CN111909258B - 用于疾病治疗的方法 - Google Patents

Abstract

描述了肽及其用于治疗例如急性心肌梗死以及其它与细胞因子风暴相关联的病症的用途。

Description

用于疾病治疗的方法

本申请是申请号为201680063220.6的中国专利申请的分案申请，该母案的申请日为2016年8月26日，发明名称为“用于疾病治疗的方法”。

相关申请的交叉引用

根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年8月28日提交的临时专利申请系列号62/211,296的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，其已经以ASCII格式经由EFS-Web提交，并且据此全文以引用方式并入。创建于2012年12月31日的所述ASCII副本，名称为65292741.txt，并且大小为18,884字节。

发明领域

本公开提供利用分离和/或合成的具有出人意料的细胞保护特性的肽来治疗疾病的新方法，所述疾病包括急性心肌梗死(AMI)；痛风；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；中毒性休克和心脏手术并发症。

发明背景

在美国和世界范围内，急性心肌梗死(AMI)一直是发病率及死亡率的主要原因。尽管当前早期再灌注的策略，许多患者仍在此期间早期死亡，并且存活的那些患者面临后期死于不利心脏重构、心力衰竭和突然死亡的风险。

许多出版物强调在AMI后接下来的2-5年中，AMI中梗死面积与心力衰竭发展概率之间的关联。

患有ST段抬高性心肌梗死(STEMI)的患者尤其面临不利心脏重构、心力衰竭以及医院内和长期死亡率的高风险。虽然在STEMI的治疗方面已经有了显著的改善，但是早期死亡率的降低已经与STEMI后心力衰竭的发生率提高关联在一起。这可能反映了幸免于指示事件的更高风险患者以及人群老化和高血压及糖尿病的流行。在STEMI的30天内，超过20％的幸存者诊断患有心力衰竭，这是一种与高发病率、失能和死亡率相关联的疾病。

心力衰竭确实是主要的公共健康问题，影响大约5百万美国人，并且每年新增500,000例。与其它心血管疾病相比，心力衰竭的发生率和普遍性持续提高，并且心力衰竭现在是65岁人群的首要住院原因，所述人群也是快速增长的人口区段。虽然发生心力衰竭后的存活率也得到改善，但当前的疗法可减缓而非终止疾病的发展。受到功能容量、呼吸困难和疲劳的进行性症状、频繁入院和丧失生产能力的经济后果、以及增加的医疗护理成本的限制，心力衰竭对医疗保健强加了重大负担。

对开发用于最小化梗死面积并在AMI后预防心力衰竭的其它治疗存在迫切的需要。当前对STEMI的治疗包括通过恢复冠状动脉开放(即，血管成形术或纤维蛋白溶解)对缺血心肌的快速再灌注、预防再栓塞(即，抗血小板剂和抗凝剂)、和神经激素阻断(即，肾素-血管紧张素-醛固酮和肾上腺素能阻断剂)。虽然这些干预各自提供增加的益处并且显著降低了发病率及死亡率，但在STEMI后心力衰竭的发生率持续提高，表明当前的治疗范式仍遗漏了一个或多个关键的病理生理机制。

因此，确定尽管最佳治疗但不利的心脏重构和心力衰竭仍然发展的机制是研究新干预方法的关键步骤，最终目标是减少STEMI后心力衰竭的发生率、负担和死亡率。

发明简述

已经意外地发现来自丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(Serpin)分子的C-末端肽(例如短肽，SP16(SEQ ID NO：1))及其变体和衍生物作为有效的细胞保护剂在治疗与细胞因子风暴和/或梗死相关联的病症如AMI中起作用。以前已经表明这些肽具有抗炎特性(参见例如美国专利8,975,224)，这使得它们在治疗由于细胞因子风暴和/或梗死导致的细胞死亡相关联的病症中的功效出人意料。在相关的病症中，虽然未受控的炎症可能有助于疾病进程，但炎症依然是恢复所需的关键过程。这由以下事实证明：调节炎性反应作为例如急性心肌梗死(AMI)的治疗的许多尝试已经失败了。

相比之下且意外地，本文所述的肽：1)允许对炎性反应的治疗调节，2)提供细胞保护效应，并且3)减少梗死面积。这种活性组合提供治疗与细胞因子风暴和/或梗死相关联的病症的令人惊讶且意外的功效。如本文实施例所述，这种令人惊讶的功效与例如IL-1拮抗剂的仅抗炎活性形成对比。

因此，提供了肽组合物、包含C-末端丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽的药物组合物、以及使用所述肽治疗病症(包括与细胞因子风暴相关联的病症)和/或减少发生在多种病症(其中细胞保护是需要的)中，例如在与缺血再灌注损伤以及导致的病理的风险相关联的病症中的梗死的方法。这些肽的意外的细胞保护特性允许将包含此类肽的组合物用于新适应症，并且允许在与例如缺血再灌注损伤相关联的病症中进行预防性干预。

具体地，已经显示了在充分确立的急性心肌梗死(AMI)动物模型中由氨基酸序列VKFNKPFVFLMIEQNTK(SEQ ID NO：1)组成的SP16肽或者SP163M VKFNKPFVFLNleIEQNTK的新细胞保护功能。

因此，提供了包含分离的肽的组合物的新用途，所述肽包含氨基酸序列X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q(SEQ ID NO：2)，基本上由其组成或由其组成，其中

X1为V或L；

X2为V、L或M或Nle；

X3为M、Nle、I或V；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；并且

Z3为任意五个氨基酸的序列，并且其中分离的肽由37个或更少的氨基酸组成。

可利用一种或多种非天然的肽键或氨基酸或者通过附接到肽官能团如聚乙二醇(PEG)，修饰所述肽以延长贮藏期限和/或生物利用率。

该组合物还可包含载体，诸如药学上可接受的载体。

在本文所述的任何实施方案的一个方面是如下方法：1)治疗与细胞因子风暴相关联的疾病，2)减少梗死面积，和/或3)治疗急性心肌梗死(AMI)，该方法包括将包含肽的药物组合物给予患有疾病的人类受试者，所述肽选自：

(a)包含氨基酸序列X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q(SEQ ID NO：2)的肽，其中

X1为V或L；

X2为V、L、Nle、或M；

X3为M、Nle、I或V；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；并且

Z3为任意五个氨基酸的序列，并且其中所述肽包含37个或更少的氨基酸；

(b)包含氨基酸序列VKFNKPFVFLMIEQNTK(SEQ ID NO：1)的肽；

(c)基本上由氨基酸序列

X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5(SEQ ID NO：3)组成的肽，其中

X1为V或L；

X2为K或R；

X3为V、L、Nle、或M；

X4为M、Nle、I或V；

X5为K或Q；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；并且

Z3为任意五个氨基酸的序列；

(d)基本上由氨基酸序列RFNRPFLR(SEQ ID NO：4)组成的肽；

(e)基本上由氨基酸序列RRRFNRPFLRRR(SEQ ID NO：8)组成的肽；

(f)基本上由氨基酸序列VKFNKPFVFLMIEQNTK(SEQ ID NO：1)组成的肽；

(g)基本上由氨基酸序列FNRPFL(SEQ ID NO：10)组成的肽；以及

(h)包含SEQ ID NO：57的肽。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关联的疾病选自急性心肌梗死(AMI)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤；急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血病、埃博拉病毒(Ebola)、禽流感、天花和全身炎性反应综合征(SIRS)。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，需要减少梗死面积的人类受试者是需要治疗选自以下的疾病的受试者：急性心肌梗死(AMI)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和中毒性休克。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，药物组合物是口服制剂。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，肽还包含至少一种第二肽或蛋白。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，至少一种第二肽或蛋白作为融合肽连接到所述肽上。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，至少一种第二肽或蛋白是表位标签或半衰期延长剂或二者。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽包含一种或多种D-氨基酸。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽当以有效量给予人类受试者时，引起血清TNF-α水平降低了75％。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由35个或更少的氨基酸残基组成。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由22个或更少的氨基酸残基组成。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽由21个或更少的氨基酸残基组成。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、或者不诊断患有选自以下的病症：II型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、I型糖尿病、和高血糖。

本发明的肽可用于降低具有病理学上提高的TNF-α水平的人类个体中的血清TNF-α水平。因此，本发明提供用于降低有需要的人中的TNF-α水平的方法或用途，包括将在药学上可接受的载体中的本发明的肽给予人类个体。在某些实施方案中，与在给予分离的多肽之前的水平相比，分离的肽当以有效量给予人类受试者时导致血清TNF-α水平降低了50％或75％。在其它实施方案中，分离的肽还包含至少一种其它蛋白。至少两种蛋白的组合可称为融合蛋白。其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。所述肽可包含表位标签和半衰期延长剂二者。

还提供了包含分离的肽的组合物，所述肽基本上由或由氨基酸序列X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5(SEQ ID NO：3)组成，其中

X1为V或L；

X2为K或R；

X3为V、L、M或Nle；

X4为M、Nle、I或V；

X5为K或Q；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；

Z3为任意五个氨基酸的序列；并且

其中与在给予所述肽之前的TNF-α水平的量相比，分离的肽当以有效量给予人类受试者时引起血清TNF-α水平降低了75％。

在某些实施方案中，分离的肽包含氨基酸序列X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5(SEQ ID NO：3)，其中X1、X2、X3、X4、X5、Z1、Z2、和Z3如上文所定义，并且其中所述肽由最多35、22或21个氨基酸残基组成。

在某些方面，本文所述并贯穿本说明书的任何实施方案的肽还包含至少一种其它蛋白。这些至少两种蛋白的组合可称为融合蛋白。具体地，其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽可包含表位标签和半衰期延长剂二者。

本公开还提供分离的肽，所述肽基本上由或由氨基酸序列RFNRPFLR(SEQ ID NO：4)和RFNKPFLR(SEQ ID NO：5)组成。在某些实施方案中，与在给予所述肽之前的TNF-α水平的量相比，分离的肽当以有效量给予人类受试者时引起血清TNF-α水平降低了50％或75％。

在本发明的所有实施方案的其它方面，分离的肽连接另一个蛋白。这些蛋白的组合可称为融合蛋白。具体地，其它蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。

在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽由最多100、35、22、21或9个另外的氨基酸组成。

在其它实施方案中，分离的肽基本上由或由氨基酸序列Z1-RFNRPFLR-Z2(SEQ IDNO：6)和Z1-RFNKPFLR-Z2(SEQ ID NO：7)组成，其中Z1和Z2独立地为1个、2个、3个、4个、5个、6个、6个、7个、8个、9个、10个或1至3个、1至5个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个、或1至10个碱性氨基酸。

在一些实施方案中，分离的肽基本上由或由氨基酸序列RRRFNRPFLRRR(SEQ IDNO：8)和RRRFNKPFLRRR(SEQ ID NO：9)组成。

本公开还提供包含分离的肽的组合物，所述肽基本上由或由氨基酸序列FNRPFL(SEQ ID NO：10)和FNKPFL(SEQ ID NO：11)组成。

本公开还提供了包含分离的或合成的肽的组合物，所述肽基本上由或由任意一种以下肽或以下肽的组合组成：如表B中列出的SP40、SP43、SP46和SP49；和它们在以下方法中的用途：1)治疗与细胞因子风暴相关联的疾病，2)减少梗死面积，和/或3)治疗急性心肌梗死(AMI)。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关联的疾病选自急性心肌梗死(AMI)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤；急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血病、埃博拉病毒(Ebola)、禽流感、天花和全身炎性反应综合征(SIRS)。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，需要减少梗死面积的人类受试者是需要治疗选自以下的疾病的受试者：急性心肌梗死(AMI)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和中毒性休克。

在一个实施方案中，本公开还提供与给予所述肽至受试者之前的TNF-α水平的量相比，降低血清TNF-α的方法，该方法包括向受试者给予有效量的如上所定义的任意一种分离的肽，从而将血清TNF-α水平降低至少50％。在一个实施方案中，与给予所述肽之前的TNF-α水平的量相比，血清TNF-α水平降低了75％。在其它实施方案中，受试者是哺乳动物。在本发明的所有实施方案的一些方面，哺乳动物是人类。

在本发明的所有实施方案的一些方面，在给予所述肽之前，人已被诊断出患有与细胞因子风暴、AMI或梗死相关联的疾病。在本发明的所有实施方案的一些方面，在给予所述肽之前，人已被诊断出患有急性心肌梗死(AMI)；痛风、中风、心脏手术并发症、外伤性脑损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、埃博拉病毒(Ebola)、禽流感、天花、全身炎性反应综合征(SIRS)、局部缺血、和/或中毒性休克。

在一些方面，在用本发明的肽治疗之前，人尚未经受用α抗胰蛋白酶如α-1-抗胰蛋白酶治疗的在先治疗。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。附带彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要的费用时由专利局提供。

图1是示出丝氨酸蛋白酶抑制蛋白C-末端肽的序列和同源性的表(按出现顺序分别是SEQ ID NO：18-24)。

图2是示出来源于截短蛋白的肽的表(按出现顺序分别是SEQ ID NO：25-32、1、33-34、1、33、38-51、10和8)。

图3A-3D示出证实在小鼠中AAT减少实验性急性心肌梗死(AMI)的梗死面积的图和图像。图3A示出左心室中的风险面积的图。图3B示出梗死面积(左心室的％)的图。CDD.在AMI后7天，用白蛋白(图3C)或AAT(图3D)治疗的代表性对照小鼠的心室中间心脏切片的马松三色染色。梗死疤痕以蓝色显示。Alb＝白蛋白。

图4A-4C示出证实SP163M的以下功效的图：减少心肌梗死面积(图4A)、降低心脏特异性肌钙蛋白I(一种心肌坏死的生物标记物)的血浆水平(图4B)，并且其也通过SP16治疗显著减少(图4B)，和保持左心室收缩功能，其使用经胸超声心动图作为左心室缩短分数测量(图4C)。

图5A和5B是证实以下的图：再灌注30’给予的SP163M显著减少了梗死面积(图5A)并保持LV缩短分数(图5B)。

图6A和6B是证实以下的图：再灌注30’给予的SP163M以剂量依赖的模式减少梗死面积(图6A)并保持LV缩短分数(图6B)。

图7是证实SP163M不影响心脏收缩性的图。示出静止时(左图)或在异丙肾上腺素攻击(收缩保留)后(右图)的心脏收缩功能的测量结果。

图8示出证实SP163M减少梗死面积并有效治疗AMI的图和超声心动图。

图9示出SP16和SP163M的细胞保护作用机制的提议模型。

图10示出流式细胞术的图，证实SP16以剂量依赖的方式增加Raw264.7鼠巨噬细胞上的LRP1表达。

图11示出急性心肌梗死中的急性炎性反应的开始和消退的示意图。

图12A和12B示出SP16结合到LRP1上。当丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结合使它们失活的蛋白酶时，发生构象变化，由此暴露包含独特基序的短肽(5-11个氨基酸)。图12A提供示意图(自Joslin G等人，J BiolChem 1991和Lillis A等人，Physiol Rev 2008改良)，以说明SP16包含AAT的五肽FVFLM(SEQ ID NO：1的氨基酸残基7-11)，其负责结合至LRP1。图12B提供SP163M而不是SP34体外结合至LRP1的证据。

图13A和13B提供SP16是LRP1激动剂的证据。SP163M抑制在THP1-XBlue^TM-MD2-CD14细胞中由LPS(图13A)或Gp96(图13B)诱导的NF-kB信号转导，并且用LRP1封闭抗体或RAP(导致LRP1下调的辅因子)处理限制SP16-相关的抑制。

图14A和14B证实LRP1介导SP16-诱导的心脏保护。小鼠用LRP1封闭抗体预处理以测试LRP1是否介导SP163M和AAT的心脏保护信号。用封闭抗体处理消除了SP163M和血浆来源的AAT二者的保护效应。N＝5-8/组。

详细描述

本公开描述分离的肽在疾病治疗和预防领域的新型且出人意料的用途，其中所述肽提供细胞保护效应。具体地，本发明描述了使用分离和/或合成的具有出人意料的细胞保护性质的肽治疗疾病的新方法，其中细胞保护是治疗疾病和/或预防病症恶化的基本组成部分，所述疾病包括例如急性心肌梗死(AMI)；痛风；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；中毒性休克和心脏手术并发症。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)代表一个蛋白酶抑制剂的大(＞1000)家族，其存在于所有生命分支中并涉及多个生理过程。在哺乳动物如人类中，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白对于内稳态是重要的，并且虽然存在一定水平的混杂，但每个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有同源的丝氨酸蛋白酶。例如，α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和α-1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)抑制炎性蛋白酶如弹性蛋白酶，而抗凝血酶抑制凝血酶并在凝血过程中起作用。

在包括COPD、血栓和丝氨酸蛋白酶抑制蛋白病(硬化症和痴呆)的人类疾病中，识别了多个特异性AAT突变。当前FDA批准了少量的人血清来源的AAT制剂用于治疗COPD。在这一治疗方法中，AAT起到类似于内源AAT的蛋白酶抑制剂的作用。

AAT是原型丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，并且与其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有共同的三级结构。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白具有～20个氨基酸(aa)的暴露的环，称为反应性中心环(RCL)，其用作同源蛋白酶的诱饵。一旦蛋白酶结合RCL，它就被捕集、部分解折叠且注定降解。RCL在其P1-P1’位点的裂解驱动蛋白酶失活过程，并且导致小的C-末端肽从丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子上释放。

