CN111909255A

CN111909255A - 胰岛素衍生物及其制备方法

Info

Publication number: CN111909255A
Application number: CN201910390460.2A
Authority: CN
Inventors: 查若鹏; 张振山; 吴松; 刘慧玲; 陈卫
Original assignee: Ningbo Kunpeng Biotech Co Ltd
Current assignee: Ningbo Kunpeng Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2020-11-10

Abstract

本发明提供了胰岛素衍生物及其制备方法。具体地，本发明提供了一种胰岛素衍生物，所述胰岛素衍生物包括：(a)胰岛素的A链；(b)胰岛素的B链；和(c)修饰基团L，所述修饰基团L连接于所述胰岛素的B链的赖氨酸位点,所述修饰基团L含有至少一个基团X或基团Y。实验结果表明，所述胰岛素衍生物在保持生物活性的同时半衰期显著延长。本发明还公开了所述胰岛素衍生物的制备方法，及其在治疗或预防糖尿病中的作用。

Description

胰岛素衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及胰岛素衍生物及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外的发病率均呈上升趋势。据不完全统计，全国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率高达3.2％。虽然许多疾病都能导致人死亡，但糖尿病是引起人死亡的第三位的主要原因。

胰岛素是胰岛细胞所分泌的一种激素，胰岛素通过与体内细胞膜上受体的相互作用，调节血糖维持在正常水平，是治疗糖尿病的特效药。然而，胰岛素不能直接口服给药，需皮下给药或肌注，在体内不稳定、易被蛋白酶降解、具有较高免疫原性从而容易被机体免疫系统识别，造成其半衰期普遍较短而必须加大给药频率和剂量，频繁地注射胰岛素，给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，临床上需要注射间隔时间更长的超长效胰岛素。

因此，本领域技术人员致力于开发新的、更长效的胰岛素衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、更长效的胰岛素衍生物。

本发明的第一方面，提供了一种胰岛素衍生物，所述胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(c)修饰基团L，所述修饰基团L连接于所述胰岛素的B链的赖氨酸位点，且所述修饰基团L选自下组：

(i)含有至少一个基团X，其中所述基团X为式I所示的基团，或

(ii)含有至少一个基团Y，其中所述基团Y为式II所示的基团，

其中，波浪线表示与所述赖氨酸位点的连接位置，m为0-8的整数；a、b、c、d、e、f各自独立的选自0至10的整数；n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述基团Y为选自下组的基团：

在另一优选例中，所述胰岛素包括人胰岛素或动物胰岛素，较佳地，所述胰岛素为人胰岛素。

在另一优选例中，所述动物胰岛素包括猪胰岛素、牛胰岛素。

在另一优选例中，所述胰岛素的A链和B链之间还包括一个或多个二硫键。

在另一优选例中，所述胰岛素包括天然胰岛素、胰岛素前体、或胰岛素的变体。

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物包括胰岛素前体和所述修饰基团L。

在另一优选例中，所述胰岛素的A链具有如SEQ ID NO.:1或2所示的序列。

在另一优选例中，所述胰岛素的B链具有如SEQ ID NO.:3、4、5或6所示的序列。

在另一优选例中，所述胰岛素的A链具有如SEQ ID NO.:1所示的序列，所述胰岛素的B链具有如SEQ ID NO.:3、5或6所示的序列。

在另一优选例中，所述胰岛素的A链具有如SEQ ID NO.:2所示的序列，所述胰岛素的B链具有如SEQ ID NO.:4或6所示的序列。

在另一优选例中，所述修饰基团L与所述赖氨酸(K)位点共价连接。

在另一优选例中，所述修饰基团L与所述赖氨酸(K)的ε-氨基共价连接。

在另一优选例中，所述胰岛素包含PK、DKT、PKT或KPT基序，并且所述修饰基团L连接于所述基序中的赖氨酸(K)位点。

在另一优选例中，所述胰岛素包含TPK、TKP或TDK基序，并且所述修饰基团L连接于所述基序中的赖氨酸(K)位点。

在另一优选例中，所述胰岛素包含YTPK、YTDKT、YTPKT或YTKPT基序，并且所述修饰基团L连接于所述基序中的赖氨酸(K)位点。

在另一优选例中，所述修饰基团L连接于所述B链的第28位或第29位赖氨酸(K)。

在另一优选例中，所述修饰基团L与对应于SEQ ID NO.:3、4或6所示序列中第29位赖氨酸(K)共价连接。

在另一优选例中，所述胰岛素的B链具有如SEQ ID NO.:3、4或6所示的序列，且所述修饰基团L连接于SEQ ID NO.:3、4或6所示序列中第29位赖氨酸(K)。

