HDV核酶的上游分别多合成了一段病毒基因组的序列，以作为同源重组的同源区。其中，T7启动子下游添加的序列为HC-1，对应的病毒基因组中位置为15159-15192。HDV核酶上游添加的序列为HC-2，对应的病毒的基因组中的位置为1-141，以提供重组所需的两个同源臂。含T7终止子和HDV核酶，HC-2，HC1, T7启动子的DNA片段通过人工合成，并通过同源重组的方式组合到pBR322载体上获得 pBR322-T7Pro-HDVTer(即基础质粒pBR322-Base)，质粒示意图如图19所示，按此方式组装的DHN3基因组如图20所示。

4.3 构建全基因组表达载体pBR322-DHN3

4.3.1 制备片段DHN3-A

制备DHN3-A片段：从pBR322-PNP质粒、pBR322-PDP质粒、pBR322-LPD3质粒上酶切回收片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3；并将片段PNP、片段PDP，以及片段LPD3 连接得到全长DHN3-A备用。具体来说，参考下表13，pBR322-PNP质粒用BtgZI和HindIII 双酶切后回收片段PNP；从pBR322-PDP质粒回收片段PDP的方法为：pBR322-PDP质粒用 BtgZI单酶切后回收片段PDP；从pBR322-LPD3质粒回收片段LDP3的方法为：pBR322-LPD3 质粒用BtgZI单酶切后回收片段LPD3；

表13 各质粒片段的酶切体系

备注：

1.片段PNP、片段PDP、片段LPD3的制备按照上表中的酶切体系及时间操作；酶切结束后，可取少量作凝胶电泳观察酶切是否完全，如不完全，需适当多加一点酶或延长孵育时间，或二者兼备；

2.片段PNP的制备需要HindIII和BtgZ Ⅰ两个酶的切割。需要指出的是这两个酶切反应是分别进行的，不是同时进行。即先使用HindIII酶切，琼脂糖电泳胶回收到目的产物后再使用BtgZI酶切。所以上表中的PBR322-PNP’指的是HindIII酶切后的产物。

3.制备含0.03％全式金染色液的0.6％琼脂(TsingKe,TSJ001)凝胶。取0.6微克琼脂加 100毫升TAE缓冲液置微波炉加热1-2分钟至琼脂完全融化，待冷却至50℃左右加全式金染色液(按1∶3000倍稀释)混匀后铺胶。注意染色剂加多了可能抑制DNA片段的链接。将上述的酶切产物全部经上述的凝胶电泳分离。将凝胶置于清洁的玻璃平板上，用一次性不锈钢刀片将正确的目的片段切下回收。用GelExtractionKit(D2500-02，OMEGA)按试剂盒提供的方法进行纯化。

4.所述片段PNP、片段PDP、片段LDP3通过高浓度T4链接酶作体外连接，获得全长DHN3-A。连接具体参数参考表14。将连接产物直接进行试剂盒(Mini BEST DNA fragmentpurification kit Version4.0，TAKARA，9761)纯化，纯化产物待用。

表14 DHN3-A连接体系

4.3.2 制备带同源臂的质粒片段

用上述pBR322-Base质粒为模板，使含同源臂的引物A2-F/A2-R(A2-F：ATCGGTAGAAGGTTCCCTCAGGTTC，(SEQ ID NO：61)；A2-R：GGTCCTATAGTGAGTCGTATTAA TG，(SEQ ID NO：62))，使用高保真酶R050进行PCR扩增。用上述纯化试剂盒(Mini BESTDNA fragmentpurification kit Version4.0，TAKARA，9761)，按试剂盒提供的方法进行对本步骤的PCR扩增产物进行纯化，制得带同源臂的质粒片段。

4.3.3 重组质粒pBR322-DHN3

将构建的含有同源臂的质粒片段与DHN3-A进行同源重组得到全基因组表达载体pBR322-DHN3。具体参数可参考表15。

表15 质粒片段与DHN3-A同源重组的配方表

试剂	用量
		DHN3-A	200ng
pBR322-Base	91.02ng
		5×CE MultiS Buffer	4μl
Exnase MultiS	2μl
		ddH<sub>2</sub>0	up to 20μl

将重组产物转化入DH5α感受态细胞。用特异性引物C-pBR322-R：GAAATTGCATCAACGCATATAGCGC，(SEQ ID NO：63)；C-NP-F：CATCTGGTTGCCCTTGCGGCTTGTT C，(SEQ ID NO：44)作单菌落PCR，获3个阳性菌落A1-A3，结果如图21所示。将A1 作扩增培养并提取质粒DNA。将A1质粒用Sac1酶切作初步鉴定，正确的酶切产物应是1 个8482bp、1个7065bp、1个3132bp、1个908bp和1个32bp的片段，结果如图22所示，显示该酶切产物与序列推断的结果一致。32bp片段太小无法在琼脂电泳胶中显示。命名该质粒为pBR322-DHN3(质粒图谱见图23)。将此质粒再次测序，验证无误后扩增备用。

5.在BHK-21细胞上拯救病毒rDHN3

将BHK-21细胞置30mm培养皿培养，待细胞长至80％左右时准备转染。用pBR322-DHN3、pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L、pXJ40-DE3共转染(各用量见表16)。4天后细胞融合征兆不清楚。将培养皿置-20℃冰箱冻融2次后将细胞和培养液收集至无菌离心管，离心12000rpm 10分钟，收集上清。将病毒液(rDHN3-P1)100μl继续感染BHK-21细胞，2-3 天后可见细胞融合病变(见图24)。继续培养1天后将培养皿置-20冰箱冻融2次，再收集离心12000rpm 10分钟。收集上清。取收集的病毒液100μl接种9日龄SPF鸡胚，鸡胚在 48h左右死亡。收获鸡胚尿囊液，提取病毒RNA，使用JF-F：CCTTGCAGCTGCAGGAATT G，(SEQ ID NO：2)；JF-R：GCTCTATACAGTATGAGGTGTCAAG，(SEQ ID NO：3) 扩增NDV病毒F基因，检测到目的条带。

表16 DHN3病毒拯救各质粒使用情况

质粒	用量
		pXJ40-NP	2.5μg
pXJ40-P	1.25μg
		pXJ40-L	1.25μg
pXJ40-DE3	3μg
		pBR322-DHN3	4μg

6.构建质粒pBR322-mNPDHN3

在本小结中我们将pBR322-DHN3上NP基因的密码子替换，形成新的质粒 pBR322-mNPDHN3。若想完成这个质粒的构建我们将1.统计DHN3基因组中NP基因中各密码子使用的频次，并且将密码子部分替换成使用相应氨基酸使用频率最高的密码子。2.合成替换后的基因序列。3.将合成后的序列替换到pBR322-DHN3质粒上，形成新的质粒 pBR322-mNPDHN3。下面将分别详细介绍：