以前已经描述了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的肽片段及其衍生物，它们经测定具有抗炎特性(美国专利8,975,224)。

本文提供的来自AMI模型的数据表明AAT-来源的肽，例如SP16，不仅具有抗炎特性，而且显示令人惊讶的细胞保护活性和减少梗死的活性。细胞保护活性和减少梗死的活性以前是未知的，并且提供了用本文所述的肽治疗某些疾病的显著且意外的优点。这通过例如以下事实得到证明：与仅具有抗性活性的化合物(例如IL-1拮抗剂)相比，SP16在治疗AMI方面具有令人惊讶的功效，提供了仅通过抗炎性无法获得的活性，导致显著改善的治疗效果。

不希望受理论的束缚，设想SP16通过干扰由缺血和再灌注引起的炎性细胞死亡(细胞焦亡)，介导本文所述的心脏保护。具体地，SP16限制急性缺血-再灌注损伤、限制心脏中的急性炎性反应、减少梗死面积、预防有害的心脏重构、并且预防心力衰竭。提出的SP16活性模型在图9中示出。

这一发现指引我们提供通过给予来自丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的C-末端肽的分子，治疗与细胞因子风暴相关联的疾病和/或减少梗死面积(例如治疗AMI)的方法。所述分子以有效减少梗死面积或者减轻细胞因子风暴的细胞破坏效应，诸如缺血再灌注损伤的量给予。

已发现来源于人α-抗胰蛋白酶的SP16(SEQ ID NO：1)和SP163M(SEQ ID NO：57)不仅表现出类似于母体蛋白α-1-抗胰蛋白酶的那些的抗炎和免疫调节特性，而且用作细胞保护剂。SP16看起来是一流的肽主开关，用于治疗自体免疫、炎性和代谢疾病，并且此外具有作为细胞保护剂的意外效果。不希望受理论的束缚，基于母体蛋白α-1-抗胰蛋白酶良好的安全性，本发明的肽能够提供良好的安全性。然而，本发明的肽更易于生产并且因此生产成本更低，因为它们远小于母体蛋白。

以前已经证明，来源于由其同源的丝氨酸蛋白酶之一导致的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子的裂解的C-末端肽具有生物学功能，该功能不同于母体(完整的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白分子)的蛋白酶抑制剂功能。例如，来自AAT、抗胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶结合蛋白的C-末端肽具有不同程度的抗炎效应。基于我们当前的研究和出乎意料的成果，我们现在认为这些肽的治疗用途可从抗炎用途扩展到细胞保护用途。新功能允许目的是预防例如局部缺血的治疗。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白以前已知的功能涉及抑制丝氨酸蛋白酶的功能。一些丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制其它类型的蛋白，并且有几种不具有抑制功能。

丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个大家族(＞1000)，它们结构上类似但是功能上相异。它们涉及多个生理过程，并且对于哺乳动物的内稳态是至关重要的。在各个丝氨酸蛋白酶抑制蛋白中的基因突变在不同的人类疾病中是明显的，包括COPD、血栓和肺气肿。

具有抑制作用的每种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白负责阻断一种或多种蛋白的活性。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与它们的靶蛋白结合，从而防止它们完成任何进一步的反应。在与靶结合时，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的结构发生不可逆的改变。某些细胞识别何时丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与其靶结合并从血流中清除这些附连的蛋白。

α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是原型的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。

(Talecris)、

(Aventis Behring)和

(Baxter)是人血清来源的AAT制剂，其由FDA批准用于治疗COPD。AAT当前在临床试验中用于治疗新发作I型糖尿病、移植物抗宿主病和囊性纤维化病。

研究人员已经在人类中鉴定了至少37种不同的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白基因。基于我们的研究，我们提出：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的分离和合成的C-末端片段提供具有抗炎、细胞保护和减少梗死活性的新的分子来源。因此，我们认为至少在表A中列出的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的C-末端片段可用于本文所述的方法。

在美国专利8,975,224中描述的肽是基于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白及其变体和衍生物的特别定义的短的分离或合成的C-末端肽，与天然丝氨酸蛋白酶抑制蛋白相比，其令人惊讶地具有有效的抗炎性质，并且对于治疗用途而言具有有用得多的尺寸。分离的肽在图1-2中示出。图1示出多种丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的C-末端片段的氨基酸序列。每种肽在紧靠肽的左侧的列2中用SEQ ID NO：标示。图2示出如图1所示的C-末端片段的截短，以及它们的变体和衍生物。同样地，每种肽在紧靠肽的列2中用SEQ ID NO：标示。

丙氨酸筛选表明如下表B所示的分离或合成或经修饰的SP16肽对于降低炎症小鼠模型中的TNF-α水平是尤其有效的。具体地，在这些特定片段中，三个最N-末端和两个最C-末端的氨基酸看起来对肽的抗炎特性起作用，因为取代它们看起来减弱所述肽降低LPS攻击的败血症小鼠模型中的TNF-α水平的能力(参见例如PCT/US13/20498；其全文以引用方式并入本文)。因此，在本发明的所有实施方案的一些方面，肽选自SP40、SP43、SP46、和SP49，它们的肽序列如表B所示。

表B示出命名为SP16；SP40；SP43；SP46；和SP49的肽，它们当给予败血症的小鼠模型时提供尤其良好的抗炎效应。SP16、SP163M、SP37、SP40、和/或SP51结合LRP1并且如本文所述设想为细胞保护性的。在一些实施方案中，SP16、SP163M、SP37、SP40、和/或SP51可用于本文所述的方法。

根据本发明的一些实施方案和方面，提供细胞保护性治疗的方法包括将有效的细胞保护或梗死面积减少量的任何分离的肽给予受试者如人类受试者，所述肽由或基本上由如下所示的序列组成：SEQ ID NO：8、10、19-34、和38-49，它们可用于本文所述的方法。由或基本上由如SEQ ID NO：8、10、19-34、和38-49所示的序列组成的任何肽也可用于减少受试者中的TNF-α。在某些实施方案中，血清中的TNF-α量与给予所述肽之前血清中的TNF-α量相比降低达50％或更多，或者75％或更多。

下表C提供另外的示例肽，它们用于降低经受LPS攻击的小鼠中的TNF-α水平。还设想将如PCT/US13/20498(其全文以引用方式并入本文)所述的具有降低TNF-α水平的能力的肽在本发明中用于组合物、药物组合物以及使用并治疗炎性病况的方法。

SP1(SEQ ID NO：18)；SP2(SEQ ID NO：19)；SP3(SEQ ID NO：20)；SP4(SEQ ID NO：21)；SP5(SEQ ID NO：22)；SP6(SEQ ID NO：23)；SP7(SEQ ID NO：24)；SP8(SEQ ID NO：25)；SP9(SEQ ID NO：26)；SP10(SEQ ID NO：27)；SP1 1(SEQ ID NO：28)；SP12(SEQ ID NO：29)；SP13(SEQ ID NO：30)；SP14(SEQ ID NO：31)；SP15(SEQ ID NO：32)；SP16(SEQ ID NO：1)；SP163M(SEQ ID No：57)SP17(SEQ ID NO：33)；SP18(SEQ ID NO：34)。

短语“基本上由...组成”在本文是指将肽的范围限定于指定的材料氨基酸，并且仅包括另外的氨基酸或者改变，其实质上不影响本发明的基本特性和新特性，即，短的分离或合成肽的抗炎能力。该定义明确排除了具有完整的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白序列的肽，并且该定义也明确排除了等于或大于37个氨基酸的任何天然存在的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的肽序列。

不希望受理论的约束，也已经鉴定了提供核心的重要氨基酸，和对于例如如本文所制造的抗炎肽可能的修饰。也提供了由如下文所示的式涵盖的分离的肽，并且它们可用于减少炎症、治疗细胞因子风暴、提高细胞存活率、和/或减少梗死面积。

已知人AAT、抗胰凝乳蛋白酶和激肽释放酶结合蛋白包含具有抗炎特性的某些组分。然而，这些组分以前尚未得到鉴定。目前已经使用例如小鼠内毒素血症模型(LPS诱导的内毒素血症)确定了一个人丝氨酸蛋白酶抑制蛋白来源的肽的新家族，其具有有效的抗炎效果。基于肽在小鼠炎症模型中的功效、肽的大小、以及母体蛋白的安全特征，基于AAT的肽、诸如SP16的肽、以及它们的片段和衍生物提供了一个新型且改善的分子，用于治疗人的炎症。

式I提供包含肽的组合物，所述肽包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：X1-Z1-F-N-R-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q(SEQ ID NO：35)和X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3(SEQ IDNO：2)，其中

X1为V或L；

X2为V、L或M或Nle；

X3为M或Nle、I或V；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；并且

Z3为任意五个氨基酸的序列，其中该肽包含37个或更少的氨基酸。

在所有实施方案的某些方面，分离的肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予所述分离的肽之前测得的血清水平相比，引起血清TNF-α水平降低50％或75％。在本发明的所有实施方案的一些方面，肽还包含融合蛋白。融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂或它们的组合。

式II提供了包含分离的肽的组合物，所述肽包含、基本上由或由以下氨基酸序列组成：X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5(SEQ ID NO：3)，其中

X1为V或L；

X2为K或R；

X3为V、L、M或Nle；

X4为M、或Nle、I或V；

X5为K或Q；

Z1为任意氨基酸；

Z2为任意两个氨基酸的序列；

Z3是任意五个氨基酸的序列；并且其中分离的肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予分离的肽之前的血清水平相比，引起血清TNF-α水平降低75％。

在某些实施方案中，包含如上所定义的氨基酸序列X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5(SEQ ID NO：3)的肽包括最多35、22或21个氨基酸残基。在本发明的所有实施方案的某些方面，肽还包含融合蛋白。具体地，融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂或它们的组合。

在本发明的所有方法及应用的一些方面，肽是SP16。

在本发明的所有方法及应用的一些方面，肽可包含SEQ ID NO：57的肽。在本发明的所有方法及应用的一些方面，肽可基本上由SEQ ID NO：57的肽组成。

因此，本发明也提供涉及分离的肽的方法及应用，所述肽由或基本上由氨基酸序列RFNRPFLR(SEQ ID NO：4)和RFNKPFLR(SEQ ID NO：5)组成，它们也可用于治疗炎症。在某些实施方案中，肽当以有效量给予人类受试者时，与在给予所述分离的肽之前的血清TNF-α水平相比，引起血清TNF-α水平降低50％或75％。在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽还包含融合蛋白。具体地，融合蛋白可选自表位标签和半衰期延长剂。在其它实施方案中，分离的肽包含最多100、35、22、21、16或9个氨基酸。在其它实施方案中，分离的肽包含氨基酸序列Z1-RFNRPFLR-Z2(SEQ ID NO：6)和Z1-RFNKPFLR-Z2(SEQ ID NO：7)，其中Z1和Z2独立地为1个、2个、3个、4个、5个、6个、6个、7个、8个、9个、10个或1至3个、1至5个、1至6个、1至7个、1至8个、1至9个、或1至10个碱性氨基酸。

在本发明的所有实施方案的一些方面，分离的肽基本上由或由氨基酸序列RRRFNRPFLRRR(SEQ ID NO：8)和RRRFNKPFLRRR(SEQ ID NO：9)组成。本公开也提供包含肽的组合物，所述肽基本上由或由氨基酸序列FNRPFL(SEQ ID NO：10)和FNKPFL(SEQ ID NO：11)组成。

在某些实施方案中，分离的肽包含5个或更多个连续氨基酸，它们来自氨基酸序列FLMIEQNTK(SEQ ID NO：36)。这些肽可用于为受试者减轻炎症、提高细胞存活率、治疗细胞因子风暴、减少梗死面积和/或降低TNF-α水平。在某些实施方案中，血清中的TNF-α水平的量与给予分离的肽之前血清中的TNF-α量相比降低。

在一些方面，治疗方法还包括在给予分离的肽之前和在给予分离的肽之后分析TNF-α血清水平。如果TNF-α血清水平的降低少于30％，可用与第一剂量相同剂量或比第一剂量更大剂量的肽重复所述给予步骤。

任何上述肽的片段的大小可不同。例如，这些片段的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或37个氨基酸。

除治疗与细胞因子风暴相关联的疾病和/或减少梗死面积之外，上述肽还能够例如治疗AMI，减轻炎症。所述肽具有抗炎和免疫调节效应，并且另外直接或间接地刺激β细胞再生。在某些实施方案中，这些肽通过降低TNF-α的活性或表达来减轻炎症。TNF-α的活性可降低10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。TNF-α的表达可降低10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。当用于治疗给予时，所述肽组合物通常还包含药学上可接受的溶液或载体。

上文所述的肽也可用于治疗、预防或改善若干病理的症状。因此，本公开还提供治疗与细胞因子风暴相关联的疾病的方法或减少梗死面积的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者给予任意一种本文所述的肽或它们的组合的步骤。在一些方面，受试者在所述治疗前尚未用α-抗胰蛋白酶进行过治疗。在一些方面，所述方法包括以下步骤：检测是否所述个体具有提高的血清TNF-α水平，并且如果所述受试者具有提高的血清TNF-α水平，则将肽给予受试者，而如果不具有提高的血清TNF-α水平，则不将肽给予受试者。

本公开也使得预防与细胞因子风暴相关联的疾病发展或预防梗死面积增加的方法变得可行，所述方法包括以下步骤：将任何一种所述肽或它们的组合给予需要预防与细胞因子风暴相关联的疾病或预防梗死面积增加的受试者。在一些方面，受试者在所述治疗前尚未用α-抗胰蛋白酶进行过治疗。在一些方面，所述方法包括以下步骤：检测是否所述个体具有提高的血清TNF-α水平，并且如果所述受试者具有提高的血清TNF-α水平，则将肽给予受试者，而如果不具有提高的血清TNF-α水平，则不将肽给予受试者。在本发明的所有实施方案的一些方面，有需要的受试者以前尚未用任何如本文所述的肽对任何病症进行过治疗。

在本发明的所有实施方案的一些方面，治疗的首要目的是为了治疗或预防与以下疾病效应后的损害相关联的非期望的细胞死亡和组织退化：急性心肌梗死(AMI)；痛风；中风；心脏手术并发症；外伤性脑损伤。在此类应用中的有效剂量通过测定对预防或改善缺血再灌注损伤的效应进行测量。所述剂量不一定与单独治疗炎症的剂量相同。效果也可通过测定例如在特定器官或组织中的细胞活力和/或细胞死亡的水平进行测量。

为方便起见，在整个专利申请(包括说明书、实施例、以及所附权利要求书)中使用的某些术语的定义贯穿整个说明书。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域(本发明所属的领域)普通技术人员通常所理解的相同的含义。

术语“野生型”分别是指天然存在的编码蛋白的多核苷酸序列或其部分、或者蛋白序列或其部分，如它在体内正常存在的。

术语“突变”是指在生物体的遗传物质中的任何变化，尤其是在野生型多核苷酸序列中的变化或在野生型蛋白序列中的变化(即，缺失、取代、添加、或改变)。虽然通常认为遗传物质中的变化导致蛋白功能的变化，但术语“突变”是指野生型蛋白序列中的变化，无论是否该变化改变了蛋白功能(例如提高功能、降低功能、赋予新功能)，或者是否该变化对蛋白功能无效应(例如突变或变异是沉默的)。在本专利申请中，术语突变与多态性在本文可互换使用。

除非另外定义，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指分离的氨基酸残基聚合物，并且不受最小长度的限制。肽、低聚肽、二聚体、多聚体等等也由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成，并且无论是生物产生并分离自天然环境、利用重组技术产生、还是通常利用天然存在的氨基酸合成产生。

在一些方面，多肽或蛋白是包含非天然存在的氨基酸的“修饰多肽”。在一些方面，多肽包含天然存在的和非天然存在的氨基酸的组合，并且在一些实施方案中，所述肽仅包含非天然存在的氨基酸。

在本发明的所有实施方案的一些方面，所述肽或修饰肽还包含共翻译和翻译后(C-末端肽裂解)修饰，例如形成二硫键、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解裂解(例如通过弗林蛋白酶(furin)或金属蛋白酶进行裂解)等等，所述修饰达到以下程度：此类修饰不影响分离肽的抗炎特性或它们改善血糖控制的能力。

在本发明的一些方面，改变了所述多肽。术语“改变的多肽”是指包括对天然序列的改变诸如缺失、添加、和取代(性质一般是保守的，如本领域技术人员已知的，例如丙氨酸)的肽，只要蛋白保持期望的活性即可，即，保持它的抗炎活性，能够改善血糖控制或降低高血糖。这些修饰可为故意的，例如通过定点诱变，或者可为偶发的，例如通过产生蛋白的人工宿主如基因工程化的细菌、酵母或哺乳动物细胞的突变，或者由于PCR扩增或其它重组DNA方法导致的错误。多肽或蛋白由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成，但是相对于肽具有确定的构象。与肽相反，蛋白一般由50或更多个氨基酸的链组成。

