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CN111886028A - 用于治疗神经退行性疾病和障碍的嵌合抗原受体 - Google Patents

用于治疗神经退行性疾病和障碍的嵌合抗原受体 Download PDF

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CN111886028A
CN111886028A CN201980016852.0A CN201980016852A CN111886028A CN 111886028 A CN111886028 A CN 111886028A CN 201980016852 A CN201980016852 A CN 201980016852A CN 111886028 A CN111886028 A CN 111886028A
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car
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D·格拉伯
J·W·库克
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Dartmouth College
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Abstract

本公开整体涉及新型嵌合抗原受体(“CAR”)、表达此类CAR的经修饰的调节性T细胞(“Treg”)和/或经工程改造以表达神经退行性疾病修饰分子的Treg，例如，其表达可防止氧化/炎症活性、或者可促进神经元生长/存活的分子，诸如神经生长因子或非典型神经营养因子。本公开还整体涉及含有此类经修饰Treg的组合物以及其作为治疗剂的使用方法，特别是用于治疗和防止神经退行性疾病和与其相关联的症状、和/或用于减缓这种神经退行性疾病的发作，特别是用于因遗传因素而存在风险的人中或用于表现出此类神经退行性疾病发展的早期体征的人中。

Description

用于治疗神经退行性疾病和障碍的嵌合抗原受体
相关的专利申请
本申请要求于2018年2月9日提交的62/628,632的优先权，其内容以引用的方式全文并入本文。
基金资助
本专利申请是在美国国立卫生研究院(“NIH”)资助的基金(基金号为R21NS102556)下由政府支持而提出。政府在本发明中享有一定权利。
序列公开
本申请含有序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，特此以引用的方式全文并入。所述ASCII副本创建于2019年2月6日，命名为43252o2613，大小为203,529字节。
技术领域
本公开整体涉及新型嵌合抗原受体(“chimeric antigen receptor，CAR”)、编码此类CAR的核酸及含有所述核酸的构建体、表达此类CAR的经修饰的调节性T细胞(“regulatory T cell，Treg”)和/或经工程改造以表达神经退行性疾病修饰分子(例如，其可防止氧化/炎症活性，或者其可促进神经元生长/存活，诸如神经生长因子或非典型神经营养因子)的Treg。本公开还整体涉及含有此类经修饰Treg的组合物以及其用作治疗剂的方法，所述治疗剂特别是用于治疗和防止神经退行性疾病和与其相关联的症状，和/或用于减缓此类神经退行性疾病的发作，特别是用于因遗传因素(ginetic factor)而存在风险的人中或在表现出此类神经退行性疾病发展的早期体征的人中。
背景技术
神经退行性疾病通常可以表征为中枢神经系统(CNS)中神经元的缓慢进行性丧失，这通常会致使由受影响的CNS区域执行的特定大脑功能(例如记忆、运动、认知)不足。这些神经退行性疾病包括，例如，阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症、亨廷顿舞蹈病和多系统萎缩症。神经退行性疾病通常会延伸十年以上，并且神经退变的实际发作可能比临床表现早很多年。
阿尔茨海默氏病(AD)是一种进行性神经退行性疾病，是60岁后记忆功能障碍和痴呆症的主要原因之一。额叶皮质和海马中的神经元功能障碍和死亡、随同的小神经胶质细胞介导的神经炎症以及异常蛋白质聚集体和原纤维的形成是AD的标志。年龄增长会增加其患病率，在美国，估计有450万65岁以上的人患有临床AD。到2050年，这个数字预计将增加到超过1300万，全球将超过1.3亿(Hebert等人，Alzheimer disease in the United States(2010-2050)estimated using the 2010 census.Neurology 2013，80：1778-83)。
散发性和家族性形式的AD具有胞外β淀粉样(Aβ)肽的过量产生和/或清除减低以及扭转tau蛋白纤维的神经内缠结。遗传性常染色体显性遗传的早发型AD的基因基础涉及可改变Aβ产生、聚集或清除的基因突变：这些基因包括淀粉样前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)。Aβ肽会自我寡聚成小的聚集体，这些聚集体可以发展成弥漫性斑块。已经产成了可结合单体形式、寡聚体形式和斑块形式的Aβ的多种抗体(Montoliu-GayaL，Villegas S：A β-Immunotherapeutic strategies：a wide range of approaches forAlzheimer’s disease treatment.Expert reviews in molecular medicine 2016，18：e13)。已知在AD中会发生神经炎症，并且当与附近的Aβ斑块相关联时会存在更大的神经退变(Heneka MT等人：Neuroinflammation in Alzheimer’s disease.The LancetNeurology 2015，14：388-405；Kreisl WC等人：Distinct patterns of increasedtranslocator protein in posterior cortical atrophy and amnestic Alzheimer’sdisease.Neurobiol.Aging2017，51：132-40)。数据表明，炎性小神经胶质细胞(中枢神经系统的常驻巨噬细胞)在神经退变和认知减退中起作用(Kreisl WC等人：Distinct patternsof increased translocator protein in posterior cortical atrophy and amnesticAlzheimer’s disease.Neurobiol Aging 2017，51：132-40；Paolicelli RC等人：TDP-43Depletion in Microglia Promotes Amyloid Clearance but Also Induces SynapseLoss.Neuron 2017，95：297，308.e6)。
全世界大约有750万人患有帕金森氏症，并且随着年龄的增加，该病的患病率逐渐增加(Hebert LE等人：Alzheimer disease in the United States(2010-2050)estimatedusing the 2010 census.Neurology 2013，80：1778-83)。到2030年，预计将有900万人患有PD。这种神经退行性疾病的临床体征包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势不稳。这些失能是由中脑黑质致密部中产生多巴胺的神经元的慢性死亡造成的。标准治疗通常涉及使用化学前体药物(左旋多巴)或阻断多巴胺的固有分解的药物(单胺氧化酶B抑制剂)来提高剩余神经元产生的神经递质多巴胺的量。若干种多巴胺激动剂也已被批准用于治疗PD。虽然这三种类型的药品可暂时改善症状缓解，但对PD的长期效果影响不大(Montoliu-GayaL，Villegas S：Aβ-Immunotherapeutic strategies：a wide range of approaches forAlzheimer’s disease treatment.Expert reviews in molecular medicine 2016，18：e13)。虽然PD的一种可行的治疗策略是防止多巴胺神经元的不断死亡，但目前尚无此类治疗方法。
PD中多巴胺神经元丧失的确切病因尚不清楚。异常加工的蛋白质和由小神经胶质细胞(中枢神经系统的常驻巨噬细胞)介导的炎症与神经元的丧失相吻合。含有α-突触核蛋白(α-synuclein)的路易小体是散发性和家族性PD中多巴胺神经元中出现的内含物。除了在细胞内包涵体中出现外，还在细胞外检测到异常的α-突触核蛋白(El-Agnaf OM，SalemSA，Paleologou KE，Curran MD，Gibson MJ，Court JA，Schlossmacher MG，Allsop D：Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasmaas apotential biomarker for Parkinson’s disease.FASEB J 2006，20：419-25；Alvarez-Erviti L，Couch Y，Richardson J，Cooper JM，Wood MJ：Alpha-synuclein release byneurons activates the inflammatory response in a microglial cellline.Neurosci Res 2011，69：337-42；Tokuda T，Qureshi MM，Ardah MT，Varghese S，Shehab SA，Kasai T，Ishigami N，Tamaoka A，Nakagawa M，El-Agnaf OM：Detection ofelevated levels of alpha-synuclein oligomers in CSF from patients withParkinson disease.Neurology 2010，75：1766-72)。单体α-突触核蛋白的生理作用尚不清楚。但是，异常α-突触核蛋白寡聚体的形成被认为在PD的病因中很重要。这进一步得到α-突触核蛋白基因中的突变支持，该突变导致蛋白质自聚集并造成PD的遗传形式。α-突触核蛋白异常导致多巴胺神经元死亡的一种假说是通过毒性神经炎症的造成或增强。寡聚α-突触核蛋白原纤维可活化小神经胶质细胞以产生自由基和促炎细胞因子，并致使神经退变(Reynolds AD，Stone DK，Mosley RL，Gendelman HE：Nitrated{alpha}-synuclein-induced alterations in microglial immunity are regulated by CD4+ T cellsubsets.J Immunol 2009，182：4137-49；Alvarez-Erviti L，Couch Y，Richardson J，Cooper JM，Wood MJ：Alpha-synuclein release by neurons activates theinflammatory response in a microglial cell line.Neurosci Res 2011，69：337-42；Theodore S，Cao S，McLean PJ，Standaert DG：Targeted overexpression of humanalpha-synuclein triggers microglial activation and an adaptive immuneresponse in a mouse model of Parkinson disease.J Neuropathol Exp Neurol 2008，67：1149-58；Zhang W，Wang T，Pei Z，Miller DS，Wu X，Block ML，Wilson B，Zhang W，ZhouY，Hong JS，Zhang J：Aggregated alpha-synuclein activates microglia：a processleading to disease progression in Parkinson′s disease.FASEB J 2005，19：533-42)。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)患者由于大脑和脊髓中进行性运动神经元丧失而发展为致命性瘫痪。在美国，每年大约有6,000例新的ALS病例，典型的发病年龄在40至70岁之间，但二十几岁的人也可以发作。ALS可以是特发性或遗传性的(约10％)，只有约20％的个体在诊断后生存超过五年。缺乏有效的治疗干预尤其成问题，因为发病率正在上升(参见，例如，Caller TA等人：Spatial analysis of amyotrophic lateral sclerosis inNorthern New England，USA，1997-2009.Muscle Nerve 2013，48：235-41)。抑制主要由大脑和脊髓的常驻巨噬细胞(小神经胶质细胞)驱动的持续的神经炎症被视作一种有前景的治疗策略。但是，这些过程很难用常规的抗炎药品来调控。
已证明用经基因工程改造的T细胞进行的细胞疗法可以为多样疾病和疾病病症提供有效治疗。例如，效应T细胞(Teff)逐渐成为癌症的“活体药品”治疗(June CH等人：Adoptive cellular therapy：A race to the finish line.Sci Transl Med 2015，7：280ps7)。在此类治疗方法中，典型从患者中分离出T细胞，对其进行修饰以表达针对肿瘤配体的嵌合抗原受体(CAR)，然后转移回患者中以靶向杀灭肿瘤并活化宿主免疫力。
T调节细胞(Treg)是具有固有的免疫抑制和抗炎特性的T细胞亚群。Treg出现于稳态条件下的中枢神经系统中，并且已经观察到Treg以增加的数量迁移或运输到中枢神经系统炎症区域(Xie L等人：Cerebral regulatory T cells restrain microglia/macrophage-mediated inflammatory responses via IL-10.Eur J Immunol 2015，45：180-91；Gong N等人：Brain ingress of regulatory T cells in a murine model ofHIV-1encephalitis.J Neuroimmunol2011，230：33-41)。
发明内容
本公开整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(例如，过表达)和/或与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述CAR细胞可与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述CAR细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，所述神经退行性疾病或病症与所述异常的或异常表达的蛋白质的表达相关联。在示例性实施方案中，所述神经退变位点可存在于中枢神经系统中，和/或所述神经退变位点存在于周围神经系统中。在示例性实施方案中，表达CAR的所述细胞可包含免疫细胞，任选地其中表达CAR的所述免疫细胞包含T细胞或T细胞祖细胞，优选T调节细胞(Treg)，诸如FOXP3+Treg。在示例性实施方案中，所施用的所述细胞可包含识别至少一种在神经退变位点表达的异常蛋白质的CAR。
在一些实施方案中，所施用的所述细胞上所包含的CAR可包含DG01(SEQ ID NO：1)、DG02(SEQ ID NO：2)、DG03(SEQ ID NO：3)、DG04(SEQ ID NO：4)、DG05(SEQ ID NO：5)、DG06(SEQ ID NO：6)、DG07(SEQ ID NO：7)、DG08(SEQ ID NO：8)、DG09(SEQ ID NO：9)、DG10(SEQ ID NO：10)、DG11(SEQ ID NO：11)和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO：24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO：43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO：44)和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，任选地，其中所述构建体中的一者或多者的每一者均靶向mutSOD1。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ IDNO：22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO：49)；DG03-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQ ID NO：50)和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，任选地，其中所述一者或多者构建体中的每一者均靶向β淀粉样蛋白。
在进一步的示例性实施方案中，CAR可包含识别至少一种在神经退变位点表达的异常蛋白质的scFv或配体。在示例性实施方案中，所述细胞可进一步经工程改造以表达至少一种促神经元因子或神经生长因子，任选地，其中所述CAR和所述NDMM在相同的或不同的细胞上。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO：51)和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达人过氧化氢酶(SEQ ID NO：52)和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达BDNF(SEQ ID NO：53)和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞经工程改造以表达IGF-1(SEQ IDNO：54)和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在示例性实施方案中，所述细胞可经进一步工程改造以表达至少一种抑制或保护神经元免受抗氧化应激和/或抑制或防止神经退变位点处的神经元死亡的抗氧化蛋白质，任选地，其中所述CAR和所述抗氧化蛋白质在相同的或在不同的细胞上，进一步任选地，其中所述抗氧化剂还促进T细胞功能或寿命。
在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应mSOD1抗原而表达增加水平的IL-10。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应mSOD1抗原而表达增加水平的细胞表面标志物，包括GITR、PD-1和/或CTLA-4中的一者或多者。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应mSOD1抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应mSOD1抗原而抑制TNF-α产生。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达包含DG05(SEQ ID NO：5)的构建体和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO：24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQID NO：40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ IDNO：43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO：44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应β淀粉样蛋白抗原而表达增加水平的IL-10和/或IL-4。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。在一些实施方案中，在受治疗的所述受试者中，所施用的所述细胞可响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制IL-6产生。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可以保护受治疗的所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性。在一些实施方案中，所施用的细胞可经工程改造以表达包含DG03(SEQ ID NO：3)的构建体和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可经工程改造以表达以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO：22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ IDNO：46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ IDNO：49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO：50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，所施用的所述细胞可保护受治疗的所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性，任选地，其中所施用的所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ IDNO：52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO：51)、NDMM BDNF构建体(SEQ IDNO：53)和/或NDMM IGF-1构建体(SEQ ID NO：54)和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
在进一步的示例性实施方案中，神经退行性疾病或病症可包含以下中的至少一者：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病、皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征(Gerstmann-
Figure BDA0002663127410000091
-Schneiker syndrome)；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征(Cockayne syndrome)；和冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。在示例性实施方案中，神经退行性疾病可包含帕金森氏病。在示例性实施方案中，神经退行性疾病可包含阿尔茨海默氏病。在示例性实施方案中，神经退行性疾病可包含肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在示例性实施方案中，CAR可结合至以下中的一者或多者：人β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白(optineurin)；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；以及富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
在示例性实施方案中，所施用的所述细胞可表达选自以下的至少一种促神经元因子、神经营养因子或神经生长因子：脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)；白介素6(IL-6)；活化蛋白C(APC)；血栓调节蛋白；组织纤溶酶原激活剂(tPA)；蛋白质去糖化酶DJ-1；组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，任选地，其中所述至少一种促神经元因子、神经营养因子或神经生长因子与所述CAR在同一细胞上或与所述CAR在不同细胞上。在示例性实施方案中，抗氧化蛋白是选自以下的蛋白质：超氧化物歧化酶诸如人超氧化物歧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、HO-1、铁蛋白、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白(H)、金属硫蛋白I、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶(Prx)诸如过氧化物还原酶MSP23；活性依赖性神经保护因子同源盒(ADNP)；藻蓝蛋白；神经珠蛋白、过氧化氢酶和NRF2，任选地，其中所述至少一种抗氧化蛋白与所述CAR在同一细胞上或与CAR在不同细胞上。在示例性实施方案中，所施用的所述细胞可减少或稳定存在于所述神经退变位点的炎症的量。在示例性的实施方案中，所施用的所述细胞可抑制或防止以下至少一者：(i)小神经胶质细胞过度活化，其中过度活化包括这样的小神经胶质细胞：其拥有至少一种活化小神经胶质细胞特征性的活性或活化小神经胶质细胞特征性的活性增加，诸如(1)形态变化、(2)迁移至炎症位点、(3)产生神经毒性或炎性细胞因子诸如IL-1、(4)与神经斑块或β淀粉样蛋白沉积物相互作用、(5)合成神经毒性蛋白、(6)分泌蛋白酶和/或活性氧类(reactiveoxygen species)、(7)诱导邻近的细胞产生淀粉样蛋白、(8)破坏髓鞘；(ii)小神经胶质细胞数量增加；(iii)在神经退变位点处产生炎性蛋白质或炎性活性；(iv)巨噬细胞活性(v)由此类位点内的细胞炎性部分或神经毒性部分的表达，诸如细胞因子、氧化剂、蛋白酶，由所述细胞例如由巨噬细胞和小神经胶质细胞和/或(vi)神经元死亡或神经元功能受损。
此外，本公开总体上涵盖编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域(例如共刺激结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制。在示例性实施方案中，与神经退行性疾病或病症相关联的蛋白质选自人β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；以及富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。额外地，在示例性实施方案中，本公开整体涉及重组细胞或经工程改造细胞，其包含至少一种编码本文所述的CAR的核酸。
此外，本公开整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(例如，过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质。本公开还整体涵盖一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG01(SEQ ID NO：1)、DG02(SEQ ID NO：2)、DG03(SEQ ID NO：3)和/或DG04(SEQ ID NO：4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。本公开额外地整体涵盖一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质包含所靶向的所述蛋白质的神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG01(SEQ ID NO：1)、DG02(SEQ ID NO：2)、DG03(SEQ ID NO：3)和/或DG04(SEQ ID NO：4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
本公开还整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质。本公开额外地整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG05(SEQ ID NO：5)、DG06(SEQ IDNO：6)和/或DG07(SEQ ID NO：7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。本公开还整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG05(SEQ ID NO：5)、DG06(SEQ ID NO：6)和/或DG07(SEQ ID NO：7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
此外，本公开整体涵盖一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质。本公开额外地整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG08(SEQID NO：8)、DG09(SEQ ID NO：9)、DG10(SEQ ID NO：10)和/或DG11(SEQ ID NO：11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。本公开还整体涉及一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG08(SEQ ID NO：8)、DG09(SEQ ID NO：9)、DG10(SEQ ID NO：10)和/或DG11(SEQ ID NO：11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
本公开还整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质。另外，本公开总体上涵盖编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与阿尔茨海默氏病相关联的β淀粉样蛋白的形式。本公开还整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与ALS疾病相关联的蛋白质。本公开额外地总体上涵盖编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是突变的或异常表达的SOD1。而且，本公开整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与帕金森氏病相关联的蛋白质。
此外，本公开总体上涵盖编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与帕金森氏病相关联的α-突触核蛋白的形式。本公开还整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG01(SEQID NO：1)、DG02(SEQ ID NO：2)、DG03(SEQ ID NO：3)和/或DG04(SEQ ID NO：4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。本公开额外地整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG05(SEQ ID NO：5)、DG06(SEQ ID NO：6)和/或DG07(SEQ ID NO：7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。额外地，本公开总体上涵盖编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG08(SEQ ID NO：8)、DG09(SEQ ID NO：9)、DG10(SEQ ID NO：10)和/或DG11(SEQ ID NO：11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
此外，本公开整体涉及治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和NDMM可由相同细胞或不同细胞表达，所述CAR和NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且所述细胞经工程改造以表达以下中的任一者或多者：DG03(SEQ ID NO：3)；DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO：22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO：49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO：50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。此外，本公开整体涉及治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，包括施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和NDMM可由相同细胞或不同细胞表达，所述CAR和NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且所述细胞经工程改造以表达以下中的任一者或多者：DG05(SEQ ID NO：5)；DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO：24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO：43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO：44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。此外，本公开整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，和(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码以下中的任一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO：22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ IDNO：46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ IDNO：49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO：50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。此外，本公开整体涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域(例如共刺激信号转导结构域)，和(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码以下构建体中的任一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQID NO：24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO：43)；和/或DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO：44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
附图的若干视图的简要说明
图1呈现了根据实施例1的抗Aβ CAR以及共表达的用于富集和跟踪经转导的细胞的非功能性截短型CD19(tCD19)的示意性设计，所述抗AβCAR由融合至CD28跨膜结构域和CD3胞内信号转导结构域的胞外scFv组成。
图2A至图2D呈现了根据实施例1的与分离自人PBMC的Treg的体外扩增和表型验证有关的数据。图2A呈现了数据，该数据表明，在CD4和CD25富集分离之前人PBMC中CD4+CD25hi Treg(R2框)占总T细胞的少量百分比。图2B呈现了数据，该数据表明，使用本发明的Treg扩增方案，培养17天后CD4+CD25hi分离的Treg扩增了1760倍。图2C呈现了数据，该数据表明，第17天的Treg表达了胞内FoxP3。图2D呈现了数据，该数据表明，在大多数第17天的Treg(在第10天和第11天转导)上检测到FoxP3、截短型CD19(tCD19)和CAR scFv。
图3A至图3B呈现了根据实施例1的与示例性的经修饰CAR的功能验证有关的数据。图3A呈现了根据实施例1的与Aβ1-42肽的寡聚化有关的数据，图3B呈现了根据实施例1的与经修饰的人T细胞所包含的CAR的结合特异性和功能有关的数据。
图4呈现了根据实施例2的与DG03-28z抗Aβ CAR经修饰Treg介导的T细胞增殖抑制有关的数据。
图5呈现了根据实施例3的于体外用寡聚Aβ刺激Aβ CAR Treg 24小时以及产生IL-10有关的数据。
图6呈现了根据实施例4的抗mutSOD1-CD28-CD3ζ CAR的示意性设计。
图7A至图7D呈现了数据，所述数据表明了效应T细胞增殖的抑制(图7A)；胞内FoxP3的表达(图7B)；以及根据备选的Treg分离方法的tCD19+细胞纯化(图7C至图7D)，该分离方法由以下组成：使用负选择分离CD4+CD127-T细胞，随后是对CD25hi细胞进行正选择以分离CD4+CD127-CD25hiTreg细胞，并用抗CD3、抗CD28、抗CD2多聚体刺激，如实施例4中所述。
图8呈现了根据实施例4的数据，该数据与三种示例性抗mutSOD1 CAR(命名为DG05、DG06和DG07)及其针对SOD1的G93A突变形式的抗原特异性活性有关。阴性对照抗B7H6CAR对突变的SOD1无响应。
图9呈现了根据实施例4的与分离自人PBMC的Treg的表型验证有关的数据。在大多数第17天的Treg(在第10天和第11天用抗mutSOD1 CAR(DG05-28z)转导)上检测到CD3、FoxP3、CD4、截短型CD19(tCD19)和带有蛋白L标签的CAR scFv。
图10呈现了根据实施例4的与分离自人PBMC的Treg的表型验证有关的数据。散点图，大多数第17天的Treg(在第10天和第11天用抗mutSOD1 CAR(DG05-28z)或抗Aβ CAR(DG03-28z)转导)上的CD4和FoxP3。
图11呈现了根据实施例5的数据，该数据展示了示例性的抗mutSOD1 CAR的抗原特异性活性。第17天的Treg(在第10天和第11天用抗mutSOD1 CAR(DG05-28z)或抗Aβ CAR(DG03-28z)转导)响应板结合的mutSOD1或可溶性寡聚Aβ1-42而产生IL-10。
图12呈现了根据实施例5的数据，该数据展示了示例性的抗mutSOD1 CAR的抗原特异性活性。由经转导以表达抗mutSOD1 CAR(命名为DG05、DG06和DG07)或阴性对照抗B7H6CAR的人T效应细胞响应连接至板结合的链霉亲和素(SA)的生物素化野生型或突变型SOD1而产生IFN-γ。
图13呈现了根据实施例5的展示DG05-28z抗mutSOD1 CAR经修饰Treg介导的T细胞增殖抑制的数据。
图14呈现了根据实施例6的抗α-突触核蛋白-CD28-CD3ζ CAR的示意性设计。
图15呈现了根据实施例7的展示示例性的经修饰Treg的功能活性的数据。第17天的Treg(在第10天和第11天用抗α-突触核蛋白CAR(DG10-28z)或抗Aβ CAR(DG03-28z)转导)响应板结合的α-突触核蛋白或响应可溶性寡聚α-突触核蛋白或Aβ1-42而产生IL-10。
图16A至图16B呈现了根据实施例8的数据，该数据展示了离体扩增并经CAR转导的人Treg中具有不同共刺激信号转导结构域并且具有或不具有CD3ζ(3ζ)刺激结构域的抗mSOD1 CAR的表达(图16A)和功能(图16B)。
图17A至图17B呈现了根据实施例9的数据，该数据展示了离体扩增并经CAR转导的人Treg中具有不同共刺激信号转导结构域并且具有或不具有CD3ζ(3ζ)刺激结构域的抗AβCAR的表达(图17A)和功能(图17B)。
图18呈现了根据实施例10的数据，该数据展示了抗mutSOD1 CAR的抗原特异性活性，如通过评价GITR、PD-1和CTLA-4的细胞表面表达以及IL-10的产生的测定法所证明的。对于与细胞表面表达标志物有关的六个曲线图的每一者：对每一者所报道的数值从上到下对应于：培养基；珠(无Ag)；和mSOD1珠。
图19A至图19B呈现了根据实施例11的数据，该数据通过测定法展示了靶向ALS的经修饰Treg的功能活性，所述测定法包括将所述经修饰Treg与源自表达人mSOD1的转基因小鼠的脊髓组织外植体共培养(图19A)，以及将经修饰Treg与源自表达人mSOD1的转基因小鼠的脊髓、肝或肺组织外植体共培养(图19B)。从非转基因小鼠或mSOD1转基因小鼠的不同疾病发展阶段收集脊髓组织：13周(见图19A：瘫痪前)、14周(见图19A：临床发病)、16周(见图19A：瘫痪)或18周(疾病末期阶段周，定义为体重减轻15％和后肢瘫痪；见图19B)。在疾病末期阶段还从mSOD1转基因小鼠对肝和肺收集(参见图19B)。
图20A至图20B呈现了根据实施例12的数据，该数据展示了经修饰Treg靶向阿尔茨海默氏病的功能活性，其中使所述经修饰Treg暴露于寡聚Aβ，然后监测IL-10和IL-4的mRNA水平(图20A)和IL-10和IL-4的蛋白质分泌水平(图20B)。
图21A至图21C呈现了根据实施例13的的数据，该数据展示了抗mutSOD1 CAR的抗原特异性抗炎活性。图21A呈现了根据实施例13的数据，该数据与在其中评价了PMA刺激的超氧化物生成抑制的测定法有关。图21B呈现了根据实施例13的数据，该数据与在其中评价了酵母聚糖刺激的超氧化物生成抑制的测定法有关。图21C呈现了根据实施例13的数据，该数据与在其中评价了TNF-α生成抑制的测定法有关。
图22A至图22C呈现了根据实施例14的的数据，该数据展示了抗Aβ CAR的抗原特异性抗炎活性。图22A呈现了根据实施例14的数据，该数据与在其中评价了PMA刺激的超氧化物生成抑制的测定法有关。图22B呈现了根据实施例14的数据，该数据与在其中评价了酵母聚糖刺激的超氧化物生成抑制的测定法有关。图22C呈现了根据实施例14的数据，该数据与在其中评价了IL-6生成抑制的测定法有关。
图23A至图23B呈现了根据实施例15的数据，该数据展示了人Treg中表达的神经退行性疾病修饰分子(NDMM)的细胞保护活性。图23A呈现了根据实施例15的数据，该数据与在其中评价了Nrf2(Keap1抑制剂肽)和人过氧化氢酶的NDMM构建体的测定法有关。图23B呈现了根据实施例15的数据，该数据与在其中评价了脑源性神经营养因子(BDNF)和胰岛素生长因子-1(IGF-1)的NDMM构建体的测定法有关。
具体实施方式
本公开整体涉及核酸构建体的构建，所述核酸构建体编码CAR、尤其是靶向在患有神经退行性疾病或病症的受试者的中枢神经系统中异常表达的蛋白质的那些CAR，和/或所述核酸构建体编码在中枢神经系统位点处防止或抑制氧化/炎性活性的特定分子，和/或所述核酸构建体编码促进神经元生长/存活或促进T细胞功能的分子。本公开进一步整体涉及这些核酸构建体在制备经工程改造以表达此类CAR和/或由此类构建体表达的其他分子的重组的或经修饰的细胞的用途，特别是重组或经修饰Treg，优选人Treg中。在示例性实施方案中，这些重组或经修饰Treg可经工程改造以表达一种或多种CAR，其中所述一种或多种CAR可靶向与特定神经退行性疾病和病症的病理相关联的不同蛋白质和/或分子标志物。这些CAR任选地可还包含共刺激信号转导或T细胞信号转导部分，诸如CD28-CD3ζ、DAP10-CD3ζ、CD44-CD3ζ、CD28或CD3ζ或另一共刺激信号转导或T细胞信号转导部分。根据本发明的经修饰Treg可进一步任选地经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(neurodegenerative disease modifying molecule，NDMM)，其可与CAR在相同或不同的核酸构建体上或者可在不包含CAR的经修饰Treg上表达。本公开具体地设想了表达一种或多种靶向神经退行性疾病的特定CAR和/或神经退行性疾病修饰分子(NDMM)的经修饰Treg、包含所述经修饰Treg的药用组合物以及制作和使用这些经修饰Treg的方法。本公开还提供了使用这些经修饰Treg治疗受试者的神经退行性疾病、障碍或病症的方法，所述神经退行性疾病、障碍或病症是诸如但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和神经炎症。
本公开的另一个具体方面涉及经修饰Treg的构建和用途，所述经修饰Treg包含外源引入的编码特定类型的神经退行性疾病修饰分子(“NDMM”，诸如抗氧化剂、神经生长因子和/或非典型神经营养因子)的多核苷酸。本公开还提供用于生成此类经修饰Treg的载体(vector)、包含表达一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM的此类经修饰Treg的药用组合物、以及制作表达一种或多种CAR和一种或多种NDMM的组合的经修饰Treg和使用所述经修饰Treg来治疗特定神经退行性疾病的方法。
定义
如本文所用，术语“神经退行性疾病(neurodegenerative disease)”、“神经退行性障碍(neurodegenerative disorder)”和“神经退行性病症(neurodegenerativecondition)”整体是指影响神经元(有时称为“神经细胞”)的任何疾病、障碍和/或病症，被影响的所述神经元诸如大脑的神经元和/或与神经细胞的退变(degeneration)或丧失相关联的神经系统的神经元。通常，神经退行性疾病可导致神经细胞的进行性退变(progressive degeneration)和/或死亡。一般而言，神经退变是神经元的结构或功能的进行性丧失，包括神经元死亡。神经退行性疾病可造成运动问题(称为共济失调(ataxia))或者精神或认知功能问题(称为痴呆(dementia))。神经退变常常与神经炎症相关，实际上许多令人衰弱的神经退行性疾病的发作、进展或原因被认为与神经炎症有关。因此，应当理解，术语神经退行性疾病和神经退行性障碍和类似者涵盖表征为神经炎症的神经疾病。有时在此类疾病中，经活化的小神经胶质细胞可能会产生促成广泛分布炎症的炎性细胞因子，并可致使和/或导致神经退行性病症和/或疾病。此外，一些神经退行性疾病和/或病症与小神经胶质细胞过度活化、小神经胶质细胞数量增加、炎性蛋白质的产生和/或炎性活性和/或神经元死亡相关联。此类神经退行性疾病的实例包括例如阿尔茨海默氏病及其他痴呆、帕金森氏病及其他帕金森氏病相关障碍、朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病；海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。在示例性实施方案中，神经退行性疾病可包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和/或ALS。在示例性实施方案中，本文所述的经修饰Treg细胞可用于治疗这些和其他神经退行性疾病的方法。
如本文所用，术语“神经炎症(neuroinfiammation)”整体是指神经组织的炎症。有时候，经活化的小神经胶质细胞可产生促成广泛分布炎症的炎性细胞因子，并可致使和/或导致神经退行性病症和/或疾病。在某些情况下，神经炎症可响应于各种诱因(cue)(包括感染、创伤性脑损伤、毒性代谢产物和/或自体免疫)而起始。在中枢神经系统(CNS)(包括脑和脊髓)中，小神经胶质细胞是常驻先天免疫细胞，其响应这些诱因而被活化，并且整体上生成活性氧类并释放信号以招募周围的免疫细胞进行炎性应答。细胞因子也可存在于神经炎症的位点和/或可造成神经炎症，并且在某些情况下，它们可以由小神经胶质细胞或巨噬细胞产生。在示例性实施方案中，神经炎症可与神经退行性疾病例如阿尔茨海默氏病、ALS和帕金森氏病相关联和/或可在期间发生。
术语“炎症(inflammation)”是指由多样细胞类型、蛋白质、体液因子和组织介导的广泛生理响应。虽然炎症可以在体内发送信号以帮助免疫系统消除病原体或不期望有的病症，但不适当水平的或改变类型的炎症可以造成体内许多生理或免疫问题。此类炎症可以是多样的疾病(包括自身免疫性疾病、纤维化疾病、慢性感染和变态反应(allergy))的病理的直接原因(Laria，A.等人，“The macrophages in rheumatic diseases”，J InflammRes.2016年2月9日；9：第1-11页；Wynn，T.A.和Ramalingam，T.R.，“Mechanisms offibrosis：fibrotic translation for fibrotic diseases”，Nat Med，2012年7月6日；18(7)：第1028-40页；Yang，Z.P.，Kuo，C.C.和Grayston，J.T，“Systemic dissemination ofChlamidia pneumoniae following intranasal inoculation in mice”，J InfectDis.1995年3月；171(3)：第736-8页；Jian，Z.和Zhu，L.，“Update on the role ofalternatively activated macrophages in asthma”，J Asthma Allergy，2016年6月3日；9：第101-7页)。炎症还可以间接恶化许多疾病的症状，或在发病机理中起到辅助作用，例如在癌症、肥胖症、代谢性疾病和心血管疾病(诸如动脉粥样硬化)中(Coussens，L.M.和Werb，Z.，“Inflammation and Cancer”.Nature.2002年12月19-26；420(6917)：第860-7页；Monteiro，R.和Azevedo，I.，“Chronic inflammation in obesity and the metabolicsyndrome”，Mediators Inflamm.2010；2010；Libby，P.，“Inflammation andcardiovascular disease mechanisms”，Am J Clin Nutr.2006年2月；83(2)：第456S-460S页)。
如本文所用，术语“神经退行性疾病修饰分子(neurodegenerative disease-modifying molecule)”或“NDMM”整体是指能够改变(减少、改进或防止)神经退行性疾病、障碍或病症的症状、进展或发作的分子。代表性的神经退行性病症包括例如阿尔茨海默氏病、ALS、帕金森氏病和其他神经炎性病症。此类NDMM分子的实例包括但不限于IL-37、IL-12、TNF-α、IFN-γ、CCL2、TNFAIP3和其他能够改变与疾病相关联的蛋白质的表达水平、活化状态或功能的分子。在示例性实施方案中，NDMM可包含一种或多种细胞因子。在其他示例性实施方案中，NDMM可包含防止氧化/炎症活性的分子。在其他示例性实施方案中，NDMM可包含促进神经元生长和/或存活的分子。在示例性实施方案中，NDMM可由根据本发明的经修饰Treg(例如，包含一种或多种CAR的经修饰Treg)表达，如本文进一步详细论述的。此外，NDMM可包含一种或多种促神经元因子、一种或多种抗氧化剂、一种或多种神经生长因子和/或一种或多种非典型神经营养因子。促神经元因子的实例包括但不限于包括白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；白介素-6(IL-6)；活化蛋白C(APC)；血栓调节蛋白；组织纤溶酶原激活剂(tPA)；蛋白质去糖化酶DJ-1；组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)。抗氧化剂的实例包括但不限于包括HO-1、铁蛋白、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白(H)、金属硫蛋白I、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶MSP23、Cu/Zn超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、NRF2活性、过氧化物还原酶(Prx)；活性依赖性神经保护因子同源盒(ADNP)；藻蓝蛋白；神经珠蛋白。神经生长因子的实例包括但不限于典型的神经营养蛋白诸如脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)和神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)。非典型的神经营养因子的非限制性实例包括胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在一些实施方案中，NDMM表达可由诱导型启动子系统控制，例如使用本领域已知的诱导型启动子系统，和/或NDMM的表达可通过CAR触发的转录控制来调控。
如本文所用，“5′帽(5′cap)”(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前端”或5′端的经修饰鸟嘌呤核苷酸。5′帽由连接至第一个转录的核苷酸的端基组成。它的存在对于被核糖体识别和保护免于RNA酶至关重要。帽的添加与转录偶联，并且共转录发生，从而彼此相互影响。转录开始后不久，所合成的mRNA的5′末端被与RNA聚合酶相关联的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。加帽部分可以被修饰以调节(modualte)mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。
术语“同种异体的(allogeneic)”或“供体来源的(donor-derived)”整体是指源于与要引入或移植材料的个体属相同物种的不同动物的任何材料。两个或多个个体在一个或多个基因座上的基因不相同时被认为是同种异体。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料在基因上可足够相异以发生抗原相互作用。
如本文所用，术语“抗体(antibody)”或“Ab”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，抗原可是由具有神经退行性疾病和/或病症的受试者中的神经元表达或异常表达的分子。此类疾病和病症的实例包括但不限于包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和ALS。其他非限制性实例包括朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病；海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。抗体可以是衍生自天然来源或衍生自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部份(portion)。该术语以最广泛意义使用并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整的抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))、双抗体(diabody)和单域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖基因工程改造形式的和/或以其他方式修饰的形式的免疫球蛋白，诸如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂缀合抗体、多特异性(例如双特异性)抗体、双抗体、三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)、串联二scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。
术语“抗体片段”或“Ab片段”是指完整抗体的一部份，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv)、单域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段)、双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。在示例性实施方案中，抗体片段可是scFv。
如本文所用，“抗体重链(antibody heavy chain)”是指在以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链(antibody light chain)”是指在以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，所谓术语“合成抗体(synthetic antibody)”意指使用重组DNA技术生成的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体，如本文所述。该术语也应理解为意指通过合成编码抗体的DNA分子(并且该DNA分子表达抗体蛋白)或规定该抗体的氨基酸序列而生成的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已使用本领域可用且周知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原(antigen)”或“Ag”是指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者均有。技术人员将理解，任何大分子(包括实际上所有的蛋白质或肽)都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或不完整核苷酸序列的任何DNA因而均编码本文所用术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于使用不止一种基因的不完整核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以多样组合排列以编码引发所期望应答的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以经生成、合成或者可以源自生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、神经组织样品、发炎的组织样品、细胞或具有其他生物组分的流体。在一些实施方案中，抗原是在神经退行性疾病或病症例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和ALS中表达的分子。在示例性实施方案中，抗原可是可与神经退行性疾病或病症相关联的以下中的任一者或多者的形式：β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TARDNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)。在一些实施方案中，抗原可是可与神经退行性疾病或病症相关联的以下中的任一者或多者的形式：具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
术语“抗原结合结构域(antigen binding domain)”或“AB结构域”是指嵌合抗原受体(CAR)的一个或多个胞外结构域，所述胞外结构域对特定抗原具有特异性。
如本文所用，术语“单采血液成分法(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，将供体或患者的血液从供体或患者移出并通过设备，该设备分隔出选定的特定成分并返回剩余物至所述供体或患者的血液循环，例如通过回输法。因此，在“单采血液成分法样品”的语境中是指使用单采血液成分法而获得的样品。
术语“自体的(autologous)”或指源自个体且之后会被重新引入同一个体的任何材料。
术语“结合(bind)”是指两个分子之间的吸引相互作用，其可导致其中分子彼此紧邻的稳定缔合。分子结合的结果有时是分子复合物的形成，其中将组分保持在一起的吸引力通常是非共价的，因此一般在能量上比共价键弱。
术语“CD28”是指蛋白质分化簇28，其为在T细胞上表达的蛋白质之一，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。小鼠CD28蛋白可与NCBI参考编号NP_031668.3或其具有刺活化性的片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。人CD28蛋白可与NCBI参考编号NP_006130或其具有刺活化性的片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
术语“CD3ζ”或者“zeta”、“ζ”、“ζ链”、“CD3-ζ”、“CD3z”、“TCR-ζ”、“CD247”或“CD3ζ”是小鼠中由1号染色体上具有基因位置为1H2.3；173.14cM的CD247基因编码的蛋白质，以及在人中由1号染色体上具有基因位置1q24.2的CD247基因编码的蛋白质。CD3ζ与T细胞受体(TCR)和CD3(由CD3γ、CD3δ和两个CD3ε构成的蛋白质复合物)一起形成TCR复合物。小鼠CD3ζ可具有NP_001106864.1、NP_001106863.1、NP_001106862.1或NP_112439.1所提供的氨基酸序列，或来自非小鼠物种(例如人、啮齿动物、猴、猿和类似者)的等价残基。人CD3ζ可具有NP_000725或NP_932170所提供的氨基酸序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿和类似者)的等价残基。