6.1 统计DHN3基因组中NP基因所有编码区密码子，如下表17。

表17 DHN3病毒基因组NP基因中编码区各密码子使用频次统计

如表17所示，我们对DHN3的NP基因编码区密码子做了统计，括号内数字代表其前密码子在NP基因中出现的次数(下面要做两点说明：1.本发明中统计的仅为DHN3基因组NP基因的编码区密码子。2.本发明中在进行密码子替换时为避免基因序列改变太大导致病毒不能有效拯救，故本发明仅替换了NP基因编码区的第1-245位氨基酸密码子序列，共735nt，对应的DHN3基因组上的位置为122-856nt。按照表17统计结果替换后的序列名为序列二(具体序列见SEQ ID NO：64)。但是按照此种方式替换后会导致替换后序列的17-19nt，23-25nt 为“ATG”，如图25所示，替换后的序列在起始编码区多2个起始密码子，可能会多编码1 或2条多肽。为避免这些可能产生的多肽对病毒拯救产生影响，故决定不对此对应的氨基酸进行替换。此17-19nt序列对应的NP编码区第6位Asp氨基酸仍然使用“GAC”而不使用统计后的使用频率最高的“GAT”；此23-25nt对应的NP基因编码区第8位氨基酸Tyr仍然使用“TAC”而不使用表17中频次出现最高的“TAT”。除去这两处外，其余碱基均按照替换后的密码子统一，统一后的序列名为序列三(具体序列见SEQ ID NO：65))

6.2 合成密码子替换后的基因序列，构建pBR322-mNPDHN3质粒

我们将密码子替换后的基因序列发送至广州擎科科技有限公司合成，广州擎科生物有限公司将合成的序列通过TA连接的方式连接到载体pUC57中(订单编号QNB0020670-1)。再将连接产物转化进TOP10感受态细胞中，挑选单克隆阳性菌落，经测序验证正确后。再将阳性菌落扩大培养后抽提质粒，经BsiWI/XbaI双酶切后回收合成的片段待用(合成序列名为序列四，具体序列见SEQ ID NO：66)。

具体步骤如下：

6.2.1 选取pBR322-DHN3质粒上的BsiWI/XbaI做为目的片段接入的酶切位点(BsiWI位于pBR322-DHN3的第4416-4421位，XbaI位于pBR322-DHN3的第5894-5899位)。将pBR322-DHN3使用BsiWI/XbaI双酶切，回收目的片段18141bp。

6.2.2 准备合成序列。现拟用pBR322-DHN3上BsiWI/XbaI两个酶切位点，则合成序列除包括替换后的序列三，还需要包括原序列上到两个酶切位点之间的序列(见图26)即pBR322-DHN3质粒片段的4416-4484位和5220-5899位，共计749bp，加上替换的序列735bp，则共计合成合成1484bp(最终合成序列见SEQ ID NO：66)。

6.2.3 将合成的序列通过TA连接克隆到质粒pUC57中，将连接产物转化入TOP10感受态细胞中。挑去阳性菌使用XbaI/HindIII酶切验证(见图27)，无误，再经测序，获得目的序列在pUC57质粒中，形成新质粒Y0016495-1(见图28)。再将质粒Y0016495-1经BsiWI/XbaI酶切后，获得合成片段1484bp，将回收的片段与6.2.1中制备的片段进行连接，将连接产物转化进TOP10感受态细胞中，挑选阳性菌落使用SacI酶切验证(见图29)，无误，再经测序验证无误，得到质粒pBR322-mNPDHN3(质粒示意图见图30)。

7.在BHK-21细胞上拯救病毒rDHN3-mNP

将BHK-21细胞置30mm培养皿培养，并在24小时之内长满。用PBR322-mNPDHN3、pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L、pXJ40-DE3共转染(各用量见表18)。2天后细胞融合即十分明显(见图31)。孵育4天后将培养皿置-20℃冰箱冻融2次后将细胞和培养液收集至无菌离心管，离心12000rpm 10分钟，收集上清。将病毒液(rDHN3-mNP-P1)100μl继续感染BHK-21细胞，24h左右可见细胞融合病变。继续培养1天后将培养皿置-20℃冰箱冻融2 次，再收集离心12000rpm 10分钟。收集上清。取收集的病毒液100μl接种9日龄SPF鸡胚，鸡胚在40h左右死亡。收获鸡尿囊液，提取病毒RNA，使用JF-F:CCTTGCAGCTGCA GGAATTG，(SEQ ID NO：2)；JF-R:GCTCTATACAGTATGAGGTGTCAAG，(SEQ ID N O：3)扩增NDV病毒F基因，得到阳性条带。继续在SPF鸡胚中扩繁rDHN3-mNP，待扩繁到10代后收集尿囊液。使用JF-F/JF-R和NDV-ST-W/C-NP-F(NDV-ST-W：ACCAAACA GAGAATCCGTGAGGTA，(SEQ ID NO：22)；C-NP-F：CATCTGGTTGCCCTTGCGGCT TGTTC，(SEQ ID NO：44))分别扩增rDHN3-mNP的F基因和NP基因片段，查看测序结果是否有突变。结果如图32所示，显示rDHN3-mNP在SPF鸡胚中扩繁至第十代F基因和 NP基因仍未发生突变。

表18 rDHN3-mNP病毒拯救各质粒使用情况

质粒	用量
		pXJ40-NP	2.5μg
pXJ40-P	1.25μg
		pXJ40-L	1.25μg
pXJ40-DE3	3μg
		pBR322-mNPDHN3	4μg

8.测定DHN3、rDHN3、rDHN3-mNP的相关毒力指标

根据OIE标准，我们将对本发明所包括的DHN3、rDHN3、rDHN3-mNP三株个病毒的HA、TCID50、EID50、MDT(Mean Dead Time)以及病毒生长曲线进行测定。

8.1 HA

1.将待检病毒用生理盐水稀释做不同浓度的稀释(10^-1-10^-10)；

2.将96孔板中每孔加入25μl生理盐水；

3.将不同稀释度的病毒液分别加入到对应的孔中，25μl每孔(每一行为一个病毒，最后一排不添加病毒液做对照用)；

4.每孔加入25μl 1％鸡红细胞；

5.15-20分钟后观察血凝情况。

8.2 TCID50

1.提前一晚将BHK-21细胞铺于96孔板中，待细胞长至80-90％开始下一步实验(每个病毒液做3个平行实验，计算CPE和非CPE的平均值)；

2.弃去培养液，用PBS把细胞清洗两次；

3.将待检病毒液使用DMEM稀释成不同的稀释度(10^-1-10^-11)；

4.将不同稀释度的病毒液分别加到对应的孔中，100μl每孔(一个96孔板测一个病毒的组织半数感染量，每一列为一个稀释度，每一行代表不同稀释度，留最后一列做空白对照)；