在另一优选例中，所述胰岛素的B链具有如SEQ ID NO.:5所示的序列，且所述修饰基团L连接于SEQ ID NO.:5所示序列中第28位赖氨酸(K)。

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物的结构选自下组，其中

为胰岛素：

其中，m为0-8的整数；a、b、c、d、e、f各自独立的选自0至10的整数；n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物选自下组：L0-GFA16-胰岛素、L2-GFA16-胰岛素、L3-GFA16-胰岛素、L4-GFA16-胰岛素、L5-GFA16-胰岛素、或L6-GFA16-胰岛素。

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L0-GFA16-胰岛素的结构如下，其中

为胰岛素：

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L2-GFA16-胰岛素的结构如下，其中

为胰岛素：

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L3-GFA16-胰岛素的结构如下，其中

为胰岛素：

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L4-GFA16-胰岛素的结构如下，其中

为胰岛素：

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L5-GFA16-胰岛素的结构如下，其中

为胰岛素：

在另一优选例中，所述胰岛素衍生物L6-GFA16-胰岛素的结构如下：

本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的胰岛素衍生物，以及药学上可接受的载体。

本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的胰岛素衍生物的用途，用于制备预防和/或治疗糖尿病、高血糖症及其他降低血糖可获益的疾病的药物或制剂。

本发明的第四方面，提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)在X基团-赖氨酸、吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶及其同源关联tRNA的存在下，培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)，从而产生胰岛素衍生物，其中所述胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(c)修饰基团L，所述修饰基团L连接于所述胰岛素的B链的赖氨酸位点，且所述修饰基团L为基团X，基团X同本发明第一方面中所定义；和任选地

(2)从发酵产物中分离所述的胰岛素衍生物。

在另一优选例中，所述胰岛素包含PK、DKT、PKT或KPT基序，并且所述基序中的赖氨酸(K)的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)。

在另一优选例中，所述胰岛素包含TPK、TKP或TDK基序，并且所述基序中的赖氨酸(K)的编码序列为替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)。

在另一优选例中，所述胰岛素包含YTPK、YTDKT、YTPKT或YTKPT基序，并且所述修饰基团L连接于所述基序中的赖氨酸(K)的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)。

在另一优选例中，所述X基团-赖氨酸为丁炔氧羰基-赖氨酸。

本发明的第五方面，提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)在式III化合物、吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶及其同源关联tRNA的存在下，

培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)，从而得到式IV化合物；和

(2)在惰性溶剂中，将式IV化合物与式V化合物进行反应，从而得到胰岛素衍生物，

式V中，a、b、c、d、e、f各自独立的选自0至10的整数；n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述得到的胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(c)修饰基团L，所述修饰基团L连接于所述胰岛素的B链的赖氨酸位点，且所述修饰基团L为基团Y，基团Y同本发明第一方面中所定义。

在另一优选例中，所述胰岛素包含TPK、TKP或TDK基序，并且所述基序中的赖氨酸(K)的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)。

在另一优选例中，所述式V化合物选自下组：L0-GFA、L2-GFA、L3-GFA、L4-GFA、L5-GFA、或L6-GFA，其中n为14至16的整数。

本发明的第六方面，提供了一种胰岛素衍生物的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)在式VI化合物、吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶及其同源关联tRNA的存在下，

培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)，从而得到式VII化合物；和

(2)在惰性溶剂中，将式VII化合物与式VIII化合物进行反应，从而得到胰岛素衍生物，

式VIII中a、b、c、d、e、f各自独立的选自0至10的整数；n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述得到的胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

本发明的第七方面，提供了一种预防和/或治疗糖尿病的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象使用本发明第一方面所述的胰岛素衍生物。

在另一优选例中，所述对象为人或非人哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种胰岛素衍生物，实验结果表明，所述胰岛素衍生物在保持生物活性的同时，具有显著延长的半衰期。本发明还提供了所述胰岛素衍生物的制药用途，及其在治疗或预防糖尿病中的作用。在此基础上，发明人完成了本发明。