术语“CD3ζ胞内信号转导结构域(CD3 zeta intracellular signaling domain)”或者“CD3ζICS结构域”或“CD3zICS”定义为来自CD3ζ链的胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，该衍生物足以在功能上发送对T细胞活化必要的初始信号。
术语“4-1BB”或“BB”是指具有以GenBank登录号AAA53133.1提供的氨基酸序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿和类似者)的等价残基的TNFR超家族成员。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是以SEQ ID NO：12提供的序列或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿和类似者)的等价残基，和/或该序列可由SEQ ID NO：212编码。
术语“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)”或者“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中典型为两种，当在免疫效应子和/或调节细胞中表达时，其可为细胞提供对靶细胞的特异性，并且任选地促进胞内信号生成。根据本发明的CAR通常将包含受体或配体结合部分，例如靶向在具有神经退行性障碍的受试者中异常表达的蛋白质的受体或配体结合部分，并且任选地可包含一个或多个共刺激信号转导或T细胞信号转导结构域诸如CD28、4-1BB、CD3ζ、DAP10-CD3ζ、CD44-CD3ζ、CD28-CD3ζ或4-1BB-CD3ζ。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域(AB结构域)、跨膜结构域(TM结构域)和胞质信号转导结构域(本文也称为“胞内信号转导结构域(ICS结构域)”)，所述胞质信号转导结构域包含源于刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号转导结构域，如下所定义。在一些方面，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，一旦存在二聚化分子时该二聚化开关可以使所述多肽彼此偶联，例如能使AB结构域偶联至ICS结构域。在一些方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相缔合的ζ链。在一些方面，CAR的胞质部份还包含共刺激结构域(CS结构域)，该共刺激结构域包含源自至少一种如下所定义的共刺激分子的一个或多个功能性信号转导结构域。在一些方面，所述共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD44、DAP10和/或CD28。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外AB结构域、TM结构域和ICS结构域，所述ICS结构域包含源自刺激分子的功能性信号转导结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外AB结构域、TM结构域、包含源自刺激分子的功能性信号转导结构域的ICS结构域和包含源自共刺激分子的功能性信号转导结构域的CS结构域。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外AB结构域、TM结构域、包含源自刺激分子的功能性信号转导结构域的ICS结构域和两个CS结构域，这两个CS结构域每一者均包含源自共刺激分子的功能性信号转导结构域，所述共刺激分子彼此相同或不同。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外AB结构域、TM结构域、包含源自刺激分子的功能性信号转导结构域的ICS结构域和至少两个CS结构域，所述至少两个CS结构域每一者均包含源自共刺激分子的功能性信号转导结构域，所述共刺激分子彼此相同或不同。在一些方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基末端(N端)包含任选的前导序列。在一些方面，CAR进一步在胞外抗原结合结构域的N-末端包含前导序列，其中该前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜的过程中从该抗原结合结构域(例如，scFv)切除。
本文中对于抗体所用的术语“竞争(compete)”意指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以与第二抗体或其抗原结合部份的结合足够相似的方式与表位结合，使得与第二抗体不存在时第一抗体的结合相比，第二抗体存在时第一抗体与其同源表位的结合结果可检测地减低。以上的替代方案中在第一抗体存在时第二抗体与其表位的结合也是可检测地减低的，这可以成立但不必如此。也就是说，第一抗体可以在第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位结合的情况下抑制第二抗体与其表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位或配体的结合时，无论程度是相同、更大或更小，所述多种抗体都被认为是彼此“交叉竞争”与其相应的表位结合。本发明涵盖竞争性抗体和交叉竞争性抗体。无论发生此类竞争或交叉竞争的机制(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其一部份的结合)如何，基于本文提供的教导，技术人员应理解，此类竞争和/或交叉竞争抗体被涵盖并且可以有用于本文公开的方法。
与“高变区(hypervariable region)”或“HVR”同义的术语“互补决定区(complementarity determining region)”和“CDR”是本领域中是已知的，指抗体可变区内的氨基酸的非连续序列(non-contiguous sequence)，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本领域中，“框架区(framework region)”和“FR”是指重链和轻链的可变区的非CDR部份。通常，每个全长重链可变区有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，每个全长轻链可变区有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
本文中的术语“共刺激分子(costimulatory molecule)”或“T细胞信号转导部分(T cell signaling moiety)”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖或特定细胞因子的表达。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，它们有助于有效的免疫应答。共刺激分子包括但不限于从以下组成的群组所选出的蛋白质：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、Toll配体受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6和与CD83特异性结合的配体。在其中CAR包含一个或多个CS结构域的实施方案中，其中每个CS结构域包含源自共刺激分子的功能性信号转导结构域。在一些实施方案中，所编码的CS结构域是4-1BB、CD28或DAP10的CS结构域。
术语“细胞因子(cytokine)”是指细胞信号转导所涉及的一广泛种类的小蛋白质。通常，它们的释放对它们周围的细胞的行为有一定效应。细胞因子可作为免疫调节剂(immunomodulating agent)参与自分泌信号转导、旁分泌信号转导和/或内分泌信号转导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子由范围广泛的细胞(包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和多样基质细胞)产生。“趋化因子(chemokine)”是通常涉及介导趋化性的细胞因子家族。
“有效量”或“有效治疗量”是指足以防止或治疗个体的疾病、病症或障碍的剂量。对于治疗或预防用途有效的量将取决于例如所治疗的疾病或障碍的阶段和严重性、患者的年龄、体重和总体健康状况以及开处方医生的判断。剂量的大小还将取决于所选择的活性剂、施用方法、施用时序和频率、可能伴随特定活性剂施用的任何不良副作用的存在、性质和程度，以及所期望的生理效应。本领域技术人员将理解，多样疾病或障碍可能需要涉及多次施用的延长治疗，也许在每轮或多轮施用中使用一种或多种经修饰Treg。
术语“铰链(hinge)”、“间隔区(spacer)”或“接头(linker)”是指可变长度的氨基酸序列，其典型在多肽构建体的两个或更多个结构域或部份之间编码以赋予柔性、改善的空间组构、邻近性等。
如本文所用，“人抗体(human antibody)”意指具有与人所产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体和/或已使用本领域技术人员已知的或本文公开的用于制作人抗体的任何技术制作的抗体。此人抗体的定义包括包含至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体。一个此类实例是包含鼠轻链多肽和人重链多肽的抗体。可以使用本领域已知的多样技术来产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，Nature Biotechnology，14：309-314，1996；Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162，1998；Hogeboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581，1991)。人抗体也可以通过已经转基因引入人免疫球蛋白基因座代替内源基因座的动物(例如，其中内源免疫球蛋白基因已部分地或完全地失活的小鼠)免疫来制作。该方法在美国专利No.5,545,807；No.5,545,806；No.5,569,825；No.5,625,126；No.5,633,425；和No.5,661,016中描述。作为另外一种选择，可通过使产生针对靶标抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化来制备人抗体(此类B淋巴细胞可回收自个体或回收自cDNA的单细胞克隆，或可在体外免疫)。参见，例如，Cole等人，“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss，第77页，1985；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95，1991；和美国专利No.5,750,373。
“iCAR”是含有抑制性受体信号转导结构域的嵌合抗原受体。这些结构域可基于例如保护素D1(PD1)或CTLA-4(CD152)。在一些实施方案中，可进一步转导本文所论述的经修饰Treg以表达iCAR。如本文所用，“免疫细胞(immune cell)”是指功能上参与先天和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的造血来源的细胞。
术语“内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)”或“IRES”是指在某些真核和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入的顺式作用RNA序列。IRES允许在蛋白质合成过程中以不依赖于5′帽的方式进行翻译起始，因此使得能从单个mRNA共表达两种蛋白质。IRES序列的进一步细节和变化可在Bonnal等人，Nucleic Acids Res.2003年1月1日；31(1)：427-428中找到。
如本文所用，术语“胞内信号转导结构域(intracellular signaling domain)”或“ICS结构域”是指分子的胞内部份。胞内信号转导结构域生成信号，该信号促进用包含CAR的核酸序列转导的细胞(例如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)的免疫调节性和/或效应子功能。免疫效应子功能的实例包括溶细胞活性和协助活性(helper activity)，包括细胞因子的分泌。免疫调节性功能(例如在经修饰Treg中的)的实例包括但不限于包括ICS结构域，包括但不限于包括CD28-CD3ζ；4-1BB-CD3ζ；Dap10-CD3ζ；CD44-CD3ζ；CTLA-4-CD3ζ；CD28；Dap10；4-1BB；3ζ。进一步实例包括TCR/CD3复合蛋白的ICS结构域、Fc受体亚基、IL-2受体亚基、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10或DAP12。
术语“DAP10”是指在人中由HSCT基因编码的蛋白质。其也可称为HCST、KAP10、PIK3AP或造血细胞信号转导子(hematopoietic cell signal transducer)。在一些实施方案中，DAP10可具有Genbank登录号Q9UBK5.1中提供的序列。
“分离(isolated)”的生物组分(诸如分离的嵌合抗原受体或细胞或载体或蛋白质或核酸)是指这样的组分：已经实质上从其环境或所述组分天然存在的生物体的细胞中的其他生物组分(例如，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器)分隔或纯化出来。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。分离的核酸或蛋白质可以用实质上纯化的形式存在，或可以存在于非原生环境诸如例如宿主细胞中。
在scFv的语境中使用的术语“接头”是指用以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的由氨基酸组成的肽接头，所述氨基酸为诸如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并且包含氨基酸序列单元Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：13)的一个或多个重复。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)3，其也称为G4S X3(SEQ ID NO：13)。此类接头可例如由核酸序列(SEQID NO：213)编码。
术语“核酸(nucleic acid)”和“多核苷酸(polynucleotide)”是指直链或支链的、单链或双链的RNA或DNA或它们的杂合体。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团诸如氟代核糖和硫醇酯，以及核苷酸支链。在聚合后，可进一步修饰核苷酸的序列，诸如通过与标记组分相缀合。本定义中所包括的其他类型的修饰是帽子、用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸和引入将多核苷酸附接至蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的手段。多核苷酸可以通过化学合成而获得或源自微生物。术语“基因(gene)”广泛地用于指与生物学功能相关联的任何多核苷酸段(segment)。因此，基因包括内含子和外显子(如基因组序列中一样)，或仅包括编码序列(如cDNA中一样)和/或对它们的表达所需的调控序列(regulatory sequence)。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA、或者编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调控序列。
“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”或“赋形剂(excipient)”是指在配制期间和/或用以允许储存时常规上用于免疫原性组合物中的化合物或材料。
如本文所用，术语“启动子(promoter)”定义为起始多核苷酸序列的特异性转录所需的被细胞的合成机构或引入的合成机构识别的DNA序列。
术语“重组(recombinant)”意指部分(moeity)，例如具有半合成或合成来源的多核苷酸，该多核苷酸不是天然存在的或者以自然界中未出现的构造连接至另一多核苷酸，或者其可指细胞，该细胞经修饰以表达或不表达相应未经修饰的细胞通常不表达或表达的多核苷酸。
术语“scFv”、“单链Fv”或“单链可变片段”是指一种融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中所述轻链和重链可变区例如经由合成接头(例如短的柔性多肽接头)邻近地连接，并且能够作为单链多肽表达，并且其中scFv保留其源自的完整抗体的特异性。除非有说明，否则如本文所用，scFv可具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，该顺序例如相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。接头可包含框架序列的部份。
术语“序列同一性(sequence identity)”或“序列同源性(sequence homology)”在本文可互换使用，并且两者均指不同多肽或核酸的序列相似性。一般而言，本发明设想与本文所公开的多肽或核酸序列中的任一者或多者具有至少90％或更高序列同源性或同一性的多肽或核酸或含有它们的构建体，更典型地，与本文所公开的多肽或核酸序列中的任一者或多者具有至少95％或更高序列同源性、或与本文所示的多肽或核酸序列中的任一者或多者拥有至少98％或更高序列同源性或序列同一性、或至少99％或更高序列同源性或同一性。确定核酸和氨基酸序列之间的同源性的方法是本领域普通技术人员众所周知的。通常，将选择或设计此类同源核酸或多肽，以便改善或以便不会不利地影响特定多肽或核酸或含有它们的构建体的所期望特性。
“信号肽(signal peptide)”(也称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)是存在于大多数新合成蛋白质的N端的短肽，目的地是进入分泌途径。信号肽的核心可含有一长段疏水性氨基酸。信号肽可从或可不从成熟多肽上切除。
本文所用的“前导序列(leader sequence)”，在本领域也称为“信号肽(signalpeptide)”、“信号序列(signal sequence)”、“靶向信号(targeting signal)”、“定位信号(localization signal)”、“定位序列(localization sequence)”、“转运肽(transitpeptide)”或“前导肽(leader peptide)”是存在于大多数新合成蛋白质的N端的短肽，目的地是进入分泌途径。信号肽的核心可含有一长段疏水性氨基酸。信号肽可从或可不从成熟多肽上切除。
“核糖体跳跃序列(ribosome skip sequence)”是指当翻译时造成核糖体上新生多聚蛋白质的切割而允许多个基因共表达的氨基酸序列。在一个方面，核糖体跳跃序列可是T2A序列，并且包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或编码该氨基酸的核苷酸序列，诸如SEQID NO：214。作为另外一种选择，可使用任何其他2A序列。其他2A序列的实例可在相关领域文献的其他地方找到(例如，参见Kim，J.H.等人，“High cleavage efficiency of a 2Apeptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines，zebrafish andmice”PLoS One.2011；6(4))。
术语“信号转导结构域(signaling domain)”是指蛋白质的功能部份(functionalportion)，其通过在细胞内发送信息来起作用，以通过生成第二信使或通过响应此类信使而作为效应子行使功能，来经由定义的信号转导途径调控细胞活性。信号转导结构域的实例包括但不限于包括CD28-CD3ζ；4-1BB-CD3ζ；Dap10-CD3ζ；CD44-CD3ζ；CTLA-4-CD3ζ；CD28；Dap10；4-1BB；和CD3-ζ。
术语“刺激性分子(stimulatory molecule)”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供胞质信号转导序列，对于免疫细胞信号转导途径的至少某些方面该序列以刺激方式调控免疫细胞的活化。在一个方面，该信号是初级信号，其例如通过TCR/CD3复合物与负载有抗原肽的MHC分子的结合而起始，并且其致使T细胞应答的介导(包括但不限于增殖、活化、分化和类似者)。以刺激方式起作用的初级胞质信号转导序列(也称为“初级信号转导结构域”)可含有信号转导基序(motif)，该基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有ITAM的胞质信号转导序列的实例包括但不限于源自以下的那些：CD3ζ(SEQ ID NO：16的氨基酸序列，可由SEQ ID NO：216编码)、共用FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcR β(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、Cd3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的任何一种或多种CAR中的胞内信号转导结构域可包含胞内信号转导序列，例如CD3ζ的初级信号转导序列。作为另外一种选择，可利用来自非人或小鼠物种(例如啮齿动物、猴、猿和类似者)的等价残基。
术语“受试者(subject)”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。受试者可患有疾病或可是健康的。受试者在本领域中也可称为“患者(patient)”。
如本文所用，术语“自杀机制(suicide mechanism)”或“自杀基因(suicidegene)”是指可以从施用了CAR表达细胞的受试者中根除本发明的CAR表达细胞的机制。自杀机制可由例如以下驱动：诱导型半胱天冬酶9(Budde等人，PLoS One 20138(12)：82742)、密码子优化的CD20(Marin等人，Hum.Gene Ther.Meth.201223(6)376-86)、CD34、截短型EGFR(Wang X，Chang W-C，Wong CW等人，A transgene-encoded cell surface polypeptidefor selection，in vivo tracking，and ablation of engineered cells.Blood.2011；118(5)：1255-1263.doi：10.1182/blood-2011-02-337360)、截短型CD19或多肽RQR8(Philip等人，和WO2013153391A，特此以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，可在本文论述的经修饰Treg中包括和利用自杀机制，以优化经修饰Treg停留在受试者系统中的时间长度或经修饰Treg的量，以减少或最小化所述经修饰Treg的毒性和/或使所述经修饰Treg的益处最大化。
如本文所用，术语“靶细胞(target cell)”是指在细胞表面上表达经修饰Treg所包含的CAR的靶分子的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是小神经胶质细胞。在一些实施方案中，靶细胞是神经元。在一些实施方案中，靶细胞是在神经退行性疾病和/或病症和/或神经炎症的病理中具有特定作用的细胞类型。在一些实施方案中，靶细胞是在疾病(诸如但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS以及本文论述的任何其他神经退行性疾病和病症)的病理中具有特定作用的细胞类型。
本文所用的术语“靶分子(target molecule)”是指被CAR或表达CAR的细胞(诸如本公开的经修饰Treg，例如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)靶向的分子。本公开的经修饰Treg所包含的CAR的AB结构域可具有对靶分子的结合亲和力。在一些实施方案中，靶分子是与神经退行性疾病或病症相关联的β淀粉样蛋白1-42的形式。在一些实施方案中，靶分子是与神经退行性疾病或病症相关联的α-突触核蛋白的形式。在一些实施方案中，靶分子是与神经退行性疾病或病症相关联的超氧化物歧化酶-1(SOD-1)的形式。在一些实施方案中，靶分子可系但不限于与神经退行性疾病和/或病症相关联的以下任一者的形式：超磷酸化tau蛋白；TARDNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。在一些实施方案中，靶分子可系与以下神经退行性疾病的非限制性列表中的任一者相关联的分子：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。
术语“转染(transfected)”、“转化(transformed)”或“转导(transduced)”是指将外源核酸转移或引入进宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代主体细胞及其子代。
所谓术语“跨膜结构域(transmembrane domain)”或“TM结构域”，其意味在膜中热力学稳定的任何三维蛋白质结构。这可系单个α螺旋、跨膜β桶、短杆菌肽A的β螺旋或任何其他结构。跨膜螺旋通常长约20个氨基酸。典型地，跨膜结构域表示跨膜蛋白(也称为整合蛋白)的单个跨膜α螺旋。
如本文所用，术语“治疗(treat，treatment，treating)”通常是指用于减少或改进疾病和/或病症的发作、进展、严重性和/或时长，或用于改进疾病和/或病症的一种或多种症状(优选一种或多种可辨别的症状)的临床程序。该疾病可系例如神经退行性疾病或病症。在一些实施方案中，“治疗”的效应可通过疾病的至少一种可测量物理参数的改进来评价，所述改进是由于施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂诸如像本文所述的经修饰Treg)而导致的。该参数可系例如基因表达谱(gene expression profile)、受疾病影响的组织的质量、与炎症相关联的标志物、与神经退行性疾病相关联的标志物、某些细胞因子或趋化因子或其他与疾病相关联的分子的存在与否，并且可不一定能被患者辨别。在其他实施方案中，“治疗”可导致抑制疾病和/或病症的进展，无论是物理上通过(例如)可辨别症状的稳定化，还是生理上通过(例如)身体参数的稳定化，或这两者。另外，如本文所用，术语“治疗”和“防止”以及由此衍生的词语不一定暗示100％或完全治愈或防止。相反，存在程度变化的治疗效应或防止效应，且本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效应。在这方面，本发明的方法可以在哺乳动物中提供对疾病和/或病症的任何量的任何水平的治疗或防止效应。此外，本文所述方法所提供的治疗或防止可以包括治疗或防止所治疗或防止的疾病的一种或多种病症或症状。同样，出于本文的目的，“防止(prevent)”可以涵盖延迟疾病或其症状或病症的发作。
术语“异种的(xenogeneic)”是指源于不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“重组Treg”或“经修饰Treg”通常是指相对于其原生状态已被改变的(例如经基因修饰的)调节T细胞。例如，在示例性实施方案中，可将经修饰Treg工程改造以表达一种或多种CAR。另外，可将示例性经修饰Treg工程改造以表达一种或多种NDMM。在示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg可用于治疗多样疾病。例如，可将经修饰Treg用于治疗特定的神经退行性疾病、病症或障碍的方法中。可用本文所公开的经修饰Treg治疗的示例性神经退行性疾病、病症和/或障碍包括例如ALS、阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。此外，在示例性实施方案中，可将本公开的经修饰Treg用于治疗CNS中的神经炎症。在一些实施方案中，可将本公开的经修饰Treg用于治疗以下神经退行性疾病和/或病症的非限制性列表中的任一者：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。
经修饰Treg以及其组合物和使用方法
本公开整体涉及经修饰Treg，例如，经工程改造以表达一种或多种嵌合抗原受体(“CAR”)和/或一种或多种神经退行性疾病修饰分子的Treg，以及涉及包含所述经修饰Treg的组合物和使用所述经修饰Treg和组合物的方法，尤其是用于治疗疾病、障碍或病症的方法(例如神经退行性疾病、障碍或病症)。在示例性实施方案中，将这些经修饰Treg工程改造以在其表面上表达至少一种部分(例如抗体，并且典型地是scFv)，其识别这样的蛋白质：所述蛋白质的表达与特定的神经退行性疾病相关联，例如特定神经退行性疾病或病症的特异性分子标志物，诸如例如，与神经炎症、ALS、阿尔茨海默氏病和/或帕金森氏病相关联的蛋白质和/或分子标志物。在其他示例性实施方案中，经修饰Treg经工程改造以表达或进一步表达防止氧化/炎症活性和/或促进神经元生长、功能和/或存活的特异性分子，诸如抗氧化剂、神经生长因子和非典型神经营养生长因子。在示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg将维持Treg表型和/或维持至少一种Treg效应子功能，并且理想的是将保留未经修饰Treg所拥有的实质上所有效应子功能。在一些示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg可迁移或运输至神经退变和/或神经炎症的位点。在另外的示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg可致使在神经退变和/或神经炎症位点处的抗炎活性。所述活性可包括与神经退变和/或神经炎症相关联的任何活性，诸如例如(1)小神经胶质细胞过度活化，(2)炎性蛋白/活性的产生和(3)神经元死亡。包含经修饰Treg的示例性治疗方法在需要其的患者中可导致疾病进展减少和/或可修复和/或改善功能。在一些实施方案中，可从供体PBMC中分离Treg并扩增以用于例如临床用途。在一些示例性实施方案中，供体细胞可系同种异体的。在其他示例性实施方案中，用于衍生Treg的供体PBMC可分离自待治疗的同一受试者。在一些示例性实施方案中，可修饰分离的Treg以减少或消除内源TCR的表达或功能。在一些示例性实施方案中，可将分离的Treg与从不同供体分离的Treg组合，所述供体可系MHC相容的或不相容的。在一些实施方案中，Treg的数量可扩增高达550倍的增加，在某些情况下，此在两周的培养周期内发生。在其他示例性实施方案中，所述Treg将包含90％或更高的纯度。在其他示例性实施方案中，经修饰Treg可穿过血脑屏障(BBB)。
在一些实施方案中，可如下分离、扩增和转导Treg：可经由两步负和正选择方案从人PBMC分离细胞。首先，利用负选择分离CD4+细胞，随后是对CD25hi+细胞进行正选择以分离CD4+CD25hi+Treg细胞。分离的CD4+CD25hi+Treg可在Treg生长培养基中培养两周期间，并用抗CD3、抗CD28、抗CD2多聚体或抗CD3、抗CD28多聚体(StemCell公司ImmunoCult)与人IL-2(300U/ml至500U/ml)活化。在第9天，可以将Treg细胞冷冻保存以备后用，因此我们可以在多个时机(occasion)测试同一供体和制备物以评估测定法变异性。
CAR
在进一步示例性方面，可修饰经修饰Treg以表达一种或多种CAR，优选在它们的细胞表面表达。根据本发明的示例性CAR可包含配体结合部分，诸如受体或抗体，例如scFv，其识别与待用Treg治疗的疾病和/或病症相关联的蛋白质和/或其他分子标志物(molecularmarker)，所述疾病和/或病症例如是特定的神经退行性疾病和/或神经炎症。在本发明的一些实施方案中，这些CAR可进一步包含一种或多种共刺激信号转导或T细胞信号转导部分或结构域，诸如本文中鉴定的和在工作实例中举例说明的或本领域中通常已知的其他者。表征为可被根据本发明的经修饰Treg所表达的CAR识别的与疾病病理相关联的异常蛋白质或异常表达蛋白质的表达的示例性神经退行性疾病包括例如ALS、阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。当在经修饰Treg中表达时，本文所述的一种或多种CAR可触发效应子应答，诸如例如细胞因子表达。在示例性实施方案中，CAR可在一种或多种特异性抗原的存在下触发效应子应答。此外，在某些方面，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述一种或多种CAR可在刺激(例如特异性抗原刺激)后触发IL-10产生。在另外的示例性实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述经修饰Treg可保留它们抑制其他T细胞的能力。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述经修饰Treg可在具有已知调节性和/或抗炎活性的T细胞的亚群中，诸如例如FOXP3+Treg。在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，其中所述一种或多种CAR包含可靶向疾病的蛋白质和/或分子标志物的单链可变片段(scFv)、跨膜信号转导结构域和胞质信号转导结构域。在示例性实施方案中，与对照治疗相比，包含一种或多种靶向所关注疾病的CAR的经修饰Treg可导致更大的炎性细胞因子产生的抑制、更高的抗炎细胞因子的表达、更好的针对神经炎症介导的运动神经元死亡的防护，并且改善存活率。
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种如本文所述的CAR，其中编码所述CAR的序列可包含信号序列。应当理解，在所述CAR表达期间可切除或可不切除所述信号序列。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：1(DG01)的序列(其可任选由SEQ ID NO：201的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG01可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的β淀粉样蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：2(DG02)的序列(其可任选由SEQ ID NO：202的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG02可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的β淀粉样蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：3(DG03)的序列(其可任选由SEQ ID NO：203的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG03可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的β淀粉样蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：4(DG04)的序列(其可任选由SEQ ID NO：204的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG04可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的β淀粉样蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：5(DG05)的序列(其可任选由SEQ ID NO：205的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG05可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的人超氧化物歧化酶的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：6(DG06)的序列(其可任选由SEQ ID NO：206的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG06可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的超氧化物歧化酶的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：7(DG07)的序列(其可任选由SEQ IDNO：207的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG07可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的超氧化物歧化酶的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：8(DG08)的序列(其可任选由SEQ ID NO：208的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG08可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的α-突触核蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：9(DG09)的序列(其可任选由SEQ ID NO：209的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG09可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的α-突触核蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：10(DG010)的序列(其可任选由SEQ ID NO：210的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG10可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的α-突触核蛋白的形式。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：11(DG11)的序列(其可任选由SEQ ID NO：211的核酸序列编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，DG11可靶向与神经退行性疾病或病症相关联的α-突触核蛋白的形式。
在示例性实施方案中，CAR可靶向包含表1所示序列的蛋白质或所述蛋白质的突变体形式：
表格1
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在一些实施方案中，CAR可以靶向与以下神经退行性疾病中的任一者或多者相关联的分子标志物，例如蛋白质：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。
在一些示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向β淀粉样蛋白1-42。在其他示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向超氧化物歧化酶-1(SOD-1)在其他示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向α-突触核蛋白。在其他示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向以下非限制性列表中的任一者：超磷酸化tau蛋白；TARDNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)。在一些实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向以下中的任何一者或多者：具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
在其他示例性实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且可进一步包含一种或多种信号转导结构域，所述信号转导结构域可由与编码所述一种或多种CAR的核酸相同或不同的核酸构建体上所包含的核酸编码。所述信号转导结构域可在所述经修饰Treg中活化不同的效应子途径和/或存活途径，并且任选地可影响细胞因子表达，例如在存在靶抗原(诸如在CNS中在神经退变位点处表达的异常表达蛋白质)的情况下，触发IL-10表达。
在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可不具有信号转导，或者可使用T细胞信号转导(即，作为CAR的抗原系链，例如仅CD28跨膜)。在其他示例性实施方案中，由经修饰Treg表达的一种或多种CAR可包含信号转导结构域组合(共刺激信号转导结构域)，该组合包括例如：CD28-CD3ζ；4-1BB-CD3ζ；Dap10-CD3ζ；CD44-CD3ζ；CTLA-4-CD3ζ；CD28；Dap10；4-1BB；CD3-ζ。在进一步示例性实施方案中，由经修饰Treg表达的共刺激信号转导结构域可包含CD28-CD3ζ；DAP10-CD3ζ；CD44-CD3ζ；4-1BB-CD3ζ；CD28；或CD3-ζ。
此外，本发明的具体示例性实施方案涉及包含一种或多种CAR的经修饰Treg，所述CAR包含单链可变片段，所述单链可变片段源自对与疾病和/或病症(诸如例如神经退行性疾病和/或神经炎症)相关联的蛋白质和/或其他分子标志物具特异性的抗体，包括但不限于本文公开的特异性scFv抗体序列。
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含CAR DG05-28Z(SEQ ID NO：24，其可任选由SEQ ID NO：224编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含CAR DG06-28Z(SEQ ID NO：25，其可任选由SEQ ID NO：225编码))，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含CAR DG07-28Z(SEQ ID NO：26，其可任选由SEQ ID NO：226编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含CAR DG10-28Z(SEQ ID NO：29，其可任选由SEQ ID NO：229编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG01-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：20，其可选地由SEQ ID NO：220编码)、DG02-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：21，其可选地由SEQ ID NO：221编码)、DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22，其可选地由SEQ ID NO：222编码)、DG04-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：23，其可选地由SEQ IDNO：223编码)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：24，其可选地由SEQ ID NO：224编码)、DG06-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：25，其可选地由SEQ ID NO：225编码)、DG07-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：26，其可选地由SEQ ID NO：226编码)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG08-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：27，其可选地由SEQ ID NO：227编码)、DG09-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：28，其可选地由SEQ IDNO：228编码)、DG10-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：29，其可选地由SEQ ID NO：229)、DG11-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：30，其可选地由SEQ ID NO：230)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO：24，其可任选地由SEQID NO：224编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：40，其可任选地由SEQ ID NO：240编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41，其可任选地由SEQ ID NO：241编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42，其可任选地由SEQ ID NO：242编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO：43，其可任选地由SEQ ID NO：243编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD28tm(也称为DG05-28ζ)(SEQ ID NO：44，其可任选地由SEQ ID NO：244编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO：22，其可任选地由SEQID NO：222编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45，其可任选地由SEQ ID NO：245编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：46，其可任选地由SEQ ID NO：246编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47，其可任选地由SEQ ID NO：247编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48，其可任选地由SEQ ID NO：248编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO：49，其可任选地由SEQ ID NO：249编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQ ID NO：50，其可任选地由SEQ ID NO：250编码)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
在进一步示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg可表达一种或多种CAR，例如，靶向在CNS神经退变位点处异常表达的蛋白质的CAR，并且可进一步修饰以表达一种或多种NDMM。作为另外一种选择，可生成表达一种或多种NDMM并且不表达CAR的经修饰Treg。这些经修饰的表达NDMM的Treg任选地可与表达一种或多种CAR的经修饰Treg组合。所述NDMM可包含防止氧化和/或炎症活性的分子。在进一步示例性实施方案中，所述NDMM当在Treg中表达时可活化神经元生长和/或存活。示例性的NDMM可包括促神经元因子、抗氧化剂、神经生长因子和/或非典型神经营养因子。示例性的抗氧化剂包括但不限于包括HO-1、铁蛋白、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白(H)、金属硫蛋白I、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶MSP23、Cu/Zn超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、NRF2活性、过氧化物还原酶(Prx)；活性依赖性神经保护因子同源盒(ADNP)；藻蓝蛋白；神经珠蛋白。示例性的促神经元因子包括但不限于包括：白介素-11受体拮抗剂(IL-1ra)；白介素-6(IL-6)；活化蛋白C(APC)；血栓调节蛋白；组织纤溶酶原激活剂(tPA)；蛋白质去糖化酶DJ-1；组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)。示例性的神经生长因子包括但不限于包括典型神经营养蛋白：脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)。示例性的非典型神经营养因子包括但不限于包括胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。在一些示例性实施方案中，由根据本发明的经修饰Treg表达的NDMM可由组成型启动子控制。在其他示例性实施方案中，由根据本发明的经修饰Treg表达的NDMM可由诱导型启动子系统控制。合适的组成型和诱导型启动子的选择是本领域技术人员公知的，并且许多此类启动子是已知的并且容易获得。此外，可通过CAR触发的转录控制来调控所述经修饰Treg对所述NDMM的表达。在本发明的一些实施方案中，本文所述的表达CAR的经修饰Treg可进一步包含外源引入的编码一种或多种NDMM的多核苷酸。在一些实施方案中，可使用单个载体将外源引入的编码NDMM和CAR构建体的多核苷酸引入细胞中。当一个载体用于CAR和NDMM二者时，CAR和NDMM可在同一顺式启动子下在载体中编码。在此类情况下，CAR和NDMM构建体可通过允许产生两个分别的翻译产物的序列而分隔开，例如IRES序列或T2A序列(由SEQ ID NO：214编码)。
在一些实施方案中，表达CAR的经修饰Treg可表达NDMM，该NDMM可系人过氧化氢酶。在一些实施方案中，表达CAR的经修饰Treg可表达NDMM，该NDMM可系人Nrf2的Neh2结构域。在一些实施方案中，表达CAR的经修饰Treg可表达NDMM，该NDMM可系人BDNF。在一些实施方案中，表达CAR的经修饰Treg可表达NDMM，该NDMM可系人IGF-1。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO：51，其可任选地由SEQ IDNO：251编码)的构建体，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM人过氧化氢酶(SEQ ID NO：52，其可任选地由SEQ ID NO：252编码)的构建体，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM BDNF(SEQ ID NO：53，其可任选地由SEQ ID NO：253编码)的构建体，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM IGF-1(SEQ ID NO：54，其可任选地由SEQ ID NO：254编码)的构建体，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
作为另外一种选择，可以将CAR构建体和NDMM构建体含于分别的载体中，用于使用两种或更多种不同的载体转染或转导细胞。
示例性的经修饰Treg可包含靶向帕金森氏病的蛋白质和/或分子标志物的经修饰Treg。在示例性实施方案中，靶向帕金森氏病的经修饰Treg可包含一种或多种CAR，其中所述一种或多种CAR可靶向α-突触核蛋白原纤维。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG08的序列(SEQ ID NO：8)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG09的序列(SEQ ID NO：9)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG10的序列(SEQ ID NO：10)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG11的序列(SEQ IDNO：11)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG08-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：27)、DG09-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：28)、DG10-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：29)、DG11-CD28-CD3ζ(SEQ IDNO：30)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，其中所述构建体每一者均靶向α-突触核蛋白。在进一步示例性实施方案中，经修饰Treg(诸如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)可靶向一种或多种神经毒性炎症介体(mediator)，例如，由活化的小神经胶质细胞产生的神经毒性炎症介质。所述经修饰Treg可减低和/或抑制小神经胶质细胞活化。在示例性实施方案中，经修饰Treg在PD中的多巴胺神经元退变的疾病位点具有靶向的抗炎和神经保护治疗活性。在一些实施方案中，经修饰Treg可仅在存在α-突触核蛋白原纤维的位点介导其功能。
在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向帕金森氏病的一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM，其中所述一种或多种CAR包含单链可变片段，诸如针对人α-突触核蛋白原纤维的人和小鼠单克隆抗体的VH和VL氨基酸序列(诸如例如，源自克隆NI 202.3G12、NI202.12F4、NI 202.21D11和mAb49/G的氨基酸序列)。在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含所述scFV且进一步包含构建体，该构建体包含CD28-CD3ζCAR(即scFv-CD28-CD3ζCAR)，其中所述scFv对人α-突触核蛋白原纤维具有特异性。包含所述scFv的构建体可包含VH+VL和VL+VH构造。在示例性实施方案中，载体可包含所述scFv-CD28-CD3ζ CAR构建体，并且可进一步包含分别的截短型(非信号转导的)人CD19(tCD19)。所述tCD19可用作转导标志物(transduction marker)，诸如用于细胞监测和/或细胞纯化目的。在示例性实施方案中，包含本文所述序列任一者的载体可包含逆转录病毒表达载体，例如pSFG。
此外，在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向ALS的一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM。所述经修饰Treg可靶向mutSOD1，例如，所述经修饰Treg可包含靶向mutSOD1的一种或多种CAR。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG05序列(SEQ ID NO：5)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG06序列(SEQ ID NO：6)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG07序列(SEQ ID NO：7)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：24)、DG06-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：25)、DG07-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：26)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，其中所述构建体每一者均靶向mutSOD1。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO：24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO：43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO：44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，其中所述构建体每一者均靶向mutSOD1。
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含靶向mutSOD1的CAR，并且在一些示例性实施方案中，所述CAR的scFv可细胞外表达，其中VL的C末端融合至人CD28铰链、跨膜和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域，以产成抗mutSOD1-CD28-CD3ζ CAR。在一些实施方案中，可通过用接头诸如例如(G4S)3接头连接重链可变区和轻链可变区来构建经修饰Treg所包含的CAR的scFv。在一些实施方案中，经修饰Treg的CAR的VL的C末端可与人CD28铰链、跨膜和胞质结构域融合，并且可随后是人CD3ζ胞质结构域。所述经修饰Treg的所述CAR可系抗mutSOD1 CAR。所述CAR可在抗原结合(例如mutSOD1的结合)时触发初级共刺激信号转导。在一些实施方案中，CAR共刺激结构域可包含但不限于包含：单独的CD3ζ；4-1BB；或CD28的共刺激结构域，或者其可包含CD28-CD3ζ、DAP10-CD3ζ或CD44-CD3ζ。在一些实施方案中，截短型(非信号转导的)人CD19(tCD19)也可在与所述CAR相同的载体中表达，诸如通过使用2A共表达系统，所述tCD19可充当追踪和纯化经转导的T细胞的方式。在一些实施方案中，当施用给需要治疗的患者时，靶向ALS的经修饰Treg可进入脊髓。在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含标志物，诸如例如VLA4、LFA-1、CCR6或CXCR3。在一些示例性实施方案中，靶向ALS的经修饰的CAR，例如包含一种或多种抗mutSOD1 CAR的经修饰Treg，并且任选地将保留Treg表型和/或在表达一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM时引发至少一些Treg效应子功能。在示例性实施方案中，经修饰Treg可响应ALS蛋白和/或疾病的分子标志物而表达IL-10。
在一些示例性的实施方案中，根据本发明的经修饰Treg可分泌抗炎细胞因子，其可导致活化的小神经胶质细胞和/或巨噬细胞的抑制。所述分泌可由于ALS蛋白和/或疾病相关联标志物(诸如mutSOD1)刺激所述经修饰Treg所包含的一种或多种CAR而发生。在一些实施方案中，所述细胞因子可包含IL-10、IL-4或TGF-β。在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可减少和/或防止小神经胶质细胞产生神经毒性自由基和炎性细胞因子。在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可用于治疗ALS的方法中，并且与对照治疗相比，所述方法可导致以下中的一者或多者：较少的巨噬细胞介导的运动神经元死亡；较少的IL-1β、TNF-α、一氧化氮和/或自由基(超氧阴离子)；以及更多量的IL-10、IL-4和TGF-β。