如本文所用，术语“肽”通常是指由通过肽键连接的氨基酸单链构成的氨基酸序列。除非另外定义，一般来讲肽包含至少两个氨基酸残基并且长度小于约50个氨基酸。

“经修饰的肽”可包括将非天然氨基酸掺入本发明的肽，这包括在某些情况下按需将合成的非天然氨基酸、取代氨基酸、或者一种或多种D-氨基酸掺入所述肽(或者除蛋白酶识别序列之外的该组合物的其它组分)。与包含L-氨基酸的形式相比，包含D-氨基酸的肽在体内或体外表现出提高的稳定性。因此，当期望或需要在体内或细胞内更大的稳定性时，构造掺入D-氨基酸的肽可为尤其有用的。更具体地，D-肽对内源肽酶和蛋白酶具有抗性，从而提供更好的关联药物及缀合物的口服跨上皮和透皮递送、改善的膜持久复合物的生物利用率(参见下文详述)、以及延长的血管内和间质寿命(在需要这样的特性时)。使用D-异构肽也能够促进关联药物和其它货物分子的透皮和口服跨上皮递送。另外，不能有效加工D-肽用于T辅助细胞的主要组织相容性复合体II类限制呈递，且因此不太可能在整个生物体中引发体液免疫反应。肽缀合物可因此利用例如细胞穿透肽序列的D-异构体形式、裂解位点的L-异构体形式、以及治疗肽的D-异构体形式进行构造。因此，在一些实施方案中，公开的所述肽包含L和D氨基酸，其中包括不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个D-氨基酸。在某些方面，所述肽包含超过10个D-氨基酸，并且在某些方面所述肽的所有氨基酸是D-氨基酸。

在另一方面，所述肽或其片段或衍生物可为“反向-翻转肽”。“反向-翻转肽”是指在至少一个位点上具有反向肽键的肽，即，相对于氨基酸侧链，氨基-和羧基-末端反向。因此，反向-翻转类似物具有相反的末端和相反的肽键方向，同时大体上保持天然肽序列中的侧链的拓扑结构。反向-翻转肽可包含L-氨基酸或D-氨基酸、或者L-氨基酸和D-氨基酸的混合物，最多所有氨基酸是D-异构体。部分反向-翻转肽的类似物是其中仅有部分序列是反向的并用对映体的氨基酸残基取代的多肽。因为此种类似物的反向-翻转部分具有相反的氨基和羧基末端，侧接反向-翻转部分的氨基酸残基分别被侧链类似的α-取代偕-二氨基甲烷和丙二酸酯取代。已发现细胞穿透肽的反向-翻转形式在跨膜转移时与天然形式一样起效。反向-翻转肽类似物的合成描述于Bonelli，F.等人，Int J Pept Protein Res.24(6)：553-6(1984)；Verdini，A和Viscomi，G.C，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1：697-701(1985)；以及美国专利6,261,569中，它们全文以引用方式并入本文。已经描述了部分反向-翻转肽类似物的固相合成方法(EP 97994-B)，其也全文以引用方式并入本文。

术语“同源性”、“同一性”和“相似性”是指在两个肽或两个最优比对的核酸分子之间的序列相似性程度。同源性和同一性可各自通过比较在各个序列中的位置进行测定，所述序列可对齐用于比较目的。例如，它基于在默认位置使用标准同源性软件，例如BLAST，2.2.14版。当比较序列中的等效位置被相同碱基或氨基酸占据时，则该分子在该位置相同；当等效位点被相似氨基酸残基(例如空间和/或电子性质相似，诸如保守氨基酸取代)占据时，则该分子可称为在该位置同源(相似)。以同源性/相似性或同一性的百分比的表示分别是指在比较序列共有位置处的相似或相同氨基酸数目的函数。“不相关的”或“不同源的”序列与如本文所公开的序列具有小于40％的同一性，但优选地小于25％的同一性。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口上相同(即，基于核苷酸-核苷酸或残基-残基)。术语“序列同一性百分比”如下计算：对比较窗口内两个最佳比对的序列进行比较，确定在两个序列中存在相同核酸碱基(如A、T、C、G、U或I)或残基的位置的数量以获得相匹配的位置的数量，用相匹配的位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100，从而获得序列同一性百分比。

如本文所用，术语“基本上相同”表示多核苷酸或氨基酸序列的特点，其中，所述多核苷酸或氨基酸含有如下序列：在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口中、通常为在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口中，相比参比序列而言具有至少85％的序列同一性，优选至少90％至95％的序列同一性，更通常为至少99％的序列同一性，其中，序列同一性百分比通过在比较窗口中将参比序列与可含有缺失或添加(总计为参比序列的20％或更少)的序列进行比较来计算。参比序列可为较大序列的子集。当用于描述多肽时，术语“相似性”通过将一条多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代与第二条多肽的序列进行比较来确定。

如本文所用，术语“同源的”或“同系物”可互换使用，并且，在用于描述多核苷酸或多肽时，表示当进行最佳比对和比较(例如使用具有用于比对的默认参数的BLAST，2.2.14版(参见本文))时，两个多核苷酸或多肽、或其指定序列是相同的，其中在至少70％的核苷酸、通常从约75％至99％、更优选至少约98％至99％的核苷酸中具有适当的核苷酸插入或缺失或氨基酸插入或缺失。如本文所用，术语“同系物”或“同源的”也指相对于结构和/或功能的同源性。对于序列同源性，如果序列为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％相同的，至少97％相同的，或者至少99％相同的，则它们是同系物。对本发明的基因或肽的同系物的确定可由本领域技术人员容易地确定。

术语“基本上同源”是指至少90％、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的序列。同源序列可以是不同物种中的相同功能基因。对本发明的基因或肽的同系物的确定可由本领域技术人员容易地确定。

对于序列比较，通常一个序列作为参比序列，将测试序列与该参比序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。

可通过如下方式进行用于比较的序列的最佳比对：例如，Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981)，其以引用方式并入本文)、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.MoI.Biol.48：443-53(1970)，其以引用方式并入本文)、Pearson和Lipman的相似性检索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-48(1988)，其以引用方式并入本文)、这些算法的计算机化执行(例如Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575Science Dr.，Madison，Wis.)、或目测检查。(一般参见Ausubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，第4版，John Wiley和Sons，New York(1999))。

可用的算法的一个示例是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对，由一组相关序列创建多序列比对，以显示序列同一性百分比。它还绘制树或系统树图(dendogram)来显示用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法(J.MoI.Evol.25：351-60(1987)，其以引用方式并入本文)的简化版。所用方法与Higgins和Sharp所述方法(Comput.Appl.Biosci.5：151-53(1989)，其以引用方式并入本文)相似。该程序可比对多达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对过程从成对比对两个最相似的序列开始，生成两个比对序列的簇。然后，将该簇与下一个最相关的序列或对比序列的簇进行比对。通过两个单独序列的成对比对的简单延伸来对比两个簇的序列。最终比对通过一系列渐进的成对比对来实现。该程序通过为序列比较区指定特定的序列以及它们的氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数来运行。例如，可使用以下参数将参比序列与其它测试序列进行比较，从而确定序列同一性百分比关系：默认空位权重(3.00)，默认空位长度权重(0.10)和加权的末端空位。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的另一示例是BLAST算法，该算法由Altschul等人描述(J.MoI.Biol.215：403-410(1990)，其以引用方式并入本文)。(也参见Zhang等人，Nucleic Acid Res.26：3986-90(1998)；Altschul等人，NucleicAcid Res.25：3389-402(1997)，它们以引用方式并入本文)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的互联网网站公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中的长度W的短字(short words)来识别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，该高得分序列对匹配或满足一些正阈值评分T。T称为相邻字计分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人(1990)，同上)。这些初始的相邻字命中(hits)用作起始搜索的种子以寻找含有它们的更长的HSP。然后，这些字命中在两个方向沿着每个序列在累积比对得分能够增加的范围内尽可能向远延伸。当发生下列情况时每个方向的字命中的延伸停止：累积比对得分由其最大获得值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLAST程序使用的默认值为：字长度(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-9(1992)，其以引用方式并入本文)比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。

除计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还执行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77(1993)，其以引用方式并入本文)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sumprobability，(P(N))，其提供在两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试氨基酸与参考氨基酸的比较中最小和概率小于约0.1、更典型小于约0.01，并且最典型地小于约0.001，那么认为该氨基酸序列与参考氨基酸序列相似。

如本文所用，术语“变体”是指通过一个或多个氨基酸或核酸缺失、添加、取代或侧链修饰而不同于多肽或核酸，但保留了这些天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物学活性的肽或核酸。氨基酸取代包括其中氨基酸用不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基取代的改变。此类取代可归类为“保守的”，在这种情况下，用在极性、侧链功能或尺寸方面具有相似性质的另一天然存在的氨基酸替换多肽中包含的氨基酸残基。此类保守取代是本领域熟知的。本发明所涵盖的取代也可为“非保守的”，其中，用具有不同特性的氨基酸(例如，来自不同组的天然存在的氨基酸)取代存在于肽中的氨基酸残基(例如，用丙氨酸取代带电的氨基酸或疏水性氨基酸)；或者，其中用非常规氨基酸取代天然存在的氨基酸。在一些实施方案中氨基酸取代是保守的。当用于多核苷酸或多肽时，该术语变体也涵盖在分别与参比多核苷酸或多肽相比(例如与野生型多核苷酸或多肽相比)时，在一级结构、二级结构、或三级结构中可存在变化的多核苷酸或多肽。

变体也可为使用本领域公知的方法分离或生成的合成的、重组的、或化学修饰的多核苷酸或多肽。如下所述，变体可包含保守氨基酸改变或非保守氨基酸改变。多核苷酸的改变可导致由参比序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。变体还可包含氨基酸的插入、缺失或取代，包括通常不出现在作为变体基础的肽序列中的氨基酸和其它分子的插入和取代，例如但不限于通常不出现在人蛋白中的鸟氨酸的插入。术语“保守取代”当描述多肽时，是指多肽的氨基酸组成的变化，该变化基本上不改变多肽的活性。例如，保守取代是指将一个氨基酸残基取代成具有相似的化学特性的不同氨基酸残基。保守氨基酸取代包括用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、或者用丝氨酸取代苏氨酸。

“保守氨基酸取代”由一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换所导致，例如将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸、将天冬氨酸替换为谷氨酸、或将苏氨酸替换为丝氨酸。因此，特定氨基酸序列的“保守取代”是指将对于多肽活性不关键的那些氨基酸进行取代，或用具有相似性质(例如酸性、碱性、正电性或负电性、极性或非极性等)的其它氨基酸对氨基酸进行取代，从而即使是对关键氨基酸的取代也不降低肽的活性(即，所述肽透过血脑屏障(BBB)的能力)。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。例如，以下六组每组包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。(也参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1984)，其以引用的方式全文并入本文。)在一些实施方案中，如果改变不降低肽的活性，改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加也可被认为是“保守取代”。插入或缺失通常在约1至5个氨基酸的范围内。保守氨基酸的选择可基于肽中待取代的氨基酸的位置进行选择，例如，氨基酸是否在肽的外部且暴露至溶剂、或是否在内部且不暴露至溶剂。

在另选的实施方案中，可基于已存在的氨基酸的位置，即，它对于溶剂的暴露(即，相比于不暴露于溶剂的位于内部的氨基酸，该氨基酸是否暴露于溶剂或是否存在于肽或多肽的外表面)，选择将要取代已存在的氨基酸的氨基酸。此类保守氨基酸取代的选择是本领域熟知的，例如如Dordo等人，J.MoI Biol，1999，217，721-739和Taylor等人，J.Theor.Biol.119(1986)；205-218以及S.French和B.Robson，J.MoI.Evol.19(1983)171所公开的。因此，能够选择适于蛋白或肽外部上的氨基酸(即，暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸取代，例如但不限于可使用以下取代：用F取代Y、用S或K取代T、用A取代P、用D或Q取代E、用D或G取代N、用K取代R、用N或A取代G、用S或K取代T、用N或E取代D、用L或V取代I、用Y取代F、用T或A取代S、用K取代R、用N或A取代G、用R取代K、用S、K或P取代A。

在另选的实施方案中，也可选择适于蛋白或肽内部的氨基酸的保守氨基酸取代，例如能够将合适的保守取代用于蛋白或肽内部的氨基酸(即，不暴露于溶剂的氨基酸)，例如但不限于可使用以下保守取代：其中用F取代Y、用A或S取代T、用L或V取代I、用Y取代W、用L取代M、用D取代N、用A取代G、用A或S取代T、用N取代D、用L或V取代I、用Y或L取代F、用A或T取代S以及用S、G、T或V取代A。在一些实施方案中，术语突变也涵盖非保守氨基酸取代。

如本文所用，术语“衍生物”是指已通过例如但不限于如泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、脂质化、糖基化或添加其它分子的技术进行化学修饰的肽。当分子含有通常不是所述分子一部分的附加化学部分时，该分子也是另一分子的“衍生物”。此类部分可改善该分子的溶解性、吸收、生物半衰期等。另选地，所述部分可以降低分子的毒性、消除或减弱该分子的任何不希望的副作用等等。能够介导此类效应的部分公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro，Ed.，MackPubl.，Easton，PA(1990)中，该文献全文以引用方式并入本文。

因此，在本发明的所有实施方案的某些方面，本发明的肽包含肽衍生物，例如聚乙二醇化的肽。

当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“功能的”是指具有与实体或分子的生物活性基本上相似的生物活性(功能方面或结构方面)的本发明的肽(作为所述实体或分子的功能衍生物或功能变体)，即，在本文所述肽的上下文中指抗炎活性。术语功能衍生物旨在包括分子的片段、类似物或化学衍生物。

术语“插入”或“缺失”通常在约1至5个氨基酸的范围内。可通过使用重组DNA技术在序列中系统地生成核苷酸的插入、缺失或取代并同时合成生产该肽，来实验性确定允许的变异。

术语“取代”当涉及肽时，是指氨基酸变化为不同实体，例如另一个氨基酸或氨基酸部分。取代可为保守取代或非保守取代。

分子如肽的“类似物”是指功能上与完整分子或其片段类似的分子。术语“类似物”也旨在包括等位基因种类和诱导的变体。类似物通常在一个或几个位点上与天然存在的肽不同，这常常通过保守取代。类似物通常表现出与天然肽至少80或90％的序列同一性。一些类似物也包括非天然的氨基酸或N或C末端氨基酸的修饰。非天然氨基酸的示例为例如但不限于二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸。可在如下所述的转基因动物模型中筛选片段和类似物的预防或治疗功效。

“共价键合的”是指通过共价化学键直接或间接(例如通过接头)连接。在本发明的所有实施方案的一些方面，融合肽是共价键合的。

如本文所用，术语“融合蛋白”是指两个或更多个蛋白的重组蛋白。融合蛋白例如可通过以下方式生产：将编码一个蛋白的核酸序列与编码另一蛋白的核酸连接，从而它们构成单个开放阅读框，该开放阅读框在细胞中能够翻译成带有所有目的蛋白的单个多肽。蛋白的排列顺序可不同。融合蛋白可包括表位标签或半衰期延长剂。表位标签包括生物素、FLAG标签、c-myc、血球凝集素、His6(SEQ ID NO：37)、洋地黄毒苷、FITC、Cy3、Cy5、绿荧光蛋白、V5表位标签、GST、β-半乳糖苷酶、AU1、AU5、和抗生物素蛋白。半衰期延长剂包括Fc结构域和血清白蛋白。

术语“受试者”和“个体”以及“患者”本文可互换使用，并且是指动物，例如人类或非人类的动物(例如哺乳动物)，向它们提供如本文所公开的药物组合物进行治疗，包括预防性治疗。如本文所用，术语“受试者”是指人类或非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，诸如非人类的灵长类动物(尤其是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子、奶牛、以及非哺乳动物如鸡、两栖动物、爬行动物等等。在一个实施方案中，受试者是人类。在另一个实施方案中，受试者是作为疾病模型的实验动物或替代动物。非人类的哺乳动物包括哺乳动物如非人类的灵长类动物(尤其是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子和奶牛。在一些方面，非人类的动物是伴侣动物如狗或猫。

“治疗”受试者的疾病或病症或者“治疗”患有疾病或病症的患者是指使个体经受药物治疗，例如施用药物，使得疾病或病症的至少一种症状减轻或稳定。通常，当治疗性给予所述肽作为治疗时，将它给予表现出例如AMI的一种或多种症状的受试者。

术语“预防”与从无症状状态时预防症状或延缓症状发展关联使用。通常，当预防性给予所述肽时，将它给予不表现出如本文所述病症(例如AMI)的临近症状的受试者。通常，受试者面临发展出梗死或与细胞因子风暴相关联的疾病如AMI的风险，这是由于家族病史、实验室结果、基因测试或生活方式导致的。所述肽也可在例如AMI或中风的症状的发作后或在诊断出所述症状后的10-30分钟或10-60分钟内给予，或者在10分钟至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，直至2、3、4、5天内给予，以预防症状恶化。所述肽也可在受伤和/或指示事件后的10-30分钟或10-60分钟内给予，或者在10分钟至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，直至2、3、4、5天内给予，以预防症状恶化。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，所述肽可在受伤和/或指示事件后10-30分钟内、30-60分钟内、或10-60分钟内给予。