长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数，在糖尿病患者体内重建胰岛素基础分泌。化学修饰是获得长效胰岛素的途径之一，化学修饰剂的结构必须稳定、无毒性、无抗原性并具有合适大小的分子量。经过本发明特定的化学修饰，可使胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长，抗原性降低。本发明经过修饰的胰岛素衍生物是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒性，药物的水溶性增加。并且可以降低肾小球对其的清除速率，增加药物在体内循环的半衰期，从而获得长效。

术语

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

脂肪酸酰基化合物

本发明的丁炔氧羰基-赖氨酸的重组胰岛素蛋白与脂肪酸酰基化合物通过点击反应连接，得到一系列半衰期显著延长的胰岛素衍生物。

本发明脂肪酸酰基化合物为14-18个碳的脂肪酸酰基化合物，结构式如下式V或式VIII化合物：

其中：a、b、c、d、e、f各自独立的选自0至10的整数；n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述脂肪酸酰基化合物选自下组：L0-GFA、L2-GFA、L3-GFA、L4-GFA、L5-GFA、或L6-GFA，其中n为14至16的整数。

在另一优选例中，所述脂肪酸酰基化合物选自下组：L0-GFA16、L2-GFA16、L3-GFA16、L4-GFA16、L5-GFA16、或L6-GFA16。

胰岛素衍生物

如本文所用，术语“胰岛素类似物”、“胰岛素衍生物”、“本发明(胰岛素)衍生物”可互换使用，均指本发明第一方面所述的胰岛素衍生物。

具体地，所述胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(i)至少一个基团X，其中所述基团X为式I所示的基团，或

(ii)至少一个基团Y，其中所述基团Y为式II所示的基团，

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:1)

GIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO.:2)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO.:3)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(SEQ ID NO.:4)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO.:5)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(SEQ ID NO.:6)

在本发明中，胰岛素衍生物包括胰岛素、胰岛素前体和胰岛素的变体。所述胰岛素的变体不同于任何天然存在的胰岛素，但仍然可以在人体内以血糖控制的方式执行与人胰岛素类似的作用。通过基本(underlying)DNA的遗传工程，可以改变胰岛素的氨基酸序列，从而改变其吸收、分布、代谢和分泌特性。改良包括更容易被注射位点吸收的胰岛素类似物，因此比皮下注射的天然胰岛素作用更快，旨在供应进餐时间所需胰岛素的药物水平(餐时胰岛素)；而那些在8小时至24小时之间缓慢释放的胰岛素类似物，旨在在白天特别是在夜间提供基础水平的胰岛素(基础胰岛素)。速效胰岛素类似物包括赖脯胰岛素(礼来公司)和门冬胰岛素(Novo Nordisk公司)，而长效胰岛素类似物包括NPH胰岛素、赖谷胰岛素(Sanofi-Aventis公司)、地特胰岛素(Novo Nordisk公司)和甘精胰岛素(赛诺菲-安万特公司)。

如本文所用，术语“变体”包括任意变体，其中(a)一个或多个氨基酸残基被一个天然或非天然存在的氨基酸残基置换；(b)两个或多个氨基酸残基的顺序颠倒；(c)(a)和(b)都同时存在；(d)任意两个氨基酸残基之间存在间隔基团；(e)一个或多个氨基酸残基为类肽形式；(f)肽的一个或多个氨基酸残基的(N-C-C)主链被修饰，或(a)至(f)的任意组合。优选地，所述变体为(a)、(b)或(c)之一。

更优选地，一个或两个氨基酸残基被一个或多个其它的氨基酸残基置换。还更优选地，一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基置换。优选地，所述置换是同源性的。

可能发生同源置换(本文使用的置换和替代均是指现存的氨基酸残基与可选的残基的互换)，即同性置换，如碱性置换碱性、酸性置换酸性、极性置换极性等。也可能发生非同源置换，即一种残基置换为另一种、或可选地包括非天然氨基酸，如鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸、正亮氨酸鸟氨酸、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯甘氨酸，下面列出了更详细的列表。同时可以有多于一个氨基酸残基被修饰。如本文所用，根据以下类别对氨基酸分类：碱性：H、K、R；酸性：D、E；非极性：A、F、G、I、L、M、P、V、W；极性：C、N、Q、S、T、Y。