在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向C9orf72的短同源异构体(sC9orf72)的CAR，该异构体与mutSOD1一样可在ALS中的运动神经元上或附近表达。在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向sC9orf72的CAR，其中所述CAR可包含针对sC9orf72的人scFV。在一些特定的示例性实施方案中，靶向sC9orf27的CAR可包含使用来自独特的人αsC9orf72的VH和VL序列的抗sC9orf72 CAR。在一些实施方案中，每个αsC9orf72 scFv的所述VL c末端可与人CD28铰链、跨膜和胞质结构域融合，随后是人CD3ζ胞质结构域，以产成可由经修饰Treg包含的抗sC9orf72 CAR。在一些实施方案中，非信号转导的截短型人CD19(tCD19)可以在包含所述CAR的载体上充当转导标志物。在示例性实施方案中，靶向sC9orf72的经修饰Treg可抑制小神经胶质细胞介导的运动神经元退变；减低IL-1β、TNF-α、一氧化氮；和/或增加IL-10、IL-4和TGF-β，诸如当施用给需要治疗的患者时。
在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向ALS的经修饰Treg，诸如包含抗mutSOD1 CAR的经修饰Treg，并且所述经修饰Treg可进入脊髓实质，识别积聚的脊髓mutSOD1蛋白，并通过产生抗炎介体来反应。当施用给需要治疗的患者时，所述经修饰Treg可减低炎性介体(例如，CCL2、CCL3、CCL4、TNF-α、IL1β、NOX2)的表达，并增加抗炎介体(例如，IL-10、IL-4和TGF-β)的表达。此外，当用于ALS的治疗方法中时，靶向ALS的经修饰Treg(诸如包含抗mutSOD1 CAR的经修饰Treg)可抑制运动神经元周围持续的和/或神经毒性的炎症。
此外，在其他示例性实施方案中，经修饰Treg可靶向与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质和/或分子标志物。在一些示例性实施方案中，所述经修饰Treg可包含一种或多种靶向所述蛋白质和/或标志物的CAR。在一些实施方案中，所述蛋白质和/或标志物可包含β淀粉样蛋白(Aβ)，特别是寡聚Aβ，和/或扭转tau蛋白纤维的神经内缠结。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG01(SEQ ID NO：1)的序列，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG02(SEQ ID NO：2)的序列，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG03(SEQ ID NO：3)的序列，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG04(SEQ ID NO：4)的序列，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG01-CD28-CD3ζ(SEQ IDNO：20)、DG02-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：21)、DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22)、DG04-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：23)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，其中所述构建体每一者均靶向β淀粉样蛋白。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO：22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO：45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO：46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO：47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO：48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO：49)；和/或DG03-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQID NO：50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，其中所述构建体每一者均靶向β淀粉样蛋白。
在示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向Aβ肽，并且可使用来自抗体(例如人和/或人源化抗体)的单链可变片段(scFv)序列包含抗Aβ CAR，所述抗体具有对Aβ(例如寡聚Aβ)的不同结合特异性。在示例性实施方案中，所述scFv可融合至人CD28铰链、跨膜和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域。所述CAR可在抗原结合和交联时触发初级信号转导(CD3ζ)和共刺激信号转导(CD28)。在一些实施方案中，截短型(非信号转导的)CD19(tCD19)也可在包含所述CAR的相同载体中表达，诸如通过使用T2A共表达系统，并且它可以充当追踪和纯化经转导的T细胞的手段。在一些实施方案中，包含抗Aβ CAR的经修饰Treg可抑制CD3活化的同种异体CD8+ T细胞的增殖。此外，在一些实施方案中，当用寡聚Aβ活化时，包含抗Aβ CAR的经修饰Treg可产生抗炎细胞因子，例如IL-10。此外，所述经修饰Treg可抑制促炎介体的产生，并且可增强活化的小神经胶质细胞或巨噬细胞的吞噬能力，诸如通过分泌例如IL-10、TGF-β和IL-4抗炎细胞因子。在一些示例性实施方案中，表达寡聚Aβ特异性CAR的根据本发明的经修饰Treg在寡聚Aβ可积聚的区域中可具有靶向的抗炎活性和神经保护效应。在一些示例性实施方案中，例如表达寡聚Aβ特异性CAR的经修饰Treg可迁移至寡聚Aβ可在其中积聚的海马。
此外，在一些示例性实施方案中，包含抗Aβ CAR的经修饰Treg可运输并积聚至Aβ沉积物和神经炎症的脑区域，其中此类区域可包括海马和额叶皮质中Aβ沉积物的位点。在一些实施方案中，包含靶向阿尔茨海默氏病的CAR的经修饰Treg可在所述脑区域中积聚，并可致使人抗炎细胞因子IL-10、TGF-β和IL4在所述区域中表达增加。这些抗炎细胞因子可致使促炎介体的表达减低和小神经胶质细胞数量减低。在一些示例性实施方案中，包含靶向阿尔茨海默氏病的CAR的经修饰Treg可改善用所述经修饰Treg治疗的患者的记忆功能。
下文将更详细地论述经修饰Treg的具体特征和/或经修饰Treg可包含的具体特征和/或经修饰Treg的靶标可包含的具体特征。
CAR
在示例性实施方案中，经修饰Treg可包含靶向神经退行性疾病或病症的一种或多种CAR，如上文和下文所论述的。在一些示例性实施方案中，一种或多种CAR可包含结合至与神经退行性疾病或病症相关联的靶分子的AB结构域。AB结构域在下文进一步论述。
抗原结合(AB)结构域
AB结构域可源自与靶分子结合的多肽。在一些实施方案中，该多肽可系与靶分子结合的受体或受体的一部份。在另一个实施方案中，AB结构域可源自与靶分子结合的配体。
在另一个实施方案中，AB结构域可源自与靶分子结合的抗体(Ab)或其抗原结合片段。Ab或其抗原结合片段的实例包括但不限于单克隆抗体；单特异性抗体；多特异性抗体；人源化抗体；四聚抗体；四价抗体；多特异性抗体；单链抗体；结构域特异性抗体；单结构域抗体(dAb)；结构域缺失抗体；scFc融合蛋白；嵌合抗体；合成抗体；重组抗体；杂合抗体；突变抗体；CDR移植抗体；包含抗原结合片段(Fab)、F(ab’)2、Fab’片段、可变片段(Fv)、单链抗体片段、单链Fv(scFv)、Fd片段、dAb片段的抗体片段；双抗体；纳米抗体；二价纳米抗体；鲨鱼可变IgNAR结构域；VHH抗体；骆驼科动物抗体和微抗体。在一个特定的实施方案中，AB结构域包含单链抗体片段，所述单链抗体片段包含可变重链区和/或可变轻链区，诸如scFv。在另一个特定的实施方案中，AB结构域包含纳米抗体。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部份或轻链可变结构域的全部或部份的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。
抗体片段可以通过多样技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，诸如包含天然不存在的构造的片段，诸如具有通过合成接头(诸如肽接头)接合的两个或更多个抗体区或链的那些片段，和/或可不通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，Ab片段是scFv。在一些方面，Ab片段是纳米抗体。
在一些方面，AB结构域可源自具有一个或多个特异性功能特征(诸如结合特性，包括结合至特定表位诸如与其他抗体的表位类似或重叠的表位)的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，AB包含scFv，所述scFv包含对靶分子具有特异性的抗体的CDR序列。CDR可使用常规方法确定。给定的CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用数个众所周知的方案中的任一种容易地确定，包括由以下描述的方案：Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”第5版.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，“(1997)J.Mol.Biol.273，927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，“Antibody-antigen interactions：Contact analysisand binding site topography，”J.Mol.Biol.262，732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc M P等人，“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains，”Dev Comp Immunol，2003年1月；27(1)：55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegger A和Pluckthun A，“Yet anothernumbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automatic modelingand analysis tool，”J Mol Biol，2001年6月.8；309(3)：657-70(Aho编号方案)。
在一些实施方案中，包含AB结构域的序列进一步包含前导序列或信号序列。在AB结构域包含scFv的一些实施方案中，前导序列可位于scFv的氨基末端。在重链可变区为N-末端的一些实施方案中，前导序列可位于重链可变区的氨基末端。在轻链可变区为N-末端的一些实施方案中，前导序列可位于轻链可变区的氨基末端。前导序列可包含任何合适的前导序列。在本发明的一些实施方案中，前导序列的氨基酸序列可包含如SEQ ID NO：31中所示的序列，或由如SEQ ID NO：231中所示的核酸序列编码的序列。在本发明的分离的细胞的成熟形式中，前导序列可不存在。
铰链
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述CAR可在AB结构域和TM结构域之间包含铰链序列。本领域普通技术人员将理解，铰链序列是利于柔性的短氨基酸序列(参见，例如，Woof等人，Nat.Rev.Immunol.，4(2)：89-99(2004))。铰链序列可以为源自或获得自任何合适分子的任何合适的序列。在一些实施方案中，可基于CAR胞外部份的期望长度来优化铰链序列的长度，所述CAR胞外部份的期望长度可基于表位在靶分子内的位置。例如，如果表位在靶分子内的膜近端区域中，则较长的铰链可系最佳。
在一些实施方案中，铰链可源自或包括免疫球蛋白Fc区(例如，IgG1 Fc区、IgG2Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgE Fc区、IgM Fc区或IgA Fc区)的至少一部份。在一些实施方案中，铰链包括落入其CH2和CH3结构域内的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA免疫球蛋白Fc区的至少一部份。在一些实施方式中，铰链还可包括相应免疫球蛋白铰链区的至少一部份。在一些实施方案中，铰链源自或包括经修饰的免疫球蛋白Fc区(例如，经修饰的IgG1 Fc区、经修饰的IgG2 Fc区、经修饰的IgG3 Fc区、经修饰的IgG4 Fc区、经修饰的IgEFc区、经修饰的IgM Fc区或经修饰的IgA Fc区)的至少一部份。经修饰的免疫球蛋白Fc区可具有一个或多个突变(例如，点突变、插入、缺失、重覆(duplication))，从而导致会造成铰链与Fc受体(FcR)的结合受损的一个或多个氨基酸置换、修饰或缺失。在一些方面，可设计经修饰的免疫球蛋白Fc区具有一个或多个突变，所述突变导致会造成铰链与一种或多种FcR(包括但不限于FcγRI、FcγR2A、FcγR2B1、Fcγ2B2、Fcγ3A、Fcγ3B、FcεRI、FcεR2、FcαRI、Fcα/μR或FcRn)的结合受损的一个或多个氨基酸置换、修饰或缺失。
在一些方面，免疫球蛋白恒定区的一部份充当AB结构域(例如scFv或纳米抗体)与TM结构域之间的铰链。与不存在铰链的情况相比，铰链可以具有提供抗原结合后CAR表达细胞的响应性增加的长度。在一些实例中，铰链的长度为12个或约12个氨基酸或长度不超过12个氨基酸。示例性的铰链包括具有以下的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，包括所列范围任一者的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，铰链具有约12个氨基酸或更少、约119个氨基酸或更少、或约229个氨基酸或更少。示例性的铰链包括CD28铰链、单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链、或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性的铰链包括但不限于在以下中描述的那些：Hudecek等人，(2013)Clin.Cancer Res.，19：3153；公开号为WO2014031687的国际专利申请；美国专利No.8,822,647或已公开的申请No.US2014/0271635。
在一些实施方案中，铰链序列源自CD8α分子、DAP10分子、CD8a分子或CD28分子。在一个优选的实施方案中，铰链序列源自CD28。在一个实施方案中，铰链包含人CD28铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)或由SEQ ID NO：232编码的序列。在一些实施方案中，铰链具有与SEQ ID NO：32至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链包含小鼠CD28铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)或由SEQ ID NO：233编码的序列。在一些实施方案中，铰链具有与SEQ ID NO：33至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，铰链包含人CD8A铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)或由SEQ ID NO：234编码的序列。在一些实施方案中，铰链具有与SEQ ID NO：34至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，铰链包含人DAP10铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)或由SEQ ID NO：235编码的序列。在一些实施方案中，铰链具有与SEQ ID NO：35至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
跨膜(TM)结构域
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述CAR可包含TM结构域。关于TM结构域，可以将CAR设计为包含与CAR的AB结构域融合的TM结构域。铰链序列可插入在AB结构域和TM结构域之间。在一些实施方案中，使用天然与CAR中的其中一个结构域相关联的TM结构域。在某些情况下，可以通过氨基酸置换来选择或修饰TM结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小。
TM结构域可源自天然的或合成的来源。如果来源是天然的，则该结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。典型地，TM结构域表示跨膜蛋白(也称为整合蛋白)的单个跨膜α螺旋。在本发明中具有特定用途的TM结构域可源自以下(即至少包括以下的跨膜区)：CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、Dap10、CD44、CTLA-4、TCRα、TCRβ或CD3ζ(SEQ ID NO：16，其可由SEQ ID NO：216编码)和/或含有它们的功能变体的TM结构域，诸如保留它们实质部份结构(例如跨膜)特性的那些。
作为另外一种选择，TM结构域可为合成的，在这种情况下，TM结构域将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体将出现于合成TM结构域的每个末端。本发明的TM结构域在膜中是热力学稳定的。其可系单个α螺旋、跨膜β桶、短杆菌肽A的β螺旋或任何其他结构。跨膜螺旋通常长约20个氨基酸。
在一些优选的实施方案中，CAR中的TM结构域可源自CD28的TM区。在一个实施方案中，TM结构域包含人CD28 TM的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)或由SEQ ID NO：236编码的序列。在一些实施方案中，TM结构域包含与SEQ ID NO：36至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，TM结构域包含小鼠CD28 TM的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)或由SEQ ID NO：237编码的序列。在一些实施方案中，TM结构域包含与SEQ ID NO：37至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，TM结构域包含人CD8A TM的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)或由SEQ ID NO：238编码的序列。在一些实施方案中，TM结构域包含与SEQ ID NO：38至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，TM结构域包含人DAP10TM的氨基酸序列(SEQ IDNO：39)或由SEQ ID NO：239编码的序列。在一些实施方案中，TM结构域包含与SEQ ID NO：39至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
任选地，短的寡肽或多肽间隔区(优选长度在2至10个氨基酸之间)可形成CAR的TM结构域和ICS结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体可提供合适的间隔区。
胞内信号转导(ICS)结构域和共刺激(CS)结构域
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述CAR可包含ICS和/或CS结构域。CAR的ICS结构域或者胞质结构域可触发或引发已设置CAR的细胞的至少一种正常功能(例如细胞因子的分泌)的活化。因此，术语“胞内信号转导结构域”或“ICS结构域”是指蛋白质的一部份，其转导功能信号并引导细胞执行专门的功能。尽管通常可以采用整个ICS结构域，但在许多情况下，使用整条链不必要。就使用胞内信号转导结构域的截短部份而言，只要其转导功能信号，就可使用该截短部份来代替完整链。术语“胞内信号转导结构域”或“ICS结构域”因而意指包括足以转导功能信号的ICS结构域的任何截短部份。
仅通过一个ICS结构域生成的信号对于完全活化细胞可系不足，且次级信号或共刺激信号可还是所需的。在此类情况下，共刺激结构域(CS结构域)可被包括在CAR的胞质部份中。CS结构域是转导此类次级信号或共刺激信号的结构域。任选地，CAR可包括两个或更多个CS结构域。CS结构域可设置在ICS结构域的上游或ICS结构域的下游。
例如，T细胞活化可以说是由两类不同类型的胞质信号转导序列介导的：通过T细胞受体(TCR)起始抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞质信号转导序列)和以抗原非依赖性的方式发挥作用来提供次级信号或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号转导序列)。初级胞质信号转导序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式发挥作用的初级胞质信号转导序列可含有信号转导基序，该基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。CAR的ICS或CS结构域中可含有此类胞质信号转导序列。
特别有用的含ITAM的初级胞质信号转导序列的实例可包括源于以下各者的ICS结构域的那些：淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fc受体亚基、IL-2受体亚基、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66d、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10和DAP12。
在一些实施方案中，CAR中的ICS结构域可包含源于CD3ζ的胞质信号转导序列。在一些实施方案中，ICS结构域包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列或由SEQ ID NO：216编码的序列。在一些实施方案中，ICS结构域包含与SEQ ID NO：16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
已报道多样CS结构域赋予不同的特性(Gacerez等人，J.Cell.Physiol.231：2590-2598，2016)。例如，据报道4-1BB CS结构域在一些体内异种移植模型中表现出增强的持续性(Milone等人.Mol Ther 2009；17：1453-1464；Song等人.Cancer Res 2011；71：4617-4627)。此外，这些不同的CS结构域产生不同的细胞因子谱，其继而对靶细胞介导的细胞毒性和疾病微环境产生不同的效应。
共刺激分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、Toll配体受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8 α、CD8 β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CRTAM、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、与CD83特异性结合的配体和类似者。
CAR的ICS结构域和CS结构域可用无规顺序或指定顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2至10个氨基酸之间)可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
进一步修饰
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含一种或多种CAR，并且所述CAR可包含进一步修饰。在一些实施方案中，可以对一种或多种CAR、编码所述CAR的核苷酸序列、编码所述CAR的载体以及包含编码所述CAR的核苷酸序列的细胞进行进一步修饰、工程改造、优化或增补，以提供或选择多样特征。这些特征可包括但不限于功效、持续性、靶标特异性、减少的免疫原性、多靶向、增强的免疫应答、扩增、生长、减少的脱靶效应、减少的受试者毒性、检测、选择、靶向和类似者。例如，所述细胞可经工程改造以表达另一种CAR，或用以具有自杀机制，并且可经修饰以移除或修饰内源受体或分子(诸如TCR和/或MHC分子)的表达。
在一些实施方案中，编码CAR的载体或核酸序列进一步编码其他基因。可使用大量技术(包括两种或多种质粒的共转染、多个启动子或双向启动子的使用、或者产成双顺反子载体或多顺反子载体)构建所述载体或核酸序列，以允许多种基因的共表达。多顺反子载体的构建可包括编码IRES元件或2A肽，诸如T2A、P2A(其氨基酸序列可包含SEQ ID NO：15，该氨基酸序列可由SEQ ID NO：215编码)、E2A或F2A(例如，参见Kim，J.H.等人，“Highcleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 inhuman cell lines，zebrafish and mice”，PLoS One.2011；6(4))。在一些实施方案中，使用T2A核糖体跳跃序列，编码CAR的核酸序列或载体进一步编码tCD19。在一个实施方案中，T2A核糖体跳跃序列包含SEQ ID NO：214中所示的核酸序列。在一个实施方案中，T2A核糖体跳跃序列包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
根据本发明的经修饰Treg所包含的CAR任选地可进一步经修饰以改善针对表达靶分子的细胞的功效。在一些实施方案中，可通过小神经胶质细胞活化的减低、炎性应答减低的和/或神经元死亡的减低来测量改善的功效。在一些实施方案中，包含一种或多种CAR的经修饰Treg可进一步包含不止一种CAR。额外的CAR可对第一CAR的靶分子具有特异性，也可对其不具有特异性。在一些实施方案中，所述一种或多种额外的CAR可作为抑制性或活化性CAR发挥作用。在一些方面，一些实施方案的CAR是刺激性或活化性CAR；在其他方面，其为共刺激CAR。在一些实施方案中，经修饰Treg可进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine，2013年12月；5(215)：215ra172)，诸如识别除第一CAR的靶分子以外的抗原的CAR，从而通过抑制性CAR与其配体的结合修饰或改变通过第一CAR递送的活化信号，例如用以减少脱靶效应。
载体或构建体
本公开还提供载体或构建体，诸如质粒或逆转录病毒构建体，所述载体或构建体中可插入DNA，诸如编码CAR者。源自逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是达到长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定地整合以及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体与源自癌逆转录病毒的载体(诸如鼠白血病病毒)相比具有添加优势，因为它们可以转导非增殖性细胞(诸如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的添加优势。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达可典型地通过将编码CAR多肽或其部份的核酸可操作地连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来达到。该载体可以合适于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有对调控所期望核酸序列的表达有用的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
使用标准的基因递送方案，本发明的表达构建体还可用于核酸免疫和基因疗法。基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,399,346、No.5,580,859、No.5,589,466，通过引用整体并入本文。
可以将核酸克隆到数个类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体(probe generation vector)和测序载体。
此外，表达载体可用病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且例如在Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)以及在其他病毒学和分子生物学手册中描述。作为载体有用的病毒包括但不限于逆转录病毒、γ-逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus)、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利No.6,326,193)。
已经开发了数个基于病毒的系统供基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装于逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送至受试者的细胞。数个逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。数个腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点(start site)上游30-110bp区域，但最近已显示出数个启动子在起始位点下游含有功能元件(functional element)。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加到50bp远，然后活性开始下降。取决于启动子，看来个别元件可以协同或独立地起作用以活化转录。
可以使用多样启动子序列，包括但不限于即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV-肌动蛋白-球蛋白杂合(CAG)启动子、延伸生长因子-1α(EF-1α)、猿猴病毒40(SV40)、早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒即刻早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。还设想使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供一种分子开关，该分子开关能够开启与其有效连接的多核苷酸序列的表达(在期望此类表达时)，或者在不期望表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部份的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有可选择的标志基因或报告基因或这二者，以利于从寻求通过病毒载体进行转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可携带在DNA分别段片上并用于共转染程序。可选择的标志物和报告基因都可侧接适当的调控序列，以使得能在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo和类似者。
在一些实施方案中，可选择的标志基因包含编码截短型CD19(trCD19)的核酸序列。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调控序列的功能性。通常，报告基因是这样一种基因：在受体生物体或组织中不存在或不表达，并且编码多肽，所述多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如酶活性)来表现。在已将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBSLetters 479：79-82)。合适的表达系统是众所周知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。通常，将显示出报告基因生物最高表达水平的具有最小5’旁侧区的构建体鉴定为启动子。可将此类启动子区与报告基因连接，并用于评价作用剂(agent)用以调节启动子驱动的转录的能力。
Treg的转导
将基因引入细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的语境中，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
Treg细胞
在扩增和基因修饰之前，可以通过多样的非限制性方法从受试者获得细胞源。可以从数个非限制性来源获得细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和疾病部位。在一些实施方案中，可使用本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在一些实施方案中，细胞可以源自健康的供体或源自被诊断出患有神经退行性疾病或病症的患者。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个处理步骤的样品，所述处理步骤诸如分隔、离心、基因工程改造(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或温育。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括源自其的经加工样品。
在一些方面，细胞所源自或分离的样品是血液或源自血液的样品，或者是单采血液成分法产物或源自单采血液成分法产物。示例性的样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、神经组织、淋巴结、肠相关联淋巴组织、粘膜相关联淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或源自其的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的语境中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
细胞纯化
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分隔步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或温育细胞，例如用以移除不希望有的组分，富集所期望组分，裂解或移除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种特性，诸如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性来分隔细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如用以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中供后续的处理步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是根据制造商的说明通过半自动化的“流通式”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter公司)完成的。在一些方面，根据制造商的说明通过切向流过滤(TFF)来完成洗涤步骤。在一些实施方案中，在洗涤后将细胞重悬于多种生物相容的缓冲液中，诸如例如，不含Ca++/Mg++的PBS。在某些实施方案中，移除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特异性分子的表达或存在来分隔不同细胞类型，所述特异性分子为诸如表面标志物(例如表面蛋白)、细胞内标志物或核酸。在一些实施方案中，表面标志物是trCD19。在一些实施方案中，可使用基于此类标志物的任何已知的分隔方法。在一些实施方案中，分隔是基于亲和力或免疫亲和力的分隔。例如，在某些方面，分离包括基于细胞的一种或多种标志物(典型地是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分隔细胞和细胞群体，例如通过与特异性结合至此类标志物的抗体或结合伴侣一起温育，随后通常是洗涤步骤，并将已与抗体或结合伴侣结合的细胞与未与抗体或结合伴侣结合的细胞分隔。
此类分隔步骤可以是基于其中已与试剂结合的细胞被保留以供进一步使用的正选择，和/或其中未与抗体或结合伴侣结合的细胞被保留的负选择。在一些实例中，两个级分均保留以供进一步使用。在一些方面，在没有对异质群体中的细胞类型特异性鉴别的抗体可用的情况下，负选择可以特别有用，从而分隔最好是基于除所期望群体以外的细胞所表达的标志物来进行。
在一些实施方案中，进行多轮分隔步骤，其中使来自一个步骤的经正选择或负选择的级分接受另一分隔步骤，诸如后续的正选择或负选择。在一些实例中，单个分隔步骤可以同时耗减表达多种标志物的细胞，诸如通过将细胞与多种抗体或结合伴侣一起温育，每种抗体或结合伴侣对负选择所靶向的标志物具有特异性。同样，可以通过将细胞与多种抗体或在多样细胞类型上表达的结合伴侣一起温育，来同时正向选择所述多个细胞类型。
在一些实施方案中，通过正选择富集特定细胞群体或通过负选择耗减特定细胞群体来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起温育来完成正选择或负选择，所述抗体或其他结合剂与分别在正选择或负选择的细胞上表达的一种或多种表面标志物(标志物+)或以相对较高水平表达的一种或多种表面标志物(标志物高)特异性结合。
在一些实施方案中，可如下分离、扩增和转导Treg：可经由两步负和正选择方案从人PBMC分离细胞。首先，利用负选择分离CD4+细胞，随后是对CD25hi+细胞进行正选择以分离CD4+CD25hi+Treg细胞。所分离的CD4+CD25hi+Treg可在Treg生长培养基中培养两周期间，并用抗CD3、抗CD28、抗CD2多聚体或抗CD3、抗CD28多聚体(StemCell公司ImmunoCult)与人IL-2(300U/ml至500U/ml)活化。在第9天，可以将Treg细胞冷冻保存以备后用，因此我们可以在多个时机测试同一供体和制备物以评估测定法变异性。
在一些方面，将待分隔的细胞样品或组合物与小的可磁化的或磁响应的材料一起温育，所述材料诸如磁响应的颗粒或微粒，诸如顺磁珠(例如，诸如Dynalbeads或MACS珠)。磁响应材料(例如颗粒)通常直接或间接附接至结合伴侣(例如抗体)，该结合伴侣特异性结合至期望分隔(例如期望进行负选择或正选择)的单个细胞、多个细胞或细胞群体上存在的分子(例如表面标志物)。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠子包含结合至特异性结合成员(诸如抗体或其他结合伴侣)的磁响应材料。有许多众所周知用于磁分隔方法中的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday的美国专利No.4,452,773以及在欧洲专利说明书EP 452342 B中描述的那些，特此通过引用并入本文。胶体大小的颗粒，诸如在Owen的美国专利No.4,795,698中描述的那些，且Liberti等人的美国专利No.5,200,084公开了此类颗粒的其他实例。
温育通常在这样的条件下进行：在该条件下，抗体或结合伴侣，或者特异性结合至此类抗体或结合伴侣的分子，诸如二抗或其他试剂，其附接至磁性颗粒或磁珠，特异性地结合至细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)。
在一些方面，将样品置于磁场中，具有磁响应颗粒或可磁化颗粒与其附接的那些细胞将会被吸引到磁体上，并与未标记的细胞分隔。对于正选择，保留吸引至磁铁的细胞；对于负选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行正选择和负选择的组合，其中正级分和负级分经保留并进一步处理或接受进一步的分隔步骤。
在一些实施方案中，将磁响应颗粒包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在一些实施方案中，磁性颗粒通过包被对一种或多种标志物具有特异性的一抗而附接至细胞上。在一些实施方案中，用一抗或结合伴侣标记细胞而不是珠子，然后添加细胞类型特异性的二抗或其他结合伴侣(例如，链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在一些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗连同使用。
在一些实施方案中，让磁响应颗粒留下附接至后续待温育、培养和/或工程改造的细胞上；在一些方面，让颗粒留下附接至细胞上以供施用给患者。在一些实施方案中，从细胞中移除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中移除可磁化颗粒的方法是已知的，且包括例如是使用竞争性的未标记抗体、与可切除接头缀合的可磁化颗粒或抗体等等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，使用进行所述方法的分离、细胞制备、分隔、加工、温育、培养和/或配制步骤中的一者或多者的系统、装置或设备来进行分离或分隔。在一些方面，该系统用于在封闭或无菌环境中执行这些步骤中的每一者，例如用以使误差、用户处理和/或污染最小。在一个实例中，该系统是如公开号为WO2009/072003的国际专利申请或US20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，该系统或设备以集成的或自含式系统和/或以自动化或可编程的方式进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一者或多者，例如全部步骤。在一些方面，该系统或设备包括与该系统或设备通讯的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程改造和配制步骤的效果进行编程、控制、评估，和/或调整处理、分离、工程改造和配制步骤的多样方面。
在一些实施方案中，本文所述的细胞群体经由流式细胞术收集和富集(或耗减)，在流式细胞术中于流体流中携带对于多种细胞表面标志物被染色的细胞。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选而收集并富集(或耗减)本文所述的细胞群体。在一些实施方案中，通过结合基于FACS的检测系统使用微机电系统(MEMS)芯片来收集和富集(或耗减)本文所述的细胞群体(参见，例如，WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10，1567-1573；以及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5)：355-376)。在这两种情况下，都可以用多种标志物标记细胞，从而允许高纯度分离明确定义的T细胞亚群。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测的标志物标记抗体或结合伴侣，以利于供正选择和/或负选择的分隔。例如，分隔可基于与经荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，基于对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的抗体或其他结合伴侣的结合的细胞分隔在流体流中进行，诸如通过荧光活化细胞分选术(FACS)，包括制备级(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞仪检测系统相结合。此类方法允许同时基于多种标志物进行正选择和负选择。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分隔方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白血细胞。
在任何上述分隔步骤中，分隔不必导致100％富集或移除特定细胞群体或表达特定标志物的细胞。例如，对特定类型的细胞(诸如表达标志物的那些细胞)的正选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致不表达所述标志物的细胞的完全不存在。同样，对特定类型的细胞(诸如表达标志物的细胞)的负选择、移除或耗减是指减低此类细胞的数量或百分比，但不必导致完全移除所有此类细胞。
细胞制备和扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括培育、温育、培养和/或基因工程改造步骤。例如，在一些实施方案中，所提供的是用于温育和/或工程改造经耗减的细胞群体的方法和培养起始组合物。
因此，在一些实施方案中，将细胞群体在培养起始组合物中温育。温育和/或工程改造可在培养皿器诸如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器中进行。
在一些实施方案中，在基因工程改造之前或与基因工程改造相连对细胞进行温育和/或培养。温育步骤可以包括培养、培育、刺激、活化和/或繁殖。
在一些实施方案中，将组合物或细胞在存在刺激条件或刺激剂的情况下温育。此类条件包括设计用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，用于模拟抗原暴露，和/或用于使细胞易感化以供基因工程改造(诸如供引入重组抗原受体)的那些条件。可以在细胞进行基因修饰之前或之后，使用在例如但不限于美国专利No.6,352,694；No.6,534,055；No.6,905,680；No.6,692,964；No.5,858,358；No.6,887,466；No.6,905,681；No.7,144,575；No.7,067,318；No.7,172,869；No.7,232,566；No.7,175,843；No.5,883,223；No.6,905,874；No.6,797,514；No.6,867,041；和美国专利申请公开No.20060121005中大致描述的方法来活化和扩增本文所论述的细胞。条件可以包括以下中的一者或多者：特定培养基、温度、氧气含量、二氧化碳含量、时间、作用剂(例如营养素、氨基酸、抗生素、离子)、和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体)以及设计用于活化细胞的任何其他作用剂。
可以体外或体内扩增Treg。在一些实施方案中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增本发明的经分离的细胞。还可以在将细胞施用给受试者后，在体内扩增细胞，例如在受试者血液中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、温育和/或工程改造之前或之后冷冻的步骤，例如冷冻保存细胞。在一些实施方案中，冷冻和后续的解冻步骤移除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上移除单核细胞。在一些实施方案中，将细胞悬浮于冷冻溶液中(例如在洗涤步骤之后)以移除血浆和血小板。在一些方面，可使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任一者。一个实例涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。然后将此用介质以1:1稀释，以使DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以每分钟1度的速率冷冻至-80摄氏度，并储存在液氮储罐的蒸汽相中。
使用根据本发明的经修饰Treg的方法
在示例性实施方案中，神经退行性疾病、病症和/或障碍的治疗可包含施用有效量的一种或多种本文所公开的经修饰Treg。在示例性实施方案中，通过施用一种或多种类型的根据本发明的经修饰Treg(例如，其中此类Treg可包括表达不同的CAR和/或NDDM的那些Treg)来治疗神经退行性疾病可在表达蛋白质和/或分子标志物的位点(即患病组织)处导致炎症减低、小神经胶质细胞活性的调节(modulation)和/或减低的神经元损害。在示例性实施方案中，可将根据本发明的经修饰Treg施用给需要治疗的患者，其中所述经修饰Treg可通过静脉内注射、皮下注射、腔内注射、心室内注射、颅内注射或鞘内注射施用。示例性的治疗方法通常包含施用有效量的一种或多种经修饰Treg，其中包含所述经修饰Treg的此类治疗可调节局部炎症或神经元存活。在一些实施方案中，所述调节可通过表达特异性分子而发生，所述特异性分子例如NDMM，例如抗氧化剂，例如神经元生长和/或存活因子。
在示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg(例如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)可用于治疗帕金森氏病的方法中。所述靶向帕金森氏病的经修饰Treg可包含一种或多种CAR，其中所述一种或多种CAR可靶向α-突触核蛋白原纤维。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG08的序列(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG09的序列(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG10的序列(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，靶向α-突触核蛋白的CAR可包含DG11的序列(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG08-CD28-CD3ζ(SEQID NO:27)、DG09-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:28)、DG10-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:29)和/或DG11-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:30)，其中每个构建体均靶向α-突触核蛋白。在进一步示例性实施方案中，经修饰Treg(诸如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)可用于治疗帕金森氏病，并且可靶向一种或多种神经毒性炎症介体，例如，由活化的小神经胶质细胞产生的神经毒性炎症介体。所述经修饰Treg可减低和/或抑制小神经胶质细胞活化。在示例性实施方案中，靶向帕金森氏病的经修饰Treg可在PD中的多巴胺神经元退变的疾病位点含有所靶向的抗炎和神经保护治疗活性。在一些实施方案中，靶向帕金森氏病的经修饰Treg可仅在α-突触核蛋白原纤维的存在位点处介导其功能。
此外，靶向帕金森氏病的经修饰Treg可用于治疗帕金森氏病的方法中，其中所述经修饰Treg可包含靶向帕金森氏病的一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM，并且进一步其中所述一种或多种CAR包含单链可变片段，诸如针对人α-突触核蛋白原纤维的人和小鼠单克隆抗体的VH和VL氨基酸序列(诸如例如，源自克隆NI 202.3G12、NI 202.12F4、NI202.21D11和mAb49/G的氨基酸序列)。在示例性实施方案中，靶向帕金森氏病的经修饰Treg可包含所述scFV且进一步包含构建体，该构建体包含CD28-CD3ζ CAR，即scFv-CD28-CD3ζCAR，其中所述scFv对人α-突触核蛋白原纤维具有特异性。包含所述scFv的构建体可包含VH+VL和VL+VH构造。
在示例性实施方案中，根据本发明的经修饰Treg(例如包含一种或多种CAR的经修饰Treg)可用于治疗ALS的方法中。靶向帕金森氏病的所述经修饰Treg可包含靶向ALS的一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM。所述经修饰Treg可靶向mutSOD1，例如，所述经修饰Treg可包含靶向mutSOD1的一种或多种CAR。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG05的序列(SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG06的序列(SEQID NO:6)。在一些实施方案中，靶向mutSOD1的CAR可包含DG07的序列(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:24)、DG06-CD28-CD3ζ(SEQID NO:25)和/或DG07-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:26)，其中每种构建体均靶向mutSOD1。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；和/或DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，其中所述构建体每一者均靶向mutSOD1。在一些实施方案中，在包含了包含使用经修饰Treg治疗ALS的方法中，经修饰Treg可在产生mutSOD1的运动神经元的位点和/或炎症位点处被活化，从而导致所述疾病位点的炎症减少。
在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-28-3ζ；DG05-28tm-10-3ζ；DG05-28tm-44-3ζ；DG05-28tm-3ζ；和/或DG05-28中的任一者或多者，并且所述经修饰Treg可响应mSOD1抗原而产生IL-10。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-28-3ζ；DG05-28tm-10-3ζ；DG05-28tm-44-3ζ；DG05-28tm-3ζ；和/或DG05-28中的任一者或多者，并且与未暴露于mSOD1的经修饰Treg相比，所述经修饰Treg可响应mSOD1抗原产生增加水平的IL-10。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ，并且与未暴露于mSOD1的经修饰Treg相比，所述经修饰Treg可响应mSOD1而具有增加的细胞表面标志物(诸如GITR、PD-1和/或CTLA-4)表达。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ，并且与未暴露于mSOD1抗原的经修饰Treg相比，所述经修饰Treg可响应mSOD1抗原(例如出现于脊髓组织中的mSOD1抗原)而产生IL-10。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ，并且与未用mSOD1抗原或抗CD3抗体刺激的经修饰Treg相比，当用mSOD1抗原和/或抗CD3抗体刺激时，所述经修饰Treg可抑制超氧化物生成。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG05-CD28-CD3ζ，并且与未用mSOD1抗原刺激的经修饰Treg相比，当用mSOD1抗原刺激时，所述经修饰Treg可抑制TNF-α产生。
在一些实施方案中，靶向ALS的经修饰Treg可用于治疗ALS的方法中，并且可包含靶向mutSOD1的CAR，并且在一些示例性实施方案中，所述CAR中的一者或多者的scFv可细胞外表达，其中VL的C末端融合至人CD28铰链、跨膜和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域，以产成抗mutSOD1-CD28-CD3ζCAR。在一些实施方案中，可通过用接头(诸如例如(G4S)3接头)连接重链可变区和轻链可变区，来构建靶向ALS的根据本发明的经修饰Treg所包含的CAR的scFv。在一些实施方案中，靶向ALS的经修饰Treg的CAR的VL的C末端可与人CD28铰链、跨膜和胞质结构域融合，并且可随后是人CD3ζ胞质结构域。所述靶向ALS的经修饰Treg的所述CAR可系例如抗mutSOD1 CAR。所述CAR可在抗原结合(例如mutSOD1的结合)时触发初级和共刺激信号转导。在一些实施方案中，由Treg表达的CAR可包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包括但不限于包含单独CD3ζ、4-1BB或CD28。在一些实施方案中，截短型(非信号转导的)人CD19(tCD19)也可在与所述CAR相同的载体中表达，诸如通过使用2A共表达系统，所述tCD19可充当追踪和纯化经转导的T细胞的方式。在一些实施方案中，治疗ALS的方法可包括使用靶向ALS的经修饰Treg，当施用给需要治疗的患者时，所述Treg可进入脊髓。在一些示例性实施方案中，靶向ALS的经修饰Treg可包含标志物，诸如例如VLA4、LFA-1、CCR6、CXCR3或促进神经元存活和/或功能性和/或延长T细胞功能的其他蛋白质。在示例性实施方案中，当表达一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM时，靶向ALS的经修饰的CAR(例如包含一种或多种抗mutSOD1 CAR的经修饰Treg)可保留Treg表型。在示例性实施方案中，当用于治疗ALS的方法中时，经修饰Treg可响应ALS蛋白和/或疾病的分子标志物而表达IL-10。
此外，根据本发明的治疗ALS的方法可包含使用经修饰Treg，其分泌抗炎细胞因子，从而导致抑制活化的小神经胶质细胞和/或巨噬细胞。所述分泌的发生可由用于ALS蛋白和/或疾病相关标志物(诸如mutSOD1)的所述经修饰Treg所表达的一种或多种CAR的刺激而导致。在一些实施方案中，所述细胞因子可包含IL-10、IL-4、TGF-β。在示例性实施方案中，当用于治疗ALS的方法中时，经修饰Treg可减少和/或防止小神经胶质细胞产生神经毒性自由基和炎性细胞因子。在一些示例性实施方案中，经修饰Treg可用于治疗ALS的方法中，并且与对照治疗相比，所述方法可导致以下中的一者或多者：较少的巨噬细胞介导的运动神经元死亡；较少的IL-1β、TNF-α和一氧化氮；以及更多量的IL-10、IL-4和TGF-β。在一些实施方案中，治疗ALS的方法可包含使用靶向C9orf72(sC9orf72)的经修饰Treg，且可达到相似的结果，并且可用类似于靶向mutSOD1的经修饰Treg的方式使用。
此外，根据本发明的一些治疗ALS的方法可包含使用经修饰Treg，其中所述经修饰Treg可包含抗mutSOD1 CAR，并且所述经修饰Treg可进入脊髓实质，识别积聚的脊髓mutSOD1蛋白，并通过产生抗炎介体来反应。当施用给需要治疗的患者时，所述经修饰Treg可减低炎性介体(例如，CCL2、CCL3、CCL4、TNF-α、IL1β、NOX2)的表达，并增加抗炎介体(例如，IL-10、IL-4和TGF-β)的表达。此外，当用于治疗ALS的方法中时，靶向ALS的经修饰Treg(诸如包含抗mutSOD1 CAR的经修饰Treg)可抑制运动神经元周围持续的和/或神经毒性的炎症。