5.4-6天后观察病变，使用Reed-Muench法计算结果。

8.3 EID50

1.选取新鲜健康的9-11日龄SPF鸡胚用于实验；

2.使用生理盐水将待检病毒液做梯度稀释，10^-1-10^-10；

3.选取10^-5-10^-10稀释度用来实验，每个稀释度5枚SPF鸡胚，每枚接种100μl稀释好的病毒液；

4.弃去24h内的死胚；

5.每日照胚三次，及时冻存死胚；

6.观察6-7天，使用Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量(在次实验的同时可以计算鸡胚半数致死量ELD50及鸡胚平均致死时间MDT)。

8.4 MDT(Mean Dead Time)

1.选取新鲜健康的9-11日龄SPF鸡胚用于实验；

2.使用生理盐水将待检病毒液做梯度稀释，10^-1-10^-11；

4.弃去24h内的死胚；

5.每日照胚三次，及时冻存死胚；

6.观察6-7天，使用Reed-Muench法计算鸡胚平均致死时间。

8.5 病毒的生长特性测定

1.将病毒按照1MOI感染BHK-21细胞；

2.孵育2h，弃去病毒液，PBS洗三次；

3.之后选择感染后4h,8h,16h,24h,36h,48h,60h收获感染病毒液，反复冻融后收获最终病毒液；

4.把收获而来的病毒液分别做TCID50；

5.测定不同感染时间的病毒TCID50，并绘制生长曲线。

以上相关测试结果如下表19和20所示。

表19 NDV各毒株相关毒力指数

表20 测定NDV各毒株生长曲线不同时间点TCID50

备注：上表中各毒株的1，2，3代表实验中的三个平行。根据表20绘制的不同时间点TCID50的生长曲线图如图33所示。

根据以上结果得出：

1.本发明成功拯救出病毒rDHN3。

2.本发明在不改变NP基因氨基酸序列的条件下改变NP基因的密码子组成，并拯救出密码子替换株NDV rDHN3-mNP。

3.本发明实验结果显示rDHN3-mNP比原毒株DHN3和拯救株rDHN3有更短的MDT和相近的TCID50，以及明显增大EID50，病毒的生长曲线中表明密码子替换后拯救出的病毒rDHN3-mNP仍然符合NDV的复制曲线。这些数据综合一起可说明密码子替换株确实提高了一些性能。这导致病毒在感染鸡胚时更快致死(MDT，46.2h)，并且滴度更高(EID50，10^8.48/ml)。这些改变是在替换了部分NP基因核苷酸序列，但并未改变NP基因的氨基酸序列。本发明可为研究NDV提供另一研究手段。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法

<130> 2020.4.27

<160> 66

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15192

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

accaaacaga gaatccgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60

tagaaggtgt gaaccccgaa cgcgagatcg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccga 120

tatgtcgtct gtttttgacg aatacgagca gctccttgct gcccagaccc gccctaacgg 180

agcccatgga gggggagaga aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240

aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ctttgcggta ttctgtcttc ggattgccgt 300

tagtgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360

ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaacgagg ccacactagc 420

tgttcttgag atcgatggtt ttgctaataa tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480

gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aattgcaggg tctctccctc gggcatgcag 540

caacggtact ccgtttgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600

cactctggaa aggatcctat ctgtccaagt ccaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660

gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720

gggtagagtc cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcat 780

aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctggttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840

tacagcaggt gggagctcta catattacaa tttggtcggg gatgtagact catacatcag 900

aaataccggg cttactgcgt ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960

agctctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080

gagctttgcg ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcagt 1140

cttagataag ggaactggca agtaccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200

gcgacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagt atcaatgaag acatggctgc 1260

tgagttaaaa ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320

tgaagaaatc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagca ggagtcctca ccgggctcag 1380

tgacgaaggc ccccgaactc cacagggtgg atcgaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440

tggggatggg gagacccaat tcctggattt tatgagaaca gtggcgaaca gcatgcggga 1500

atcgcctaat cctgcacaga gcaccactca tctagagcct cccccgaccc ctggggcatc 1560

ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactact cccagcctgc ctccatagga 1620

ccacaccaaa cccctccccc aaaacccccc cacacccccc gacccacaac cccgcacgac 1680

ccccccaaca aaagctcccc cccaccctct cccccacccc cagccacacg accccatcca 1740

cccgggacaa cacaggcaca gctcggccag tcaacaatcc tcccagagtc caaggtatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagacatcc agagaccagg acgggtcacc aagctctctg 1860

ttctcccttc tacccggtga gttagggtga agatggctac ctttacagat gcggagatag 1920

atgacatact tgagaccagt gggactgtca ttgatagcat aattacggcc cagggcaaat 1980

cagccgagac cgtcggaaga agtgcgatcc cgcagggcaa gaccaaagct ccaagcacag 2040

cacgggagaa gcacgggagt gcccagccac acgccagtca ggacgtcccc gaccaacaag 2100

acagaacaga aaaacagcca tccacacctg agcaggcaac cccacacaac aacccaccga 2160

ccacacccac cgaaccgccc tccacccagg ccgcaagcga gaccagcgac acacagctca 2220

aaaccggagc aagcaactcc cttctgtcca tgctcgacaa attaagcaat aaatcgtcta 2280

atgctaaaaa gggcccatgg tcgggtcccc aagaagggca tcaccaatct ccggcccaac 2340

aacacgggaa ccagtcgagc catggaagca accagggaag accacagcac caggtcaagg 2400

ccgtctctgg aaaccggggc atagacgaga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt 2460

cacaaccatc agctggtgca acccctcatg cgccccagtc agggcagagc caagacaata 2520

ttcctgtacc tgtggatcgt gtccagctac ctgccgactt tgcgcaggcg atgatgtcta 2580

tgatggaggc attatctcag aaggtaagta aagttgatca tcagctggat ctggtcttga 2640

aacagacatc ctctattcct atgatacgat ctgaaatcca acagctcaag acatctgttg 2700

cgatcatgga agctaactta ggtatgatga aaattctgga ccctggttgt gccaacattt 2760

catctttaag tgatctccgg gcagtagccc gatcccaccc agtcctagtt tcgggccccg 2820

gagacccatc tccttacgtg acacaagagg gtgaaatgac gctcaataaa ctctcacaac 2880

cagtgcagca cccttctgaa ttgattaagt ctgccaccgc aagcgggcct gacatgggag 2940

tggagaagga cactgtccgc gcattaatca cctcacgccc gatgcatcca agctcctcgg 3000

ctaagctcct gagcaagcta gatgcagcca agtcaattga agagatcagg aagatcaagc 3060

gccttgcgct gaatggttga tggccgtcac aactcatagc aggctcctgt cgcttcagca 3120

tcacacggaa tcccccggga gccccccctt gcgaatccat gcttcaacac cccagacaac 3180

agccctctct caccatcccc aatccctcgc atgatcgcac aactgcaacc aatctagcag 3240

cattagagat taagaaaaaa cacgggtaga atcaaagtgc ctcgattgaa ccaaaatgga 3300

ctcatccagg acaatcgggc tgtactttga ttctgccctt ccttccagta gcctattagc 3360

atttccgatt atcttacaag atacaggaga cgggaagaaa caaatcactc cacaatacag 3420

gatccagcat cttgattcgt ggacagacag taaggaagac tcggtattta tcaccaccta 3480

cgggttcatc tttcaagttg ggaatgaagg agccactgtc ggtgtgatca atgacaatcc 3540

caggcatgag ctactctctt ccgcaatgct ctgcttaggg agtgtcccga acaacggaga 3600

tcttgttgag ctggcgagag cctgcctcac tatggtggta acctgcaaga agagtgcaac 3660

taacactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgagtgctgc aaaattgtat 3720