除了氨基酸间隔基团(如甘氨酸或β-丙氨酸残基)，可以插入到载体部分的任意两个氨基酸残基之间的合适的间隔基团包括：烷基，如甲基、乙基或丙基。本领域技术人员能够理解另一种变体形式，(e)型，包括以类肽形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免疑问，本文使用“类肽形式”来表示α-C取代基位于所述残基的N原子而非α-C上的变体氨基酸残基。制备类肽形式的肽是本领域已知的，例如SimonRJ等，PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。(f)型修饰可由国际公开PCT/GB99/01855中描述的方法进行。氨基酸变体(优选为(a)或(b)型)优选独立地发生在任意位置。如上所述，可能同时发生多于一个的同源或非同源置换。通过在序列内反转一些氨基酸残基的序列可得到其它变体。在一个实施方案中，替换氨基酸残基选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

在一个优选的实施方案中，本发明的胰岛素衍生物来自人胰岛素。

不同哺乳动物中动物胰岛素的氨基酸序列类似于人胰岛素(人胰岛素INN)。然而，在脊椎动物物种中有相当大的活力。猪胰岛素与人类多样性仅有一个氨基酸不同，并且牛胰岛素仅有三个氨基酸不同。这二者都对人类受体有大致相同强度的活性。当无法生物合成人胰岛素(人胰岛素rDNA)时，牛胰岛素和猪胰岛素是首先用于临床的胰岛素类似物(自然发生，通过从动物胰脏提取得到)。来自鲨鱼和一些鱼类的胰岛素也可能是有效的。

在另一个优选的实施方案中，本发明的胰岛素类似物来自人胰岛素或其变体。更优选地，胰岛素为生物合成的胰岛素(人胰岛素rDNA)。

本发明的胰岛素衍生物可以盐或酯的形式存在，特别是可药用的盐或酯。

本发明的化合物的可药用的盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。合适的可药用的盐可参见Berge等人的综述J Pharm Sci,66,1-19(1977)。可与强无机酸，如矿物酸(例如硫酸、磷酸或氢卤酸)；与强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤素取代)的具有1至4个碳原子的烷羧酸(例如乙酸)；与饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二酸；与羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；与氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；与苯酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(例如被卤素取代)的(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸(例如甲磺酸或对甲苯磺酸)形成盐。

本发明也包括本发明衍生物的溶剂化物的形式。权利要求中所用的术语包括这些形式。本发明还涉及本发明类似物的各种晶体形式、多晶形物和(无水型)含水型。药学产业已经建立了这样的方式，化学化合物可以任意这样的形式通过略微改变在化合物的合成制备中所用的溶剂的纯化方法和/或分离方法被分离。

本发明还包括前体药物形式的本发明的衍生物。这种前体药物通常是本发明衍生物，其中一个或多个合适的基团经修饰从而在人或哺乳动物受试者中施用时该修饰能够逆转。尽管也可与这样的前体药物一起施用第二种试剂从而在体内进行所述逆转，但是这样的逆转通常是由该受试者体内天然存在的酶进行的。这样的修饰的例子包括酯(例如上述的任意那些)，其中所述逆转可由酯酶进行。其它这样的体系是本领域技术人员所熟知的。

在本发明的一个实施方式中，通过以下方式制备本申请的胰岛素衍生物。

利用蛋白定点修饰技术，构建编码吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶基因的重组质粒和编码琥珀密码子抑制tRNA基因、在B29位引入N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素原基因的重组质粒。将所述重组质粒均转染入宿主细胞中，在所述宿主细胞中诱导表达并分离纯化得到在B29位引入N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素原；

对所述在B29位引入N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素原通过透析进行复性，对复性后的人胰岛素原进行酶解处理，得到带有N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素。

由于脂肪酸酰基化合物带有叠氮基团，引入带有端炔的胰岛素蛋白，利用“点击化学”反应原理，炔与叠氮反应生成1，2，3-三唑环，形成交连。

治疗用途

本发明的另一个方面涉及如上所述的胰岛素衍生物在药物中的用途。

本发明的另一个方面涉及如上所述的胰岛素衍生物在治疗或预防糖尿病中的用途、或治疗或预防高血糖症中的用途。

本发明的另一个方面涉及如上所述的胰岛素衍生物在制备用于治疗糖尿病、或治疗或预防高血糖症的药物中的用途。如本文所用，短语“制备药物”包括除了本发明的类似物在筛选进一步治疗剂或制备这样的药物的任意阶段中的用途以外，将本发明的类似物直接用作药物的用途。