在一些示例性实施方案中，经修饰Treg(例如包含一种或多种CAR的经修饰Tre)可用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中。所述经修饰Treg可靶向与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质和/或分子标志物。在示例性实施方案中，所述经修饰Treg可包含一种或多种靶向所述蛋白质和/或标志物的CAR。在一些实施方案中，所述蛋白质和/或标志物可包含β淀粉样蛋白(Aβ)，特别是寡聚Aβ，和/或扭转tau蛋白纤维的神经内缠结。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG01的序列(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG02的序列(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG03序列(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，靶向β淀粉样蛋白的CAR可包含DG04序列(SEQID NO:4)。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG01-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:20)、DG02-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:21)、DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO:22)和/或DG04-CD28-CD3ζ(SEQID NO:23)，其中每种构建体均靶向β淀粉样蛋白。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；和/或DG03-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQ ID NO:50)，其中所述构建体每一者均靶向β淀粉样蛋白。在示例性实施方案中，经修饰Treg所包含的CAR可靶向Aβ肽，并且可使用来自抗体(例如人和/或人源化抗体)的单链可变片段(scFv)序列来包含抗AβCAR，所述抗体有对Aβ(例如寡聚Aβ)的不同结合特异性。在某些示例性实施方案中，所述scFv可融合至人CD28铰链、跨膜结构域和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域。所述CAR可在抗原结合和交联时触发初级信号转导(CD3ζ)和共刺激信号转导(CD28)。在一些实施方案中，截短型(非信号转导的)CD19(tCD19)也可在包含所述CAR的相同载体中表达，诸如通过使用T2A共表达系统，并且它可以充当追踪和纯化经转导的T细胞的手段。在一些实施方案中，治疗阿尔茨海默氏病的方法中所用的包含抗Aβ CAR的经修饰Treg可抑制CD3活化的同种异体CD8+ T细胞的增殖。此外，在某些实施方案中，当用寡聚Aβ活化时，包含抗Aβ CAR的经修饰Treg当用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中时可产生抗炎细胞因子，例如IL-10。此外，当用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中时，所述经修饰Treg可抑制促炎介体的产生，并且可增强活化的小神经胶质细胞或巨噬细胞的吞噬能力，诸如通过分泌例如IL-10、TGF-β和IL-4抗炎细胞因子。在一些示例性实施方案中，当用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中时，表达寡聚Aβ特异性CAR的经修饰Treg可在寡聚Aβ可积聚的区域中具有靶向的抗炎活性和神经保护效应。在一些示例性实施方案中，当用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中时，根据本发明的经修饰Treg可迁移至寡聚Aβ可在其中积聚的海马。
在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG03-28-3ζ；DG03-28tm-10-3ζ；DG03-28tm-44-3ζ；和/或DG03-28tm-CD3ζ中的任一者或多者，并且与未暴露于Aβ抗原的经修饰Treg相比，所述经修饰Treg可响应所述Aβ抗原而产生IL-10。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ，并且与未暴露于Aβ抗原的经修饰Treg相比，所述经修饰Treg可响应所述Aβ抗原而产生增加水平的IL-10和/或IL-4，其可例如通过IL-10和/或IL-4的mRNA水平来测量，和/或通过ELISA测定法来测量。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ，并且与未用Aβ抗原或抗CD3抗体刺激的经修饰Treg相比，当用Aβ抗原抗原和/或抗CD3抗体刺激时，所述经修饰Treg可抑制超氧化物生成。在一些实施方案中，一种或多种经修饰Treg可包含DG03-CD28-CD3ζ，并且与未用Aβ抗原或抗CD3抗体刺激的经修饰Treg相比，当用Aβ抗原和/或抗CD3抗体刺激时，所述经修饰Treg可抑制IL-6产生。
此外，在一些示例性实施方案中，可用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中的经修饰Treg可包含抗Aβ CAR，并且可运输并积聚至Aβ沉积物和神经炎症的脑区域，其中此类区域可包括海马和额叶皮质中Aβ沉积物的位点。在一些实施方案中，当用于治疗阿尔茨海默氏病的方法中时，包含靶向阿尔茨海默氏病的CAR的经修饰Treg可在所述脑区域中积聚，并可致使人抗炎细胞因子IL-10、TGF-β和IL4在所述区域中表达增加。这些抗炎细胞因子可致使促炎介体的表达减低和小神经胶质细胞数量减低。在示例性实施方案中，包含靶向阿尔茨海默氏病的CAR的经修饰Treg可改善用所述经修饰Treg治疗的患者的记忆功能。
在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)的构建体，并且与不包含使用所述经修饰Treg的治疗方法相比，所述经修饰Treg可展示出细胞保护活性，诸如例如，保护细胞免受过氧化氢毒性。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM人过氧化氢酶的构建体，并且与不包括使用所述经修饰Treg的治疗方法相比，所述经修饰Treg可展示出细胞保护活性，诸如例如，保护细胞免受过氧化氢毒性。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM BDNF的构建体，并且与不包括使用所述经修饰Treg的治疗方法相比，所述经修饰Treg可展示出细胞保护活性，诸如例如，保护细胞免受过氧化氢毒性。在一些实施方案中，经修饰Treg可包含用于表达NDMM IGF-1的构建体，并且与不包括使用所述经修饰Treg的治疗方法相比，所述经修饰Treg可展示出细胞保护活性，诸如例如，保护细胞免受过氧化氢毒性。
下面详细论述根据本发明的经修饰Treg的进一步治疗应用。
治疗应用
通过上述方法获得的分离的细胞或源自此类分离的细胞的细胞系可以在治疗受试者的疾病、障碍或病症中用作药剂。在一些实施方案中，此一药剂可以用于治疗神经退行性疾病或病症。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病或病症可系帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或ALS。
细胞起源
为了本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群体，所述细胞可以对受试者而言是异种的、同种异体的或自体的细胞。一般来讲，与受治疗的受试者相比，细胞是自体的或同种异体的。在其中细胞是同种异体的情况下，优选所述细胞相对于待治疗的受试者是MHC或HLA组织相容的和/或经修饰以损及或消除细胞的内源TCR和/或MHC的表达或功能性。在一些情况下，同种异体Treg可系优选的，尤其是如果待治疗的受试者的Treg患病和/或拥有使它们对于治疗用途未及理想的一些特性。在一些情况下，同种异体Treg可系优选的，尤其是如果Treg是从健康供体获得的，因为它们可更好地迁移或运输至所期望的位点，即CNS内的神经退变或神经炎症的位点。
在一些实施方案中，通过自体转移来进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，其中从待接受细胞疗法的受试者或从源自此一受试者的样本分离和/或以别的方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者，例如患者，并且所述细胞在分离和加工随后施用给同一受试者。
在一些实施方案中，通过同种异体转移来进行细胞疗法，例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法，其中从待接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以别的方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将细胞施用给相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在基因上是相同的。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者在基因上是类似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
受试者
本文所指的受试者可系任何活的受试者。在一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物。本文所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物(mammal)”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，诸如兔。哺乳动物可来自肉食目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，也可来自奇蹄目，包括马科动物(马)。哺乳动物可系灵长目、类猴目(Ceboid)或类猿目(Simoid)(猴)，或系类人目(人和猿)。
在一些实施方案中，向其施用细胞、细胞群体或组合物的受试者是灵长类动物，优选人。在一些实施方案中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成年受试者和老年受试者。在一些实例中，患者或受试者是用于疾病、过继细胞疗法和/或用于评估毒性效果(诸如细胞因子释放综合征(CRS))的经验证动物模型。
在一些实施方案中，受试者患有持续或复发疾病，例如在用另一种免疫疗法和/或其他疗法治疗之后。在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法有抗性，但所述施用仍有效地治疗受试者。在一些实施方案中，所述受试者尚未复发，但是被确定为处于复发风险中，诸如处于高复发风险中，因此预防性地施用化合物或组合物，例如用以减少复发的可能性或防止复发。
在一些实施方案中，所述方法包括将包含一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM的经修饰Treg或含有所述细胞的组合物施用给受试者、组织或细胞，诸如患有神经退行性疾病或病症、处于患神经退行性疾病或病症的风险或怀疑患有神经退行性疾病或病症的受试者、组织或细胞。在一些实施方案中，将所述细胞、群体和组合物施用给待治疗的患有特定疾病或病症的受试者，例如经由过继细胞疗法，诸如过继T细胞疗法。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用给受试者，诸如患有所述疾病或病症或处于所述疾病或病症风险中的受试者。在一些方面，该方法从而治疗，例如改进所述疾病或病症的一种或多种症状，诸如通过减少、抑制小神经胶质细胞或使其失活，减少炎症和/或神经炎症，和/或减低神经元死亡。
功能活性
在一些实施方案中，本公开包括一种细胞疗法，其中对分离的细胞例如Treg进行基因修饰以表达一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM，所述一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM针对在神经退行性疾病或病症中表达的靶分子，且所述经修饰Treg细胞被输注进需要其的受试者中。此类靶分子的实例包括β淀粉样蛋白1-42、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、α-突触核蛋白、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；胱抑素C。此类施用能以靶分子特异性的方式减低神经退变和/或神经炎症。
在一些实施方案中，经修饰Treg可以经历体内扩增并且可以持续一段延伸的时间。
一旦将细胞(经修饰Treg)施用给受试者(例如人)，即通过数个已知方法中的任一种来测量经工程改造的细胞群体在一些方面的生物活性。待评估的参数包括体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)条件下工程改造的或天然的Treg细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合。
在一些方面，通过评估临床效果来测量生物活性，所述临床效果诸如疾病症状的减少(诸如与例如是阿尔茨海默氏病、ALS和帕金森氏病的神经退行性疾病或病症相关联的症状)。
靶标
可包含一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM的本公开的Treg可用于治疗、防止或诊断涉及本文所述靶分子(例如，α-突触核蛋白、β淀粉样蛋白或mutSOD1)的表达的任何病症、障碍或疾病。例如，本发明还设想治疗或防止神经退行性疾病或病症的方法，所述神经退行性疾病或病症可包括：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、朊病毒病、除了ALS之外的运动神经元疾病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、多发性硬化症、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。所设想的方法包括施用经修饰Treg，所述经修饰Treg任选地可包含根据本公开的一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM。
施用模式
本发明的组合物可用数种方式施用，取决于期望局部治疗还是全身治疗。就过继细胞疗法而言，用于过继细胞疗法的细胞施用的方法是已知的，并且可与所提供的方法和组合物相连使用。例如，过继T细胞疗法的方法例如在以下中有所描述：给Gruenberg等人的美国专利申请公开No.2003/0170238；给Rosenberg的美国专利No.4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85。参见例如，Themeli等人(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
此类施用可系外用(topical)、肠胃外或肠内。本发明的组合物典型合适用于肠胃外施用。如本文所用，药用组合物的“肠胃外施用(parenteral administration)”包括表征为受试者组织的物理性裂开的任何施用途径以及通过组织中的裂口施用所述药用组合物，因此通常导致直接施用进血流、进入肌肉或进入内部器官。肠胃外施用因而包括但不限于通过注入组合物、通过透过手术切口施加组合物、通过透过组织穿透性的非手术伤口施加组合物和类似者来施用药用组合物。具体而言，所设想肠胃外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；以及肾脏透析输注技术。在一些实施方案中，本发明组合物的肠胃外施用包含皮下或腹膜内施用。
合适用于肠胃外施用的药用组合物的制剂典型地通常包含与药学上可接受的载体(诸如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类制剂的制备、包装或出售的形式可合适于推注施用或合适于连续施用。可注射制剂可用单位剂型制备、包装或出售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬剂、溶液剂、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和类似者。此类制剂可进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一些实施方案中，以干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分，以用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构，然后肠胃外施用该重构的组合物。肠胃外制剂还包括水性溶液，其可含有赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选到pH为3至9)，但是对于一些应用，它们可更合适地配制成无菌非水性溶液剂或配制成干燥形式，以与合适的媒介物(诸如无菌无热原水)连同使用。示例性的肠胃外施用形式包括在无菌水性溶液(例如丙二醇或右旋糖水溶液)中的溶液剂或混悬剂。如果期望的话，可以合适地缓冲此类剂型。有用的其他可肠胃外施用的制剂包括包含微晶形式的或脂质体制备物中的活性成分的那些制剂。供肠胃外施用的制剂可配制成立即释放和/或修饰释放(modified release)。修饰释放制剂包括延迟释放、延续释放(sustainedrelease)、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序化释放。
术语“经口的(oral)”、“肠内的(enteral)”、“肠内地(enterally)”、“经口地(orally)”、“非肠胃外的(non-parenteral)”、“非肠胃外地(non-parenterally)”和类似者，是指通过沿消化道的途径或模式向个体施用化合物或组合物。组合物的“经口”施用途径的实例包括但不限于从口吞咽液体或固体形式的组合物、通过鼻空肠管或胃造口管施用组合物、十二指肠内施用组合物和直肠施用，例如，使用用于消化道的下肠道的栓剂。优选地，包含经修饰Treg的配制组合物合适于经由注射施用。
用于外用施用(topical administration)的药用组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂、半固体剂、单相组合物、多相组合物(例如水包油、油包水)、泡沫剂、微海绵、脂质体、纳米乳剂、气溶胶泡沫剂、聚合物、富勒烯和散剂。常规药用载体(pharmaceutical carrier)、水性、粉末或油性基质、增稠剂和类似者可系必要的或可取(desirable)的。
供经口施用的组合物和制剂包括散剂或颗粒剂(granule)、水或非水性介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、囊剂或片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可系可取的。
供肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水性溶液剂，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，诸如但不限于渗透促进剂、梳理化合物(cardercompound)和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开的药用组合物包括但不限于溶液剂、乳剂和含脂质体制剂。这些组合物可由多种组分生成，所述组分包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。
可方便地以单位剂型提供的本公开的药用组合物可根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分与药用载体(pharmaceutical carrier)或赋形剂缔合的步骤。通常，通过以下步骤来制备制剂：将活性成分与液体载体(liquid carrier)或细分的固体载体或二者均匀且紧密地缔合，然后(如果必要的话)将产品塑形。
本公开的组合物可配制成许多可行的剂型中的任一者，诸如但不限于片剂、胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂、气溶胶剂和灌肠剂。本公开的组合物还可配制成在水性、非水性或混合介质中的混悬剂。水性混悬剂可还含有增加混悬剂粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬剂可还含有稳定剂。
在本公开的一些实施方案中，药用组合物可作为泡沫剂配制和使用。药用泡沫剂包括制剂，诸如但不限于乳剂、微乳剂、霜剂、凝胶剂和脂质体。虽然性质上基本相似，但这些制剂的组分和最终产品的稠度有变化。在细胞水平上增强寡核苷酸摄取的作用剂也可添加到本发明的药用组合物和其他组合物中。例如，阳离子脂质(诸如lipofectin(美国专利No.5,705,188))、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(诸如聚赖氨酸(WO 97/30731))也增强寡核苷酸的细胞摄取。
本发明的组合物可额外含有药用组合物中常规出现的其他补佐组分。因此，例如，组合物可含有额外的相容药学活性材料，诸如例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有对物理配制本发明组合物的多样剂型有用的额外材料，诸如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在被添加时不应不当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以经灭菌，并且(如果期望的话)与助剂混合，所述助剂为例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质和类似者，所述助剂不会与制剂的核酸有害地相互作用。
包含本公开的经修饰Treg的群体的制剂可包括药学上可接受的赋形剂。制剂中所包括的赋形剂将具有不同的目的，目的取决于例如经修饰Treg、所用的经修饰Treg的亚群以及施用模式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：生理盐水、缓冲盐水、右旋糖、感染用水、甘油、乙醇以及它们的组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张度剂、增量剂以及润滑剂。包含本公开的经修饰Treg的群体的制剂典型可在不存在任何诸如动物血清的非人组分(例如牛血清白蛋白)的情况下制备和培养。
制剂或组合物还可含有不止一种活性成分，所述活性成分对用所述结合分子或细胞治疗的特定适应症、疾病或病症有用，所述活性成分优选为具有与所述结合分子或细胞互补的活性的那些活性成分，其中各自的活性不会不利地彼此影响。此类活性成分合适地以对预期目的有效的量组合而存在。因此，在一些实施方案中，药用组合物进一步包括其他药用活性剂或药品，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些方面，药用组合物可以采用定时释放递送系统、延迟释放递送系统和延续释放递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗位点的敏化之前，并且有足够的时间来造成待治疗位点的敏化。许多类型的释放递送系统是可用的并且是已知的。此类系统可以避免重复施用组合物，从而增加受试者和医生的便利性。
剂量
在一些实施方案中，药用组合物含有对治疗或防止疾病或病症(例如神经退行性疾病或病症)有效的量(诸如治疗有效量或预防有效量)的本公开的经修饰Treg，例如包含一种或多种CAR和/或一种或多种NDMM的Treg。在一些实施方案中，通过周期性评估受治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于若干天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复治疗直至发生对疾病症状的所期望抑制。然而，其他剂量方案可为有用的并且可以确定。所期望剂量可以通过以下方式来递送：单次推注施用组合物、多次推注施用组合物或连续输注施用组合物。
在某些实施方案中，在经修饰Treg的语境中，向受试者施用范围为约100万至约1000亿个的细胞，诸如例如1百万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞，或者由前述值中任两者定义的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞，约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞，或由前述值中任两者定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或这些范围之间的任何值和/或每千克受试者体重此一数量的细胞。例如，在一些实施方案中，细胞或细胞群体的施用可以包含每kg体重施用约103至约109个细胞，包括在那些范围内的所有整数值的细胞数。
细胞或细胞群体可以用一个或多个剂量施用。在一些实施方案中，所述有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施方案中，所述有效量的细胞可以在一周期时间内作为不止一个剂量施用。施用时序在管理医生的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可从任何来源获得，诸如血库或供体。虽然个体需要有变化，但是对于特定疾病或病症确定给定细胞类型的有效量的最佳范围，在本领域技术范围内。有效量意指提供治疗益处或预防益处的量。施用的剂量取决于接受者的年龄、健康和体重、同时治疗的类型(如果有的话)、治疗频率和所期望效应的性质。在一些实施方案中，肠胃外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。在一些实施方案中，施用可以是静脉内施用。在一些实施方案中，可以通过注射进疾病位点来直接进行施用。
为了本公开的目的，所施用的经修饰Treg的量或剂量应足以在合理的时间范围内在受试者或动物中实现治疗或预防响应。例如，在从施用时间起约2小时或更长的周期(例如约12小时至约24小时或更多小时)内，经修饰Treg的剂量应足以与抗原结合，或检测、治疗或防止疾病。在某些实施方案中，该时间周期可能甚至更长。将通过特定的经修饰Treg的功效和动物(例如，人)的状况以及待治疗的动物(例如，人)的体重来确定剂量。
在一些实施方案中，将根据本发明的经修饰Treg作为组合治疗的一环施用，诸如与本领域已知的另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次施用。例如，在一些实施方案中，将根据本发明的经修饰Treg细胞与一种或多种额外的治疗剂(诸如抗体、核酸或小分子)或与另一种治疗干预相结合，同时或以任何顺序依次共同施用。在一些语境中，将细胞与另一部分共同施用，所述另一部分可促进细胞穿过BBB的能力。在一些语境中，将细胞与在时间上足够接近的另一种疗法共同施用，使得细胞群体增强一种或多种额外治疗剂的效应，或反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种额外治疗剂之前施用所述细胞。在一些实施方案中，在一种或多种额外治疗剂之后施用所述细胞。
实施例
实施例1：对于靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg的Treg分离、扩增和CAR转导
在本实施例中，靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg包含胞外scFv，该scFv融合至人CD28铰链、跨膜结构域和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域(图1)。靶向阿尔茨海默氏病的CAR包括DG01(SEQ ID NO：1)、DG02(SEQ ID NO：2)、DG03(SEQ ID NO：3)和DG04(SEQID NO：4)、DG01-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：20)、DG02-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：21)、DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22)以及DG04-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：23)。如下制备靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg。
以两步细胞分离过程从人PBMC中分离出CD4+CD25+Treg。首先，根据制造商的说明书，使用MOJOSORTTM人CD4 T细胞分离试剂盒(Biolegend公司)和EASYSEPTM磁体(StemCell公司)通过负选择分离人CD4+细胞。其次，使用抗人CD25微珠II(美天旎公司(Miltenyi))和带有MiniMACSTM Separator磁体(美天旎公司)的MS柱通过正选择从CD4+分离细胞富集CD25hi细胞。将CD4+CD25hi细胞在补充有10％热灭活人AB血清(西格玛公司(Sigma))的Treg生长培养基中以1×106个细胞/mL在24孔非组织培养板中培养。Treg生长培养基是(1)X-Vivo-15或(2)RPMI，其补充有10mM HEPES、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和50μM 2-ME。细胞温育条件为加湿、37℃和5％CO2。在培养的第0天和第9天，用ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞活化剂(StemCell公司)的25μL/1×106个细胞刺激细胞。在一些情况下，改用CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂系可行的。从培养的第2天开始，在Treg生长培养基中补充300至500U/mL人IL-2(来自罗氏公司(Roche)的Tecin，由NIH惠赠)。在第5天，将培养的细胞转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第10天和第11天用逆转录病毒CAR构建体转导细胞两天。根据制造商的说明书，用
Figure BDA0002663127410000991
(宝生物美国公司(Takara Bio USA，Inc.))预先包被24孔非组织培养板孔，然后将第10天的培养细胞以0.3×106个细胞/孔添加到0.3mL的Treg生长培养基中。以0.7mL/孔添加逆转录病毒上清液，并将板在30℃下以1500rcf离心1小时，然后温育过夜。次日，将0.5mL培养上清液替换为具有500U/mL IL-2的0.5mL逆转录病毒上清液，并将细胞再次离心，然后温育过夜。次日，将细胞以1×106个细胞/mL转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第13天，通过用流式细胞术测量细胞上共转导的截短型CD19的百分比来评价细胞样品的转导效率。如果细胞的转导率低于30％，则可以根据制造商的说明书使用抗CD19-PE和EasySepTM释放PE正选择试剂盒(StemCell公司)富集细胞。每两天添加以新鲜的Treg生长培养基来培养细胞，直到第17天。
流式细胞术步骤如下进行。
通过用特异性抗体染色来确定细胞表型分型：FITC缀合的抗人CD3(克隆OKT3；Biolegend公司)、FITC抗人CD4(克隆OKT4；Biolegend公司)、PE抗人CD127(克隆A019DS；Biolegend公司)、PE抗人CD25(克隆M-A251；Biolegend公司)、PE抗人CD19(克隆SJ25C1；Biolegend公司)或PE抗小鼠CD19(克隆6D5；Biolegend公司)。对于细胞内染色，将eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组与APC抗人Fox3(克隆PCH101；英杰公司(Invitrogen))或APC大鼠IgG2a同种型对照(克隆eBR2a；英杰公司)一起使用。为了直接标记CAR scFv，使用生物素化蛋白L(1μg/mL；金斯瑞公司(GenScript))，随后使用链霉亲和素-PE(Biolegend公司)。标记基于scFv的CAR的其他试剂可以包括FITC抗人IgG F(ab’)2特异性抗体(Jackson ImmunoResearch公司)、PE AffiniPure F(ab′)2片段抗人IgG(JacksonImmunoResearch公司)或PE AffiniPure F(ab′)2片段抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch公司)。使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI，USA))分析细胞。
图2A至图2D呈现了与如上所论述从人PBMC分离的Treg的体外扩增和表型验证有关的数据。图2A展示，在CD4和CD25富集分离之前人PBMC中CD4+CD25hi Treg(R2框)占总T细胞的小量百分比。图2B展示，使用本Treg扩增方案，培养17天后CD4+CD25hi分离的Treg扩增了1760倍。图2C展示，第17天的Treg表达了细胞内FoxP3。图2D展示，在大多数第17天的Treg(在第10天和第11天转导)上检测到FoxP3、截短型CD19(tCD19)和CAR scFv。
如下对靶向β淀粉样蛋白的CAR进行功能验证。在PBS中温育七天的过程中可以发生Aβ1-42肽的寡聚化，并在本实施例中导致较大寡聚体的比率随时间增加，如图3A所展示。为了测试CAR抗原特异性的活性，使用了经转导以表达DG03-28ζ抗Aβ CAR(SEQ ID NO：22)的总效应T细胞(CD4+和CD8+Teff细胞)。当这些CAR T细胞暴露于具有较高比率的较大聚集体的Aβ寡聚体时，出现了较高的IFN-γ分泌，而没有抗原时则几乎没有发生响应(图3B)。这展示出CAR保留了对Aβ的结合特异性，并且寡聚的抗原活化了CAR T细胞(图3B)。
实施例2：使用靶向阿尔茨海默氏病的示例性经修饰Treg的Treg抑制测定法
将如实施例1所述的包含CAR的经修饰Treg以12,500至400,000个细胞/0.1mL/孔之间的系列稀释度平板接种于96孔V形底平板的Treg生长培养基中。根据制造商的说明书，使用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(英杰公司)对同种异体PBMC进行预标记。将CSFE标记的PBMC用或不用抗CD3(1ug/mL；克隆HIT3a；Biolegend公司)刺激，并添加至平板接种的Treg或添加至无Treg的孔。72小时后，用人Cohns级分(1mg/mL；西格玛公司)封闭细胞，然后用APC抗CD8(克隆RTA-T8；Biolegend公司)染色以供流式细胞仪分析CD8+细胞的CSFE表达。CFSE可以随着每次细胞分裂而减少，因此分裂的细胞可具有较低的CFSE值。与用抗CD3 mAb刺激的PBMC的对照孔相比来测定CD8+ T细胞增殖的抑制百分比。
上述Treg抑制测定法的结果在图4中呈现。图4展示，增加比率的第17天的包含DG03-28z的抗Aβ CAR Treg抑制了共培养的CD3刺激的同种异体PBMC中CSFE标记的CD8+细胞的增殖。
实施例3：抗原刺激靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg
为了用可溶性抗原刺激，将第17天的CAR Treg以50,000个细胞/孔平板接种于未包被的96孔组织培养板中不含IL-2的Treg生长培养基中。Aβ1-42或α-突触核蛋白通过在37℃下于PBS中以40μM温育1周并每天搅拌来使其预寡聚化。将寡聚Aβ1-42添加至0.1mL Treg生长培养基中的Treg，并在24小时和72小时收集无细胞上清液以供人IL-10 ELISA(Biolegend公司)。对于用平板结合的抗原进行刺激，将96孔ELISA板用PBS中的Aβ1-42、wtSOD1、mutSOD1或α-突触核蛋白于4℃包被过夜。将板用PBS漂洗3次，并将第17天的CARTreg以50,000个细胞/孔添加至抗原包被的96孔ELISA板中不含IL-2的Treg生长培养基中。在24小时和72小时收集无细胞上清液以供人IL-10 ELISA(Biolegend公司)。作为另外一种选择，将PBS中的链霉亲和素于4℃在96孔ELISA板上包被过夜，并在漂洗掉未结合的链霉亲和素后施加生物素化的抗原。刺激抗原的另一种备选方法可以是使用包被有抗原的纳米级或微米级大小聚苯乙烯珠，例如，与链霉亲和素缀合珠连接的生物素化抗原。
图5展示，用寡聚Aβ体外刺激24小时的包含DG03-28z的抗AβCAR Treg产生了IL-10。通过学生t检验，P＜0.001。
实施例4：对于靶向ALS的经修饰Treg的Treg分离、扩增和CAR转导
在本实施例中，靶向ALS的经修饰Treg包含使用人可变重链(VH)和轻链(VL)序列的抗mutSOD1 CAR。抗mutSOD1 scFv在细胞外表达，其VL的C端融合至人CD28铰链、跨膜和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域以产成抗mutSOD1-CD28-CD3ζ CAR(图6)。一旦抗原结合，这种CAR将触发初级信号转导和共刺激信号转导。截短型(非信号转导的)人或小鼠CD19(tCD19)也使用2A共表达系统在同一载体中表达，并且其充当跟踪和纯化经转导T细胞的一种方式。如下制备靶向ALS的经修饰Treg。靶向ALS的CAR包括DG05(SEQ ID NO：5)、DG06(SEQID NO：6)、DG07(SEQ ID NO：7)、DG05-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：24)、DG06-CD28-CD3ζ(SEQ IDNO：25)和DG07-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：26)。
以两步细胞分离过程从人PBMC中分离出CD4+CD25+Treg。首先，根据制造商的说明书，使用MOJOSORTTM人CD4 T细胞分离试剂盒(Biolegend公司)和EASYSEPTM磁体(StemCell公司)通过负选择分离人CD4+细胞。其次，使用抗人CD25微珠II(美天旎公司(Miltenyi))和带有MiniMACSTM Separator磁体(美天旎公司)的MS柱通过正选择从CD4+分离细胞富集CD25hi细胞。将CD4+CD25hi细胞在补充有10％热灭活人AB血清(西格玛公司(Sigma))的Treg生长培养基中以1×106个细胞/mL在24孔非组织培养板中培养。Treg生长培养基是(1)X-Vivo-15或(2)RPMI，其补充有10mM HEPES、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和50μM 2-ME。细胞温育条件为加湿、37℃和5％CO2。在培养的第0天和第9天，用ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞活化剂(StemCell公司)的25μL/1×106个细胞刺激细胞。在一些情况下，改用CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂系可行的。从培养的第2天开始，在Treg生长培养基中补充300至500U/mL人IL-2(来自罗氏公司(Roche)的Tecin，由NIH惠赠)。在第5天，将培养的细胞转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第10天和第11天用逆转录病毒CAR构建体转导细胞两天。根据制造商的说明书，用
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(宝生物美国公司(Takara Bio USA，Inc.))预先包被24孔非组织培养板孔，然后将第10天的培养细胞以0.3×106个细胞/孔添加到0.3mL的Treg生长培养基中。以0.7mL/孔添加逆转录病毒上清液，并将板在30℃下以1500rcf离心1小时，然后温育过夜。次日，将0.5mL培养上清液替换为具有500U/mL IL-2的0.5mL逆转录病毒上清液，并将细胞再次离心，然后温育过夜。次日，将细胞以1×106个细胞/mL转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第13天，通过用流式细胞术测量细胞上共转导的截短型CD19的百分比来评价细胞样品的转导效率。如果细胞的转导率低于30％，则可以根据制造商的说明书使用抗CD19-PE和EasySepTM释放PE正选择试剂盒(StemCell公司)富集细胞。每两天添加以新鲜的Treg生长培养基来培养细胞，直到第17天。
流式细胞术步骤如下进行。
通过用特异性抗体染色来确定细胞表型分型：FITC缀合的抗人CD3(克隆OKT3；Biolegend公司)、FITC抗人CD4(克隆OKT4；Biolegend公司)、PE抗人CD127(克隆A019DS；Biolegend公司)、PE抗人CD25(克隆M-A251；Biolegend公司)、PE抗人CD19(克隆SJ25C1；Biolegend公司)或PE抗小鼠CD19(克隆6D5；Biolegend公司)。对于细胞内染色，将eBioscienceTM Foxp3/转录因子染色缓冲液组与APC抗人Fox3(克隆PCH101；英杰公司(Invitrogen))或APC大鼠IgG2a同种型对照(克隆eBR2a；英杰公司)一起使用。为了直接标记CAR scFv，使用生物素化蛋白L(1μg/mL；金斯瑞公司(GenScript))，随后使用链霉亲和素-PE(Biolegend公司)。标记基于scFv的CAR的其他试剂可以包括FITC抗人IgG F(ab’)2特异性抗体(Jackson ImmunoResearch公司)、PE AffiniPure F(ab′)2片段抗人IgG(JacksonImmunoResearch公司)或PE AffiniPure F(ab′)2片段抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch公司)。使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI，USA))分析细胞。
作为另外一种选择，对于对照CAR TZ47-28z CAR，如下进行转导。经由两步负和正选择方案从人PBMC分离细胞。首先，使用负选择分离CD4+CD127-T细胞，随后是对CD25+细胞进行正选择以分离CD4+CD127-CD25+Treg细胞。在培养的两周内，将分离的CD4+CD25+CD127-Treg用带有人IL-2的抗CD3、抗CD28、抗CD2包被的珠(StemCell公司ImmunoCult)活化。在第9天，Treg细胞冷冻经保存以备后用，因此可以在多个时机测试相同的供体和制备物来评估测定法的变异性。使用此方案，从初始的1×108个全PBMC生成5×108个Treg细胞(CD4+、CD127-、CD25+、FoxP3+)系可行的。
对于CAR转导，用Immunocult活化剂珠将解冻的9天扩增的Treg细胞刺激48小时。通过在Rectroection包被的板(Clontech Laboratories，Inc.公司)中与抗mutSOD1 CAR、或阴性对照CAR和tCD19、或者单独的tCD19载体自旋接种来转导Treg。转导后三天，利用磁珠选择(StemCell公司)纯化转导的tCD19+细胞。用这种方法，显示出用抗B7H6 CAR和tCD19转导的扩增Treg保留了Treg表型：效应T细胞增殖的抑制(图7A)，以及细胞的大多数表达了细胞内FoxP3(图7B)。tCD19+细胞的纯化导致纯度高达95％(图7C至图7D)。关于图7A，从人PBMC分离并体外扩增的CD4+CD127-CD25+细胞具有Treg样功能，如对CSFE标记的T效应细胞(Teff)的CD3刺激增殖的抑制所显示。关于图7B，CD4+CD127-CD25+分离且扩增的细胞对细胞内Treg标志物FoxP3呈阳性。关于图7C至图7D，在用截短型CD19(tCD19)逆转录病毒转导分离的Treg随后，17％的CD4+细胞表达了tCD19(图7C)，在tCD19纯化后，95％的分选细胞为tCD19+(图7D)。
使用总效应T细胞(CD4+和CD8+ T细胞)(源自人PBMC，所述人PBMC用40ng/mL可溶性OKT3和100u/mL IL-2刺激，在培养的第2天和第3天在用Retronectin包被的孔中自旋转导，并在培养的第8天使用)下，三种抗mutSOD1 CAR(分别命名为DG05、DG06和DG07)显示出针对SOD1的G93A突变形式的抗原特异性活性，其类似于靶向B7H6的抗B7H6(TZ47)CAR T细胞(图8)。从中开发了抗mutSOD1 CAR DG05和DG06的两种人抗体对具有ALS突变的人SOD1有选择性。
图9呈现了如上所论述的与分离自人PBMC的Treg的表型验证有关的数据。图9展示，使用基于流式细胞术的测定法在人Treg中表达的DG05-28Z(SEQ ID NO：24)检测到对以下标志物呈阳性：FoxP3；CD4；CD3；转导标志物截短型CD19(tCD19)；以及通过用生物素化蛋白L和链霉亲和素-PE标记的CAR。此外，表达抗mutSOD1 CAR DG05-28z的经修饰Treg具有与表达靶向不同靶标的CAR(DG03-28z(SEQ ID NO：22))的Treg类似的表型(图10)。
实施例5：靶向ALS的经修饰Treg的功能活性
下面呈现出了使用在人Treg中表达的抗mutSOD1 CAR DG05-28z(SEQ ID NO：24)的IL-10 ELISA数据。图11展示，与在单纯培养基中培养相比，当在具有包被在孔表面的(板结合的)mutSOD1的孔中培养时，抗mutSOD1 CAR Treg DG05-28z产生IL-10。此外，图11展示抗mutSOD1 CAR Treg不会响应可溶性寡聚Aβ1-42而产生IL-10，而抗AβCAR Treg确实响应可溶性寡聚Aβ1-42而产生IL-10。
图12展示，相对于如上所述的与板结合的链霉亲和素连接的wtSOD1，人效应T细胞中表达的DG05-28z(SEQ ID NO：24)和DG06-28z(SEQ ID NO：25)抗mutSOD1 CAR响应生物素化的mutSOD1而产生IFN-γ。当在人T效应细胞中表达时，相比于mutSOD1，第三种抗mutSOD1CAR(称为DG07-28z(SEQ ID NO：26))响应wtSOD1而产生较高量的IFN-γ。
涉及表达抗mutSOD1 CAR DG05-28z的经修饰Treg的IL-10产生测定法展示，预期抗SOD1 CAR Treg可以响应突变型和野生型形式的SOD1是合理的，但仅在它们聚集或结合于表面(例如组织培养板)上时。基于如上所述的在人T效应细胞中表达的DG05-28z和DG06-28z抗mutSOD1 CAR的数据，预期CAR可以对聚集的或板结合的mutSOD1相对于wtSOD1更具选择性是合理的。
通过T效应细胞的体外增殖抑制来评价经修饰Treg调节功能。Teff的来源是经CSFE标记的同种异体PBMC。将包含CAR的经修饰Treg以12,500至400,000个细胞/0.1mL/孔之间的系列稀释度平板接种于96孔V形底平板的Treg生长培养基中。根据制造商的说明书，使用CellTraceTM CFSE细胞增殖试剂盒(英杰公司)对同种异体PBMC进行预标记。将CSFE标记的PBMC用或不用抗CD3(1ug/mL；克隆HIT3a；Biolegend公司)刺激，并添加至平板接种的Treg或添加至无Treg的孔。72小时后，用人Cohns级分(1mg/mL；西格玛公司)封闭细胞，然后用APC抗CD8(克隆RTA-T8；Biolegend公司)染色以供流式细胞仪分析CD8+细胞的CSFE表达。CFSE可以随着每次细胞分裂而减少，因此分裂的细胞可具有较低的CFSE值。与用抗CD3 mAb刺激的PBMC的对照孔相比来测定CD8+ T细胞增殖的抑制百分比。72小时后或与抗mutSOD1CAR Treg共培养后，测量CSFE标记的PBMC中Teff的CD8亚群的增殖。将CAR Treg与PBMC以0.13∶1、0.5∶1和2∶1的Treg∶PBMC比率共培养(图13)。
实施例6：对于靶向帕金森氏病的经修饰Treg的Treg分离、扩增和CAR转导
在本实施例中，靶向帕金森氏病的经修饰Treg包含使用人可变重链(VH)和轻链(VL)的抗α-突触核蛋白CAR。抗α-突触核蛋白scFv在细胞外表达，其VL的C端融合至人CD28铰链、跨膜和胞质结构域，随后是人CD3ζ胞质结构域以产成抗α-突触核蛋白-CD28-CD3ζ CAR(图14)。一旦抗原结合，这种CAR将触发初级信号转导和共刺激信号转导。截短型(非信号转导的)人CD19(tCD19)也使用2A共表达系统在同一载体中表达，并且其充当跟踪和纯化经转导T细胞的一种方式。靶向帕金森氏病的CAR包括DG08(SEQ ID NO：8)、DG09(SEQ ID NO：9)、DG10(SEQ ID NO：10)、DG11(SEQ ID NO：11)、DG08-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：27)、DG09-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：28)、DG10-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：29)和DG11-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：30)。如下制备靶向帕金森氏病的经修饰Treg。
以两步细胞分离过程从人PBMC中分离出CD4+CD25+Treg。首先，根据制造商的说明书，使用MOJOSORTTM人CD4 T细胞分离试剂盒(Biolegend公司)和EASYSEPTM磁体(StemCell公司)通过负选择分离人CD4+细胞。其次，使用抗人CD25微珠II(美天旎公司(Miltenyi))和带有MiniMACSTM Separator磁体(美天旎公司)的MS柱通过正选择从CD4+分离细胞富集CD25hi细胞。将CD4+CD25hi细胞在补充有10％热灭活人AB血清(西格玛公司(Sigma))的Treg生长培养基中以1×106个细胞/mL在24孔非组织培养板中培养。Treg生长培养基是(1)X-Vivo-15或(2)RPMI，其补充有10mM HEPES、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和50μM 2-ME。细胞温育条件为加湿、37℃和5％CO2。在培养的第0天和第9天，用ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞活化剂(StemCell公司)的25μL/1×106个细胞刺激细胞。在一些情况下，改用CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂系可行的。从培养的第2天开始，在Treg生长培养基中补充300至500U/mL人IL-2(来自罗氏公司(Roche)的Tecin，由NIH惠赠)。在第5天，将培养的细胞转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第10天和第11天用逆转录病毒CAR构建体转导细胞两天。根据制造商的说明书，用
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(宝生物美国公司(Takara Bio USA，Inc.))预先包被24孔非组织培养板孔，然后将第10天的培养细胞以0.3×106个细胞/孔添加到0.3mL的Treg生长培养基中。以0.7mL/孔添加逆转录病毒上清液，并将板在30℃下以1500rcf离心1小时，然后温育过夜。次日，将0.5mL培养上清液替换为具有500U/mL IL-2的0.5mL逆转录病毒上清液，并将细胞再次离心，然后温育过夜。次日，将细胞以1×106个细胞/mL转移至25cm2组织培养物处理的烧瓶中。在培养的第13天，通过用流式细胞术测量细胞上共转导的截短型CD19的百分比来评价细胞样品的转导效率。如果细胞的转导率低于30％，则可以根据制造商的说明书使用抗CD19-PE和EasySepTM释放PE正选择试剂盒(StemCell公司)富集细胞。每两天添加以新鲜的Treg生长培养基来培养细胞，直到第17天。
实施例7：靶向帕金森氏病的经修饰Treg的功能活性
通过在具有包被在孔表面的(板结合的)α-突触核蛋白和具有可溶性寡聚α-突触核蛋白的孔中培养经修饰Treg，来与在单纯培养基中培养相比而评价靶向帕金森氏病的功能活性。为了用可溶性抗原刺激，将第17天的CAR Treg以50,000个细胞/孔平板接种于未包被的96孔组织培养板中不含IL-2的Treg生长培养基中。Aβ1-42或α-突触核蛋白通过在37℃下于PBS中以40μM温育1周并每天搅拌来使其预寡聚化。将寡聚α-突触核蛋白添加至0.1mLTreg生长培养基中的Treg，并在24小时和72小时收集无细胞上清液以供人IL-10 ELISA(Biolegend公司)。对于用平板结合的抗原进行刺激，将96孔ELISA板用PBS中的Aβ1-42、wtSOD1、mutSOD1或α-突触核蛋白于4℃包被过夜。将板用PBS漂洗3次，并将第17天的CARTreg以50,000个细胞/孔添加至抗原包被的96孔ELISA板中不含IL-2的Treg生长培养基中。在24小时和72小时收集无细胞上清液以供人IL-10 ELISA(Biolegend公司)。作为另外一种选择，将PBS中的链霉亲和素于4℃在96孔ELISA板上包被过夜，并在漂洗掉未结合的链霉亲和素后施加生物素化的抗原。刺激抗原的另一种备选方法可以是使用包被有抗原的纳米级或微米级大小聚苯乙烯珠，例如，与链霉亲和素缀合的珠连接的生物素化抗原。图15呈现的数据展示，与在单纯培养基中培养相比，当在具有包被在孔表面(板结合的)α-突触核蛋白和具有可溶性寡聚α-突触核蛋白的孔中培养时，抗α-突触核蛋白CAR Treg产生IL-10。另外，如图15中所呈现的，抗α-突触核蛋白CAR Treg不会响应可溶性寡聚Aβ1-42而产生IL-10，而抗Aβ CAR Treg确实响应可溶性寡聚Aβ1-42而产生IL-10，因此展示了Treg上的CAR的抗原特异性。
实施例8：靶向ALS的经修饰Treg的表达和功能活性
在本实施例中，在离体扩增并CAR转导的人Treg中评价了具有不同共刺激信号传导结构域，并且还具有或不具有CD3-ζ(“CD3ζ”)刺激结构域的抗mSOD1 CAR的表达和功能。抗mSOD1 scFv DG05和CD28跨膜结构域(“28tm”)在所有构建体中，而小鼠截短型CD19处于与CAR在同一构建体上的载体中。CD3-ζ(“CD3ζ”)结构域接合至共刺激结构域CD28(“28”)、DAP10(“10”)或CD44(“44”)，以产生以下抗mSOD1 CAR：DG05-28-3ζ(SEQ ID NO：24)；DG05-28tm-10-3ζ(SEQ ID NO：40)和DG05-28tm-44-3ζ(SEQ ID NO：41)。额外地，产生了包含不具有刺激或共刺激结构域的CD28跨膜结构域(“CD28tm”)的抗mSOD1 CAR(DG05-28tm，SEQ IDNO：44)；产生了包含具有3ζ结构域而无CD28共刺激结构域的CD28跨膜结构域的抗mSOD1CAR(DG05-28tm-3ζ，SEQ ID NO：42)；并产生了包含不具有3ζ结构域的CD28共刺激结构域的抗mSOD1 CAR(DG05-28，SEQ ID NO：43)。
如实施例4中大致描述的，将本实施例的经修饰Treg进行分离、扩增和转导。更具体而言，如实施例4中所述从人PBMC制备第17天的CAR Treg。使用了具有以下抗mSOD1 CAR的PG13逆转录病毒：DG05-28-3ζ(SEQ ID NO：24)；DG05-28tm-10-3ζ(SEQ ID NO：40)；DG05-28tm-44-3ζ(SEQ ID NO：41)、DG05-28tm-3ζ(SEQ ID NO：42)、DG05-28(SEQ ID NO：43)和DG05-28tm(SEQ ID NO：44)。
如下进行本实施例的流式细胞术测定法。通过用生物素化蛋白L(1μg/mL；金斯瑞公司，美国新泽西州皮斯卡特维(Piscataway，NJ，USA))直接标记CAR scFv，随后用链霉亲和素-PE(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)直接标记来测量CAR转导的Treg的百分比。使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI，USA))分析细胞。将仅用链霉亲和素-PE染色的细胞用于确定非特异性背景信号的阈值(参见图16A，六个流式细胞术图的红色垂直线)。
如下进行本实施例的测定法，该测定法包含通过板结合的抗原活化CAR Treg。将96孔ELISA板于4℃以50μL/孔并用PBS中10μg/mL的纯化mutSOD1蛋白包被过夜。将板用PBS漂洗3次，然后用0.1mL/孔的X-VIVOTM-15+10％人血清封闭。将培养基添加至未用mSOD1蛋白包被的对照孔中。以50,000个细胞/0.2mL/孔添加CAR Treg并温育6小时。将细胞转移到96孔细胞培养板孔中并再温育18小时。收集无细胞培养基以供人IL-10 ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)。
现在参见图16A，利用蛋白L染色的流式细胞术结果展示CAR构建体DG05-28-3ζ；DG05-28tm-10-3ζ；DG05-28tm-44-3ζ；DG05-28tm-3ζ；DG05-28和DG05-28tm每一者均在人Treg上表达。
现在参见图16B，DG05-28-3ζ；DG05-28tm-10-3ζ；DG05-28tm-44-3ζ；DG05-28tm-3ζ；DG05-28而非DG05-28tm响应mSOD1抗原而产生IL-10(ELISA)。关于图16B，ns＝不显著；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001，通过学生t检验(n＝3)。
实施例9：靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，在离体扩增并且CAR转导的人Treg中，评价了具有不同共刺激信号传导结构域并且具有或不具有CD3-ζ(3ζ)刺激结构域的抗Aβ CAR的表达和功能。抗Aβ scFvDG03和CD28跨膜(“28tm”)结构域均在所有构建体中，并且小鼠截短型CD19也与CAR在同一构建体上表达。CD3ζ(“3ζ”)接合至来自CD28(“28”)、DAP10(“10”)、CD44(“44”)、4-1BB(“BB”)的共刺激结构域，以产生以下抗Aβ CAR：DG03-28-3ζ(SEQ ID NO：22)；DG03-28tm-10-3ζ(SEQ ID NO：45)；DG03-28tm-44-3ζ(SEQ ID NO：46)；和DG03-28tm-BB-3ζ(SEQ IDNO：47)。额外地，产生了包含不具有刺激或共刺激结构域的CD28跨膜结构域的抗Aβ CAR(DG03-28tm(SEQ ID NO：50))；产生了包含具有CD3ζ结构域而无共刺激结构域的CD28跨膜结构域的抗Aβ CAR(DG03-28tm-3ζ(SEQ ID NO：48))；以及产生了包含CD28跨膜结构域和CD28共刺激结构域但没有CD3ζ结构域的抗Aβ CAR(DG03-28(SEQ ID NO：49))。
如实施例1中大致描述的，将本实施例的经修饰Treg进行分离、扩增和转导。更具体而言，如实施例1中所述从人PBMC制备第17天的CAR Treg。使用了具有以下抗Aβ CAR的PG13逆转录病毒：DG03-28-3ζ(SEQ ID NO：22)、DG03-28tm-10-3ζ(SEQ ID NO：45)、DG03-28tm-44-3ζ(SEQ ID NO：46)、DG03-28tm-BB-3ζ(SEQ ID NO：47)、DG03-28tm-3ζ(SEQ IDNO：48)、DG03-28(SEQ ID NO：49)和DG03-28tm(SEQ ID NO：50)。
如下进行本实施例的流式细胞术测定法。通过用PE抗小鼠CD19(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)间接标记共表达的小鼠截短型CD19来测量CAR转导的Treg的百分比。使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI，USA))分析细胞。将非染色细胞用于设定非特异性背景信号的阈值(参见图17A，七个流式细胞术图的红色垂直线)。
如下制备本实施例的寡聚Aβ。将200μM PBS中的Aβ1-42肽在PBS中于37℃温育7天。将寡聚Aβ稀释至40μM，等分，并在-20℃下保存。
如下进行本实施例的测定法，该测定法包含通过板结合的寡聚Aβ活化CAR Treg。将CAR Treg以50,000个细胞/0.2mL/孔平板接种于组织培养物处理的96孔板中的X-VIVOTM-15+10％人血清(含或不含100nM Aβ)中并温育24小时。收集无细胞培养基以供人IL-10ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)。
现在参见图17A，利用msCD19染色的流式细胞术结果展示CAR构建体DG03-28-3ζ、DG03-28tm-10-3ζ、DG03-28tm-44-3ζ、DG03-28tm-BB-3ζ、DG03-28tm-3ζ、DG03-28和DG03-28tm每一者均在人Treg上表达。
现在参见图17B，DG03-28-3ζ；DG03-28tm-10-3ζ；DG03-28tm-44-3ζ和DG03-28tm-CD3ζ，而非DG03-28tm-BB-3ζ；DG03-28和DG03-28tm响应板结合的寡聚Aβ抗原而产生IL-10(ELISA)。关于图17B，ns＝不显著；*＝p＜0.05；***＝p＜0.001，通过学生t检验(n＝3)。
实施例10：靶向ALS的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，大致根据实施例5中所述的程序评价抗mutSOD1CAR的抗原特异性活性。将经工程改造以表达抗mSOD1 CAR DG05-28-3ζ(SEQ ID NO：24)的离体扩增并经CAR转导的人Treg与用mSOD1预先包被的直径为6.0μm或0.6μm的聚苯乙烯珠(用于模拟在ALS患者的CNS中发展的mSOD1聚集体)共培养，并监测对GITR、PD-1和CTLA-4的细胞表面表达的效应(参见图18)。额外地，通过进行ELISA测定法来评价IL-10的产生(参见图18)。靶向ALS的抗mSOD1 CAR包括了包含DG05-28-CD3ζ(SEQ ID NO：24)的经修饰Treg。