“特异性地结合”或“特异性结合”是指识别和结合所需的多肽但基本上不识别和结合样品(例如生物样品)中的其它分子的化合物或抗体，这自然包括本发明的多肽。特异性结合可通过至少约1x10-6 M或更小的解离常数来表征。在其它实施方案中，解离常数为至少约1x10-7 M、1x10-8M、或1x10-9 M。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域公知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子共振等等。

“分离的”是指多肽已经与任何自然环境诸如体液如血液隔离，并且与天然伴随所述肽的组分分离。

分离的和“基本上纯的”是指已被分离并纯化的多肽，该多肽与天然伴随其的组分至少某种程度上分离。通常，当多肽按重量计至少约60％，或者至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，或者甚至至少约99％没有天然缔合的蛋白和天然存在的分子时，它是基本上纯的。例如，基本上纯的多肽可通过以下方式获得：通过从天然来源中提取、通过在通常不表达该蛋白的细胞中表达重组核酸、或通过化学合成。

在例如TNF-α水平的上下文中使用的“减少”或“抑制”是指生物样品如血液或组织样品、细胞、细胞提取物或细胞上清液中蛋白量的下降。例如，此类降低可由下降的RNA稳定性、转录或翻译、增加的蛋白降解或RNA干扰所致。优选地，与参考值相比，这种降低为至少约5％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约80％，或者甚至至少约90％。

在权利要求书和本专利申请的上下文中，术语“参考值”通常是指受炎症影响或患有炎症的个体内存在的异常高的TNF-α水平。参考值通常是在给予本发明的肽之前个体内的TNF-α量。在关于血糖控制的所有实施方案的一些方面，术语“参考值”是指用于测量受试者内的血糖控制的数值。有多个测试可用于测定例如人类受试者是否受到糖尿病前期的影响。此类测试包括例如A1C测试、空腹血糖测试(FPG)、以及口服葡萄糖耐量测试(OGTT)。

基因或蛋白的表达或活性的“提高”是指细胞、细胞提取物、或细胞上清液中蛋白或核酸的水平或活性的正向改变。例如，这种提高可由于提高的RNA稳定性、转录、或者翻译、或者降低的蛋白降解而引起。优选地，这种提高高出在对照条件下的表达或活性水平至少5％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约80％，至少约100％，至少约200％，或者甚至约500％或更高。

当用于描述核酸分子时，本文所用的术语“重组体”是指基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作原因，该多核苷酸不与其在自然界中关联的多核苷酸的全部或部分关联。当用于蛋白或多肽时，术语重组体是指通过重组多核苷酸的表达而产生的多肽。当用于宿主细胞时，术语重组体是指向其中引入了重组多核苷酸的宿主细胞。就某物质(例如细胞、核酸、蛋白或载体)而言，重组体在本文中也用来指所述物质已通过引入异源物质(例如细胞、核酸、蛋白或载体)进行修饰。

术语“载体”是指能够运送与其连接的另一核酸的核酸分子；质粒是由“载体”所包含的种类的一个类型。术语“载体”通常是指含有复制起点和对于在宿主细胞中复制和/或维持所必需的其它实体的核酸序列。能够引导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列表达的载体本文称为“表达载体”。通常，具实用性的表达载体通常处于“质粒”形式，这是指环状双链DNA环，处于其载体形式的DNA环不与染色体结合，并且通常包含用于稳定表达或瞬时表达编码DNA的实体。可用于本文所公开的方法的其它表达载体例如但不限于质粒、游离体(episomes)、细菌人工染色体(bacterial arti(icial chromosomes)、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可整合到宿主基因组中，或可在特定细胞中自主复制。载体可为DNA或RNA载体。也可使用本领域技术人员已知的提供等同功能的其它形式的表达载体，例如自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组中的载体。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的那些。能够引导它们可操作地连接的基因表达的载体本文称为“表达载体”。

术语“病毒载体”是指利用病毒、或病毒相关联的载体作为进入细胞的核酸构建体的载体。构建体可被整合并包装进非复制、缺陷型病毒基因组(像腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或单纯疱疹病毒(HSV)或其它，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体)，用于感染或转导到细胞中。载体可掺入也可不掺入细胞基因组。如果需要，构建体可包括用于转染的病毒序列。另选地，构建体可掺入能够游离复制的载体，例如EPV和EBV载体。

冠词“一个(a/an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。以举例的方式，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。除非在操作实施例中或另有说明，本文所用的表示成分的量或反应条件的所有数字在所有情况下均应被理解为由术语“约”修饰。当与百分比一起使用时，术语“约”可意指+1％。本发明还通过以下实施例详述，但是本发明的范围不应受它们的限制。

应当理解，本发明不受本文所述的具体方法、方案和试剂等的限制，并且因此可以是变化的。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围只通过权利要求进行定义。从以下详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其它特征和优点将显而易见。

本发明的治疗方法

本发明的一个方面涉及本文所述的肽和其突变体、变体、类似物或衍生物的用途。具体地，这些方法涉及将如本文所述的任何一种肽或它们药学上可接受的修饰形式在药学上可接受的载体中给予受试者，例如需要其的哺乳动物，例如人类，即，患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗AMI的受试者。这些疾病和病症的临床描述是熟知的。在一些方面，人在给予本发明的一种或多种肽之前首先诊断患有疾病的一种或多种症状。在一些实施方案中，人之前未曾被给予AAT作为症状的治疗方法。

如本文所用，“与细胞因子风暴相关联的”的疾病是其中细胞因子风暴是疾病的起因，疾病的症状，或疾病的发病结果的疾病。与细胞因子风暴相关联的疾病的非限制性示例可包括急性心肌梗死(AMI)；痛风；中风；心脏手术并发症；和/或外伤性脑损伤。

需要减少梗死面积的受试者可为患有梗死的受试者。需要减少梗死面积的受试者可为患有或诊断患有例如急性心肌梗死(AMI)；局部缺血；中风；外伤性脑损伤；和/或中毒性休克的受试者。

如本文所用，“急性心肌梗死”或“AMI”是指减少或停止流向心脏的血流，这可能通过多种原因导致心脏组织破坏。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、和/或不诊断患有选自以下的病症：II型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、I型糖尿病、和高血糖。

例如已在建立用于包括AMI的人类疾病的临床前小鼠模型中显示例如SP16肽显著改善症状。例如，SP16显示减少梗死面积。

使用广为接受的临床前安全研究，也已经提供了例如SP16肽可被安全给予的证据。例如，在AMI模型中也已经显示SP16不影响心脏收缩性。另外，使用FastPatch分析已显示例如SP16肽不影响hERG活性，并且另外不能鉴定在人类受体淘选研究(GenSEPExplorer)中对SP16肽的任何命中。

因此，在一个方面提供了用于治疗患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗AMI的受试者的方法，该方法包括向需要其的人类受试者给予包含本发明的至少一种肽的组合物。在一些方面，所述肽包含SP16。

已经显示本发明的肽如SP16是Toll样受体-2激动剂。因此，不希望受理论的约束，所述肽如SP16用作抗炎药物，其通过促进抗炎细胞因子分布而起作用。另外，不希望受理论的约束，所述肽如SP16也能够用作免疫调节剂，其通过诱导致耐受性且保护性的T-调节细胞(T-regs)的扩增而起作用。此外，不希望受理论的约束，与一般抑制免疫系统的大多数当前可用的治疗方法(用一般的免疫抑制剂治疗同时使受治疗的个体暴露于感染风险)相比，所述肽如SP16也能够在不诱导一般免疫抑制的情况下下调自体免疫响应，从而提供对自体免疫疾病的优异治疗。

因为所述肽来源于AAT，并且根据体内和体外模型的结果，预期大多数AAT的治疗效应也适用于本发明的肽(如SP16)是合理的。具体地，AAT已经显示调节T-细胞增殖和NF-kappa-B活化；削弱NK靶细胞相互作用；抑制上皮细胞EGFR/TLR-4信号转导的丝氨酸蛋白酶活化；参与TNF-α-诱导的基因表达和内皮细胞的细胞凋亡；预防大肠杆菌(E.coli)引起的红细胞溶血，减少循环的嗜曙红细胞数；抑制中性粒细胞趋化、NADHP氧化酶和ANCA信号转导；抑制单核细胞和巨噬细胞细胞因子释放和CD14表达的调节，并且抑制肥大细胞组胺释放；以及调节B-细胞增殖和细胞因子产生。在一些方面，所述肽是SP16，其可包含通常用于提高肽的生物利用率和/或贮存期限的一种或多种修饰，例如聚乙二醇化等等。

也使用TLR-2测定法，使用丙氨酸扫描进行肽优化分析。利用使用工程化TLR-2指示细胞系(HEK-BLUE^TM mTLR2，Invivogen)的实验获取数据。细胞用20μg/ml的指示肽孵育24小时。在TLR2活化时，细胞分泌碱性磷酸酶，其可被检测到。该检测一式三次进行，并且用平均值作曲线图。肽SP34是乱序肽对照(黄色)，并且PAM(Pam3CSK4；红色)是阳性对照。参见例如PCT/US13/20498；该专利以引用的方式全文并入本文。

下表提供SP16的药代动力学特征分析的结果。

PK参数	SP16，IV(5mg/kg)
		C0(μg/mL)	2.5
至最后的AUC(μg-hr/mL)	0.9
		t1/2(hr)	1.9
总CL(mL/hr)	140
		总CL(mL/min/kg)	9.7
最后时间点	8.0
		MRTINF(hr)	1.1
V(mL)	374
		Vss(mL)	149

进行该分析时，三只正常大鼠静脉内注入5mg/kg SP16，并且在注入后的8个时间点测定SP16的血浆浓度。对于每个时间点，通过LC/MS/MS测定SP16水平，并且所述值用于计算Cmax(2.5ug/ml)和T1/2(1.9小时)。测定通过Apredica，Boston，MA执行。因此，SP16经测定在正常大鼠中具有1.9小时的半衰期。

SP16安全特征也包括hERG数据。hERG FastPatch分析表明SP16在多达25μM的剂量下不抑制hERG。这一数据预测SP16在人中将不具有心脏安全问题。该研究通过Apredica，Boston，MA执行。

此外，还使用人类受体淘选进行分析。GenSEP Explorer面板包含111个体外测定靶，它们经仔细选择以评估药物/化学品的生物活性。测定类别包括GPCR、电压门控离子通道、配体门控离子通道、神经递质转运体、核受体和类固醇、以及不同组的生物化学靶，包括磷酸二酯酶、激酶和其它相关的酶。该研究通过Caliper LifeSciences执行，并且结果汇总在下表中。看起来SP16对111种人类受体无效应，指示SP16具有优异的人体安全特征。

根据SP16的安全特征，可以合理地外推出本文提供的其它肽片段在给予人时也将是安全的。

在一个实施方案中，本文所述的治疗方法还包括选择或诊断患有任何上述病症的受试者，例如在给予如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物之前由炎症引起的病症，从而治疗病症或功能不良，诸如炎症。此类选择由技术人员通过多种可用的方法进行，例如评估本文所述的症状。例如，AMI可通过例如心电图、胸片、或肌钙蛋白水平进行诊断。例如，能够评估受试者内的TNF-α量以测定受试者内存在的炎症程度。

在所有实施方案的一些方面，可使用C-反应性蛋白作为炎症或治疗功效的标记物。如果体内某处存在高度怀疑的组织受伤或感染，C-反应性蛋白(CRP)用于检测炎症。CRP用作感染和炎症的一般标记物，并且可用于评估个体的急性或慢性炎症状况。血液中的高或提高的CRP量表明存在炎症。在怀疑患有严重细菌感染的个体中，高CRP表明存在感染。在患有慢性炎性病况的人中，高水平的CRP表明疾病发作或者治疗尚未生效。健康人血清中的正常浓度通常低于10mg/L，随着年龄增长略微增加。较高的水平见于晚孕女性、轻度炎症和病毒感染(10-40mg/L)、活跃性炎症、细菌感染(40-200mg/L)、严重细菌感染和烧伤(＞200mg/L)。在一些方面，术语“参考值”是指当使用CRP作为炎症的诊断测试时，CRP的测量值。

成功的或有效的治疗通过减轻如本文所述的病症或功能不良的一种或多种症状来证明。期望将如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物给予需要其的受试者以预防或延缓本文所述的病症和机体功能不良的发展(例如起因于梗死、细胞因子风暴、炎症或自体免疫组织破坏的那些，或者在患有糖尿病的个体内通过刺激β细胞量扩增减轻的病症)。术语“预防”用于指其中受试者仍未患有经预防的具体病症的情况，意指它尚未以任何可察觉的形式显露。预防涵盖预防或延缓症状的发生和/或严重度(包括其中受试者已经患有另一种病症的一种或多种症状的情况)。预防一般在具有发展出病症或机体功能不良的受试者中进行。认为此类受试者需要预防。例如，与在给予本发明的肽之前的水平相比，TNF-α水平的降低将是成功治疗的证据。

在一个实施方案中，本文所述的预防方法还包括在向受试者给予肽或其突变体、变体、类似物或衍生物之前，选择具有患某种病症风险的受试者，例如本文所述的起因于梗死、细胞因子风暴、炎症或自体免疫组织破坏或机体功能不良的那些，从而预防所述病症或功能不良。此种选择由技术人员通过多种可用的方法进行。例如，评估风险因素或诊断已知引起病症或功能不良的疾病、或者已知引起病症或功能不良的治疗或疗法。一般认为患有疾病或受伤或具有相关家族病史(已知促进病况)的受试者具有增加的风险。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗措施，其中目标是预防或延缓疾病的发展，例如减少与炎症相关联的病症、疾病或病况的至少一种影响或症状。取决于病症，如果一种或多种症状得到改善或者临床标记物如肌钙蛋白、TNF-α、CRP、血糖和/或HbA1c的水平在正常值范围内或比反映炎症或血糖控制不良的异常值更接近正常参考值，根据本文对该术语的定义，治疗是一般“有效的”。另选地，如果疾病的发展减缓、症状的表现或疾病标记物减少，则治疗是“有效的”。即，“治疗”包括改善症状或标记物、延缓发展或延缓至少一种症状的恶化(如果不进行治疗，预期将发生恶化)。有益的或期望的临床结果包括但不限于缓解一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定病情(即，不恶化)、延缓或减缓疾病发展、缓解或减轻病情。“治疗”也可指与如果不接受治疗的预期存活期相比，延长的存活期。需要治疗的那些包括患有梗死、细胞因子风暴、或炎症的一种或多种症状，诸如与AMI相关联的症状的患者。

可例如使用许多易于获得的商用ELISA试剂盒来评估TNF-α水平。

在一些方面，本发明涉及预防细胞因子风暴、梗死，和/或AMI的方法，该方法通过将所述的肽给予仍未表现出细胞因子风暴、梗死、和/或AMI的症状的个体进行。例如，可将所述肽给予具有发展成AMI的高风险、但是仍未患有AMI的个体，用于帮助延缓AMI的发展或预防AMI的发展。

如本文所用，术语“有效量”是指包含一种或多种如本文所公开的肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的量，它们用于减少疾病或病症的至少一种或多种症状，并且涉及足量的药理组合物以提供期望的效果。如本文所用，短语“治疗有效量”是指足量的组合物，其用于治疗病症，具有合理的效/险比，可用于任何医学治疗。因此，术语“治疗有效量”是指如本文所公开的组合物的量，当给予患有例如AMI的典型受试者时其足以实现与提高水平的炎症、梗死、或细胞因子风暴相关联的症状或临床标记物的治疗学上或预防学上的减少。通常疾病标记物如炎性标记物(例如TNF-α)超过20％的减少指示有效治疗。在某些情况下，在给予本发明的肽之前个体内TNF-α水平超过50％或超过75％的降低指示有效治疗。

治疗学上或预防学上显著的症状减少为与对照或未治疗的受试者或在给予所述肽之前的受试者状态相比，测量参数的例如至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约125％，至少约150％或更多。测量的或可测量的参数包括临床上可检出的疾病标记物，例如提高或降低的生物标记物如TNF-α的水平，以及涉及临床上接受的症状量度或梗死、细胞因子风暴、和炎症的标记物的参数。然而，应当理解，如本文所公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。所需的精确的量将根据多种因素而变化，诸如待治疗的疾病类型、受试者的性别、年龄和体重。

对于治疗患有与细胞因子风暴相关联的疾病的受试者；需要减少梗死面积的受试者；和/或需要治疗AMI的受试者，术语“治疗有效量”是指用于延缓一种或多种症状的发展并导致疾病标记物如TNF-α或CRP浓度的量降低的安全且足够的量。疾病的治疗有效量取决于疾病类型、受治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、给予模式等等。因此，规定精确的“有效量”是不可能的。然而，对于任何给定病例，合适的“有效量”可由本领域的普通技术人员仅利用常规实验来测定。治疗效果可由本领域的普通技术人员进行判断，例如，治疗效果可在炎症(例如LPS模型)、AMI(例如异丙肾上腺素模型)、自体免疫组织破坏(例如CAIA模型)或糖尿病(例如db/db小鼠模型)的已知动物模型中进行评估。当使用实验动物模型时，当细胞因子风暴或梗死的症状相对于未治疗动物显示减少时，治疗效果得到证实。