本发明的另一个方面涉及在需要的受试者中治疗糖尿病、或治疗或预防高血糖症的方法，所述方法包括施用根据如上所述的治疗有效量的胰岛素衍生物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)相比现有技术，本发明胰岛素衍生物药效更持久、平稳、长期降血糖，其半衰期显著延长。

(2)本发明胰岛素衍生物不会造成低血糖，并且可以减少注射次数，副作用小。

(3)本发明制备方法副产物少，收率高，成本低，工艺简单，适合大规模生产。无需溴化氰裂解、氧化亚硫酸盐解以及相关纯化步骤。无需使用高浓度的硫醇或疏水性吸附树脂。纯化步骤少，生产成本低。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：含有丁炔氧羰基-赖氨酸的重组胰岛素蛋白的合成

利用化学方法合成编码含有SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的丁炔氧羰基-赖氨酸的重组胰岛素蛋白的DNA片段，其中，第80位赖氨酸(K)的编码序列替换为TAG(编码赖氨酸衍生物)。然后将编码SEQ ID NO.:7的完整氨基酸序列的DNA片段克隆到修饰的pBAD-HisA载体中。所得质粒则用于结构为丁炔氧羰基-赖氨酸的重组胰岛素蛋白的表达。将该质粒和酶质粒pEvol-pylRs-pyl一起转化到大肠杆菌菌株Top10中。将转化液在含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落，在含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm恒温摇床培养过夜。然后，将所述过夜培养物接种到含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的100ml TB液体培养基中，并于37℃培养，直到OD₆₀₀为2-4。然后，向所述培养基中加入25％的阿拉伯糖溶液至0.25％的终浓度，并加入0.1M的丁炔氧羰基-赖氨酸溶液至5mM的终浓度，以诱导所述融合蛋白的表达。将所述培养液继续培养16-20h，然后离心(10000rpm，5min，4℃)收集。

SEQ ID NO.:7的氨基酸序列：

MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDDDDDKTLVNRIELKGIDFENLYFQGRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN，其中第80位K为共价连接有丁炔氧羰基的赖氨酸。

融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达。为释放包涵体，在高压均质机破碎大肠杆菌细胞，通过5000g离心法去除细胞碎片和可溶性大肠杆菌宿主蛋白，以含有吐温80、EDTA、NaCl溶液洗涤包涵体，再以纯水洗涤包涵体1-2次。洗涤后包涵体溶于pH 10.5-11.5并含有2-10mMβ-巯基乙醇的7.5M脲中，使溶解后总蛋白的浓度为10-25mg/ml。将样品稀释5-10倍，维持4-80，pH值在10.5-11.7的条件下进行常规折叠14-30小时。于18-25粗下，pH值维持在8.0-9.5，用胰蛋白酶和羧肽酶B进行酶切10-20小时，然后加入0.45M的硫酸铵终止酶切反应。反相HPLC分析结果表明，该酶切步骤的产率高于90％。胰蛋白酶与羧肽酶B酶切后获得的胰岛素类似物被命名为丁炔氧羰基-赖氨酸-人胰岛素。膜过滤澄清样品，以0.45M硫酸铵作为缓冲液A，纯水作为缓冲液B，经疏水层析初纯化，获得丁炔氧羰基-赖氨酸-人胰岛素粗提取液，电泳纯度达90％。后经过聚合物反相填料及C8反相填料纯化，最终获得纯度高于99％的丁炔氧羰基-赖氨酸-人胰岛素。

实施例2：L0-GFA16-胰岛素的合成(n为14)

由于脂肪酸酰基化合物带有叠氮基团，引入带有端炔的胰岛素蛋白，利用“点击化学”反应原理，炔与叠氮反应生成1，2，3-三唑环，形成交连。向1.5ml干净的离心管中加入4μL硫酸铜(50μM)，随后按顺序加入3μL BTTAA(300μM)和10μL实施例1中制备的IV化合物(N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素蛋白)(约5μM)。此时，可以将溶液稀释到恰当的体积或蛋白质浓度。向该溶液中加入1μL的L0-GFA16的(1mM)，和2μL抗坏血酸钠(2.5mM)引发反应。在室温下大约1小时后，添加5μL的SDS-PAGE样品缓冲液，加热至100℃保持10min，通过12％的SDS-PAGE分析。该凝胶回收，通过凝胶成像、荧光分析，然后用考马斯亮蓝染色。