如实施例4中大致描述进行经修饰Treg的分离、扩增和CAR转导。更具体地，如实施例4中所述从人PBMC制备CAR Treg，并且在第10天和第11天将具有抗mSOD1 CAR DG05-28-3ζ的PG13逆转录病毒用于转导。
对于本实施例，如下进行CAR Treg的冷冻保存和解冻后恢复。将第16天的CARTreg在MR.FROSTYTM冷冻容器中于-80℃在90％热灭活FBS和10％DMSO的溶液中以20×106个细胞/mL在冷冻管中冷冻保存24小时，然后转移至液氮。解冻细胞并在PBS中漂洗，在X-VIVOTM-15+10％人血清+500u/mL IL-2中重悬至2×106个细胞/mL，并温育24小时。将细胞离心以团块化(pellet)细胞，重悬于4mL X-VIVOTM-15培养基中，并在4mL的LYMPHOPREPTM分隔介质上以800×g离心20分钟。收集处于分裂间期的细胞，在X-VIVOTM-15中漂洗并团块化细胞。将细胞在X-VIVOTM-15+10％人血清(无IL-2)中重悬至1×106个细胞/mL。
与本实施例的基于珠的测定法一起使用的抗原包被的聚苯乙烯珠的制备如下进行。纯化的生物素化带His标签的人突变型G93A SOD1蛋白(mSOD1)由Roos博士(芝加哥大学医学中心(University of Chicago Medical Center)，美国伊利诺伊州芝加哥市(Chicago，IL，USA))惠赠。将SPHEROTM链霉亲和素包被的颗粒6μm直径的聚苯乙烯(Spherotech公司，目录号为SVP-60-5，美国伊利诺伊州莱克福里斯特市(Lake Forest，IL，USA))和SPHEROTM兔抗6×His包被的颗粒0.6μm直径的聚苯乙烯(Spherotech公司，目录号为HISP-05-2，美国伊利诺伊州莱克福里斯特市)在含无菌1％热灭活FBS的PBS中漂洗。通过以12,000×g微量离心2分钟使珠粒团块化。将珠重悬于含有或不含2μg/mL mSOD1的1％FBS中，并在室温下温育1.5小时团块化细胞，在1％FBS中漂洗，然后重悬于X-VIVOTM-15+10％人血清中。
如下进行本实施例的基于珠的测定法，该测定法包含通过珠结合的抗原活化CARTreg。将CAR Treg以1.6×106个细胞/0.8mL/孔平板接种于组织培养物处理的12孔板中的X-VIVOTM-15+10％人血清中。以4∶1的珠∶细胞比率添加未包被的和mSOD1包被的6μm直径的聚苯乙烯珠。以100∶1的珠∶细胞比率添加未包被的和mSOD1包被的0.6μm直径的聚苯乙烯珠。未向作为纯培养基对照的一些孔添加珠。温育24小时后，收集无细胞培养基以供人IL-10 ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)。收集细胞供流式细胞术以评估细胞表面标志物。用APC抗人GITR(克隆621；BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)、APC抗人PD-1(克隆EH12.2H7；BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)和PE抗人CTLA-4(克隆BNI3；BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)标记细胞。测量平均荧光强度(MFI)，并使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司，美国密歇根州安娜堡市)制备直方图。将非染色细胞用于设定非特异性背景信号的阈值(参见图18，六个流式细胞仪图每一者的垂直线)。
现在参见图18，结果展示，与用mSOD1预先包被的6.0um或0.6um珠共培养的经修饰Treg增加了GITR、PD-1和CTLA-4的细胞表面表达(24小时后的流式细胞术；显示出平均MFI)(参见图18，六个流式细胞术图)。
此外，本实施例的IL-10 ELISA测定法进一步展示了经修饰的人Treg对mSOD1的响应性，因为经修饰的人Treg对mSOD1包被的珠发生了响应，如相对于未用抗原包被的珠或相对于单纯培养基的IL-10产量增加所证明(参见图18，两个上清液的IL-10图)。
实施例11：靶向ALS的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，通过将经修饰Treg与源自表达人mSOD1的转基因小鼠的脊髓组织外植体共培养来评价靶向ALS的经修饰Treg的功能活性。额外地，通过将经修饰Treg与源自表达人mSOD1的转基因小鼠的脊髓、肝脏或肺组织外植体共培养来评价靶向ALS的经修饰Treg的功能活性。经修饰Treg包括了包含DG05-CD28-CD3ζ(在图19A和图19B中称为DG05-28z)(SEQ ID NO：24)的经修饰Treg，以及作为阴性对照的包含抗Aβ CAR(在图19A和图19B中称为DG03-28z)(DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22))的经修饰Treg。
如实施例4中大致描述进行经修饰Treg的分离、扩增和CAR转导。更具体而言，如实施例4中所述从人PBMC制备CAR Treg。在第10天和第11天将具有抗mSOD1 CAR DG05-CD28-CD3ζ或抗Aβ CAR DG03-CD28-CD3ζ的PG13逆转录病毒用于转导。
如下进行CAR Treg的冷冻保存和解冻后恢复。将第16天的CAR Treg在Mr.FROSTYTM冷冻容器中于-80℃在90％热灭活FBS和10％DMSO的溶液中以20×106个细胞/mL在冷冻管中冷冻保存24小时，然后转移至液氮。解冻细胞并在PBS中漂洗，在X-VIVOTM-15+10％人血清+500u/mL IL-2中重悬至2×106个细胞/mL，并温育24小时。将细胞离心以团块化(pellet)细胞，重悬于4mL X-VIVOTM-15培养基中，并在4mL的LYMPHOPREPTM分隔介质上以800×g离心20分钟。收集处于分裂间期的细胞，在X-VIVOTM-15中漂洗并团块化细胞。将细胞在X-VIVOTM-15+10％人血清(无IL-2)中重悬至1×106个细胞/mL。
对于本实施例，如下进行小鼠组织外植体对CAR Treg的活化。在本实施例中使用B6SJL.SOD1-G93A(stock号为002726，The Jackson Laboratory公司，美国缅因州巴港(BarHarbor，ME，USA))和非转基因同窝出生者(littermate)。监测mSOD1转基因小鼠的体重减轻和肢体瘫痪。在不同疾病发展阶段从非转基因小鼠或mSOD1转基因小鼠收集脊髓组织：13周(瘫痪前)、14周(临床发病)、16周(瘫痪)或18周(疾病末期阶段周，定义为体重减轻15％和后肢瘫痪)。还在疾病末期阶段从mSOD1转基因小鼠对肝和肺收集将组织转移到冰冷的X-VIVOTM-15培养基中，切成2mm×2mm的小块，置于无培养基的96孔ELISA板的孔中5分钟，然后将CAR Treg以50,000个细胞/孔添加至0.2mL的X-VIVOTM-15+10％的人血清(不含IL-2)中。温育24小时后，收集无细胞培养基以供人IL-10 ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)。
现在参见图19A，当与脊髓外植体共培养时，靶向mSOD1的DG05-CD28-CD3ζ刺激了IL10的产生，而表达阴性对照CAR(DG03-CD28-CD3ζ)的Treg没有刺激IL-10的产生(ns＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001，通过学生t检验(对于图19A，n＝8))。
现在参见图19B，当与脊髓组织共培养时，靶向mSOD1的DG05-CD28-CD3ζ刺激IL10的产生，但当与肝或肺组织共培养时没有，而当与脊髓、肝或肺组织任一者共培养时，表达阴性对照CAR(DG03-CD28-CD3ζ)的Treg没有刺激IL-10的产生(ns＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001，通过学生t检验(对于图19B，n＝3))。
实施例12：靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，通过使经修饰Treg暴露于寡聚Aβ并监测IL-10和IL-4的mRNA水平和蛋白分泌水平，来评价靶向阿尔茨海默氏病的所述经修饰Treg的功能活性。经修饰Treg包括了包含抗Aβ CAR DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22)的经修饰Treg。
如实施例1中大致描述进行经修饰Treg的分离、扩增和CAR转导。更具体而言，如实施例1中所述从人PBMC制备第17天的CAR Treg。在第10天和第11天将具有抗Aβ CAR DG03-CD28-CD3ζ的PG13逆转录病毒用于转导。
如下进行用于本实施例的寡聚Aβ的制备。将200μM PBS中的Aβ1-42肽在PBS中于37℃温育7天。将寡聚Aβ稀释至40μM，等分，并在-20℃下保存。
对于本实施例，如下进行寡聚Aβ对CAR Treg的活化。将CAR Treg以50,000个细胞/0.2mL/孔平板接种于组织培养物处理的96孔板中的X-VIVOTM-15+10％人血清(含或不含100nM Aβ)中并温育24小时。收集无细胞培养基以供人IL-4ELISA和人IL-10 ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)。
对于本实施例，如下进行定性RT-PCR。将CAR Treg以1.0×106个细胞/1.0mL/孔平板接种于组织培养物处理的12孔板中的X-VIVOTM-15+10％人血清中，并温育过夜。第二天添加寡聚Aβ(100nM)，其中一些孔留下未处理(无抗原)。在将寡聚Aβ添加至细胞后7.5小时收集细胞，然后团块化细胞，然后使用TRIzol试剂(英杰公司，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆市(Waltham，MA，USA))提取RNA。通过分光光度法对洗脱的RNA进行定量，并将1ug用QSCRIPTTM cDNA SuperMix(Quanta Biosciences公司，美国麻萨诸塞州贝弗利市(Beverly，MA，USA))逆转录。反应混合物含有2ng cDNA、200nM dNTP、400nM引物、1×标准Taq缓冲液(New England BioLabs公司)和0.625U的TAQ聚合酶(BioLabs公司)，总反应体积为25μl。所用引物的序列如下：人β-肌动蛋白(101bp产物)：正向，5′-GGC CGA GGA CTT TGA TTG C-3′(SEQ ID NO：255)；反向，5′-TGG GGT GGCTTT TAG GAT GG-3′(SEQ ID NO：256)；人IL-4(148bp产物)：正向，5′-GCT TCC CCC TCTGTT CTT CC-3′(SEQ ID NO：257)；反向，5′-GAT GTC TGT TAC GGT CAA CTC G-3′(SEQ IDNO：258)；和人IL-10(82bp产物)：正向，5′-TCA AGG CGC ATG TGA ACT CC-3′(SEQ ID NO：259)；反向，5′-CAG GGA AGA AAT CGA TGA CAG C-3′(SEQ ID NO：260)。将样品置于2720热循环仪(应用生物系统公司(Applied BioSystems)，美国加利福尼亚州福斯特城(FosterCity，CA，USA))中，于95℃达2分钟，随后依次是95℃下30秒、60℃下30秒，然后68℃下35秒的循环阶段，达35个循环。将扩大(amplification)产物在含有1×SYBRTM Safe DNA凝胶染料(英杰公司，赛默飞世尔科技公司，美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆市)的1.5％琼脂糖凝胶上在105V电泳35分钟。使用Alpha Imager EP凝胶记录系统(Alpha Innotech公司，美国加利福尼亚州圣利安卓市(San Leandro，CA，USA))对条带进行显影并在302nm下成像。
现在参见图20A，通过RT-PCR凝胶染色监测，与未暴露于寡聚Aβ的经修饰Treg相比，暴露于寡聚Aβ的经修饰Treg展示出IL-10和IL-4mRNA水平的增加。β-肌动蛋白染色充当对照(参见图20A)。
现在参见图20B，通过ELISA监测，与未暴露于寡聚Aβ的经修饰Treg相比，暴露于寡聚Aβ的经修饰Treg展示出IL-10和IL-4产量的增加。
实施例13：靶向ALS的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，在下述测定法中评价抗mutSOD1 CAR的抗原特异性抗炎活性。经修饰Treg包括了包含抗mSOD1 CAR DG05-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：24)的经修饰Treg。
如实施例4中大致描述进行经修饰Treg的分离、扩增和CAR转导。更具体而言，如实施例4中所述从人PBMC制备CAR Treg。在第10天和第11天将具有抗mSOD1 CAR DG05-CD28-CD3ζ的PG13逆转录病毒用于转导。
对于本实施例，如下进行CAR Treg的冷冻保存和解冻后恢复。将第16天的CARTreg在Mr.FROSTYTM冷冻容器中于-80℃下在90％热灭活FBS和10％DMSO的溶液中以20×106个细胞/mL在冷冻管中冷冻保存24小时，然后转移至液氮。解冻细胞并在PBS中漂洗，在X-VIVOTM-15+10％人血清+500u/mL IL-2中重悬至2×106个细胞/mL，并温育24小时。将细胞离心以团块化(pellet)细胞，重悬于4mL X-VIVOTM-15培养基中，并在4mL的LYMPHOPREPTM分隔介质上以800×g离心20分钟。收集处于分裂间期的细胞，在X-VIVOTM-15中漂洗并团块化细胞。将细胞在X-VIVOTM-15+10％人血清(无IL-2)中重悬至1×106个细胞/mL。
如下进行本实施例的CAR Treg的预活化。将96孔ELISA板于4℃以50μL/孔并用PBS中10μg/mL的纯化mutSOD1蛋白或5ug/mL OKT3抗体(抗CD3)包被过夜。未活化的CAR Treg的对照孔留下不包被。将板用PBS漂洗3次，然后用0.1mL/孔的X-VIVOTM-15+10％人血清封闭。以100,000个细胞/0.2mL/孔添加CAR Treg并温育6小时。然后收集细胞，并在X-VIVOTM-15+10％人血清中稀释至500,000个CAR Treg/mL。
如下进行本实施例的预活化的CAR Treg和单核细胞/巨噬细胞的共培养。通过CD14负选择(StemCell公司19359)从人PBMC(与CAR Treg不同的供体)分离单核细胞，并在96孔组织培养物处理的白色发光检测仪板(
Figure BDA0002663127410001181
3719)中以50,000个细胞/0.1mL/孔温育6小时。以40,000个细胞/0.1mL/孔添加未活化的、mSOD1预活化的或抗CD3预活化的CAR Treg。将共培养的细胞以0.2mL/孔的最终体积温育2天。
如下进行本实施例的CAR Treg/巨噬细胞共培养物的刺激。温育2天后，通过添加豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA；40nM)、酵母聚糖颗粒(20μg/mL)或脂多糖(LPS；20ng/mL)刺激CAR Treg/巨噬细胞共培养物。为了测量超氧化物生成，将光泽精(lucigenin)(5μM)与PMA或酵母聚糖添加，并在6小时内的7个时间点在Centro LB 960微孔板发光检测仪上测量光泽精介导的生物发光(2秒曝光)。为了通过ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)测量TNF-α，在添加LPS后6小时收集无细胞培养基。
现在参见图21A，用mSOD1或抗CD3抗体预刺激的包含DG05-CD28-CD3ζ的经修饰Treg展示出对PMA刺激的超氧化物生成的抑制(如通过光泽精介导的发光所测量的)。关于图21A，ns＝不显著；**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
现在参见图21B，用mSOD1或抗CD3抗体预刺激的包含DG05-CD28-CD3ζ的经修饰Treg展示出对酵母聚糖刺激的超氧化物生成的抑制(如通过光泽精介导的发光所测量的)。关于图21B，ns＝不显著；**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
现在参见图21C，如通过ELISA在24小时的时候测量的，用mSOD1预刺激的包含DG05-CD28-CD3ζ的经修饰Treg展示出对LPS刺激的TNF-α产生的抑制，而用抗CD3抗体预刺激的包含DG05-CD28-CD3ζ的经修饰Treg未展示出对LPS刺激的TNF-α产生的抑制。关于图21C，ns＝不显著；**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
实施例14：靶向阿尔茨海默氏病的经修饰Treg的功能活性
在本实施例中，在下述测定法中评价抗Aβ CAR的抗原特异性抗炎活性。经修饰Treg包括了包含抗Aβ CAR DG03-CD28-CD3ζ(SEQ ID NO：22)的经修饰Treg。
如实施例1中大致描述进行经修饰Treg的分离、扩增和CAR转导。更具体而言，如实施例1中所述从人PBMC制备CAR Treg。在第10天和第11天将具有抗Aβ CAR DG03-CD28-CD3ζ的PG13逆转录病毒用于转导。
对于本实施例，如下进行经修饰CAR Treg的冷冻保存和解冻后恢复。将第16天的CAR Treg在Mr.FROSTYTM冷冻容器中于-80℃下在90％热灭活FBS和10％DMSO的溶液中以20×106个细胞/mL在冷冻管中冷冻保存24小时，然后转移至液氮。解冻细胞并在PBS中漂洗，在X-VIVOTM-15+10％人血清+500u/mL IL-2中重悬至2×106个细胞/mL，并温育24小时。将细胞离心以团块化(pellet)细胞，重悬于4mL X-VIVOTM-15培养基中，并在4mL的LYMPHOPREPTM分隔介质上以800×g离心20分钟。收集处于分裂间期的细胞，在X-VIVOTM-15中漂洗并团块化细胞。将细胞在X-VIVOTM-15+10％人血清(无IL-2)中重悬至1×106个细胞/mL。
如下进行本实施例的经修饰CAR Treg的预活化。将96孔ELISA板于4℃以50μL/孔并用PBS中3μg/mL的Aβ1-42肽或5ug/mL的OKT3抗体(抗CD3)包被过夜。未活化的CAR Treg的对照孔留下不包被。将板用PBS漂洗3次，然后用0.1mL/孔的X-VIVOTM-15+10％人血清封闭。以100,000个细胞/0.2mL/孔添加CAR Treg并温育6小时。然后收集细胞，并在X-VIVOTM-15+10％人血清中稀释至500,000个CAR Treg/mL。
如下进行本实施例的预活化的经修饰CAR Treg和单核细胞/巨噬细胞的共培养。通过CD14负选择(BioLegend公司，480060，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)从人PBMC(与CARTreg不同的供体)分离单核细胞，并在96孔组织培养物处理的白色发光检测仪板(
Figure BDA0002663127410001201
3719)中以50,000个细胞/0.1mL/孔温育6小时。以50,000个细胞/0.1mL/孔添加未活化的、Aβ预活化的或抗CD3预活化的CAR Treg。将共培养的细胞以0.2mL/孔的最终体积温育2天。
如下进行本实施例的经修饰CAR Treg/巨噬细胞共培养物的刺激。温育2天后，通过添加豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA；40nM)、酵母聚糖颗粒(20μg/mL)或脂多糖(LPS；20ng/mL)刺激CAR Treg/巨噬细胞共培养物。为了测量超氧化物生成，将光泽精(lucigenin)(5μM)与PMA或酵母聚糖添加，并在6小时内的6个时间点在Centro LB 960微孔板发光检测仪上测量光泽精介导的生物发光(2秒曝光)。为了通过ELISA(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)测量IL-6，在添加LPS后24小时收集无细胞培养基。
现在参见图22A，用板结合的Aβ抗原或用抗CD3抗体预刺激的包含DG03-CD28-CD3ζ的经修饰Treg抑制了PMA刺激的超氧化物生成(如通过光泽精介导的发光所测量的)。关于图22A，**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
现在参见图22B，用板结合的Aβ抗原或用抗CD3抗体预刺激的包含DG03-CD28-CD3ζ的经修饰Treg抑制了酵母聚糖刺激的超氧化物生成(如通过光泽精介导的发光所测量的)。关于图22B，**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
现在参见图22C，用板结合的Aβ抗原或用抗CD3抗体预刺激的包含DG03-CD28-CD3ζ的经修饰Treg抑制了LPS刺激的IL-6产生，如在24小时的时后通过ELISA测量的。关于图22C，**＝p＜0.01，相对于未活化的CAR Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
实施例15：经工程改造以表达抗氧化剂或生长因子的神经退行性疾病修饰分子(NDMM)Treg的功能活性
在本实施例中，评价了在人Treg中表达的神经退行性疾病修饰分子(NDMM)的细胞保护活性。
如下进行本实施例的NDMM-Treg的分离、扩增和转导。如实施例1、实施例4和实施例6中所述从人PBMC制备NDMM工程改造Treg。代替CAR构建体，在第10天和第11天用于Treg转导的PG13逆转录病毒具有以下的NDMM构建体：Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO：51)、人过氧化氢酶(SEQ ID NO：52)、脑源性神经营养因子(BDNF)(SEQ ID NO：53)和胰岛素生长因子-1(IGF-1)(SEQ ID NO：54)。所述NDMM构建体共表达截短型小鼠CD19以监测转导效率。模拟物转导的Treg(无PG13逆转录病毒)用作对照。
如下进行本实施例的NDMM Treg的流式细胞术。通过用PE抗小鼠CD19(BioLegend公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)间接标记共表达的小鼠截短型CD19来测量NDMM转导的Treg的百分比。使用ACCURITM C6流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，美国密歇根州安娜堡市(Ann Arbor，MI，USA))分析细胞。将非染色细胞用于设定非特异性背景信号的阈值。
如下进行本实施例的NDMM Treg的冷冻保存和解冻后恢复。将第17天的CAR Treg在Mr.FROSTYTM冷冻容器中于-80℃下在90％热灭活FBS和10％DMSO的溶液中以20×106个细胞/mL在冷冻管中冷冻保存24小时，然后转移至液氮。解冻细胞并在PBS中漂洗，在X-VIVOTM-15+10％人血清+500u/mL IL-2中重悬至2×106个细胞/mL，并温育24小时。将细胞离心以团块化细胞，重悬于4mL X-VIVOTM-15培养基中，并在4mL的LYMPHOPREP分隔介质上以800×g离心20分钟。收集处于分裂间期的细胞，在X-VIVOTM-15中漂洗并团块化细胞。将细胞在不完全杜尔贝科高葡萄糖改良伊格尔培养基(DMEM；Hyclone 30022)中重悬至2×106个细胞/mL，该培养基补充有10％热灭活FBS、MEM非必需氨基酸溶液、HEPES(10mM)和青霉素/链霉素溶液。
如下进行本实施例的NDMM-Treg和表达荧光素酶的SH-SY5Y神经元细胞的共培养。使先前经转导以表达萤光素酶(Luc)的人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y在完全DMEM中生长至60％-90％的融合度，所述完全DMEM补充有10％热灭活FBS、MEM非必需氨基酸溶液、HEPES(10mM)、丙酮酸钠(1mM)、2-巯基乙醇(50μM)和青霉素/链霉素溶液。通过胰蛋白酶消化收集Luc-SH-SY5Y细胞，通过以500×g离心5分钟团块化细胞，重悬于不完全DMEM(不含丙酮酸钠和2-巯基乙醇)中，并以10,000个细胞/0.1mL/孔平板接种于96孔组织培养物处理的白色发光检测仪板(
Figure BDA0002663127410001221
3719)中。温育3小时后，将不完全DMEM培养基中的NDMM-Treg或模拟物-Treg以100,000Treg/0.05mL/孔(最终体积为0.15mL/孔)添加至Luc-SH-SY5Y细胞。将共培养的细胞温育24小时。
本实施例的过氧化氢毒性测定法如下进行。在NDMM-Treg/luc-SH-SY5Y共培养物温育24小时后，添加50μL不完全DMEM培养基，添加终浓度为0、20、40、60、80和320μM的过氧化氢(H2O2)。将暴露于H2O2的共培养物温育24小时，然后通过生物发光测量存活的luc-SH-SY5Y神经元细胞的相对数量。向每个孔添加荧光素(50μg/mL)，温育30分钟，并在Centro LB960微孔板发光检测仪上测量生物发光(2秒曝光)。
现在参见图23A，经过工程改造以表达抗氧化剂(Keap1抑制剂肽或过氧化氢酶)的经离体扩增且转导的人Treg保护了人SH-SY5Y神经元细胞(表达荧光素酶)免受过氧化氢毒性。关于图23A，ns＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01，相对于模拟物转导的Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
现在参见图23B，经工程改造以表达生长因子(BDNF或IGF-1)的经离体扩增并转导的人Treg保护了人SH-SY5Y神经元细胞(表达荧光素酶)免受过氧化氢毒性。关于图23B，ns＝不显著；*＝p＜0.05；**＝p＜0.01，相对于模拟物转导的Treg，通过邓尼特多重比较检验(n＝3)。
在前面的程序中，已经描述了多样步骤。然而，将显而易见的是，在不脱离如所附权利要求书中所阐述的示例性程序的较广泛范围的情况下，可以对其进行多样修饰和改变，并且可实施额外的程序。
附录A–氨基酸和核酸序列
DG01 SCFV(SEQ ID NO:1)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
DG02 SCFV(SEQ ID NO:2)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIK
DG03 SCFV(SEQ ID NO:3)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK
DG04 SCFV(SEQ ID NO:4)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIK
DG05 SCFV(SEQ ID NO:5)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
DG06 SCFV(SEQ ID NO:6)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIK
DG07 SCFV(SEQ ID NO:7)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIK
DG08 SCFV(SEQ ID NO:8)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVL
DG09 SCFV(SEQ ID NO:9)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVL
DG10 SCFV(SEQ ID NO:10)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIK
DG11 SCFV(SEQ ID NO:11)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:12)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
(G4S)3接头(SEQ ID NO:13)
GGGGSGGGGSGGGGS
T2A(SEQ ID NO:14)
RAKRSGSGEGRGSLITCGDVEENPGP
P2A(SEQ ID NO:15)
RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
CD3Z(SEQ ID NO:16)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人β淀粉样蛋白，同源异构体APP770(标识符：P05067-1)(SEQ ID NO:17)
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN
人超氧化物歧化酶，标识符：P00441-1(SEQ ID NO:18)MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
人α突触核蛋白，同源异构体1(标识符：P37840-1)(SEQ ID NO:19)
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
DG01.28.Z CAR(SEQ ID NO:20)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG02.28.Z CAR(SEQ ID NO:21)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG03.28.Z CAR(SEQ ID NO:22)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG04.28.Z CAR(SEQ ID NO:23)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG05.28.Z CAR(SEQ ID NO:24)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG06.28.Z CAR(SEQ ID NO:25)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG07.28.Z CAR(SEQ ID NO:26)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG08.28.Z CAR(SEQ ID NO:27)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG09.28.Z CAR(SEQ ID NO:28)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG10.28.Z CAR(SEQ ID NO:29)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
DG11.28.Z CAR(SEQ ID NO:30)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
信号序列(SEQ ID NO:31)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHS
人CD28铰链(SEQ ID NO:32)
VKGKHLCPSPLFPGPSKP
小鼠CD28铰链(SEQ ID NO:33)
IKEKHLCHTQSSPKL
人CD8A铰链(SEQ ID NO:34)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
人DAP10铰链(SEQ ID NO:35)
QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP
人CD28 TM(SEQ ID NO:36)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
小鼠CD28 TM(SEQ ID NO:37)
FWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT
人CD8A TM(SEQ ID NO:38)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
人DAP10 TM(SEQ ID NO:39)
LLAGLVAADAVASLLIVGAVF
DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(SEQ ID NO:40)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(SEQ ID NO:41)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG05-CD28tm-CD3ζ(SEQ ID NO:42)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG05-CD28(SEQ ID NO:43)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
DG05-CD28tm(SEQ ID NO:44)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD
DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(SEQ ID NO:45)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(SEQ ID NO:46)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(SEQ ID NO:47)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG03-CD28tm-CD3ζ(SEQ ID NO:48)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
DG03-CD28(SEQ ID NO:49)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
DG03-CD28tm(SEQ ID NO:50)
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
用于表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)的构建体(SEQ ID NO:51)
MMDLELPPPGLPSQQDMDLIDILWRQDIDLGVSREVFDFSQRRKEYELEKQKKLEKERQEQLQKEQEKAFFAQLQLDEETGEFLPIQPAQ
用于表达NDMM人过氧化氢酶的构建体(SEQ ID NO:52)
MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL
用于表达NDMM BDNF的构建体(SEQ ID NO:53)
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
用于表达NDMM IGF-1的构建体(SEQ ID NO:54)
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGWPKTHPGGEQKEGTEASLQIRGKKKEQRREIGSRNAECRGKKGK
DG01 SCFV(SEQ ID NO:201)
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccaggtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgccagcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggtggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctccagggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtattactgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcacaacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgacatccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcagggccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgatctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttcacactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcacccccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaa
DG02 SCFV(SEQ ID NO:202)
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgaggtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc tgtgccgccagcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct ggcaaaggcc tcgaatgggtggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc gacaacgtga agggcaggtt caccatctccagggacaata gcaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtactactgcgtgag gtacgaccac tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtccagcgccgga ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccagtcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc cagagcctcctggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga caaagccccc agaggctgatctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga ttctccggct ccggcagcgg caccgacttcacactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttccccaggacctt cggccaggga accaaggtgg agatcaag
DG03 SCFV(SEQ ID NO:203)
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgaggtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc tgtgccgcctccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct ggcaagggcc tggaactggtggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct gatagcgtga agggcaggtt caccatctccagggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtactactgcgccag cggcgactat tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcagcggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtcacacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat ggcgacacctacctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc tacaaggtga gcaacaggttctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga accgatttca ccctcaagat cagcagagtggaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggcaccaaggtgga gatcaaa
DG04 SCFV(SEQ ID NO:204)
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaagtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc tgtgctgccagcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct ggcaaaggcc tggagtgggtgagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc gactccgtga agggcaggtt caccatctccagggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtactactgtgccag gggcaagggc aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggacagggcaccctg gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggaggaagcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc acactgagctgcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag aaacctggcc aggcccccaggctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg cctgccagat ttagcggcag cggcagcggcaccgacttta ccctgaccat ttccagcctg gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatctacaacatgcc tatcaccttc ggccagggca caaaagtgga aatcaag
DG05 SCFV(SEQ ID NO:205)
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaagtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggcagcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggtcagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagggacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactactgcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgagctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccagagccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtgagcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaacagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagctccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggccagggcacaaa ggtggagatc aag
DG06 SCFV(SEQ ID NO:206)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccaggtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgccagcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggtggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagcagagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtacttctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgctggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagcccttccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagctggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgcagtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctgcaacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggcaccagactgga gatcaag
DG07 SCFV(SEQ ID NO:207)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgaggtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgccagcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggtggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagcagggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtactactgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcggcggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccacactgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctggcctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccggcatccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcctgaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctggagatcaag
DG08 SCFV(SEQ ID NO:208)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccaggtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagccagcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggatgggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgaccaccgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtactactgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgacagtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagcttacacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgcccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacaccgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatctccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtggtgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tc
DG09 SCFV(SEQ ID NO:209)
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagaggtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc tgtgccgtaagcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca gggcagggac tccagtgggtagcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatcatctcacgag acgattcccg caacatgttg tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctgtttactactg tacttcagcg cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggaggctctggaggg gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgtaagccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc cactggtatcagcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa cgccctagcg gggttcccgaacgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaagcggattact attgccaatc acctgatagt acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttgactgtactg
DG10 SCFV(SEQ ID NO:210)
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccaggtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcctccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggatgggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaacagggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtactactgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcagcaccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgacatcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaagagcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggccatccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagcggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgccagcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaa
DG11 SCFV(SEQ ID NO:211)
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaagtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacctctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggtggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcaccatatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcgatgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcacggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatgacacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaaatatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgcttctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaactgatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtcacgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaag
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:212)
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaaactactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactg
(G4S)3接头(SEQ ID NO:213)
ggcggaggcg gatcaggagg aggaggatca ggcggaggag gatca
T2A(SEQ ID NO:214)
agagccaaaa ggtctggctc cggtgagggc agaggaagtc ttataacatg cggtgacgtggaggagaatc ccggccct
P2A(SEQ ID NO:215)
agagccaaaa ggtccggaag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgacgtggaagaga atcctggccc c
CD3Z(SEQ ID NO:216)
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DG01.28.Z CAR(SEQ ID NO:220)
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccaggtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgccagcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggtggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctccagggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtattactgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcacaacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgacatccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcagggccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgatctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttcacactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcacccccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaagc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaagtcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctatagcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtgactacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacgcgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccagcagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaagagacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatgaactgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaaggggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcaggccctgccccc t
DG02.28.Z CAR(SEQ ID NO:221)
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DG03.28.Z CAR(SEQ ID NO:222)
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DG04.28.Z CAR(SEQ ID NO:223)
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atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaagtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggcagcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggtcagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagggacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactactgcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgagctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccagagccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtgagcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaacagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagctccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggccagggcacaaa ggtggagatc aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccggaccttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaacagtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatgactccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagcctatcgctccaag cttagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccagctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggaccctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataagatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctttaccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccct
DG06.28.Z CAR(SEQ ID NO:225)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccaggtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgccagcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggtggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagcagagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtacttctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgctggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagcccttccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagctggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgcagtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctgcaacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggcaccagactgga gatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttctaagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcctttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactccccgccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctccaagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctataacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgagatggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggcggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccagggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
DG07.28.Z CAR(SEQ ID NO:226)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgaggtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgccagcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggtggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagcagggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtactactgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcggcggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccacactgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctggcctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccggcatccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcctgaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctggagatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagcccttttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattattttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccgggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttagagtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctcaatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaaagccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggcctacagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagtacagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
DG08.28.Z CAR(SEQ ID NO:227)
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccaggtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagccagcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggatgggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgaccaccgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtactactgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgacagtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagcttacacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgcccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacaccgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatctccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtggtgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tcgctagcgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccctatttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttgctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactacatgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgacttcgcagcctat cgctccaagc ttagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggccagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtggccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgcagaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcacgatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgccccct
DG09.28.Z CAR(SEQ ID NO:228)
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DG10.28.Z CAR(SEQ ID NO:229)
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccaggtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcctccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggatgggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaacagggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtactactgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcagcaccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgacatcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaagagcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggccatccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagcggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgccagcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaagcta gcgtgaaagggaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggtggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagaggagcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattaccagccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc aagcttagag tgaagttcag caggagcgcagacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagtacgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctcaggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggcgagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacgacgcccttca catgcaggcc ctgccccct
DG11.28.Z CAR(SEQ ID NO:230)
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaagtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacctctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggtggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcaccatatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcgatgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcacggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatgacacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaaatatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgcttctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaactgatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtcacgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaaggctagc gtgaaaggga aacacctttgtccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggcttgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgcacagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgccccaccacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa gcttagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcgtaccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttggacaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgtacaatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggaggggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcacatgcaggccct gccccct
信号序列(SEQ ID NO:231)
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccac
人CD28铰链(SEQ ID NO:232)
gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gccc
小鼠CD28铰链(SEQ ID NO:233)
ataaaagaga aacatctttg tcatactcag tcatctccta agctg
人CD8A铰链(SEQ ID NO:234)
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctgtccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcctgtgat
人DAP10铰链(SEQ ID NO:235)
cagacgaccc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctcctgttccggat gtgggtccct ctctctgccg
人CD28 TM(SEQ ID NO:236)
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtggcctttatta ttttctgggt g
小鼠CD28 TM(SEQ ID NO:237)
ttttgggcac tggtcgtggt tgctggagtc ctgttttgtt atggcttgct agtgacagtggctctttgtg ttatctggac a
人CD8A TM(SEQ ID NO:238)
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatcaccctttact gc
人DAP10 TM(SEQ ID NO:239)
ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg ttc
DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(SEQ ID NO:240)
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DG05-CD28(SEQ ID NO:243)
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DG05-CD28tm(SEQ ID NO:244)
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DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(SEQ ID NO:245)
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DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(SEQ ID NO:246)
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DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(SEQ ID NO:247)
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DG03-CD28tm-CD3ζ(SEQ ID NO:248)
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DG03-CD28(SEQ ID NO:249)
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
DG03-CD28tm(SEQ ID NO:250)
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
用于表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)的构建体(SEQ ID NO:251)
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用于表达NDMM人过氧化氢酶的构建体(SEQ ID NO:252)
ATGGCAGACAGTCGAGACCCTGCTagcGACCAAATGCAACATTGGAAAGAGCAACGGGCGGCCCAGAAAGCCGACGTTTTGACCACTGGGGCAGGTAATCCTGTTGGAGATAAGCTGAACGTcATcACGGTTGGACCCCGGGGACCGCTGCTCGTTCAAGACGTGGTTTTTACGGATGAGATGGCCCATTTTGATCGAGAGAGGATACCAGAAAGGGTTGTGCACGCTAAGGGCGCAGGTGCCTTCGGATATTTCGAGGTAACTCACGACATTACTAAGTATAGCAAGGCCAAGGTATTTGAACACATTGGCAAGAAGACGCCGATAGCGGTCCGATTCAGTACAGTGGCGGGCGAGTCAGGTTCAGCCGATACCGTGAGAGATCCGAGAGGATTTGCCGTGAAATTTTATACAGAGGACGGCAACTGGGACTTGGTAGGAAACAATACCCCAATATTTTTCATAAGGGACCCAATCCTTTTTCCCAGCTTTATTCATTCACAGAAGCGGAACCCACAAACGCACTTGAAAGATCCTGACATGGTGTGGGATTTTTGGAGCTTGAGGCCAGAGAGCCTGCACCAAGTGAGCTTCTTGTTCAGCGACAGAGGCATACCGGACGGTCATAGACACATGAACGGTTACGGTAGTCACACCTTCAAACTGGTGAACGCCAACGGAGAGGCTGTCTATTGTAAGTTCCACTATAAAACCGATCAAGGCATCAAAAACCTGAGCGTAGAGGACGCAGCCCGCCTTTCTCAAGAAGATCCAGACTATGGGATCCGGGATCTCTTTAACGCCATAGCTACGGGTAAATATCCCTCTTGGACGTTCTATATCCAGGTAATGACATTCAATCAAGCAGAGACTTTCCCCTTTAACCCGTTTGACCTTACTAAAGTATGGCCGCATAAGGACTACCCTCTGATTCCCGTCGGCAAACTCGTGCTTAACAGGAATCCAGTCAACTATTTCGCAGAAGTCGAGCAAATCGCCTTTGACCCTTCTAACATGCCGCCGGGAATCGAAGCGTCACCGGACAAGATGCTTCAAGGTCGGCTTTTCGCATACCCCGACACTCACCGACACAGACTGGGTCCGAATTATCTTCACATACCTGTCAACTGCCCATATAGAGCACGCGTTGCGAACTACCAGCGCGATGGTCCGATGTGCATGCAGGACAACCAGGGGGGGGCACCCAACTATTATCCAAATTCATTTGGGGCGCCGGAACAACAACCGTCAGCCCTTGAACACTCCATCCAGTATTCTGGCGAAGTAAGACGCTTCAACACGGCTAATGATGACAACGTTACACAGGTTAGAGCGTTTTATGTGAACGTCTTGAACGAGGAACAACGGAAACGACTTTGCGAAAACATAGCGGGTCATTTGAAAGATGCTCAGATTTTTATCCAAAAAAAAGCCGTCAAAAATTTTACCGAAGTCCACCCCGATTACGGTTCACATATTCAGGCCCTGTTGGATAAGTACAACGCGGAAAAGCCCAAGAATGCAATACACACGTTTGTTCAGAGCGGGAGCCACCTCGCTGCTCGAGAGAAAGCAAATCTG
用于表达NDMM BDNF的构建体(SEQ ID NO:253)
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用于表达NDMM IGF-1的构建体(SEQ ID NO:254)
ATGGGGAAAATCTCCTCTCTCCCTACCCAGTTGTTCAAGTGTTGCTTTTGTGACTTCTTGAAGGTAAAAATGCACACTATGTCATCCAGTCACCTTTTTTATTTGGCTCTGTGCCTCCTCACATTCACCAGTTCAGCTACTGCCGGGCCTGAAACACTCTGCGGCGCCGAACTCGTTGATGCGCTTCAATTCGTGTGTGGAGATAGGGGGTTTTACTTTAACAAGCCGACGGGTTATGGTAGCTCAAGTAGACGAGCGCCACAGACTGGAATAGTAGATGAATGCTGTTTCCGCTCATGCGACCTTCGCAGATTGGAAATGTACTGCGCTCCTCTTAAACCAGCAAAGAGTGCGCGGTCCGTGCGAGCCCAACGACATACCGATATGCCAAAAACCCAGAAATATCAGCCGCCGTCTACCAACAAGAACACCAAGAGTCAGAGGAGAAAGGGTTGGCCCAAGACGCACCCGGGTGGCGAACAAAAAGAAGGTACTGAGGCAAGTTTGCAAATTCGAGGAAAGAAGAAAGAACAACGAAGAGAGATAGGTTCTCGCAATGCGGAATGTCGAGGCAAAAAAGGTAAG
正向引物人β-肌动蛋白(SEQ ID NO:255)
GGC CGA GGA CTT TGA TTG C
反向引物人β-肌动蛋白(SEQ ID NO:256)
TGG GGT GGC TTT TAG GAT GG
正向引物人IL-4(SEQ ID NO:257)
GCT TCC CCC TCT GTT CTT CC
反向引物人IL-4(SEQ ID NO:258)
GAT GTC TGT TAC GGT CAA CTC G
正向引物人IL-10(SEQ ID NO:259)
TCA AGG CGC ATG TGA ACT CC
反向引物人IL-10(SEQ ID NO:260)
CAG GGA AGA AAT CGA TGA CAG C
序列表
<110> 达特茅斯学院理事会
<120> 用于治疗神经退行性疾病和障碍的嵌合抗原受体
<130> 43252.2613
<140> 待分配
<141> 同上
<150> 62/628,632
<151> 2018-02-09
<160> 260
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG01 SCFV
<400> 1
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr
115 120 125
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265
<210> 2
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG02 SCFV
<400> 2
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
165 170 175
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
195 200 205
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
245 250 255
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265
<210> 3
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03 SCFV
<400> 3
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys
<210> 4
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG04 SCFV
<400> 4
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr
115 120 125
Val Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
165 170 175
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
180 185 190
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
195 200 205
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
225 230 235 240
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met
245 250 255
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265
<210> 5
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05 SCFV
<400> 5
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys
260
<210> 6
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG06 SCFV
<400> 6
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Val
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Ile Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
180 185 190
Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
245 250 255
Glu Ile Lys
<210> 7
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG07 SCFV
<400> 7
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile
35 40 45
Ser Gly Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Gly
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Met Ala Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
180 185 190
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
195 200 205
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Arg Ser Asn Trp Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250 255
<210> 8
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG08 SCFV
<400> 8
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Asn Phe
35 40 45
Ile Asp Phe His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ser Asn Pro Gln Ser Gly Asn Ser Ser Ser Ala
65 70 75 80
Gln Arg Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Met Ser
85 90 95
Ala Ala Tyr Met Asp Leu Asn Trp Leu Thr Leu Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Pro His Asp Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Phe Asp
115 120 125
Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu
145 150 155 160
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile
165 170 175
Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys His Tyr Ala His Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Ile Val Val Ile Tyr Lys Asp Thr Glu
195 200 205
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr
210 215 220
Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala His
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Val Ser Ser Thr Tyr Val Val Phe Gly
245 250 255
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
260
<210> 9
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG09 SCFV
<400> 9
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Asp Phe
35 40 45
Glu Lys Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Val Ala Arg Ile Lys Ser Thr Ala Asp Gly Gly Thr Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Ala Pro Val Glu Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Arg Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
145 150 155 160
Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Glu Ala Leu Pro
165 170 175
Met Gln Phe Ala His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Val
180 185 190
Ile Val Val Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly
210 215 220
Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Asp Ser
225 230 235 240
Thr Asn Thr Tyr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250 255
<210> 10
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG10 SCFV
<400> 10
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ile Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu
115 120 125
Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu
165 170 175
Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Pro
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
210 215 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
245 250 255
Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
<210> 11
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG11 SCFV
<400> 11
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Gly Tyr Arg Pro Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met
145 150 155 160
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr
180 185 190
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
260 265
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 14
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Ile Thr
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 15
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3Z
<400> 16
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 17
<211> 770
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β淀粉样蛋白，同源异构体APP770（标识符：P05067-1）
<400> 17
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
1 5 10 15
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
20 25 30
Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
35 40 45
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu
65 70 75 80
Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
85 90 95
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
100 105 110
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu
145 150 155 160
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
165 170 175
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 215 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
260 265 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290 295 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr
325 330 335
Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr
340 345 350
Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala
355 360 365
Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp
370 375 380
Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala
385 390 395 400
Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala
405 410 415
Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile
420 425 430
Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn
435 440 445
Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met
450 455 460
Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu
465 470 475 480
Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys
485 490 495
Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe
500 505 510
Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser
515 520 525
Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser
530 535 540
Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp
545 550 555 560
Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val
565 570 575
Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala
580 585 590
Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro
595 600 605
Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe
610 615 620
Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val
625 630 635 640
Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser
645 650 655
Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp
660 665 670
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
675 680 685
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
690 695 700
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu
705 710 715 720
Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val
725 730 735
Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met
740 745 750
Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met
755 760 765
Gln Asn
770
<210> 18
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人超氧化物歧化酶，标识符：P00441-1
<400> 18
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145 150
<210> 19
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人α-突触核蛋白，同源异构体1（标识符：P37840-1）
<400> 19
Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val
35 40 45
Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr
50 55 60
Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys
65 70 75 80
Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys
85 90 95
Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro
115 120 125
Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala
130 135 140
<210> 20
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG01.28.Z CAR
<400> 20
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr
115 120 125
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys
260 265 270
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
275 280 285
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
290 295 300
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
305 310 315 320
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
325 330 335
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
340 345 350
Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro
465
<210> 21
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG02.28.Z CAR
<400> 21
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser
165 170 175
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu
180 185 190
Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
195 200 205
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
225 230 235 240
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr
245 250 255
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys
260 265 270
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
275 280 285
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
290 295 300
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
305 310 315 320
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
325 330 335
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
340 345 350
Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro
465
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<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
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Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
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Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
325 330 335
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
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Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
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Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
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Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
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Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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165 170 175
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180 185 190
Ile Val Val Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Asn Thr Tyr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250 255
Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
260 265 270
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
275 280 285
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
290 295 300
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
305 310 315 320
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
325 330 335
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
355 360 365
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
370 375 380
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
385 390 395 400
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
405 410 415
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
420 425 430
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
435 440 445
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455
<210> 29
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG10.28.Z CAR
<400> 29
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Lys Arg Lys Tyr Ser
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ile Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Asp His Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Leu
115 120 125
Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu
165 170 175
Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Pro
195 200 205
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
210 215 220
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
225 230 235 240
Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
245 250 255
Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
275 280 285
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
290 295 300
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
305 310 315 320
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
325 330 335
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
340 345 350
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
355 360 365
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
385 390 395 400
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
405 410 415
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
420 425 430
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
435 440 445
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
450 455 460
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470
<210> 30
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG11.28.Z CAR
<400> 30
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Gly Tyr Arg Pro Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met
145 150 155 160
Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr
180 185 190
Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu
225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ser Val Lys
260 265 270
Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro
465
<210> 31
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 31
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1 5 10 15
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<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28铰链
<400> 32
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1 5 10 15
Lys Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD28铰链
<400> 33
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1 5 10 15
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<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8A铰链
<400> 34
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
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<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人DAP10铰链
<400> 35
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 36
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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD28 TM
<400> 37
Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu Phe Cys Tyr Gly Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 38
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1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 39
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Val Phe
20
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-DAP10-CD3Z
<400> 40
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
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Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
260 265 270
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
290 295 300
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg
305 310 315 320
Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg
325 330 335
Gly Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
340 345 350
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
355 360 365
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
370 375 380