ggttgtgtca aatcggtact catcagtgaa tgcagtgaag catgtgaagg cgcccgaaaa 3780

gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttt gtctccttga ctgtggtgcc 3840

gagaagggat gtctacagga tcccaactac agtattgaaa gtgtctggct cgagcctgta 3900

caatcttgcg ctcaatgtca ctattgatgt ggacgtggat ccgaagagcc cgttagtcaa 3960

atccctttct aagtccgata gcgggtacta tgcgaatctt tttctgcata tcggacttat 4020

gtccactgta gataagagag gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag 4080

gagactcaat ctatctgttg ggctcagtga tgtgctcgga ccctctgtgc ttgtgaaggc 4140

gagaggtgca cggactaagc tacttgctcc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta 4200

tcctatagca aatgcctctc cccaggttgc caagatactc tggagccaga ccgcgcacct 4260

gcggagcgtg aaagtcatca ttcaagccgg cactcagcgt gctgttgcag tgaccgccga 4320

tcatgaggta acctccacta agatagagaa gaagcatgcc attgctaaat acaatccttt 4380

cagaaaatag gttacatccc taagactgca gttcacctgc tttcccgaat catcatgaca 4440

ccagataatg atccatctcg actgcttgta gttagttcac ctgtccagca aattagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtctg gaccccgacc ggcacactca ggacacagca tgggctccaa 4560

accttctacc aggatcccag cacctctaat gctaatcact cgaattatgc tgatattgaa 4620

ctgcatccgt ctgacaagtt ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtaat 4680

aacaggagat aaggcagtca atgtatatac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740

gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca agagccccat tggaggcata 4800

taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccattcgca agatccaagg 4860

gtctgtatcc acgtccggag gaaggagaca aaaacgcttt ataggtgctg ttattggcag 4920

tgtagctctc ggggttgcaa cagcggcaca gataacagca gctgcggccc taatacaagc 4980

caaacagaat gctgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcga ccaatgaagc 5040

tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca attatcagtg gcagttggga agatgcaaca 5100

gtttgtcaat gaccagttta ataacacggc gcgagaatta gactgcataa aaatcacaca 5160

acaggtcggt gtagaactca acctatacct aactgagcta actacagtat tcgggccaca 5220

gatcacctcc cctgcattaa ctcagctaac catccaggcg ctctataatt tagctggtgg 5280

caatatggac tacttattaa ctaagttagg tataggaaac aatcaactca gctcattaat 5340

tggtagcggc ctgatcactg gttaccctat actgtatgac tcacatactc aactcttggg 5400

catacaagtt aatctgccct cagtcgggaa cttaaataat atgcgtgcca cctatctgga 5460

gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata tgcctcagca ctggtcccga aagtagtgac 5520

acaagtcggt tctgtgatag aagagcttga cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga 5580

tttatattgt actagaatag tgacattccc catgtctcca ggtatttatt cctgtttaag 5640

tggcaacaca tcagcctgca tgtattcaaa gactgaaggc gcactcacta cgccgtatat 5700

ggcccttagg ggctcagtta ttgctaattg taagataaca acatgcagat gtacagaccc 5760

tcctggcatc atatcgcaaa attatggaga agctgtatcc ctgatagata gacactcgtg 5820

caatgtctta tcattagacg gcataactct gaggctcagt ggggaatttg atgcaactta 5880

tcaaaagaac atctcaatat tagattctca ggtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc 5940

aactgaactt ggaaacgtca ataattcgat cagcaatgcc ttggacaagt tggcagaaag 6000

caacagcaaa ctagaaaaag tcaacgtcag actaactagc acatccgctc tcattaccta 6060

tattgttcta actgtcattt ccctaatttt cggtgcactt agtctggttt tagcgtgtta 6120

cctgatgtac aagcagaagg cacaacaaaa gaccctgtta tggcttggga acaataccct 6180

cgatcagatg agagccacca tgagagcatg aatgcaaata ggaagtggac ggacacccaa 6240

cggcagcccg tgtgtcaatt ccgataacct gtcaagtagg agacttaaga aaaaattact 6300

gggaacaagc aaccaaagag caatacacgg gtagaacggt cagaggagcc acccttcaat 6360

tgaaaattag gcttcacaac atccgttcta ccacaccacc aacaacaaga gtcaatcatg 6420

gaccgcgtgg ttaacagagt catgctggag aatgaagaaa gagaagcaaa gaacacatgg 6480

cgcttagttt tccggatcgc agtcttattt ttaatggtaa tgattctagc tatctctgcg 6540

gctgccctgg catacagcat ggaggccagt acgccacacg acctcgcagg catatcgact 6600

gtgatctcca agacagaaga taaggttacg tctttactca gttcaagcca agatgtgata 6660

gataagatat acaagcaggt agctcttgaa tccccgctgg cactattaaa caccgaatct 6720

gtaattatga atgcaataac ctctctttct tatcaaatta acggggctga gaacagtagc 6780

ggatgcggtg cgcccgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata 6840

gtggacgaca ttagtaatgt cgcatcattt tatccttctg catatcaaga acacttgaat 6900

ttcatcccgg cacctactac aggatctggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgggc 6960

accacccatt attgttatac tcacaatgtg atactatctg gttgcagaga tcactcacac 7020

tcacatcaat acctagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080

tctactctgc gctccatcaa tttagatgac actcaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt 7140

gcaacccctt taggttgtga tatgctgtgc tctaaggtca cagggactga agaggaggat 7200

tacaagtcag ttgcccccac atcaatggtg cacggaaggc taggatttga cggtcaatac 7260

catgagaaag acttagacac cacggtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccgggg 7320

gtgggaggag ggtcttttat tgacggccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctcaaa 7380

cctaattcac ccagtgacat cgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgccataat 7440