在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不患有选自以下的病症、不患有选自以下的病症的症状、或者不诊断患有选自以下的病症：II型糖尿病、狼疮、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、湿疹、牛皮癣、囊性纤维化病、类风湿性关节炎、急性放射综合征、烧伤、炎性肠病、I型糖尿病、和高血糖。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不具有提高的TNF-α水平。在本文所述的任意方面的一些实施方案中，受试者不需要降低TNF-α水平。

如本文所用，术语“给予”和“引入”本文可互换使用，并且是指将如本文所公开的治疗剂如一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物通过某种方法或途径置于受试者内，所述方法或途径导致递送此类治疗剂至期望的部位。可通过任何合适的途径给予化合物，这导致对受试者的有效治疗。

如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可通过本领域已知的或本文所述的任何途径给予，例如口服、肠胃外(例如静脉内或肌内)、腹膜内、经直肠、经皮、经鼻、经阴道、吸入、皮肤(贴剂)、或经眼部。如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可以任何剂量或剂量方案给予。也可利用泵，例如用于胰岛素给予的泵。在一些实施方案中，一种或多种肽可口服给予。如美国专利8,975,224的图16所示；该专利以引用的方式全文并入本文，例如与腹膜内注射SP16和地塞米松相比，SP16的口服给予显示有效。

剂量

对于本发明的治疗方法，它不旨在如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的给予受具体给予模式、剂量、或给予频率的限制；本发明设想所有给予模式，包括肌内、静脉内、腹膜内、囊内、关节内、病灶内、皮下、或者任何其它途径给予，它们足以提供足够治疗例如炎症、梗死、或细胞因子风暴相关的病症的剂量。治疗剂可以单剂量或多剂量给予患者。当给予多剂量时，剂量可彼此间隔例如一小时、三小时、六小时、八小时、一天、两天、一周、两周、或一个月。例如，治疗剂可给予例如2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、或更多周。应当理解，对于任何特定受试者，根据个体需要以及给予或监督给予组合物的人员的职业判断，应随时间推移调整具体剂量方案。例如，如果较低的剂量不提供足够的治疗活性，可提高治疗剂的剂量。

虽然主治医师最终将决定适合的量以及给予方案，如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的治疗有效量可为0.0001、0.01、0.01、0.1、1、5、10、25、50、100、500、或1,000mg/kg或μg/kg的剂量。有效剂量可由来源于体外或动物模型测试生物分析法或系统的剂量-响应曲线外推得到。

用于特定患者或受试者的剂量可由本领域的普通技术人员利用常规考虑(例如通过合适的常规药理方案)来确定。医师可例如首先开出相对低剂量的药方，随后提高剂量直至获得合适的响应。给予患者的剂量随时间推移足以在患者中实现有益的治疗响应、或者例如减少症状、或者其它合适的活性，这取决于应用。剂量由以下因素确定：具体制剂的功效、以及如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的活性、稳定性或血清半衰期、以及患者状况、以及待治疗的患者的体重或体表面积。剂量大小也由伴随具体载体、制剂等等给予具体受试者的任何不良副作用存在与否、性质、和程度来确定。根据本领域熟知的方法，包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的治疗组合物任选地在一种或多种合适的体外和/或体内疾病动物模型中进行测试，例如炎症或糖尿病模型，从而确认疗效、组织代谢、以及估算剂量。具体地，剂量可初始通过相关测定法对治疗与未治疗(例如治疗对未治疗的细胞或动物模型的比较)的活性、稳定性或其它合适的测量来确定。制剂给予速率通过相关制剂的LD50和/或对如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的任何副作用的观察来确定。给予可经由单剂量或分开的剂量完成。

在对如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物(它们给予以治疗或预防疾病)的有效量的测定中，医师评估循环血浆水平、制剂毒性、和疾病的发展。

化合物的功效和毒性可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序进行测定，例如ED50(剂量对50％的群体有效)和LD50(剂量对50％的群体致命)。毒性对治疗效果的剂量比率是治疗指数，并且它可表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的药物组合物是优选的。

这些化合物可通过任何合适的给予途径给予人和其它动物用于治疗，所述途径对小的肽有效，包括口服、经鼻(通过例如喷雾)、直肠、阴道内、肠胃外、脑池内和局部，例如粉末、软膏剂或滴剂，包括颊面和舌下给予。

本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可不同，从而获得有效实现对具体受试者、组合物以及给予模式的期望治疗响应，并且对受试者无毒性的活性成分的量。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括本发明使用的具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予次数、使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、其它药物、与使用的具体化合物联合使用的化合物和/或物质、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康和之前的就医史等等，这些因素是医疗领域所熟知的。

药物组合物制剂-“药学上可接受的载体”

如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的给予可通过任何合适的方式，所述方式导致治疗疾病的蛋白浓度。化合物可以任意合适量包含在任何合适的载体物质中，并且一般存在的量为按组合物总重量计1-95％。组合物可以适于口腔、肠胃外(例如静脉内或肌内)、腹膜内、直肠、皮肤、经鼻、经阴道、吸入、皮肤(贴剂)、或眼部给予途径的剂型提供。因此，组合物可为例如以下的形式：片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒剂、悬浮液、乳液、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏剂、霜剂、硬膏剂、浸液、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂、或气雾剂。药物组合物可根据常规的制药实践来配制(参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000，ed.A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，MarcelDekker，New York，全文以引用方式并入本文)。

可配制根据本发明的药物组合物以释放活性化合物，释放时间为在给予时立即释放或者在给予后的任何预定的时间或时间段释放。后几种类型的组合物一般称为控释制剂，其包括(i)在体内经延长的时间形成基本上恒定浓度的本发明的药剂的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在体内经延长的时间形成基本上恒定浓度的本发明的药剂的制剂；(iii)通过在体内保持相对恒定的有效水平的药剂，同时最小化与药剂的血浆水平波动(锯齿状动力学模式)相关联的非期望副作用，在预定的时期内维持药剂作用的制剂；(iv)局部化药剂作用的制剂，例如在患病组织或器官附近或其中空间安置控释组合物；(v)实现方便给药的制剂，例如，每周给予一次或每两周给予一次组合物；以及(vi)靶向所述药剂作用的制剂，其通过使用载体或化学衍生物将治疗剂递送至特定的靶细胞类型。对于具有在胃肠道中窄吸收窗或者相对短的生物半衰期的化合物而言，以控释制剂的形式给予蛋白是尤其优选的。

可使用许多策略中的任一种以获得控制释放，其中释放速率大于所述化合物的代谢速率。在一个示例中，控制释放通过适当选择不同的制剂参数和成分获得，包括例如不同类型的控释组合物和涂层。因此，蛋白用合适的赋形剂配制到药物组合物中，在给予时以受控的方式释放蛋白。示例包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮剂、乳剂、微胶囊、分子络合物、微球剂、纳米微粒、贴剂和脂质体。

如本文所用，短语“肠胃外给予”和“经肠胃外给予”是指除经肠内给予和局部给予之外的给予模式，通常通过注射，并且无限制地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、脑脊髓内(intracerebrospinal)、以及胸骨内注射和输注。如本文所用，短语“全身给予”、“经全身给予”、“外周给予”和“经外周给予”是指并非直接将治疗组合物给予到肿瘤中，使得它进入动物的全身并且因此经受代谢和其它相似的过程。

如本文所用，短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型：它们在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过多毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效/险比相称。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指涉及保持所述药剂的活性或者从身体的一个器官或部分携带或转运所述药剂到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的物质、组合物或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。除了是如本文所定义的术语“药学上可接受的”之外，每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。药物制剂包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物连同一种或多种药学上可接受的成分。载体可为固体、半固体或液体稀释剂、霜剂或胶囊的形式。这些药物制剂是本发明的另一个目的。通常活性化合物的量为按制剂重量计0.1-95％，对于肠胃外使用优选地为按制剂重量计0.2-20％，并且在口服给予情况下优选地为按制剂重量计1％至50％。为了临床上使用本发明的方法，将本发明的靶向递送组合物配制成药物组合物或药物制剂，用于肠胃外给予，例如静脉内；粘膜给予，例如鼻内；肠内给予，例如口服；局部给予，例如透皮；眼部给予，例如经由角膜划痕或其它给予模式。所述药物组合物包含本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的成分的组合。载体可为固体、半固体或液体稀释剂、霜剂或胶囊的形式。

术语“药学上可接受的载体”旨在包括适合于所需的特定剂型的所有溶剂、稀释剂、或其它液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等。通常此类化合物从身体的一个器官或部分携带或转运到身体的另一个器官或部分。每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且对患者无伤害。能够充当药学上可接受的载体的材料的一些示例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其功能衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物制剂中使用的其它无毒的可相容的物质。

本文所用的术语“药物组合物”是指通常包含赋形剂如药学上可接受的载体的组合物或制剂，所述赋形剂是本领域常规的并且适于给予哺乳动物，并且优选人或人细胞。可特别配制此类组合物用于经由许多途径中的一种或多种给予，包括但不限于口服、眼部、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、鼻内、舌下、椎管内、脑室内等等。此外，本文描述了用于局部(例如口腔粘膜、呼吸道粘膜)和/或口服给予的组合物，其能够形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、口服灌洗剂或粉剂，它们是本领域已知的。该组合物也能够包括稳定剂和防腐剂。例如载体、稳定剂和助剂，University of the Sciences in Philadelphia(2005)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts andComparisons，第21版。

在某些实施方案中，本发明的化合物可包含一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺、和前药”是指本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺、和前药，它们在合理的医学判断范围内适于接触患者的组织，无过多的毒性、刺激性、过敏反应等等，与合理的效/险比相称，并且它们在本发明化合物的预期使用中有效。术语“盐”是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可在最后分离和纯化化合物时原位制备，或者可通过单独将经纯化的化合物以其游离碱形式与合适有机或无机酸反应并分离由此生成的盐而制备。这些可包括基于碱金属和碱土金属的阳离子如钠、锂、钾、钙、镁等等，以及无毒铵、季铵、和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等等(参见例如Berge S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66，1，其以引用方式并入本文)。

术语“药学上可接受的酯”是指本发明化合物的相对无毒的酯化产物。这些酯可在最后分离和纯化化合物时原位制备，或者可通过单独将经纯化的化合物以其游离酸形式或羟基与合适酯化剂反应而制备。羧酸可通过在存在催化剂的情况下用醇处理而转化成酯。该术语还旨在包括低级烃基团，其能够在生理条件下溶剂化，例如烷基酯、甲基、乙基和丙基酯。

如本文所用，“药学上可接受的盐或前药”是如下盐或前药：它们在合理的医学判断范围内适于接触受试者的组织，无过多的毒性、刺激性、过敏反应等等，与合理的效/险比相称，并且对于它们的预期使用有效。

术语“前药”是指体内快速转化以产生功能上有活性的如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的化合物。在T.Higachi和V.Stella，″Pro-drugsas Novel Delivery Systems，″A.C.S.Symposium Series第14卷，以及BioreversibleCarriers in：Drug Design，ed.Edward B.Roche，American Pharmaceutical Associationand Pergamon Press，1987中提供了充分的讨论，这两篇文献均以引用方式并入本文。如本文所用，前药是在体内给予时代谢成或以其他方式转化成化合物在生物学、药学或治疗学上活性形式的化合物。可设计如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的前药以改变如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的代谢稳定性或转运特性，从而消除副作用或毒性，改善化合物的风味或改变化合物的其它特性或性质。根据药效学过程和体内药物代谢的知识，一旦知道如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物活性形式，医药领域的技术人员一般就能够设计化合物的前药(参见例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A BiochemicalApproach，Oxford University Press，N.Y.，第388-392页)。选择并制备合适前药的常规方法描述于例如“Design of Prodrugs，”ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985。前药的合适示例包括对应酸的甲酯、乙酯和甘油酯。

肠胃外组合物

药物组合物可通过如下方式肠胃外给予：以剂型、制剂或者经由适当的递送装置或含有常规无毒的药学上可接受的载体和助剂的植入物的注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)。此类组合物的配制和制备是药物制剂领域的技术人员所熟知的。

可以单位剂型(例如，单剂量安瓿)或含有几个剂量的小瓶来提供肠胃外使用的组合物，并且所述小瓶中可添加适当防腐剂(见下文)。组合物的形式可为溶液、悬浮液、乳液、输注装置、或用于植入的递送装置、或者其可以干粉形式存在，在使用前用水或其它合适载体重构。除活性剂之外，所述组合物可包括适当的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性剂可掺入微球剂、微胶囊、纳米微粒、脂质体等用于控制释放。此外，所述组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。

如上所述，根据本发明的药物组合物可以是适合无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将适当的活性剂溶解或悬浮于胃肠外可接受的液体媒介中。可以使用的可接受的媒介和溶剂是：水、通过添加适量盐酸、氢氧化钠或适当缓冲液而被调节至适当pH的水、1，3-丁二醇；林格氏溶液；右旋糖溶液；和等渗氯化钠溶液。含水制剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。当一种所述化合物仅略溶或微溶于水时，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或者所述溶剂可以包括10-60％w/w的丙二醇等。

在组合物中还可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、风味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂。

药学上可接受的抗氧化剂的示例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷酯、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的制剂包括适于静脉内、口服、经鼻、局部、透皮、颊面、舌下、直肠、经阴道和/或肠胃外给予的那些。制剂可常规地以单位剂型提供，并且可通过制药领域中任何熟知的方法制备。可以与载体材料结合以制备单一剂型的活性成分的量一般将是产生疗效的化合物的量。

制备这些制剂或组合物的方法包括将本发明的化合物与载体以及任选的一种或多种辅助成分相缔合的步骤。一般来讲，通过均匀并紧密地使本发明的化合物与液体载体或细粉碎的固体载体或以上二者缔合，并且随后根据需要成形产品来制备所述制剂。

适于口服给予的本发明制剂可以为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用增香的基料，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉剂、颗粒的形式，或者作为在含水或非水液体中的溶液或混悬液、或作为水包油型或油包水型液体乳液或作为酏剂或糖浆剂、或作为锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等等，其各自包含预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的化合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂给予。

适于肠胃外给予的本发明药物组合物包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物连同以下物质的组合：一种或多种药学上可接受的无菌等渗含水或非水溶液、分散液、混悬液或乳液、或可以在使用前重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。

可用于包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的合适的含水和非水载体的示例包括水、乙醇、多元醇类(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油、和可注射有机酯类，诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料，诸如卵磷脂，就分散液而言通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以包含助剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚山梨酸等，来确保对微生物作用的预防。组合物中还可以期望包括等渗剂，诸如糖类、氯化钠等。此外，还可以通过包含延长吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。

在某些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓药物从皮下或肌内注射中吸收。可以通过使用具有较低水溶性的结晶或无定形物质的液体分散体达到这一目的。随后，药物的吸收速率依赖于其溶出率，其进而可以取决于结晶大小和晶形。或者，通过将药物溶于或悬浮于油载体中延迟肠胃外给予的药物形式的吸收。

通过形成主题化合物在生物可降解聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中的微囊基质来制备可注射的贮库剂型。根据药物与聚合物之比和所用特定聚合物的性质，药物释放速率可以得到控制。其它生物可降解聚合物的示例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物诸如如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物捕集在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备可注射的贮库制剂。

无论所选的给予途径如何，都可以通过本领域的普通技术人员已知的常规方法，将以合适的水合形式使用的本发明化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。

肠胃外组合物的受控释放

受控释放的肠胃外组合物可为含水悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液、或乳液的形式。也可将组合物掺入生物相容的载体、脂质体、纳米粒子、植入物、或输注装置中。

用于制备微球和/或微胶囊的材料为例如可生物降解的/可生物侵蚀的聚合物，诸如聚半乳糖聚-(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)、聚(乳酸)、聚乙醇酸、以及它们的混合物。在配制控释肠胃外制剂时可以使用的生物相容性载体是碳水化合物(例如葡聚糖)、蛋白质(例如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可以是非生物可降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))或它们的组合。

口服使用的固体剂型

用于口服使用的制剂包括含有活性成分与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物的片剂，并且此类制剂是本领域技术人员已知的(例如美国专利：5,817,307；5,824,300；5,830,456；5,846,526；5,882,640；5,910,304；6,036,949；6,036,949；和6,372,218，它们以引用方式并入本文)。例如，这些赋形剂可以是：惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；粒化剂和崩解剂(例如纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或海藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶凝淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和防粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。其它药学上可接受的赋形剂可为着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

所述片剂可以是未包衣的，或者其可以通过已知技术包衣，任选以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供较长期的持续作用。所述包衣可适合以预定模式释放蛋白(例如，为获得控释制剂)，或者其可调节为直至通过胃后才释放所述药剂(肠溶包衣)。包衣可以是糖包衣、膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)或者肠溶包衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。此外，可以使用时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固体片剂组合物可以包括适于保护该组合物免受不希望的化学变化(例如，在释放活性物质之前的化学降解)的包衣。可以与上述Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology中描述的类似方式将所述包衣应用于固体剂型上。

本发明的组合物可共混在片剂中，或者可以分开。在一个示例中，第一药剂包含在片剂内部，而第二药剂在外部，使得第二药剂的大部分在第一药剂释放前被释放。

用于口服的制剂还可以是咀嚼片、或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。可以使用上文在片剂和胶囊下提及的成分以常规方式制备粉剂和颗粒剂，例如，使用混合器、流化床装置或喷雾干燥设备。