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
405 410 415
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
420 425 430
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
435 440 445
Pro Pro Arg
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-CD44-CD3Z
<400> 41
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1 5 10 15
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20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
260 265 270
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
290 295 300
Ile Phe Trp Val Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val
305 310 315 320
Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu
325 330 335
Asn Gly Glu Ala Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys
340 345 350
Glu Ser Ser Glu Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg
355 360 365
Asn Leu Gln Asn Val Asp Met Lys Ile Gly Val Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 42
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-CD3Z
<400> 42
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
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100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
260 265 270
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
290 295 300
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg
305 310 315 320
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
325 330 335
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
340 345 350
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
355 360 365
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
370 375 380
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
385 390 395 400
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
405 410 415
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 43
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28
<400> 43
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Gly Ser Gly Asn Tyr Gly Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
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Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
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Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
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Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
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Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
305 310 315 320
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
325 330 335
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
340 345
<210> 44
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm
<400> 44
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
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Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
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115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
260 265 270
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
275 280 285
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
290 295 300
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
305 310 315
<210> 45
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-DAP10-CD3Z
<400> 45
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
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115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro
305 310 315 320
Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Lys
325 330 335
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
340 345 350
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
355 360 365
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
370 375 380
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
385 390 395 400
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
405 410 415
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
420 425 430
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
435 440 445
Arg
<210> 46
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-CD44-CD3Z
<400> 46
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn
305 310 315 320
Ser Gly Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly
325 330 335
Glu Ala Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser
340 345 350
Ser Glu Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu
355 360 365
Gln Asn Val Asp Met Lys Ile Gly Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 47
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3Z
<400> 47
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Leu Glu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
325 330 335
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
340 345 350
Cys Glu Leu Lys Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 48
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-CD3Z
<400> 48
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
305 310 315 320
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
325 330 335
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
340 345 350
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
355 360 365
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
370 375 380
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
405 410 415
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420
<210> 49
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28
<400> 49
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
305 310 315 320
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
325 330 335
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
340 345
<210> 50
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm
<400> 50
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
165 170 175
Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ala Ser Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
260 265 270
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
275 280 285
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
290 295 300
Trp Val
305
<210> 51
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM Nrf2（Keap1抑制剂肽）的构建体
<400> 51
Met Met Asp Leu Glu Leu Pro Pro Pro Gly Leu Pro Ser Gln Gln Asp
1 5 10 15
Met Asp Leu Ile Asp Ile Leu Trp Arg Gln Asp Ile Asp Leu Gly Val
20 25 30
Ser Arg Glu Val Phe Asp Phe Ser Gln Arg Arg Lys Glu Tyr Glu Leu
35 40 45
Glu Lys Gln Lys Lys Leu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Gln Lys
50 55 60
Glu Gln Glu Lys Ala Phe Phe Ala Gln Leu Gln Leu Asp Glu Glu Thr
65 70 75 80
Gly Glu Phe Leu Pro Ile Gln Pro Ala Gln
85 90
<210> 52
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM人过氧化氢酶的构建体
<400> 52
Met Ala Asp Ser Arg Asp Pro Ala Ser Asp Gln Met Gln His Trp Lys
1 5 10 15
Glu Gln Arg Ala Ala Gln Lys Ala Asp Val Leu Thr Thr Gly Ala Gly
20 25 30
Asn Pro Val Gly Asp Lys Leu Asn Val Ile Thr Val Gly Pro Arg Gly
35 40 45
Pro Leu Leu Val Gln Asp Val Val Phe Thr Asp Glu Met Ala His Phe
50 55 60
Asp Arg Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Lys Gly Ala Gly
65 70 75 80
Ala Phe Gly Tyr Phe Glu Val Thr His Asp Ile Thr Lys Tyr Ser Lys
85 90 95
Ala Lys Val Phe Glu His Ile Gly Lys Lys Thr Pro Ile Ala Val Arg
100 105 110
Phe Ser Thr Val Ala Gly Glu Ser Gly Ser Ala Asp Thr Val Arg Asp
115 120 125
Pro Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Glu Asp Gly Asn Trp Asp
130 135 140
Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile Arg Asp Pro Ile Leu
145 150 155 160
Phe Pro Ser Phe Ile His Ser Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr His Leu
165 170 175
Lys Asp Pro Asp Met Val Trp Asp Phe Trp Ser Leu Arg Pro Glu Ser
180 185 190
Leu His Gln Val Ser Phe Leu Phe Ser Asp Arg Gly Ile Pro Asp Gly
195 200 205
His Arg His Met Asn Gly Tyr Gly Ser His Thr Phe Lys Leu Val Asn
210 215 220
Ala Asn Gly Glu Ala Val Tyr Cys Lys Phe His Tyr Lys Thr Asp Gln
225 230 235 240
Gly Ile Lys Asn Leu Ser Val Glu Asp Ala Ala Arg Leu Ser Gln Glu
245 250 255
Asp Pro Asp Tyr Gly Ile Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ile Ala Thr Gly
260 265 270
Lys Tyr Pro Ser Trp Thr Phe Tyr Ile Gln Val Met Thr Phe Asn Gln
275 280 285
Ala Glu Thr Phe Pro Phe Asn Pro Phe Asp Leu Thr Lys Val Trp Pro
290 295 300
His Lys Asp Tyr Pro Leu Ile Pro Val Gly Lys Leu Val Leu Asn Arg
305 310 315 320
Asn Pro Val Asn Tyr Phe Ala Glu Val Glu Gln Ile Ala Phe Asp Pro
325 330 335
Ser Asn Met Pro Pro Gly Ile Glu Ala Ser Pro Asp Lys Met Leu Gln
340 345 350
Gly Arg Leu Phe Ala Tyr Pro Asp Thr His Arg His Arg Leu Gly Pro
355 360 365
Asn Tyr Leu His Ile Pro Val Asn Cys Pro Tyr Arg Ala Arg Val Ala
370 375 380
Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Pro Met Cys Met Gln Asp Asn Gln Gly Gly
385 390 395 400
Ala Pro Asn Tyr Tyr Pro Asn Ser Phe Gly Ala Pro Glu Gln Gln Pro
405 410 415
Ser Ala Leu Glu His Ser Ile Gln Tyr Ser Gly Glu Val Arg Arg Phe
420 425 430
Asn Thr Ala Asn Asp Asp Asn Val Thr Gln Val Arg Ala Phe Tyr Val
435 440 445
Asn Val Leu Asn Glu Glu Gln Arg Lys Arg Leu Cys Glu Asn Ile Ala
450 455 460
Gly His Leu Lys Asp Ala Gln Ile Phe Ile Gln Lys Lys Ala Val Lys
465 470 475 480
Asn Phe Thr Glu Val His Pro Asp Tyr Gly Ser His Ile Gln Ala Leu
485 490 495
Leu Asp Lys Tyr Asn Ala Glu Lys Pro Lys Asn Ala Ile His Thr Phe
500 505 510
Val Gln Ser Gly Ser His Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ala Asn Leu
515 520 525
<210> 53
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM BDNF的构建体
<400> 53
Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met
1 5 10 15
Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu
20 25 30
Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly
35 40 45
Pro Lys Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu
50 55 60
His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn
65 70 75 80
Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu
85 90 95
Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu
100 105 110
Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg
115 120 125
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
130 135 140
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
165 170 175
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
180 185 190
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
195 200 205
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
210 215 220
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
225 230 235 240
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
245
<210> 54
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM IGF-1的构建体
<400> 54
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe
1 5 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu
20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala
35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
100 105 110
Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp
115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr
130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu
145 150 155 160
Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys
165 170 175
Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys
180 185 190
Lys Gly Lys
195
<210> 55
<400> 55
000
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<400> 57
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<400> 58
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<400> 59
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<400> 60
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<400> 61
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<400> 62
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<400> 63
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<400> 64
000
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<400> 65
000
<210> 66
<400> 66
000
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<400> 67
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<400> 69
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000
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<210> 201
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG01 SCFV
<400> 201
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct 180
ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc 240
gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc 300
caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga 360
atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc 420
gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac 480
atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc 540
acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc 600
aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga 660
ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag 720
gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc 780
accaaggtgg agatcaaa 798
<210> 202
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG02 SCFV
<400> 202
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag 60
gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct 180
ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc 240
gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac 360
tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga 420
ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag 480
tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc 540
cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga 600
caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga 660
ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag 720
gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga 780
accaaggtgg agatcaag 798
<210> 203
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03 SCFV
<400> 203
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaa 777
<210> 204
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG04 SCFV
<400> 204
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa 60
gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc 120
tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct 180
ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc 240
gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc 360
aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg 420
gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga 480
agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc 540
acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag 600
aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg 660
cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg 720
gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc 780
ggccagggca caaaagtgga aatcaag 807
<210> 205
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05 SCFV
<400> 205
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aag 783
<210> 206
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG06 SCFV
<400> 206
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc 120
tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc 180
ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg 240
gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc 360
ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc 420
ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct 480
tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc 540
atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc 600
tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc 660
accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc 720
cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaag 777
<210> 207
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG07 SCFV
<400> 207
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc 120
tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct 180
ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga 240
gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc 360
ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca 480
ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc 540
agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat 600
gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac 660
ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag 720
aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaag 768
<210> 208
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG08 SCFV
<400> 208
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc 120
tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct 180
ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc 240
cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg 300
gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac 360
ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc 420
gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt 480
acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga 540
gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc 600
gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc 660
accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac 720
tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag 780
ctgaccgtcc tc 792
<210> 209
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG09 SCFV
<400> 209
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag 60
gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc 120
tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca 180
gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct 240
tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg 300
tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg 360
cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg 420
gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta 480
agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc 540
cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa 600
cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt 660
acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt 720
acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactg 768
<210> 210
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG10 SCFV
<400> 210
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc 120
tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct 180
ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc 240
cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg 300
gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat 360
cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca 420
gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac 480
atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc 540
aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg 600
taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag 660
agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc 720
acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct 780
ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaa 816
<210> 211
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG11 SCFV
<400> 211
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa 60
gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca 120
tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc 180
ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac 240
tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg 300
tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt 360
ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct 420
gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg 480
acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc 540
agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag 600
cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc 660
gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag 720
gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt 780
gctgggacta agttggagct gaag 804
<210> 212
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 212
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 213
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 213
ggcggaggcg gatcaggagg aggaggatca ggcggaggag gatca 45
<210> 214
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 214
agagccaaaa ggtctggctc cggtgagggc agaggaagtc ttataacatg cggtgacgtg 60
gaggagaatc ccggccct 78
<210> 215
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 215
agagccaaaa ggtccggaag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac 60
gtggaagaga atcctggccc c 81
<210> 216
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3Z
<400> 216
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 217
<400> 217
000
<210> 218
<400> 218
000
<210> 219
<400> 219
000
<210> 220
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG01.28.Z CAR
<400> 220
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct 180
ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc 240
gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc 300
caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga 360
atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc 420
gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac 480
atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc 540
acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc 600
aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga 660
ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag 720
gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc 780
accaaggtgg agatcaaagc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 840
cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 900
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 960
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1020
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc 1080
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1260
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1320
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1380
cacatgcagg ccctgccccc t 1401
<210> 221
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG02.28.Z CAR
<400> 221
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag 60
gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc 120
tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct 180
ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc 240
gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac 360
tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga 420
ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag 480
tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc 540
cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga 600
caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga 660
ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag 720
gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga 780
accaaggtgg agatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 840
cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 900
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 960
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1020
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc 1080
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1140
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1200
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1260
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1320
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1380
cacatgcagg ccctgccccc t 1401
<210> 222
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03.28.Z CAR
<400> 222
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 960
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1020
gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1080
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1140
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1200
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1260
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1320
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1380
<210> 223
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG04.28.Z CAR
<400> 223
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa 60
gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc 120
tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct 180
ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc 240
gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc 360
aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg 420
gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga 480
agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc 540
acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag 600
aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg 660
cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg 720
gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc 780
ggccagggca caaaagtgga aatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 840
cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 900
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 960
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1020
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga 1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1410
<210> 224
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05.28.Z CAR
<400> 224
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 960
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1020
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaag cttagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1260
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1320
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1380
ccccct 1386
<210> 225
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG06.28.Z CAR
<400> 225
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc 120
tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc 180
ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg 240
gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc 360
ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc 420
ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct 480
tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc 540
atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc 600
tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc 660
accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc 720
cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaaggct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 960
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1020
gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1080
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1140
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1200
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1260
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1320
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1380
<210> 226
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG07.28.Z CAR
<400> 226
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag 60
gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc 120
tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct 180
ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga 240
gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc 360
ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca 480
ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc 540
agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat 600
gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac 660
ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag 720
aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaaggc tagcgtgaaa 780
gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg 840
gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 900
ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 960
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1020
gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1080
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1140
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1200
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1260
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1320