实施例3：L2-GFA16-胰岛素、L3-GFA16-胰岛素、L4-GFA16-胰岛素、L5-GFA16-胰岛素、L6-GFA16-胰岛素的合成(n为14)

向1.5ml干净的离心管中加入4μL硫酸铜(50μM)，随后按顺序加入3μL BTTAA(300μM)和10μL实施例1中制备的N-(丁炔氧羰基)-赖氨酸的人胰岛素蛋白(约5μM)。此时，可能需要加水，将溶液稀释到恰当的体积或蛋白质浓度。向该溶液中加入1μL的L0-GFA16的(1mM)，和2μL抗坏血酸钠(2.5mM)引发反应。在室温下大约1小时后，添加5μL的SDS-PAGE样品缓冲液，加热至100℃保持10min，通过12％的SDS-PAGE分析。该凝胶回收，通过凝胶成像、荧光分析，然后用考马斯亮蓝染色。

类似地，将实施例1中制备的IV化合物与L3-GFA16、L4-GFA16、L5-GFA16、L6-GFA16分别进行点击反应所得产物结构如下。

实施例4：本发明胰岛素衍生物在大鼠体内的药物代谢动力学研究

通过反应生成的胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长。实验分为对照品组与供试品组，分别皮下注射重组人胰岛素、L6-GFA16-胰岛素，给药剂量均为0.45mg/kg，单次给药。各组动物均在给药后在15min、30min、1h、2h、3h、5h、7h、12h、24h时间点采集血液。采用LC-MS/MS分析方法检测不同胰岛素类似物的含量。使用代谢动力学数据分析软件WinNonlin 7.0对血浆浓度数据进行统计，利用非房室模型法(NCA)计算药代参数(表1)。由表1可知，药物在各组动物中达峰时间相近，均为0.5-1小时，L6-GFA16-胰岛素的半衰期为重组人胰岛素的3-4倍，药物在体内暴露时间延长，暴露量增加。

表1各组动物体内的主要药代动力学参数

重复上述实验，不同的是采用本发明所述的L2-GFA16-胰岛素、L3-GFA16-胰岛素、L4-GFA16-胰岛素、L5-GFA16-胰岛素。结果发现，本发明所述的胰岛素衍生物在保持生物活性的同时，半衰期均显著延长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司

<120> 胰岛素衍生物及其制备方法

<130> P2018-1685

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Gly

20

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr

20 25 30

<210> 7

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Lys Thr Leu

20 25 30

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe

35 40 45

Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu

50 55 60

Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

65 70 75 80

Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

85 90 95

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

100

Claims

1.一种胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(i)含有至少一个基团X，其中所述基团X为式I所示的基团，或

(ii)含有至少一个基团Y，其中所述基团Y为式II所示的基团，

2.如权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述基团Y为选自下组的基团：

3.如权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素的A链具有如SEQ IDNO.:1或2所示的序列。

4.如权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素的B链具有如SEQ IDNO.:3、4、5或6所示的序列。

5.如权利要求1所述的胰岛素衍生物，其特征在于，所述胰岛素衍生物选自下组：

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的胰岛素衍生物，以及药学上可接受的载体。

7.如权利要求1所述的胰岛素衍生物的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗糖尿病、高血糖症及其他降低血糖可获益的疾病的药物或制剂。

8.一种胰岛素衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)在X基团-赖氨酸、吡咯赖氨酰基-tRNA合成酶及其同源关联tRNA的存在下，培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列为TAG，从而产生胰岛素衍生物，其中所述胰岛素衍生物包括：

(a)胰岛素的A链；

(b)胰岛素的B链；和

(c)修饰基团L，所述修饰基团L连接于所述胰岛素的B链的赖氨酸位点，且所述修饰基团L为基团X，基团X同权利要求1中所定义；和任选地

(2)从发酵产物中分离所述的胰岛素衍生物。

9.一种胰岛素衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列为TAG，从而得到式IV化合物；和

10.一种胰岛素衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

培养含有胰岛素编码序列的菌株，其中，所述编码序列中，胰岛素的B链中的赖氨酸位点的编码序列为TAG，从而得到式VII化合物；和