aacacatgcc ccgataaaca agattaccaa attcggatgg ctaagtcctc atataaacct 7500

gggcgatttg gtggaaagcg cgtacagcaa gctatcctat ctatcaaagt gtcaacatcc 7560

ctgggtaagg acccggtgct gactattcca cctaatacaa tcacactcat gggagccgaa 7620

ggcagaatcc tcacagtagg gacatctcac ttcttgtatc aacgagggtc ttcatatttc 7680

tcccctgcct tattgtatcc catgacagta agtaacaaaa cggctacact ccatagtcct 7740

tacatgttta atgctttcac tcggccaggt agtgtccctt gccaggcatc agcaaggtgc 7800

cccaactcat gcatcactgg ggtctatacc gatccatatc ccttaatctt ctataggaat 7860

catactctac gaggggtctt cgggacgatg cttgatgatg aacaagcgag gcttaacccc 7920

gtatctgcag tatttgacaa catatctcgc agtcgtgtca cccgggtgag ttcaagcaac 7980

accaaggcag catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagactaa taaagtttat 8040

tgtcttagta tcgcagaaat atccaatacc ctattcgggg aatttaggat cgttcccttg 8100

ctagttgaga tcctcaaaga tgatagagtt taagaagcta gacttggccg attgagccaa 8160

tcataggatg gttgggagga cgacattgcg ccaatcatct cccataatgc ttagagtcaa 8220

gctgaacatt agcataaatc aggatcccgt gttgttgggc aaccgcaatc cgacaatgct 8280

gacatgattg ttctgagtct cgctcactgt cactttatta agaaaaaaca caagaagcat 8340

tgacatataa gggaaaataa ccaacaagag agaacacggg taggacatgg cgggctccgg 8400

tcctgagagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca catttatcct ctccattggt 8460

caagcacaaa ttgttatact actggaaatt aaccgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 8520

ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata ctggagtcag ccactcctga 8580

cacagagaga atgataaaac ttgggcgggc ggtgcaccag actctcaacc acaattccaa 8640

gatgactgga gtgctccatc ccaggtgttt agaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700

ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caagatatgg 8760

agacctgttc acaaagctgt gcgtgcaagt tgagaagaaa ttgctagggt catctctgtc 8820

taataatgtc ccacgatcag aggaattcaa cagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880

tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat ataaaacaag tccaaaggca 8940

tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag ttagtaacat taaatcataa 9000

gataggccat gtctttatta ctcctgagct tgtcattgtg acacacacag acgagaacaa 9060

gttcacatgt ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg gatatgatgg aaggcaggga 9120

catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg aacctatccg agaaaattga 9180

tgatattctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta ggtaatcaag tctatgatgt 9240

tgtagcatta atggagggat ttgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc catcaggtac 9300

atttgcagga gatttctttg catttaacct acaggagctc aaaaacacgt taatcgaact 9360

tctccccaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt gccactgtat tctctggatt 9420

agaacagaac caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt ttgtggggtc atccattgct 9480

tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540

ctttgatatg atcctccagg tattatcttt ctttaaagga acaatcatca atggatacag 9600

aaaaaagaac tcaggtgtgt ggccacgcgt caaagtagat acaatatatg gaaatatcat 9660

tgggcagcta catgctgatt cagcagagat ctcacatgat gtcatgttga gggagtacaa 9720

gagtttatcc gctcttgaat ttgagccatg tatagattat gaccctgtta ccaatctaag 9780

catgttccta aaagacaagg caatcgcaca tcctagtgat aactggctcg cctcatttag 9840

gcggaaccta ctctctgagg accagaagaa acagataaag gaggcaactt caactaaccg 9900

cctcctgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatcca tataaagaaa tggaatacct 9960

gacaaccctc gagtacctaa gagatgacag tgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa 10020

agaggtgaaa gtgaatggac ggatttttgc taaattaaca aagaaactaa ggaattgcca 10080

ggtaatggca gaaggaattc tagctgacca gattgcacct ttcttccagg gaaatggggt 10140

cattcaagat agcatatcct tgacaaagag tatgttagca atgagtcaac tgtcctttaa 10200

cagcaataag aaacgtatcg ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaacc gcaatcatga 10260

tcccaagagc aagaatcgta gaagagttgc cacctttatc acgactgacc tacaaaagta 10320

ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa actattcgcc catgccatca atcagctgat 10380

gggcctacct catttctttg agtggattca tcttaggctg atggacacta caatgtttgt 10440

aggggatcct ttcaatcctc caagtgaccc gaccgactgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500

tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggactctgtc agaagctatg 10560

gacgatgatc tcaattgctg caatccaact tgccgcagca agatctcatt gtcgagttgc 10620

ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agctgtaacg agagaggtga gatcagatga 10680

ttccccggat atggtattga cgcagttgca tcaggctagt gataatttct tcaaggaatt 10740

gattcatgtc aatcatctga ttggccataa cctgaaggat cgtgaaacca ttagatcaga 10800

cacattcttc atatacagca aacgaatatt caaagatgga gcaatactca gtcaggtcct 10860

caaaaattca tctaaattgg tgctaatatc aggtgacctt agcgaaaaca ctgtaatgtc 10920

ctgtgccaac attgcatcca ctgtagcacg actatgtgag aatgggcttc ctaaggactt 10980

ctgttactat ttgaactacc taatgagttg cgtgcagaca tattttgatt cagagttttc 11040

tattactcac agctcacagt cagattccaa ccagtcctgg attgaggata tctctttcgt 11100

acactcatac gtgttaaccc ctgcccaact ggggggactg agtaaccttc aatactcaag 11160

gctctacaca aggaatattg gcgacccagg gaccactgcc tttgcagagg tcaagcgact 11220

agaagcagtg gggttgttga gtcccagcat catgactaac atcttaacca ggccacctgg 11280

caatggagat tgggccagcc tatgcaacga cccatactct tttaattttg agactgttgc 11340

aagcccaaat attgtcctca agaaacatac acagaaagtc ctatttgaga catgttcaaa 11400

ccctttatta tccggggtac atacagagga caatgaggca gaagagaaag cattggctga 11460

attcttactc aatcaagaag tgattcaccc acgtgtcgca catgctatca tggaagcaag 11520

ctctgtgggt aggagaaagc aaattcaagg gcttgttgac acaacgaaca ctgtgattaa 11580

gattgcactg actaggaggc ccctcggtat caaaagactg atgcggataa tcaattactc 11640

aagcatgcat gcaatgttgt tcagggatga tattttctta tccactagat ccaaccaccc 11700

attagtttct tctaatatgt gctcgctgac gctagcagat tatgctcgga acagaagctg 11760

gtcacccctg acagggggca ggaaaatact gggtgtatcc aaccccgata ccatagaact 11820

tgtggaggga gagattctca gcgtcagtgg agggtgcaca aaatgtgaca gcggagatga 11880

gcagtttact tggttccatc ttccaagcaa tatagagttg actgatgaca ccagcaaaaa 11940

tcccccgatg agagtgccat atctcgggtc gaagactcaa gagagaagag ccgcctcact 12000

tgcgaaaata gcccatatgt caccacatgt gaaagcagca ctaagggcat catccgtgtt 12060

aatctgggct tatggggaca atgaagtgaa ctggactgct gctcttaata ttgcaaggtc 12120

tcgatgcaac ataagctcag agtatcttcg gctattgtca cccctgccca cagctgggaa 12180

tctccaacat agattggatg atggcataac ccagatgaca tttacccctg catctctcta 12240

cagagtgtcg ccttacattc acatatccaa tgattctcaa aggctgttca ccgaagaagg 12300

ggtcaaagag ggaaacgtgg tttaccagca aattatgctc ttgggtttat ctctaattga 12360

gtcactcttc ccaatgacaa caaccagaac atacgatgag atcacattac acctccacag 12420

taaatttagc tgctgtatcc gagaagcgcc tgtcgcagtt cctttcgagc tcctcggact 12480

ggtaccggaa ttaaggatgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccta gccctatatc 12540