在口服给予的本发明固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒等)中，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任意下列物质混合：填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和/或硅酸；粘合剂，诸如，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，诸如甘油；崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；溶解延缓剂，诸如石蜡；吸收促进剂，诸如季铵化合物；润湿剂，诸如，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；吸收剂，诸如高岭土和膨润土；润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠及其混合物；和着色剂。就胶囊、片剂和丸剂而言，药物组合物还可以包含缓冲剂。使用诸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇类等的赋形剂，相似类型的固体组合物可以用作软和硬明胶胶囊的填充剂。

可以通过任选用一种或多种辅助成分通过压制或模制来制备片剂。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备压制片。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物制备模制片。

可以任选地给本发明药物组合物的片剂和其它固体剂型，诸如糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒加刻痕或使用包衣和壳来制备，诸如肠溶包衣以及制药领域中众所周知的其它包衣。还可以使用例如不同比例以提供期望释放模式的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球来配制它们，以提供其中活性成分的缓慢释放或受控释放。可以对它们灭菌，例如通过经截留细菌的过滤器过滤，或在无菌固体组合物的形式中掺入灭菌剂，所述组合物在紧接使用前可以溶解于无菌水或一些其它无菌注射介质中。这些组合物还可以任选包含遮光剂并且可以属于这类组合物，即它们仅或优选在胃肠道的某部分任选以延缓方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的示例包括聚合物物质和蜡。活性成分还可以与一种或多种上述赋形剂一起处于微囊化形式中。在一个方面，消退素(resolvin)和/或保护素(protectin)或者其前体或类似物的溶液可以滴眼剂的形式给予，用于眼部血管新生，或者以滴耳剂的形式用于治疗耳炎。

根据本发明可用的肽的口服给予已经如例如美国专利8,975,224所述显示起作用。

肽的口服给予已经显示也对其它蛋白或肽药物起作用。例如，抗-CD3抗体的口服给予已经显示对治疗例如糖尿病(Ishikawa等人Diabetes.2007年8月；56(8)：2103-9.Epub，2007年4月24日)、以及自体免疫脑脊髓炎(Ochi等人Nat Med.2006年6月；12(6)：627-35.Epub，2006年5月21日)起作用。不希望受理论的约束，提出经由肠相关淋巴组织(GALT)是可能的。因此，在本发明的所有实施方案的一些方面，所述肽的制剂是口服制剂，并且所述方法通过口服给予所述肽来实施。

用于本发明化合物口服给予的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬液、糖浆剂和酏剂。

除活性成分外，液体剂型还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其它溶剂，助溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇类和失水山梨醇的脂肪酸酯类、以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括助剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、增甜剂、矫味剂、着色剂、香料和防腐剂。

除活性化合物外，混悬液还可以包含助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇类、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯类、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶、以及它们的混合物。

用于如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的局部或透皮给予的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体、以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂相混合。

除本发明的活性化合物之外，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶还可以包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇类、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌、或者它们的混合物。除本发明的活性化合物之外，粉剂和喷雾剂还可以包含赋形剂，诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉或这些物质的混合物。喷雾剂还可以另外包含常用的抛射剂，诸如氯氟烃类和挥发性未取代的烃类，诸如丁烷和丙烷。

透皮贴剂具有对身体提供受控递送的本发明化合物(消退素和/或保护素或者其前体或类似物)的附加优势。可以通过将化合物溶解或分散在适当介质中来制备此类剂型。吸收促进剂还可以用于增加化合物通过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将活性化合物分散于聚合物基质或凝胶中控制这种通量的速率。在另一方面，可生物降解的或可吸收的聚合物能够提供延长的、常常局部的多肽药剂释放。治疗剂的增加的半衰期或延长释放的潜在有益效果是显而易见的。局部释放的潜在有益效果是能够在较长时间内取得比更广泛的全身给予高得多的局部剂量或浓度，也有可能避免可能的非期望副作用，所述副作用可能在全身给予时发生。

适于递送如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的可生物吸收的聚合物基质可选自多种可生物吸收的合成聚合物，它们在文献中得到广泛描述。此类合成的可生物吸收的、生物相容的聚合物可经几周或几个月释放蛋白，其可包括例如聚-α-羟基酸(例如聚丙交酯、聚乙交酯以及它们的共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、聚乙二醇与聚对苯二甲酸丁二酯的嵌段共聚物(Polyactive^TM)、酪氨酸衍生物聚合物或聚(酯-酰胺)。用于制造药物递送材料和植入物的合适可生物吸收的聚合物在以下文献中进行了讨论：例如美国专利4,968,317、5,618,563等等，以及由S.W.Shalaby编辑的“BiomedicalPolymers”，Carl Hanser Verlag，Munich，Vienna，New York，1994，以及上述出版物中引用的多个参考文献。应选择的特定的可生物吸收的聚合物将取决于受治疗的具体患者。

基因疗法

如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物可有效地通过基因疗法用于治疗。一般参见例如美国专利5,399,346，其以引用方式并入本文。一般原则是将多核苷酸引入患者的靶细胞中。

通过本领域已知的合适技术(例如，提供处于合适载体形式的多核苷酸，或将多核苷酸封装在脂质体中)来帮助进入细胞。

基因疗法的期待模式是通过使多核苷酸在细胞内部复制，增强和延长所需效果这样的方式来提供该多核苷酸。因此，将多核苷酸可操作地连接到合适的启动子，例如，相应基因的天然启动子，在肝、神经元、骨骼、肌肉、皮肤、关节或软骨细胞中固有有效的异源启动子，或可被合适的试剂诱导的异源启动子。

可将与真核细胞相容的表达载体、优选与脊椎动物细胞相容的表达载体用于生产表达如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物(包括具有如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的融合蛋白)的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域公知的，并可从多个商业来源获得。通常提供了含有方便所需DNA区段插入的限制性位点的此类载体。此类载体可为病毒载体，例如，腺病毒、腺相关病毒、痘病毒如正痘(orthopox)(牛痘和减毒牛痘)、禽痘病毒(avipox)、慢病毒、鼠莫洛尼白血病病毒(moloney leukemia virus)等等。另选地，可使用质粒表达载体。

可在本发明中使用的病毒载体系统包括但不限于：(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，例如正痘，如牛痘病毒载体或禽痘病毒(例如，金丝雀痘或鸡痘)；以及(j)辅助病毒依赖性腺病毒(helper-dependentadenovirus)或无内容腺病毒(gutless adenovirus)。在一个优选的实施方案中，所述载体是腺病毒。复制缺陷型病毒也可是有利的。

载体可掺入也可不掺入细胞基因组。如果需要，构建体可包括用于转染的病毒序列。另选地，构建体可掺入能够游离复制的载体，例如EPV和EBV载体。

“可操作地连接”是指核酸分子与一个或多个调控序列(例如启动子)以如下方式连接：该连接使得当合适分子(例如转录激活蛋白)结合到调控序列上时，允许核酸分子表达和/或分泌产物(例如蛋白)。换句话讲，本文所用的术语“可操作地连接”是指核酸序列与核苷酸的调控序列(例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点、以及其它信号序列)的功能关系。例如，核酸序列(通常为DNA)与调控序列或启动子区的可操作连接是指该DNA与该调控序列或启动子之间的物理和功能关系，从而这样的DNA的转录由该调控序列或启动子通过特异性识别、结合和转录该DNA的RNA聚合酶来启动。为了优化表达和/或体外转录，可能需要修饰调控序列，以用于在表达其的细胞类型中表达该核酸或DNA。此类修饰的期许或需要能够凭经验确定。欲表达的可操作地连接的多核苷酸通常包括合适的起始信号(例如ATG)并保持正确的阅读框以允许多核苷酸序列在表达控制序列的控制下表达，并且产生由多核苷酸序列编码的期望多肽。

如本文所用，术语“启动子”或“启动子区”或“启动子元件”已经在本文中定义，是指控制与其可操作地连接的核酸序列的转录的核酸序列区段，通常为但不限于DNA或RNA或它们的类似物。启动子区包含足以用于RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。启动子区的这一部分被称为启动子。此外，启动子区包含调节RNA聚合酶的这种识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的，或可以响应于反式作用因子。启动子可为组成型或调控型，这取决于调控的性质。

术语“调控序列”与“调控元件”在本文可互换使用，是指调节与其可操作地连接的核酸序列的转录，并由此作为转录调节剂起作用的核酸区段，通常为但不限于DNA或RNA或它们的类似物。调控序列调节与其可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达。调控序列通常包括“调控元件”，它们是作为转录结合结构域并由转录蛋白和/或转录因子、阻遏物或增强子等的核酸结合结构域识别的核酸序列。典型的调控序列包括但不限于转录启动子、可诱导的启动子和转录元件、控制转录的可选操作序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和/或翻译终止的序列。诱导或控制与其可操作地连接的蛋白编码序列的转录的核酸序列(例如起始信号、增强子和启动子)包括在术语“调控元件”中。在一些示例中，重组基因的转录处于启动子序列(或其它转录调控序列)的控制之下，启动子序列(或其它转录调控序列)控制重组基因在想要在其中进行表达的细胞类型中的表达。应当理解，重组基因可处于与对天然存在形式的蛋白的转录进行控制的转录调控序列相同或不同的转录调控序列的控制之下。在某些情况下，启动子序列被启动特定基因的转录所需的细胞合成机制或引入的合成机制识别。

调控序列可以是单个调控序列或多个控调序列、或修饰的调控序列、或它们的片段。修饰的调控序列为其中核酸序列已通过某种手段改变或修饰(例如但不限于突变、甲基化等)的调控序列。

在如本文所公开的方法中可用的调控序列为足以使启动子依赖性基因表达在细胞类型特异性、组织特异性方面是可控的、或通过外部信号或试剂(例如，增强子或抑制子)是可诱导的启动子元件；这样的元件可以位于天然基因的5′或3′区或内含子内。

如本文所用，术语“组织特异性启动子”是指用作启动子(即调控可操作地连接到该启动子的选定核酸序列的表达)，并且在特定组织细胞中选择性地影响选定核酸序列的表达的核酸序列。

在一些实施方案中，可有利的是以组织或细胞特异性的方式引导如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的表达。可实现肌肉特异性的表达，例如使用骨骼肌MKC启动子(公开于美国专利申请WO2007/100722中，其以引用方式并入本文)，或者其它肌肉特异性的启动子，例如α-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链-2(它是骨骼肌特异性的(Shani等人，Nature，314；283-86，1985)、在下丘脑激活的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason等人，Science，234；1372-78，1986)、以及平滑肌启动子SM22a，它们全部是本领域公知的。

术语“组成型活性启动子”是指在给定细胞内所有时间中均表达的基因的启动子。用于在哺乳动物细胞中使用的示例性启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子，并且用于在原核细胞中使用的示例性启动子包括噬菌体T7启动子和T3启动子等。术语“诱导型启动子”是指能够响应于给定信号(例如试剂的增加或减少)而表达的基因的启动子。诱导型启动子的非限制性示例是“tet-on”和“tet-off”启动子、或者在特定组织类型中受调控的启动子。

在一个具体的实施方案中，可使用包含编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的核酸序列的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合入宿主细胞DNA所需的组件。关于逆转录病毒载体的更多详细信息可见于Boesen等人，Biotherapy 6：291-302(1994)中，其描述了使用逆转录病毒载体来将mdrl基因递送到造血干细胞，以使干细胞更耐化疗。说明逆转录病毒载体在基因疗法中的使用的其它参考文献为：Clowes等人，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem等人，Blood83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及Grossman和Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。

携带感兴趣的基因的重组逆转录病毒载体的制造通常以两步骤实现。首先，可将编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的序列插入逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体包含有效表达代谢调节剂所需的序列(包括可通过病毒长末端重复(LTR)或者通过内部启动子/增强子及相关剪接信号提供的启动子元件和/或增强子元件)；以及将病毒RNA有效地包装成感染性病毒粒子所需的序列(例如，包装信号(Psi)、tRNA引物结合位点(-PBS)、反转录所需的3′调控序列(+PBS))，以及病毒LTR)。LTR含有为病毒基因组RNA结合、逆转录酶和整合酶功能所需的序列，以及涉及指导待包装在病毒颗粒中的基因组RNA表达的序列。

在构建重组逆转录病毒载体后，将载体DNA引入包装细胞系中。包装细胞系提供以反式(in trans)将病毒基因组RNA包装成具有所需宿主范围的病毒颗粒所需的病毒蛋白(例如，病毒编码核心(gag)、聚合酶(pol)和包膜(env)蛋白)。通过病毒颗粒表面上表达的包膜基因产物的类型来部分控制宿主范围。包装细胞系可表达亲嗜性(ecotrophic)、兼嗜性(amphotropic)或异嗜性(xenotropic)包膜基因产物。另选地，包装细胞系可以缺乏编码病毒包膜(env)蛋白的序列。在这种情况下，包装细胞系可将病毒基因组包装成缺乏膜结合蛋白(例如，env蛋白)的颗粒。为了生产含有允许病毒进入细胞的膜结合蛋白的病毒颗粒，可用编码膜结合蛋白(例如，水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白)的序列转染含有逆转录病毒序列的包装细胞系。然后，转染的包装细胞可产生含有由被转染的包装细胞系表达的膜结合蛋白的病毒颗粒；含有来源于由另一病毒的包膜蛋白包壳化的一种病毒的病毒基因组RNA的这些病毒颗粒被认为是假型病毒颗粒。

腺病毒是可用于基因疗法的其它病毒载体。对于将基因递送到呼吸道上皮细胞，腺病毒是特别引人注目的媒介。腺病毒天生感染呼吸道上皮细胞，并在此引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其它靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，Current Opinion in Genetics andDevelopment 3：499-503(1993)，给出了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout等人，HumanGene Therapy 5：3-10(1994)，证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮细胞。另一优选的病毒载体是痘病毒，如牛痘病毒，例如减毒牛痘(如改良安卡拉痘苗病毒(MVA)或NYVAC)，禽痘病毒，如鸡痘或金丝雀痘。在基因疗法中使用腺病毒的其它示例可见于Rosenfeld等人，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公布WO94/12649；以及Wang等人，Gene Therapy 2：775-783(1995)。在另一个实施方案中，使用慢病毒载体，例如美国专利6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述的基于HIV的载体，它们以引用方式并入本文。也设想使用腺相关病毒(AAV)载体(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；以及美国专利5,436,146，它们以引用方式并入本文)。

基因疗法的另一方法涉及通过诸如电穿孔、脂转染(lipofection)、磷酸钙介导的转染、或病毒感染的方法来将基因转移到组织培养中的细胞。通常，转移方法包括将可筛选标记转移至细胞。然后，将细胞置于筛选下，以分离出摄取并表达该转移基因的细胞。然后，将那些细胞递送给患者。

美国专利5,676,954(其以引用方式并入本文)报道了将与阳离子脂质体载体复合的遗传物质注射到小鼠中。美国专利4,897,355、4,946,787、5,049,386、5,459,127、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055、和国际公布号：WO 94/9469(其以引用方式并入本文)提供了用于将DNA转染进细胞和哺乳动物的阳离子脂质。美国专利5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055、和国际公布号：WO 94/9469(其以引用方式并入本文)提供了将DNA-阳离子脂质复合体递送进哺乳动物的方法。此类阳离子脂质复合体或纳米粒子也可用于递送蛋白。

可通过任何合适的方法将基因或核酸序列引入靶细胞中。例如，可通过转染(例如，磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染)、脂转染、电穿孔、显微注射(例如，通过直接注射裸DNA)、基因枪、用含有肌肉相关转基因的病毒载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、核转移等，将如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的构建体引入到细胞中。可通过以下方法将编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的核酸引入细胞：电穿孔(参见例如Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107：584-87(1982))和基因枪(例如基因枪(gene gun)；Johnston和Tang，Methods Cell Biol.43Pt A：353-65(1994)；Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11478-82(1993))。

在某些实施方案中，可通过转染或脂转染将编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的基因或核酸序列引入靶细胞。转染或脂转染的合适试剂包括例如磷酸钙、DEAE-葡聚糖、脂质体、lipfectamine、DIMRIE C、Superfect、和Effectin(Qiagen)、unifectin、maxifectin、DOTMA、DOGS(Transfectam；双十八烷基酰胺甘氨酰精胺)、DOPE(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOTAP(1，2-二油酰基-3-三甲铵丙烷)、DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)、DHDEAB(N，N-双正十六烷基-N，N-二羟乙基溴化铵)、HDEAB(N-正十六烷基-N，N-二氢乙基溴化铵)、聚凝胺、聚乙烯亚胺(PEI)等。(参见例如Banerjee等人，Med.Chem.42：4292-99(1999)；Godbey等人，Gene Ther.6：1380-88(1999)；Kichler等人，Gene Ther.5：855-60(1998)；Birchaa等人，J.Pharm.183：195-207(1999)，它们全文以引用方式并入本文)。

本领域已知的用于药剂(例如，蛋白和/或核酸)的治疗性递送的方法可用于递送多肽或编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的核酸，例如细胞转染、基因疗法、用递送媒介或药学上可接受的载体直接给予、通过提供含有编码本发明的靶向融合多肽的核酸的重组细胞进行间接递送。