agagagggat tttgcgagac ttgacttagc tatattcaag agttatgagc ttaacttgga 12600

atcatatccc acgctggagc taatgaacat tctttcgata tctagcggga aattgattgg 12660

ccaatctgtg gtttcttatg atgaagatac ttctataaag aatgatgcta taatagtgta 12720

tgacaacaca cggaattgga ttagtgaggc acagaactca gatgtggtcc gcctgtttga 12780

gtatgcagca ctcgaagtgc tcctcgactg tgcttatcaa ctctactatc tgagggtaag 12840

gggtctaaac aacatcgtcc tatacatgaa tgacttatat aagaacatgc cagggatcct 12900

actctccaat attgcagcca cgatatccca ccccctcatt cactcaaggt tgaatgcagt 12960

aggtctaatt aatcatgacg ggtcacacca gcttgcagat atagactttg tcgaggtgtc 13020

tgcgaaattg ttagtctcct gcactcgacg cgtggtctca ggtttatatg cagggagtaa 13080

gtatgatctg ctgtttccat ctgtcttaga tgataacctg aatgagaaga tgcttcaact 13140

aatttcccgg ttatgctgct tgtacacagt gctctttgct acaacaagag aaatcccaaa 13200

aataaggggc ctatcagcag aagagaaatg ctcaatactc actgagtatc tattgtcgga 13260

tgctgtaaaa ccgttgctta ggtccgaaca attgagttct atcatgtctc ccaacataat 13320

cacgttccca gccaatctat actacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagagaacg 13380

agaggacaga gatactatct tgtcgttgtt gttccctcag gagtcactgc ttgagcttcg 13440

cccagtacgg gacattggtg ctcgagtgaa agacccgttt acccgacaac ccgcatcttt 13500

catacaagag ctggatctga gtgccccagc aaggtacgac gcgtttacac tgagtaagat 13560

ttgcttcgag cacacactac cgaacccaag ggaagattac ctagtacgat acttgttcag 13620

aggagtaggg actgcttcat cttcttggta taaggcgtct catcttctat ccatatctga 13680

ggttaggtgt gcaagacatg ggaactcttt atacttagcg gaaggaagcg gagccatcat 13740

gagtcttctt gaattgcata taccacatga gaccatctat tacaatacac ttttctcgaa 13800

tgagatgaac cctccacagc ggcatttcgg acctacacca acacagtttc taaactcggt 13860

cgtttatagg aatctacaag cggaagtgcc atgtaaagat ggatatgtcc aggagttcta 13920

tccattatgg agagagaatg cagaagaaag tgatctgacc tcagataagg cagttggata 13980

tatcacatct gtagtaccct acaggtctgt atcattacta cattgtgaca ttgagattcc 14040

tccagggtcc agtcaaagct tattagatca actggctact aatttatccc tgattgccat 14100

gcattctgtg agagagggcg gggtagtgat catcaaggta ctgtatgcaa tggggtacta 14160

cttccactta ctcatgaatt tattcactcc atgttccacg aaaggataca tactttccaa 14220

tggctacgcc tgtagagggg atatggagtg ttacctgata ttcgttatgg gctgcttagg 14280

cgggcccact ttcgtgcacg aagtggtaag gatggcaaaa gctctaatac aacgacacgg 14340

tacacttcta tctaaatcag atgaaatcac attgactaag ctatttacct cacagcagcg 14400

tcgtgtaaca gatctcctat ccagcccttt accgaagcta atgaggctct taagtgaaaa 14460

cattgatgct gcactaattg aagccggggg acagcccgtc cgtccatttt gtgcagaaag 14520

tttggtgagc acactaacaa atacgaccca gacaactctg atcattgcca gccacattga 14580

cacagtcatc cggtccgtga tttacatgga ggctgagggt gacctcgccg acacagtgtt 14640

cttattaact ccttacaatc tatccacaga cggtaaaaag agaacatcac ttaagcagtg 14700

caccaaacag atcttggaag tcacaatatt gggtctcaga gccaaagaca tcaataaaat 14760

aggtgatgta atcagcttag tactcagagg tgcgatttcc ctagaggacc tcatcccatt 14820

aaggacatac ctgaagcaca gtacctgtcc taaatacctg aaagcggtcc taggtattac 14880

taagctcaaa gaaatgttca caggtacttc gttattgtac ttgactcgcg ctcaacaaaa 14940

attctacatg aaaactatag gtaatgctgc caagggatat tacagtaata atgactctta 15000

aaggcaatcg tacaccaatc agttatcttc ttaactgatg actccctcat tgacttgatt 15060

ataccagatt agaaaaaagt taaattctga ctctttggaa ctcgtattcg gattcagtta 15120

gttaacttta agcaaaaatg cgcaaagtcg tctctaatca cagctatgtc attcaccaaa 15180

tctctgtttg gt 15192

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ccttgcagct gcaggaattg 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gctctataca gtatgaggtg tcaag 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ggatggttgg gaggacgac 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcaactgcgt caacaccat 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gttagcaatg agtcaactgt cc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cttcttcggt gaacagcctt tg 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ctacagagtg tcgccttac 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggtaaagggc tggataggag a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tctccaatgg ctatgcctgt a 21

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gcgcaccaaa cagagatttg gtgaatgac 29

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tgggagtgga gaaggac 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gttatctgtg ccgctgt 17

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gactccattc gcaaga 16

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cattctccag cacgac 16

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ccgataacct gtcaagtag 19

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gtcagcattg tcggatt 17

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gaacaagccg caaggg 16

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

catctgcaga cagtcccact ggtctcaagt at 32

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

catacttgag accagtggga ctgtc 25

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

caggagcctg ctatgagt 18

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

accaaacaga gaatccgtga ggta 24

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

tcagtacccc cagtcag 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

caggaaacag ctatgac 17

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

atatgaattc gccaccatgg ctacctttac agatgcggag 40

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

tatactcgag tcaaccattc agcgcaagg 29

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

accggaattc gccaccatgt cgtctgtttt tgacgaatac gagc 44

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

atatctcgag tcagtacccc cagtcagtgt cg 32

<210> 30

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

actcactata gggcgaattc ggatccgcca tgaacacgat taacatcgc 49

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

taagatctgg taccgagctc ctgcagttac gcgaacgcga agtccgactc 50

<210> 32

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

gcaacgtgct ggttattgtg 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gaagtccgac tctaagatgt cacg 24

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

ggacagttga ctcattgcta acata 25

<210> 36

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

actcactata gggcgaattc ggatccggat ggttgggagg acgacattg 49

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

tatgttagca atgagtcaac tgtcc 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

gtgaatgtaa ggcgacactc tgtag 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

ctacagagtg tcgccttaca ttcac 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

cgaatatcag gtaacactcc atatc 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gatatggagt gttacctgat attcg 25

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

taagatctgg taccgagctc ctgcaggcgc accaaacaga gatttggt 48

<210> 43

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

attgcatcaa cgcatatagc gctagcgcga tgtaccgcgg atcgttacca aacagagaat 60

ccgtgaggta c 71

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

catctggttg cccttgcggc ttgttc 26

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

gaacaagccg caagggcaac cagatg 26

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

gacagtccca ctggtctcaa gtatg 25

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

catacttgag accagtggga ctgtc 25

<210> 48

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

tgtttgacag cttatcatcg ataagcttcc tccatcatag acatcatcgc ct 52

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

attgcatcaa cgcatatagc gctagcaggc gatgatgtct atgatggagg 50

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

gacagtgtcc ttctccactc ccatg 25

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

catgggagtg gagaaggaca ctgtc 25

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

gacccttgga tcttgcgaat ggagtc 26

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

gactccattc gcaagatcca agggtc 26

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

gtctcctact tgacaggtta tcgg 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

ccgataacct gtcaagtagg agac 24

<210> 56

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

tgtttgacag cttatcatcg ataagcttgt gcgatgtcac tgggtgaatt agg 53

<210> 57

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

attgcatcaa cgcatatagc gctagcccta attcacccag tgacatcgca c 51

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

cgcaatgtcg tcctcccaac catcc 25

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 59

ggatggttgg gaggacgaca ttgcg 25

<210> 60

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 60

ttgacagctt atcatcgata agcttgcgat gagcggccgc tccattaata cgactcacta 60

taggaccaaa cagagatttg gtgaatgac 89

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 61

atcggtagaa ggttccctca ggttc 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 62