各种递送系统是已知的，并且可用于直接给予治疗性多肽(例如如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物)和/或编码如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的核酸，例如，包封于脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达该化合物的重组细胞、以及受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入方法可为肠内的或胃肠外的，并且包括但不限于皮内途径、肌内途径、腹膜内途径、静脉内途径、皮下途径、肺途径、鼻内途径、眼内途径、硬膜外途径以及口服途径。药剂可以通过任何方便的途径(例如，通过输注或推注，通过经由上皮内层或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收)进行给予，并且可以与其它生物活性剂一起给予。给予可为全身的或局部的。

在一个具体的实施方案中，将本发明的药物组合物局部给予至需要治疗的区域是可取的；这可例如但不受限地通过手术期间的局部输注；局部应用，例如通过注射、借助导管、或借助植入物(植入物为多孔材料、非多孔材料或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜)、纤维或商业皮肤替代品)来实现。

在另一个实施方案中，活性剂可在囊泡、特别是脂质体中递送(参见Langer(1990)Science 249：1527-1533)。在另一个实施方案中，活性剂可在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer(1990)，同上)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料(参见Howard等人(1989)J.Neurosurg.71：105)。

因此，广泛而多样的基因转移/基因疗法载体和构建体是本领域公知的。这些载体容易适用于本发明的方法。通过使用重组DNA/分子生物学技术的适当操作将可操作地连接的多肽编码核酸区段插入所选的表达/递送载体，可以生成很多用于实施本文所述方法的等效载体。

其它实施方案

根据前述内容，将显而易见的是可对本文所述的本发明实施各种变型和修改，以使其适用各种用法和条件。此类实施方案也落入所附权利要求的范围内。

本公开也设想一种制品，它是用于提供如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的标记容器。制品包含包装材料和在包装材料中包含的如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药剂。

在制品中的药剂是本发明的任何组合物，适于提供如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物，并且根据公开的指示配制成如本文所述的药学上可接受的形式。因此，所述组合物可包含如本文所公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物或能够表达这种肽的DNA分子。

所述制品包含单位剂量或多个剂量的一定量的药剂，足以用于治疗本文所述的病症。包装材料包括指示其中包含的药剂的使用的标签。

所述标签还可包括使用说明书及市场可能需要的相关信息。包装材料可包括用于存储药剂的容器。

如本文所用，术语包装材料是指诸如玻璃、塑料、纸、箔等等的材料，其能够将药剂保持在固定的装置中。因此，例如包装材料可为塑料或玻璃小瓶、层压包壳及类似容器，它们用于容纳包含药剂的药物组合物。

在优选的实施方案中，包装材料包括标签，它是描述制品内容物及其中包含的药剂的使用的有形表示。

实施例

实施例1-使用SP163M肽治疗急性心肌梗死

SP16肽是来源于循环血清蛋白α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的短片段。US FDA已经批准使用来源于人血浆的三种α1-抗胰蛋白酶产品：Prolastin、Zemaira、和Aralast。

如本文所述，SP163M肽包含母体AAT的已报道的抗炎特性。在VirginiaCommonwealth University(VCU)进行的试验性临床研究中，AAT已经初步显示安全有效地阻断发生在AMI之后的炎性反应。此外，SP163M已经在AMI的临床前模型中显示等同或更好的抗炎活性。我们与VCU的研究人员合作，迅速开发出SP16用于治疗AMI，AMI是美国和世界范围内的一个主要的未满足医学需求。

在美国和世界范围内，急性心肌梗死(AMI)一直是发病率及死亡率的主要原因。尽管早期再灌注的当前策略，许多患者仍在此期间早期死亡，并且存活的那些患者面临后期死于不利心脏重构、心力衰竭和突然死亡的风险。多个出版物强调在AMI后接下来的2-5年中，AMI中梗死面积与心力衰竭发展概率之间的关联。

患有ST段抬高性心肌梗死(STEMI)的患者尤其面临不利心脏重构、心力衰竭和医院内以及长期死亡率的高风险。虽然在STEMI的治疗方面已经取得了显著的改善，但是早期死亡率的降低已经与提高的STEMI后心力衰竭的发生率关联在一起¹。这可能反映幸免于指示事件的更高风险患者以及人群老化和高血压及糖尿病的流行。在STEMI 30天内，超过20％的幸存者诊断患有心力衰竭，一种与高发病率、失能和死亡率相关联的疾病。

心力衰竭确实是主要的公共健康问题，影响大约5百万美国人，并且每年新增500,000例。与其它心血管疾病相比，心力衰竭的发生率和普遍性持续提高，并且心力衰竭现在是65岁人群的首要住院原因，所述人群也是快速增长的人口区段。虽然发生心力衰竭后的存活率也得到改善，但当前的疗法可减缓而非终止疾病的发展。受到功能容量、呼吸困难和疲劳的进行性症状、频繁入院和丧失生产能力的经济后果、以及增加的医疗护理成本的限制，心力衰竭对医疗保健强加了显著的负担。

对开发用于最小化梗死面积并在AMI后预防心力衰竭的其它治疗存在迫切的需要²。当前对STEMI的治疗包括通过恢复冠状动脉开放(即，血管成形术或纤维蛋白溶解)对缺血心肌的快速再灌注、预防再栓塞(即，抗血小板剂和抗凝剂)、和神经激素阻断(即，肾素-血管紧张素-醛固酮和肾上腺素能阻断剂)。虽然这些干预各自提供增加的益处并且显著降低了发病率及死亡率，但在STEMI后心力衰竭的发生率持续提高，表明当前的治疗范式仍遗漏了一个或多个关键的病理生理机制。

因此，确定尽管最佳治疗但不利的心脏重构和心力衰竭仍然发展的机制是研究新干预方法的关键步骤，最终目标是减少STEMI后心力衰竭的发生率、负担和死亡率。

在AMI之后的炎症、不利心脏重构和心力衰竭之间存在紧密的相互作用。急性心肌局部缺血和梗死引发在心肌内的强炎性反应³。白细胞侵润损伤的心肌以协调组织修复和梗死愈合，导致新形成的血管和修复性纤维化。因此，炎症是梗死愈合必需的，但是不受控的炎症导致心脏的进一步损伤和非功能性愈合，它们是不利心脏重构和心力衰竭的基础。在实验动物模型中，炎性反应的程度决定不利心脏重构，与梗死面积无关³。在患有AMI的患者内，炎性反应的强度反映循环生物标记的水平，预示不利心脏重构、心力衰竭和死亡⁴。C-反应性蛋白(一种急性期反应物)在AMI中增加并预示结果。

因此，炎性反应的调节是本发明的一个目的。虽然以前调节炎性反应的尝试已经失败了，但我们提出一个新的且显著不同的方法用于调节炎性反应，该方法使用SP163M肽，α-1抗-胰蛋白酶(AAT)一种17-mer修饰的衍生物⁵。AAT是一种血浆中富含的天然存在的抗炎蛋白，在内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞中提供强细胞保护效应⁵。

在急性心肌梗死(AMI)的实验模型中，在局部缺血开始时或在再灌注时给予AAT导致显著更小的梗死面积和更有利的心脏愈合和重构(图3A-3D)⁶。

尽管在AMI期间AAT改善心脏功能的机制可能不止一个，但提出了白介素-1(IL-1)生成的抑制^6-7。这是相关的，因为在实验研究和VCU完成的2个小型试验性临床实验中，IL-1抑制已经显示在AMI期间安全有效地限制心肌损伤^8-10。

为了检查SP163M在AMI中的效应，所述肽在之前用于AAT的相同小鼠模型中进行测试。简而言之，成年雄性ICR小鼠进行冠状动脉结扎，诱导心肌局部缺血30分钟，随后进行再灌注。在再灌注时提供100μg剂量的SP16或其等同体积的NaCl 0.9％溶液。SP16显著减少心肌梗死面积＞50％(图4A)，其作为整个左心室上的左心室梗死百分比测量(在氯化三苯基四唑染色时显示为白色)，而存活心肌显示为鲜红色。心脏特异性肌钙蛋白I是一种心肌坏死的生物标记，它的血浆水平通过SP163M处理也显著降低(图4B)。SP16的心脏保护效应转变为左心室收缩功能的保持，其利用经胸超声心动图，作为左心室缩短分数测量(图4C)。

在小鼠中SP163M对实验性急性心肌梗死的保护效应

十周龄的雄性ICR(CD1)小鼠进行30分钟的外科冠状动脉结扎，随后再灌注24小时，用于模拟用再灌注疗法治疗的急性心肌梗死(AMI)的场景。一个亚组的小鼠进行假手术，其中识别并分离冠状动脉，但是不结扎。

SP163M活性肽或对照溶液媒介在再灌注时以100μg/小鼠的剂量腹膜内给予。

梗死面积通过氯化三苯基四唑(TTC)/伊文思蓝染色进行病理血测量，并且在24小时通过测量血浆肌钙蛋白I水平进行测量。在重新结扎冠状动脉结后，将伊文思蓝逆行注入通过主动脉以识别无风险的心肌(蓝色)。TTC用于染色存活心肌(红色)。

超声心动图用于评估左心室(LV)缩短分数，作为体内收缩功能的量度。

每组包括至少6只小鼠。

在小鼠的实验性AMI中再灌注30分钟内给予SP163M的保护效应

检查再灌注后延迟用SP163M处理另外30分钟的选项。序列与SP163M具有16/17个相同氨基酸，但是次序杂乱的对照肽SP34也进行测试。

十周龄的雄性ICR(CD1)小鼠进行30分钟的外科冠状动脉结扎，随后再灌注24小时，用于模拟用再灌注疗法治疗的AMI的场景。

SP163M活性肽或SP34对照肽在再灌注时或延迟30’后以100μg/小鼠的剂量腹膜内给予，用于模拟在再灌注和药物治疗之间可能发生延迟的临床场景。

梗死面积用TTC/伊文思蓝染色进行测量。超声心动图用于评估左心室(LV)缩短分数，作为体内收缩功能的量度。每组包括至少6只小鼠。

以再灌注30’给予的SP163M显著减少了梗死面积(图5A)并保留LV缩短分数(图5B)。

在小鼠的实验性AMI中SP163M提供剂量依赖性的梗死面积减少

比较10μg剂量至100μg剂量的SP163M的心脏保护能力。结果如图6所示，该图显示SP163M剂量甚至减少90％后显示有效，这通过梗死面积和LV收缩功能进行测量(分别如图6A和6B所示)。

十周龄的ICR小鼠进行外科冠状动脉结扎30分钟，随后再灌注24小时。SP16以2个不同剂量(10或100ug)延迟30’给予。对照肽SP34(100μg)或媒介溶液用作对照。

梗死面积用TTC/伊文思蓝染色进行测量。经胸超声心动图用于评估左心室(LV)缩短分数。每组包括至少6只小鼠。

再灌注30’给予的SP163M以剂量依赖的模式减少梗死面积(图6A)并保留LV缩短分数(图6B)。

SP163M对健康小鼠的心脏收缩力无影响

为了测试SP163M对心脏收缩力的作用，进行以下研究。SP163M肽显示对心脏收缩力无影响，这增加了这种肽药物的安全性(图7)。SP34是具有SP16的乱序序列的肽，并用作对照肽。

两周龄的ICR小鼠用SP163M(100μg/小鼠，腹膜内)、对照肽SP34(100μg/小鼠)或媒介溶液处理。超声心动图用于评估基线时和180分钟后的左心室(LV)缩短分数。

心脏收缩力保留用异丙肾上腺素攻击(10ng/kg，腹膜内)测试，测量处理5’内的LV缩短分数的增加。每组包括至少6只小鼠。

SP163M不改变静止时(图7，左图)或在异丙肾上腺素攻击(收缩保留)后(图7，右图)的心脏收缩功能。

讨论

除它的抗炎效应之外，SP163M还是心脏保护性的。它通过在再灌注时拯救心脏细胞免于死亡而减少梗死面积。在AMI中测试IL1拮抗剂，显示明显的抗炎效应，但是不减少梗死面积(不具有心脏保护作用)。在减少梗死的AMI中表现的SP163M的细胞保护效应也可应用于导致细胞死亡的其它损伤，例如其它局部缺血情况、中风、外伤性脑损伤和中毒性休克。本文设想SP163M可允许治疗急性心肌梗死、痛风、中风、与心脏手术相关联的并发症、外伤性脑损伤、与“细胞因子风暴”相关联的任何其它疾病。

参考文献

1.Velagaleti RS，Pencina MJ，Murabito JM等人，Long-term trends in theincidence of heart failure after myocardialinfarction.Circulation 2008；118：2057-2062

2.Eapen ZJ，Tang WH，Felker GM等人，Definingheart failure end points inST-elevation myocardial infarction trials：integrating past experiences tochart a path forward.Circ Cardiovasc QualOutcomes 2012；5：594-600

3.Mezzaroma E，Toldo S，Farkas D等人The inflammasome promotes adversecardiac remodeling following acute myocardial infarction in the mouse.ProcNatl Acadi Scie USA2011；108：19725-19730

4.Roubille F，Samri A，Cornillet L等人Routinely-feasible multiplebiomarkers score to predict prognosis after revascularized STEMI.Eur J InternMed 2010；21：131-136

5.Lewis EC.Expanding the clinical indications for α(1)-antitrypsintherapy.Mol Med2012；18：957-70.

6.Toldo S，Seropian IM，Mezzaroma E等人Alpha-1 antitrypsin inhibitscaspase-1 and protects from acute myocardial ischemia-reperfusion injury.JMol Cell Cardiol 2011；51：244-51.

7.Pott GB，Chan ED，Dinarello CA，Shapiro L.Alpha-1-antitrypsin is anendogenous inhibitor of proinflammatory cytokine production in whole blood.JLeukoc Biol.2009；85：886-95.

8.Abbate A，Salloum FN，Vecile E等人Anakinra，a recombinant humaninterleukin-1 receptor antagonist，inhibits apoptosis in experimental acutemyocardial infarction.Circulation2008；117：2670-2683

9.Abbate A，Kontos MC，Grizzard JD等人Interleukin-1 blockade withanakinra to prevent adverse cardiac remodeling after acute myocardialinfarction (Virginia Commonwealth University Anakinra Remodeling Trial[VCU-ART]Pilot Study).Am J Cardiol 2010；15：1371-1377

10.Abbate A，Van Tassell BW，Biondi-Zoccai GG，Kontos MC，Grizzard JD，Spillman DW，Oddi C，Roberts CS，Melchior RD，Mueller GH，Abouzaki NA，Rengel LR，Varma A，Gambill ML，Falcao RA，Voelkel NF，Dinarello CA，Vetrovec GW.Effects ofInterleukin-1 Blockade with Anakinra on Adverse Cardiac Remodeling and HeartFailure Following Acute Myocardial Infarction(from the VCU-ART2 Pilot Study).Am J Cardiol 2013-in press.