ggtcctatag tgagtcgtat taatg 25

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 63

gaaattgcat caacgcatat agcgc 25

<210> 64

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 64

atgagcagcg tctttgatga gtatgagcag ctcctcgcag cacagaccag accaaatggg 60

gcacatgggg ggggggagaa ggggagcacc ctcaaggtcg aggtcccagt ctttaccctc 120

aatagcgatg atccagagga tagatggaat tttgcagtct tttgcctcag aatcgcagtc 180

agcgaggatg caaataagcc actcagacag ggggcactca tcagcctcct ctgcagccat 240

agccaggtca tgagaaatca tgtcgcactc gcagggaagc agaatgaggc aaccctcgca 300

gtcctcgaga tcgatgggtt tgcaaataat gtcccacagt ttaataatag aagcggggtc 360

agcgaggaga gagcacagag atttatggtc atcgcaggga gcctcccaag agcatgcagc 420

aatgggaccc catttgtcac cgcaggggtc gaggatgatg caccagagga tatcaccgat 480

accctcgaga gaatcctcag cgtccaggtc caggtctggg tcaccgtcgc aaaggcaatg 540

accgcatatg agaccgcaga tgagagcgag accagaagaa tcaataagta tatgcagcag 600

gggagagtcc agaagaagta tatcctccat ccagtctgca gaagcgcaat ccagctcatc 660

atcagacata gcctcgcagt cagaatcttt ctcgtcagcg agctcaagag agggagaaat 720

accgcagggg ggagc 735

<210> 65

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 65

atgagcagcg tctttgacga gtacgagcag ctcctcgcag cacagaccag accaaatggg 60

gcacatgggg ggggggagaa ggggagcacc ctcaaggtcg aggtcccagt ctttaccctc 120

aatagcgatg atccagagga tagatggaat tttgcagtct tttgcctcag aatcgcagtc 180

agcgaggatg caaataagcc actcagacag ggggcactca tcagcctcct ctgcagccat 240

agccaggtca tgagaaatca tgtcgcactc gcagggaagc agaatgaggc aaccctcgca 300

gtcctcgaga tcgatgggtt tgcaaataat gtcccacagt ttaataatag aagcggggtc 360

agcgaggaga gagcacagag atttatggtc atcgcaggga gcctcccaag agcatgcagc 420

aatgggaccc catttgtcac cgcaggggtc gaggatgatg caccagagga tatcaccgat 480

accctcgaga gaatcctcag cgtccaggtc caggtctggg tcaccgtcgc aaaggcaatg 540

accgcatatg agaccgcaga tgagagcgag accagaagaa tcaataagta tatgcagcag 600

gggagagtcc agaagaagta tatcctccat ccagtctgca gaagcgcaat ccagctcatc 660

atcagacata gcctcgcagt cagaatcttt ctcgtcagcg agctcaagag agggagaaat 720

accgcagggg ggagc 735

<210> 66

<211> 1484

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 66

cgtacgggta gaaggtgtga accccgaacg cgagatcgaa gcttgaacct gagggaacct 60

tctaccgata tgagcagcgt ctttgacgag tacgagcagc tcctcgcagc acagaccaga 120

ccaaatgggg cacatggggg gggggagaag gggagcaccc tcaaggtcga ggtcccagtc 180

tttaccctca atagcgatga tccagaggat agatggaatt ttgcagtctt ttgcctcaga 240

atcgcagtca gcgaggatgc aaataagcca ctcagacagg gggcactcat cagcctcctc 300

tgcagccata gccaggtcat gagaaatcat gtcgcactcg cagggaagca gaatgaggca 360

accctcgcag tcctcgagat cgatgggttt gcaaataatg tcccacagtt taataataga 420

agcggggtca gcgaggagag agcacagaga tttatggtca tcgcagggag cctcccaaga 480

gcatgcagca atgggacccc atttgtcacc gcaggggtcg aggatgatgc accagaggat 540

atcaccgata ccctcgagag aatcctcagc gtccaggtcc aggtctgggt caccgtcgca 600

aaggcaatga ccgcatatga gaccgcagat gagagcgaga ccagaagaat caataagtat 660

atgcagcagg ggagagtcca gaagaagtat atcctccatc cagtctgcag aagcgcaatc 720

cagctcatca tcagacatag cctcgcagtc agaatctttc tcgtcagcga gctcaagaga 780

gggagaaata ccgcaggggg gagctctaca tattacaatt tggtcgggga tgtagactca 840

tacatcagaa ataccgggct tactgcgttt ttcctaacac tcaaatatgg aatcaatacc 900

aagacgtcag ctctcgcact cagcagcctc acaggtgata tccaaaaaat gaaacagctc 960

atgcgtttat atcggatgaa aggtgaaaat gcaccataca tgacattgtt aggtgacagt 1020

gaccagatga gctttgcgcc agccgaatat gcacaacttt attcttttgc catgggcatg 1080

gcatcagtct tagataaggg aactggcaag taccaatttg ccagggactt tatgagcaca 1140

tcattctggc gacttggagt agagtatgct caggctcagg gaagtagtat caatgaagac 1200

atggctgctg agttaaaact aaccccagca gcaaggagag gcctggcagc tgctgcccaa 1260

cgagtatctg aagaaatcgg cagcatggac attcctactc aacaagcagg agtcctcacc 1320

gggctcagtg acgaaggccc ccgaactcca cagggtggat cgaacaagcc gcaagggcaa 1380

ccagatgctg gggatgggga gacccaattc ctggatttta tgagaacagt ggcgaacagc 1440

atgcgggaat cgcctaatcc tgcacagagc accactcatc taga 1484

Claims

1.一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)将能够在细胞中表达T7 RNA聚合酶DE3基因克隆进pXJ40载体，获得质粒pXJ40-DE3；

(3)将新城疫病毒的全基因组cDNA克隆进质粒pBR322中，获得全基因组表达载体pBR322-DHN3；

(4)统计新城疫病毒NP基因中编码各氨基酸的密码子的使用频次，然后将编码相应氨基酸的密码子部分替换成使用频率最高的密码子，得到密码子替换后的NP基因序列，将替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上，形成新的质粒pBR322-mNPDHN3；

(5)采用步骤(1)的三种辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P和pXJ40-L，步骤(2)的质粒pXJ40-DE3和步骤(4)的质粒pBR322-mNPDHN3共转染BHK-21细胞，得到拯救病毒rDHN3-mNP。

2.根据权利要求1所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于：所述新城疫病毒是指基因Ⅶ型新城疫病毒，其全基因组序列如序列表SEQ IDNO：1；NP基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1-1591nt；P基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1925-3109nt；L基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-15192nt。

3.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P通过如下方法获得：

(2)使用引物pXJ40-NP-F和pXJ40-NP-R扩增NP基因，使用引物pXJ40-P-F和pXJ40-P-R扩增P基因，然后将扩增出的产物用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切；

(3)将步骤(1)的质粒片段分别与步骤(2)中酶切后的NP基因序列和P基因序列连接，得到辅助质粒pXJ40-NP和pXJ40-P；

两对引物序列分别如下：

pXJ40-NP-F：ACCGGAATTCGCCACCATGTCGTCTGTTTTTGACGAATACGAGC；

pXJ40-NP-R：ATATCTCGAGTCAGTACCCCCAGTCAGTGTCG；

pXJ40-P-F：ATATGAATTCGCCACCATGGCTACCTTTACAGATGCGGAG；

pXJ40-P-R：TATACTCGAGTCAACCATTCAGCGCAAGG。

4.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的给基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述辅助质粒pXJ40-L通过如下方法获得：

(2)设计四对带同源重组序列的特异性引物，分别扩增覆盖L基因完整序列的基因片段L1、L2、L3和L4，其中片段L1的5’末端带有与pXJ40 BamHI端同源的同源臂，片段L4的3’末端带有与pXJ40 PstI端同源的同源臂；

所述L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt；

所述四对带同源重组序列的特异性引物序列分别如下：

pXJ40-L1-F：5’-ACTCACTATAGGGCGAATTCGGATCCGGATGGTTGGGAGGACGACATTG-3’；

pXJ40-L1-R：5’-GGACAGTTGACTCATTGCTAACATA-3’；

pXJ40-L2-F：5’-TATGTTAGCAATGAGTCAACTGTCC-3’；

pXJ40-L2-R：5’-GTGAATGTAAGGCGACACTCTGTAG-3’；

pXJ40-L3-F：5’-CTACAGAGTGTCGCCTTACATTCAC-3’；

pXJ40-L3-R：5’-CGAATATCAGGTAACACTCCATATC-3’；

pXJ40-L4-F：5’-GATATGGAGTGTTACCTGATATTCG-3’；

pXJ40-L4-R：5’-TAAGATCTGGTACCGAGCTCCTGCAGGCGCACCAAACAGAGATTTGGT-3’。

5.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述质粒pXJ40-DE3通过如下方法获得：

(2)设计引物pXJ40-DE3-F和pXJ40-DE3-R从大肠杆菌BL21上扩增出能够表达T7 RNA聚合酶的基因序列DE3；

所述引物序列如下：

pXJ40-DE3-F：ACTCACTATAGGGCGAATTCGGATCCGCCATGAACACGATTAACATCGC；

pXJ40-DE3-R：TAAGATCTGGTACCGAGCTCCTGCAGTTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC；

所述DE3基因的序列见序列表SEQ ID NO：32。

6.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于所述全基因组表达载体pBR322-DHN3通过如下方法获得：

(1)建立pBR322-Base载体：人工合成依次含有HC-1、T7启动子、HDV核酶、T7终止子和HC-2的基因片段，将其插入到pBR322载体上，获得基础质粒pBR322-Base；T7启动子下游的序列HC-1对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为15159-15192nt，HDV核酶上游的序列HC-2对应序列表SEQ ID NO：1中的位置为1-141nt，以提供重组所需的两个同源臂；

所述引物序列如下：

A2-F:ATCGGTAGAAGGTTCCCTCAGGTTC；

A2-R:GGTCCTATAGTGAGTCGTATTAATG；

(5)构建DHN3全基因组表达载体pBR322-DHN3；将步骤(4)中的质粒片段和步骤(3)中的病毒全基因组DHN3-A进行同源重组，得到全基因组表达载体pBR322-DHN3；

所述MINI基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为1414-1949nt；PD1基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为2935-4956nt；PD2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为4838-6454nt；PD3基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为6261-8283nt；L1基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为8166-10709nt；L2基因在序列表SEQ ID NO：1中位置为10174-12299nt；L3基因在序列表SEQ IDNO：1中位置为12238-14433nt；L4基因在序列表SEQ ID NO：1中位置14214-15192nt。

7.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于：步骤(4)中所述的部分替换是指替换NP基因编码区的第1-245位氨基酸对应的密码子但保持原有的氨基酸序列不变，共735nt，对应序列表SEQ ID NO：1上的位置为122-856nt。

8.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于：步骤(4)中所述的部分替换过程中，若替换后会在序列起始编码区附近产生新的起始密码子则不替换。

9.根据权利要求2所述的一株经过密码子替换的基因Ⅶ型新城疫病毒的拯救方法，其特征在于步骤(4)中所述将密码子替换后的NP基因序列替换到pBR322-DHN3质粒上的步骤为：

(1)将pBR322-DHN3使用BsiWI和XbaI双酶切，回收目的片段；

(3)将步骤(1)的目的片段与步骤(2)人工合成的片段进行连接，得到pBR322-mNPDHN3质粒。