实施例2

Met被Nle置换以提高肽稳定性，例如在SEQ ID NO：57-Ac-Val-Lys-Phe-Asn-Lys-Pro-Phe-Val-Phe-Leu-Nle-Ile-Glu-Gln-Asn-Thr-Lys-NH2(SEQ ID NO：57)的肽中。可氧化甲硫氨酸。

实施例3-LRP1介导SP16-诱导的心脏保护

SP163M在本文证实结合LRP1(低密度脂蛋白受体-相关的蛋白)并且是LRP1的激动剂(如对于母体AAT显示的)。还显示阻断LRP1消除SP163M和AAT的心脏保护效应。

介绍

LRP1是负责SEC(在炎性反应期间积聚的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白酶络合物)的血浆清除的受体。因此，LRP1的作用是阻止并中断炎症。LRP1可经由直接调节关键炎性途径而起作用；所述途径例如NFkB、IRF-3和AP-1(例如ERK p42/p44、p38和JNK)。

在鼠的腹腔巨噬细胞中，LRP1通过与IRF-3的细胞内相互作用下调LPS驱动的炎性反应。另外，LRP1调节炎性细胞因子，影响吞噬作用和细胞迁移，以及Treg分布。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，包括例如SEQ ID NO：1和57的肽，能够经由高度保守的五肽结合LRP1的簇II或IV。参见图12A。因此，SP163M能够通过细胞信号转导、细胞因子调节、减少CD4 T细胞和Th17细胞，诱导导致炎性反应下调的级联反应。

LRP1的调节涉及多种炎性和自体免疫疾病。疾病诸如神经退化性疾病、动脉粥样硬化、和II型糖尿病。急性心肌局部缺血和再灌注导致心肌坏死和炎症，如果不进行治疗，这可能导致组织受伤和心力衰竭。缺血性损伤是AMI的标志。再灌注，虽然有利于减少总梗死面积，但是与更多的损伤相关联。局部缺血-再灌注损伤的炎性反应，虽然促进梗死愈合，但诱导存活心肌的进一步损失，导致功能不良疤痕形成。大的梗死面积、强炎性反应、以及功能不良疤痕的形成，均代表AMI后心力衰竭的基础。另一方面，快速消退炎性反应与更有利的愈合以及减少心力衰竭的发生率相关联。

虽然不希望受理论的约束，提出对AMI后组织损伤的炎性反应导致在受伤部位募集血浆丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，抑制白细胞丝氨酸蛋白酶，并且通过LRP1向炎性反应消退进行信号转导。因此提出在AMI早期给予外源的血浆来源的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白将导致通过LRP1的炎症损伤抑制，引起心脏保护效应以及更快速的炎症消退。此外，提出给予来源于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的C3末端的合成小肽将提供LRP1介导的强心脏保护信号，同时不抑制血浆丝氨酸蛋白酶。参见图11。

SP163M提高在鼠巨噬细胞上的LRP1表达

SP163M在本文证实以剂量依赖的方式增加Raw264.7鼠巨噬细胞上的LRP1表达(图10)。将0.2x10^6个巨噬细胞接种到24孔板中并生长至70％汇合。细胞用媒介(红色)、50ug/ml的SP16(紫色)、100ug/ml的SP16(绿色)或200ug/ml的SP16(蓝色)、乱序对照(橙色)或COG133(ApoE肽)(粉色)处理3小时，然后用冷的PBS 5mM EDTA收获。样品用抗-LRP1(abcamab92544)标记并用Alexa Fluor^TM 488兔二抗(invitrogen)染色，并且随后通过流式细胞术(Guava easyCyte^TM流式细胞仪)进行分析。示出归一化至对照的平均荧光强度(MFI)。(每个样品收集＞10,000个事件)。

SP163M结合LRP1

进行体外测定以检查SP163M与LRP1的结合。为了进行测定，重组LRP1蛋白(1μg/ml)(R&D Systems，Minneapolis，MN)在存在生物素-SP163M(1-5μg/ml)的情况下，在4℃下冰上孵育1小时。这种混合物随后在4℃下用lmg/ml M280 Streptavidin Dynabeads(Invitrogen，Carlsbad，CA)孵育1.5小时。Dynabeads用PBS+0.1％Tween20洗涤并在SDS加载缓冲液中煮沸5分钟。上清液在NuPAGE4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上分离并转移到硝化纤维素膜上。该膜用抗LRP1(LRP-1Cluster II Affinity Purified PolyclonalAb，R&D，Minneapolis，MN)进行探测，并且在4℃下孵育过夜。该膜随后用TBS-T洗涤3次并与在5％乳TBS-T中以1∶10,000稀释的HRP-偶联抗山羊二抗一起孵育。蛋白印迹利用SuperSignalWestFemto MaximumSensitivitySubstrate试剂盒(ThermoScientific)和BioRad MolecularImager ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad，Hercules，CA)，通过化学发光可视化。

图12B示出LRP1结合1μg和μ5g的浓度的SP163M。同时LRP1不结合对照SP34肽。

SP163M是LRP1激动剂

THP1-XBlue^TM-MD2-CD14细胞(InvivoGen，San Diego，CA)用于体外测定以检查SP163M是否是LRP1的激动剂。将THP1-XBlue^TM-MD2-CD14细胞保持在RPMI 1640培养基(Thermo Scientific)中，其中补充有10％热灭活的FBS，1％Pen-Strep，100ug/mlNormocinTM，200ug/ml ZeocinTM，和250μg/ml的G418。根据销售商的指导将细胞系在37℃下保持在5％CO2中。

THP1-XBlue^TM-MD2-CD14细胞以1 x 10⁵个细胞/孔接种在96-孔细胞培养板中。所述细胞用肽或乱序对照肽(100μg/ml)处理30分钟，随后加入LPS(5ng/ml)或GP96(100pM)。在37℃下孵育18-24小时后，将20μl的上清液转移到180μl的QUANTI-Blue^TM SEAP检测介质中。NF-κB可诱导的SEAP水平通过测量吸光度来检测。在阻断LRP1的实验中，使用抗-LRP1抗体(125μg/ml)(克隆5A6，Molecular Innovations，Novi，MI)或受体关联蛋白(RAP)(1μM)(Molecular Innovations)30分钟，随后加入所述肽。

如图13所示，SP163M抑制由LPS(图13A)和GP96(图13B)诱导的NF-kB信号转导。用LRP抗体或RAP(导致LRP1下调的辅因子)处理在经LPS和GP96处理的细胞中限制SP163M-相关的抑制。

LRP1介导SP163M-诱导的心脏保护

为了检查LRP1是否介导SP163M的心脏保护效应，各组小鼠用LRP1封闭抗体在实验性AMI之前进行处理。测量所得梗死面积和LV收缩功能。

Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)供应的成年杂种雄性CD1小鼠(10周龄)用于这一研究。由对小鼠冠状动脉结扎手术熟练的单个操作员(S.T.)进行所有手术。通过将左前降冠状动脉进行瞬时冠状动脉结扎30分钟以诱导前壁和心尖的局部缺血(显示灰白色)，随后进行再灌注，并且导致左心室大约15％的梗死，诱导实验性AMI[1]。

在手术时，小鼠用戊巴比妥钠(70-100mg/kg)深度麻醉，插管并置于右侧卧位。实施左胸廓切开术，接着进行心包切除术并结扎近侧左冠状动脉，随后进行再灌注。在闭合胸腔通路后，小鼠恢复至多1周，不限制进食和饮水。研究人员(A.G.M)将仅在手术期间目测显示缺血且涉及整个心尖的小鼠随机分配成不同的处理后的组，该研究人员不参与判断目标终点。实验在用于生物医学研究的实验动物指南下进行，该指南由国立卫生研究院(NationalInstitutesof Health)出版(在2011年修订)。该研究方案由VirginiaCommonwealth University的Institutional Animal Care and Use Committee批准。

接受LRP1封闭抗体预处理的小鼠在手术前16小时给予抗体以使抗体有足够的时间结合靶受体。将小鼠随机分配到不同的手术后处理组，其中手术后处理作为再灌注之后立即的单次腹膜内给予提供。手术后处理组为：SP163M 100μg，与SP163M等同体积的媒介，LRP1封闭抗体(AB)克隆5A6 3mg/kg(Molecular Innovations)，LRP1-AB和SP163M 100μg，血浆来源的α-1抗胰蛋白酶(AAT)60mg/kg(Aralast NP，Baxter，Deerfield，IL，USA)，LRP1-AB和AAT。每组包括5至8只小鼠。

如前文所述测量梗死面积(在图14A中报告)[1]。一个亚组的小鼠在手术后24小时处死，并且迅速摘除心脏并置于Langendorff装置上，其中冠状动脉用含有肝素(40U/ml)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)1X pH7.4顺行灌注。在洗出血液后，灌注在PBS 1X中的10％氯化三苯基四唑(Sigma Aldrich)，随后用带结扎并灌注1％的酞菁蓝染料(Quantum Ink，Louisville，KI，USA)，将在PBS1X中的5mM腺苷推注至主动脉，直至心脏大多数部分变蓝。随后，从Langendorff装置上移除心脏，冷冻，并从心尖至基部切成6个均匀厚度(约1mm)的横切片。梗死组织(看上去是白色)和存活组织(鲜红色)通过计算机形态测量，使用Image ProPlus 6.0软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)进行测量。梗死面积报告为左心室的％。

还测定LV收缩功能(在图14B中报告)。小鼠在利用戊巴比妥钠(30-50mg/kg)的轻度麻醉下且在24小时进行基线(在手术前)经胸超声心动图。超声心动图用Vevo770成像系统(VisualSonics Inc，Toronto，Ontario，Canada)和30-MHz探针进行[1，2]。心脏以B-模式自胸骨旁短轴和心尖视角可视化。测量了在B-模式下的左心室(LV)舒张末期和收缩末期的面积以及在M-模式下的LV舒张末期直径(LVEDD)、LV收缩末期直径(LVESD)。计算LV缩短分数(FS)和LV射血分数(EF)。一个亚组的小鼠在7天时进行重复的超声心动图以测量梗死面积(无动力的段的数目[2])和左心室收缩功能。

所有结果表示为平均值和标准误差。使用方差分析(ANOVA)进行3组或更多组之间的比较，随后对不配对数据进行T检验以比较每个处理组与相应的对照。在LPS攻击后的SP16和媒介的KaplanMeyer存活曲线使用对数秩检验(Log-rank test)进行比较。使用社会科学统计软件包(Statistical Package for Social Sciences，SPSS，22.0版，IBM inc.，New York，NY)进行所有分析。认为＜0.05的P值是显著的。

结果。用封闭LRP1抗体处理小鼠消除了SP163M和血浆来源的AAT二者的保护效应。

参考文献

1.Toldo S，Seropian IM，Mezzaroma E，Van Tassell BW，Salloum FN，Lewis EC，Voelkel N，Dinarello CA，Abbate A：Alpha-1antitrypsin inhibits caspase-1andprotects from acute myocardial ischemia-reperfusion inj ury.Journal ofmolecular and cellular cardiology 2011，51(2)：244-251.

2.Seropian IM，Abbate A，Toldo S，Harrington J，Smithson L，Ockaili R，Mezzaroma E，Damilano F，Hirsch E，Van Tassell BW：Pharmacologic Inhibition ofPhosphoinositide 3-Kinase Gamma(PI3Kγ)Promotes InfarctResorption andPreventsAdverse Cardiac Remodeling After Myocardial Infarction in Mice.Journal ofcardiovascular pharmacology 2010，56(6)：651-658.

序列表

<110> 赛品制药有限责任公司

<120> 用于疾病治疗的方法

<130> 065292-074121

<140>

<141>

<150> 61/699,571

<151> 2012-09-11

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成共有序列"

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> /取代="Leu"

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(1)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> /取代="Leu"或"Met"

<220>

<221> 其他特征

<222> (8)..(8)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(10)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> /取代="Ile"或"Val"

<220>

<221> 其他特征

<222> (11)..(11)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(16)

<223> 任何氨基酸

<400> 2

Val Xaa Phe Asn Lys Pro Phe Val Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Gln

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成共有序列"

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> /取代="Leu"

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(1)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> /取代="Arg"

<220>

<221> 其他特征

<222> (5)..(5)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> /取代="Leu"或"Met"

<220>

<221> 其他特征

<222> (8)..(8)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(10)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> /取代="Ile"或"Val"

<220>

<221> 其他特征

<222> (11)..(11)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(16)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(17)

<223> /取代="Gln"

<220>

<221> 其他特征

<222> (17)..(17)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<400> 3

Val Xaa Phe Asn Lys Pro Phe Val Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Lys

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Arg

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Arg Phe Asn Lys Pro Phe Leu Arg

1 5

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(10)

<223> 任何碱性氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(10)

<223> /注释="该区域可包含1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9,

10或1-3, 1-5, 1-6,

1-7, 1-8, 1-9, 或1-10个

碱性氨基酸"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(28)

<223> 任何碱性氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (19)..(28)

<223> /注释="该区域可包含1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9,

10或1-3, 1-5, 1-6,

1-7, 1-8, 1-9, 或1-10个

碱性氨基酸"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见对于取代的详细描述和优选实施方案的提交的说明书"

<400> 6

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Asn Arg Pro Phe

1 5 10 15

Leu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25

<210> 7

<211> 28

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(10)

<223> 任何碱性氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(10)

<223> /注释="该区域可包含1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9,

10或1-3, 1-5, 1-6,

1-7, 1-8, 1-9, 或1-10个

碱性氨基酸"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(28)

<223> 任何碱性氨基酸

<220>

<221> 其他特征

<222> (19)..(28)

<223> /注释="该区域可包含1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9,

10或1-3, 1-5, 1-6,

1-7, 1-8, 1-9, 或1-10个

碱性氨基酸"

<220>

<221> 来源

<223> /注释="参见对于取代的详细描述和优选实施方案的提交的说明书"

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Asn Lys Pro Phe

1 5 10 15

Leu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Arg Arg Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Arg Arg Arg Phe Asn Lys Pro Phe Leu Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Phe Asn Arg Pro Phe Leu

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Phe Asn Lys Pro Phe Leu

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Ala Ala Ala Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Val Lys Phe Ala Ala Ala Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Val Lys Phe Asn Lys Pro Ala Ala Ala Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Ala Ala Ala Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Ala Ala Ala Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Ala Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 18

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met

1 5 10 15

Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn

20 25 30

Pro Thr Gln Lys

35

<210> 19

<211> 39

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Ser Ala Gln Thr Asn Arg His Ile Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu

1 5 10 15

Val Val Ile Phe Ser Thr Ser Thr Gln Ser Val Leu Phe Leu Gly Lys

20 25 30

Val Val Asp Pro Thr Lys Pro

35

<210> 20

<211> 40

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe

1 5 10 15

Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln Asn Ile Phe Phe Met Ser

20 25 30

Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala

35 40

<210> 21

<211> 38

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 21

Ser Gly Arg Pro Pro Met Ile Val Trp Phe Asn Arg Pro Phe Leu Ile

1 5 10 15

Ala Val Ser His Thr His Gly Gln Thr Ile Leu Phe Met Ala Lys Val

20 25 30

Ile Asn Pro Val Gly Ala

35

<210> 22

<211> 38

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 22

Lys Ser Leu Pro Gln Thr Ile Pro Leu Leu Asn Phe Asn Arg Pro Phe

1 5 10 15

Met Leu Val Ile Thr Asp Asp Asn Gly Gln Ser Val Phe Phe Met Gly

20 25 30

Lys Val Thr Asn Pro Met

35

<210> 23

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 23

Ser Ala Gln Val Glu Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val

1 5 10 15

Ile Ile Val Ser Thr Asn Thr Gln

20

<210> 24

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 24

Ser Ile Pro Pro Gln Met Ile Val Trp Phe Asn Arg Pro Phe Leu Ile

1 5 10 15

Ala Ile Ser His Thr His Thr Gln

20

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met

1 5 10 15

Ile Glu Gln Asn Thr Lys

20

<210> 26

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Ser Ala Gln Thr Asn Arg His Ile Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu

1 5 10 15

Val Val Ile Phe Ser Thr Ser Thr Gln

20 25

<210> 27

<211> 26

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe

1 5 10 15

Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln

20 25

<210> 28

<211> 26

<212> PRT

<213> 家鼠

<400> 28

Lys Ser Leu Pro Gln Thr Ile Pro Leu Leu Asn Phe Asn Arg Pro Phe

1 5 10 15

Met Leu Val Ile Thr Asp Asp Asn Gly Gln

20 25

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile

1 5 10 15

Glu Gln Asn Thr Lys

20

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Asn Arg His Ile Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Phe

1 5 10 15

Ser Thr Ser Thr Gln

20

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Thr Arg Thr Ile Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val

1 5 10 15

Pro Thr Asp Thr Gln

20

<210> 32

<211> 21

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 32

Thr Ile Pro Leu Leu Asn Phe Asn Arg Pro Phe Met Leu Val Ile Thr

1 5 10 15

Asp Asp Asn Gly Gln

20

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met

1 5 10

<210> 34

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Met

1 5 10 15

Ile Glu Gln Asn Thr Lys

20

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成共有序列"

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> /取代="Leu"

<220>

<221> 其他特征

<222> (1)..(1)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> /取代="Leu"或"Met"

<220>

<221> 其他特征

<222> (8)..(8)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(10)

<223> 任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> /取代="Ile"或"Val"

<220>

<221> 其他特征

<222> (11)..(11)

<223> /注释="相对于所述位置的注解中的残基，序列中给出的残基没有偏好"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(16)

<223> 任何氨基酸

<400> 35

Val Xaa Phe Asn Arg Pro Phe Val Xaa Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Gln

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys

1 5

<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成6xHis标签"

<400> 37

His His His His His His

1 5

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Arg Arg Arg Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu

1 5 10 15

Gln Asn Thr Lys Arg Arg Arg

20

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

Arg Arg Arg Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Arg Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Phe Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Gln

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val Val Ile

1 5 10

<210> 42

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

Arg Arg Arg Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Phe Ser

1 5 10 15

Thr Ser Thr Gln Arg Arg Arg

20

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

Arg Arg Arg Leu Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Val Val Ile Arg Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr

1 5 10 15

Gln

<210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile

1 5 10

<210> 46

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Arg Arg Arg Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro

1 5 10 15

Thr Asp Thr Gln Arg Arg Arg

20

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Arg Arg Arg Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Arg Arg

1 5 10 15

Arg

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu

1 5

<210> 49

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Arg Arg Arg Val Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 50

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 50

Ile Pro Pro Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Met Ile

1 5 10 15

Glu Gln Asn Thr Lys

20

<210> 51

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注释="人工序列的描述: 合成肽"

<400> 51

Phe Pro Lys Met Val Pro Gln Phe Asn Thr Glu Leu Lys Ile Phe Pro

1 5 10 15

Glu Val Asn Ile Lys

20

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 52

Ala Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 53

Val Ala Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 54

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 54

Val Lys Ala Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Ala

1 5 10 15

Lys

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 56

Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr

1 5 10 15

Ala

Claims (9)

1.一种肽，其由氨基酸序列VKFNKPFVFL[Nle]IEQNTK(SEQ ID NO：57)构成。

2.根据权利要求1所述的肽，其中，一种或多种氨基酸具有D-构型。

3.根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽通过聚乙二醇化被修饰。

4.根据权利要求1所述的肽，其中，所述氨基酸序列SEQ ID NO：57的N-末端被乙酰化且所述氨基酸序列SEQ ID NO：57的C-末端被酰胺化。

5.一种药物组合物，包含权利要求1-4中任一项的肽，以及药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药物组合物被配制成适于口服，肠胃外，覆膜内，经直肠，皮下，经鼻，经阴道，吸入，皮肤，或经眼部给予的剂型。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是口服制剂。

8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是肠胃外制剂。

9.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是皮下制剂。

Images