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t 1371
<210> 227
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG08.28.Z CAR
<400> 227
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag 60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc 120
tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct 180
ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc 240
cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg 300
gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac 360
ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc 420
gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt 480
acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga 540
gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc 600
gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc 660
accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac 720
tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag 780
ctgaccgtcc tcgctagcgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga 840
ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 900
ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 960
agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 1020
tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaagc ttagagtgaa gttcagcagg 1080
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1140
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1200
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1260
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1320
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1380
caggccctgc cccct 1395
<210> 228
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG09.28.Z CAR
<400> 228
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag 60
gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc 120
tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca 180
gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct 240
tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg 300
tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg 360
cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg 420
gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta 480
agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc 540
cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa 600
cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt 660
acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt 720
acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactggc tagcgtgaaa 780
gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg 840
gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 900
ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 960
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1020
gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1080
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1140
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1200
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1260
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1320
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t 1371
<210> 229
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG10.28.Z CAR
<400> 229
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag 60
gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc 120
tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct 180
ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc 240
cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg 300
gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat 360
cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca 420
gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac 480
atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc 540
aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg 600
taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag 660
agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc 720
acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct 780
ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaagcta gcgtgaaagg gaaacacctt 840
tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt 900
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 960
agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1020
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1080
aagcttagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1140
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1200
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1260
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1320
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1380
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccct 1419
<210> 230
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG11.28.Z CAR
<400> 230
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa 60
gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca 120
tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc 180
ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac 240
tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg 300
tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt 360
ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct 420
gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg 480
acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc 540
agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag 600
cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc 660
gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag 720
gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt 780
gctgggacta agttggagct gaaggctagc gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc 840
ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1020
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa gcttagagtg 1080
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1140
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1200
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1260
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1320
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1380
gcccttcaca tgcaggccct gccccct 1407
<210> 231
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 231
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccac 54
<210> 232
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28铰链
<400> 232
gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gccc 54
<210> 233
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD28铰链
<400> 233
ataaaagaga aacatctttg tcatactcag tcatctccta agctg 45
<210> 234
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8A铰链
<400> 234
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 235
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人DAP10铰链
<400> 235
cagacgaccc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctcc 60
tgttccggat gtgggtccct ctctctgccg 90
<210> 236
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28 TM
<400> 236
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 237
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠CD28 TM
<400> 237
ttttgggcac tggtcgtggt tgctggagtc ctgttttgtt atggcttgct agtgacagtg 60
gctctttgtg ttatctggac a 81
<210> 238
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8A TM
<400> 238
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 239
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人DAP10 TM
<400> 239
ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg 60
ttc 63
<210> 240
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-DAP10-CD3Z
<400> 240
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagcc tgtgcgcacg cccacgccgc 960
agccccgccc aagaagatgg caaagtctac atcaacatgc caggcagggg caagcttaga 1020
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1080
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1140
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1200
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1260
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1320
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1353
<210> 241
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-CD44-CD3Z
<400> 241
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgagtcga agaaggtgtg ggcagaagaa aaagctagtg 960
atcaacagtg gcaatggagc tgtggaggac agaaagccaa gtggactcaa cggagaggcc 1020
agcaagtctc aggaaatggt gcatttggtg aacaaggagt cgtcagaaac tccagaccag 1080
tttatgacag ctgatgagac aaggaacctg cagaatgtgg acatgaagat tggggtgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473
<210> 242
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm-CD3Z
<400> 242
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggagagtgaa gttcagcagg 960
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1020
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1080
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1140
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1200
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1260
caggccctgc cccctcgc 1278
<210> 243
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28
<400> 243
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 960
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1020
ccacgcgact tcgcagccta tcgctcc 1047
<210> 244
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG05-CD28tm
<400> 244
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa 60
gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc 120
tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct 180
ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac 240
agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag 300
atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt 360
ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga 420
ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag 480
agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc 540
cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg 600
ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc 660
agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac 720
tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc 780
aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag 840
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 900
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgac 957
<210> 245
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-DAP10-CD3Z
<400> 245
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcctgtgcg cacgcccacg ccgcagcccc 960
gcccaagaag atggcaaagt ctacatcaac atgccaggca ggggcaagct tagagtgaag 1020
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1080
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1140
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1200
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1260
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1320
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1347
<210> 246
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-CD44-CD3Z
<400> 246
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag tcgaagaagg tgtgggcaga agaaaaagct agtgatcaac 960
agtggcaatg gagctgtgga ggacagaaag ccaagtggac tcaacggaga ggccagcaag 1020
tctcaggaaa tggtgcattt ggtgaacaag gagtcgtcag aaactccaga ccagtttatg 1080
acagctgatg agacaaggaa cctgcagaat gtggacatga agattggggt gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 247
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3Z
<400> 247
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcctcgaga aacggggcag aaagaaactc 960
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1020
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgaagct tagagtgaag 1080
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1140
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1200
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1407
<210> 248
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm-CD3Z
<400> 248
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggagag tgaagttcag caggagcgca 960
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1020
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1080
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1140
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1200
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1260
ctgccccctc gc 1272
<210> 249
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28
<400> 249
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 960
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1020
gacttcgcag cctatcgctc c 1041
<210> 250
<211> 918
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DG03-CD28tm
<400> 250
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120
tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct 180
ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct 240
gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat 360
tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc 420
ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc 480
acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat 540
ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc 600
tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga 660
accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt 720
agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct 780
agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 840
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 900
tttattattt tctgggtg 918
<210> 251
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM Nrf2（Keap1抑制剂肽）的构建体
<400> 251
atgatggatt tggaacttcc ccccccaggg ctcccatccc aacaagacat ggatctcata 60
gacatactgt ggagacagga catcgatctg ggggtcagcc gcgaagtttt cgacttttca 120
caaaggcgga aagaatatga attggaaaag cagaaaaaat tggaaaaaga acgccaggaa 180
cagcttcaga aggagcagga aaaagccttt tttgcccagc ttcagctgga cgaggaaaca 240
ggggaatttc tccccatcca accagcccag 270
<210> 252
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM人过氧化氢酶的构建体
<400> 252
atggcagaca gtcgagaccc tgctagcgac caaatgcaac attggaaaga gcaacgggcg 60
gcccagaaag ccgacgtttt gaccactggg gcaggtaatc ctgttggaga taagctgaac 120
gtcatcacgg ttggaccccg gggaccgctg ctcgttcaag acgtggtttt tacggatgag 180
atggcccatt ttgatcgaga gaggatacca gaaagggttg tgcacgctaa gggcgcaggt 240
gccttcggat atttcgaggt aactcacgac attactaagt atagcaaggc caaggtattt 300
gaacacattg gcaagaagac gccgatagcg gtccgattca gtacagtggc gggcgagtca 360
ggttcagccg ataccgtgag agatccgaga ggatttgccg tgaaatttta tacagaggac 420
ggcaactggg acttggtagg aaacaatacc ccaatatttt tcataaggga cccaatcctt 480
tttcccagct ttattcattc acagaagcgg aacccacaaa cgcacttgaa agatcctgac 540
atggtgtggg atttttggag cttgaggcca gagagcctgc accaagtgag cttcttgttc 600
agcgacagag gcataccgga cggtcataga cacatgaacg gttacggtag tcacaccttc 660
aaactggtga acgccaacgg agaggctgtc tattgtaagt tccactataa aaccgatcaa 720
ggcatcaaaa acctgagcgt agaggacgca gcccgccttt ctcaagaaga tccagactat 780
gggatccggg atctctttaa cgccatagct acgggtaaat atccctcttg gacgttctat 840
atccaggtaa tgacattcaa tcaagcagag actttcccct ttaacccgtt tgaccttact 900
aaagtatggc cgcataagga ctaccctctg attcccgtcg gcaaactcgt gcttaacagg 960
aatccagtca actatttcgc agaagtcgag caaatcgcct ttgacccttc taacatgccg 1020
ccgggaatcg aagcgtcacc ggacaagatg cttcaaggtc ggcttttcgc ataccccgac 1080
actcaccgac acagactggg tccgaattat cttcacatac ctgtcaactg cccatataga 1140
gcacgcgttg cgaactacca gcgcgatggt ccgatgtgca tgcaggacaa ccaggggggg 1200
gcacccaact attatccaaa ttcatttggg gcgccggaac aacaaccgtc agcccttgaa 1260
cactccatcc agtattctgg cgaagtaaga cgcttcaaca cggctaatga tgacaacgtt 1320
acacaggtta gagcgtttta tgtgaacgtc ttgaacgagg aacaacggaa acgactttgc 1380
gaaaacatag cgggtcattt gaaagatgct cagattttta tccaaaaaaa agccgtcaaa 1440
aattttaccg aagtccaccc cgattacggt tcacatattc aggccctgtt ggataagtac 1500
aacgcggaaa agcccaagaa tgcaatacac acgtttgttc agagcgggag ccacctcgct 1560
gctcgagaga aagcaaatct g 1581
<210> 253
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM BDNF的构建体
<400> 253
atgacgatcc tgtttctgac aatggtgatt agctatttcg gatgtatgaa agccgccccg 60
atgaaggagg ccaatatcag gggacaaggt gggctggctt atccgggcgt aaggacacac 120
ggcacactgg agagtgtgaa cggcccgaag gccggatcac gaggattgac gagcctcgca 180
gatacgtttg agcatgtaat cgaagagctc ttggatgaag accaaaaggt ccgccccaat 240
gaggagaaca acaaagacgc agacctgtac acatcacgag ttatgctgtc aagtcaagtg 300
ccgctcgaac caccactcct ctttctgctg gaggagtaca aaaactattt ggacgctgct 360
aacatgtcta tgcgagtgcg cagacatagt gaccctgcca gacgcggtga gctttcagtc 420
tgtgattcta taagtgagtg ggtaaccgca gcagataaga agactgccgt agacatgtca 480
gggggaactg tgactgtact tgaaaaggtt cccgtttcta aagggcagct caaacagtat 540
ttctatgaaa caaagtgtaa tccaatgggg tacaccaagg aaggttgcag gggaatcgac 600
aagcgacatt ggaacagtca atgtcggacc actcagagct acgtccgcgc tctcacgatg 660
gatagtaaga aacgcatcgg gtggagattc atcagaatcg acacctcttg cgtctgtact 720
cttacaatta agcgagggcg a 741
<210> 254
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于表达NDMM IGF-1的构建体
<400> 254
atggggaaaa tctcctctct ccctacccag ttgttcaagt gttgcttttg tgacttcttg 60
aaggtaaaaa tgcacactat gtcatccagt cacctttttt atttggctct gtgcctcctc 120
acattcacca gttcagctac tgccgggcct gaaacactct gcggcgccga actcgttgat 180
gcgcttcaat tcgtgtgtgg agataggggg ttttacttta acaagccgac gggttatggt 240
agctcaagta gacgagcgcc acagactgga atagtagatg aatgctgttt ccgctcatgc 300
gaccttcgca gattggaaat gtactgcgct cctcttaaac cagcaaagag tgcgcggtcc 360
gtgcgagccc aacgacatac cgatatgcca aaaacccaga aatatcagcc gccgtctacc 420
aacaagaaca ccaagagtca gaggagaaag ggttggccca agacgcaccc gggtggcgaa 480
caaaaagaag gtactgaggc aagtttgcaa attcgaggaa agaagaaaga acaacgaaga 540
gagataggtt ctcgcaatgc ggaatgtcga ggcaaaaaag gtaag 585
<210> 255
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物人B-肌动蛋白
<400> 255
ggccgaggac tttgattgc 19
<210> 256
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物人B-肌动蛋白
<400> 256
tggggtggct tttaggatgg 20
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物人IL-4
<400> 257
gcttccccct ctgttcttcc 20
<210> 258
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物人IL-4
<400> 258
gatgtctgtt acggtcaact cg 22
<210> 259
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物人IL-10
<400> 259
tcaaggcgca tgtgaactcc 20
<210> 260
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物人IL-10
<400> 260
cagggaagaa atcgatgaca gc 22

Claims (157)

1.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)的细胞，所述嵌合抗原受体靶向至少一种(i)在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点异常表达(例如，过表达)和/或与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，或者此外所述细胞经工程改造以表达神经退行性疾病修饰分子(NDMM)，其中所述CAR和NDMM可由相同或不同的细胞表达，其中在所述CAR和/或NDMM表达细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述CAR和/或NDMM表达细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，所述神经退行性疾病或病症与所述异常的或异常表达的蛋白质的表达相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退变位点存在于中枢神经系统中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退变位点存在于外周神经系统中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经退变位点存在于外周神经系统和中枢神经系统中。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述表达CAR的细胞包含免疫细胞。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，表达CAR的所述免疫细胞包含T细胞或T细胞祖细胞，优选T调节细胞(Treg)诸如FOXP3+Treg。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞包含CAR，所述CAR识别在神经退变位点表达的至少一种异常蛋白质。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR包含scFv或配体，所述scFv或配体识别在神经退变位点表达的至少一种异常蛋白质或异常表达的蛋白质。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞上所包含的所述CAR包含DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQ ID NO:2)、DG03(SEQ ID NO:3)、DG04(SEQ IDNO:4)、DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQ ID NO:6)，和/或DG07(SEQ ID NO:7)、DG08(SEQ IDNO:8)、DG09(SEQ ID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或包含与上述构建体中的任一者或多者有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或包含与上述构建体中的任一者或多者有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述构建体中的一者或多者中的每一者均靶向mutSOD1。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；DG03-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQ IDNO:50)，和/或包含与上述构建体中的任一者或多者有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述一者或多者构建体中的每一者均靶向β淀粉样蛋白。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR细胞经进一步工程改造以表达至少一种NDMM，例如促神经元因子或神经生长因子，其中所述CAR和所述NDMM由相同或不同的细胞表达。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO:51)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达人过氧化氢酶(SEQ ID NO:52)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达BDNF(SEQ ID NO:53)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达IGF-1(SEQ ID NO:54)，和/或与上述构建体包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞经进一步工程改造以表达至少一种抗氧化蛋白，所述抗氧化蛋白抑制或保护神经元免受抗氧化应激和/或抑制或防止在所述神经退变位点的神经元死亡，其中所述CAR和所述抗氧化蛋白由相同或不同细胞表达。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂还促进T细胞功能或寿命。
21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病或病症包含以下中的至少一者：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；和冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。
22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病包含帕金森氏病。
23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病包含阿尔茨海默氏病。
24.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述神经退行性疾病包含肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
25.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR结合至以下中的一者或多者：人β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白(optineurin)；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；以及富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
26.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞表达选自以下的至少一种促神经元因子、神经营养因子或神经生长因子：脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；白介素-6(IL-6)；活化蛋白C(APC)；血栓调节蛋白；组织纤溶酶原激活剂(tPA)；蛋白质去糖化酶DJ-1；组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，任选地，其中所述至少一种促神经元因子、神经营养因子或神经生长因子由与所述CAR相同的细胞或由与所述CAR不同的细胞表达。
27.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞表达选自以下的至少一种抗氧化蛋白：超氧化物歧化酶诸如人超氧化物歧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、HO-1、铁蛋白、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白(H)、金属硫蛋白I、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶(Prx)诸如过氧化物还原酶MSP23；活性依赖性神经保护因子同源盒(ADNP)；藻蓝蛋白；神经珠蛋白、过氧化氢酶和NRF2，任选地，其中所述至少一种抗氧化蛋白由与所述CAR相同的细胞或由与所述CAR不同的细胞表达。
28.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞减少或稳定所述神经退变位点存在的炎症的量。
29.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞抑制或防止以下中的至少一者：
(i)小神经胶质细胞过度活化，其中过度活化包括这样的小神经胶质细胞：其拥有至少一种活化小神经胶质细胞特征性的活性或活化小神经胶质细胞特征性的活性增加，诸如(1)形态变化、(2)迁移至炎症位点、(3)产生神经毒性或炎性细胞因子诸如IL-1、(4)与神经斑块或β淀粉样蛋白沉积物相互作用、(5)合成神经毒性蛋白、(6)分泌蛋白酶和/或活性氧类、(7)诱导邻近的细胞产生淀粉样蛋白、(8)破坏髓鞘；
(ii)小神经胶质细胞数量增加；
(iii)在神经退变位点产生炎性蛋白质或炎性活性；和/或
(iv)神经元死亡或神经元功能受损。
30.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞减缓所述神经退行性疾病的发作。
31.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞减缓所述神经退行性疾病的进展。
32.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞修复或增加神经细胞功能或减缓神经细胞功能的丧失。
33.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中增加认知或稳定认知的丧失。
34.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述治受试者中减少或减缓神经运动功能的丧失和/或瘫痪。
35.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中减少神经损伤或斑块的数量或大小。
36.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中减少癫痫发作的次数或严重程度。
37.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应mSOD1抗原而表达增加水平的IL-10。
38.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应mSOD1抗原而表达增加水平的细胞表面标志物，包括GITR、PD-1和/或CTLA-4中的一者或多者。
39.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应mSOD1抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。
40.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应mSOD1抗原而抑制TNF-α产生。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达包含DG05(SEQ ID NO:5)的构建体，和/与上述构建体或包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
42.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ IDNO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
43.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原而表达增加水平的IL-10和/或IL-4。
44.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。
45.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞在受治疗的所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制IL-6产生。
46.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞保护受治疗的所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达包含DG03(SEQ ID NO:3)的构建体。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO:50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
49.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞保护受治疗的所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性。
50.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ ID NO:52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO:51)、NDMM BDNF构建体(SEQ ID NO:53)、NDMM IGF-1构建体(SEQ ID NO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
51.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是全身施用或局部施用。
52.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞穿过血脑屏障(BBB)。
53.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞通过注射，例如通过选自静脉内、皮下、腔内、心室内、颅内和鞘内的手段来施用。
54.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR包含结合至人β淀粉样蛋白、人超氧化物歧化酶或人α-突触核蛋白中的一者或多者的scFv。
55.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR包含scFv，所述scFv结合至具有表1中所含序列的人β淀粉样蛋白、人超氧化物歧化酶或人α-突触核蛋白中的一者或多者。
56.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所施用的所述细胞还包含自杀基因，所述自杀基因任选地在诱导型启动子的控制下表达。
57.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，由所施用的所述细胞表达的所述CAR包含至少一个信号转导结构域，例如共刺激结构域，其任选地选自CD28-CD3ζ、4-1BB-CD3ζ、DAP10-CD3ζ、CD44-CD3ζ、CTLA4-CD3ζ、CD28、DAP10、4-1BB和CD3ζ。
58.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，由所施用的所述细胞表达的所述CAR包含选自CD28-CD3ζ、DAP10-CD3ζ、CD44-CD3ζ、CD28和CD3ζ的至少一个信号转导结构域。
59.根据前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞表达出识别在神经退变位点表达的不同蛋白质的若干种CAR，或者所施用的所述细胞由自身表达不同的根据前述权利要求任一项所述的CAR的细胞构成。
60.一种核酸，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激结构域，其表达任选地由相同的或不同的诱导型或组成型启动子控制。
61.根据权利要求60所述的核酸，其特征在于，与神经退行性疾病或病症相关联的所述蛋白质选自人β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；以及富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
62.根据权利要求60或61所述的核酸，其特征在于，与神经退行性疾病或病症相关联的所述蛋白质包含淀粉样蛋白，例如β淀粉样蛋白，或突变型超氧化物歧化酶1，或人α-突触核蛋白中的一者或多者。
63.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸进一步编码人过氧化氢酶和/或人Nrf2的Neh2结构域。
64.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸进一步编码人IGF-1。
65.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸进一步编码人BDNF。
66.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸进一步编码以下构建体中的一者或多者：NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO:51)；NDMM人过氧化氢酶(SEQID NO:52)；NDMM BDNF(SEQ ID NO:53)；和/或NDMM IGF-1(SEQ ID NO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
67.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的配体结合结构域包含scFv。
68.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR包含至少一个信号转导结构域，例如共刺激结构域，其任选地选自CD28-CD3ζ、4-1BB-CD3ζ、DAP10-CD3ζ、CD44-CD3ζ、CTLA4-CD3ζ、CD28、DAP10、4-1BB和CD3ζ。
69.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸编码以下中的一者或多者：DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQ ID NO:2)、DG03(SEQ ID NO:3)、DG04(SEQ ID NO:4)、DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQ ID NO:6)、DG07(SEQ ID NO:7)、DG08(SEQ ID NO:8)、DG09(SEQ ID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
70.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸编码以下中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
71.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸编码以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；DG03-CD28tm(也称为DG03-28tm)(SEQ ID NO:50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
72.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸含于构建体诸如质粒或病毒，例如逆转录病毒构建体上。
73.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，编码所述CAR的所述核酸含于构建体上，所述构建体进一步包含编码促神经元因子和/或抗氧化蛋白和/或神经生长因子或非典型神经营养因子的基因。
74.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，编码所述CAR的所述核酸含于构建体上，所述构建体进一步包含编码至少一种抗氧化蛋白的核酸，例如延长T细胞功能和/或具有神经保护作用的抗氧化蛋白的核酸。
75.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的所述配体结合部分结合至个体中存在的神经退变或神经炎症位点处的异常蛋白质或异常表达的蛋白质，所述个体具有选自以下的神经退行性疾病或病症：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、朊病毒病、运动神经元疾病(MND)诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病(HD)、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、弗里德赖希共济失调、路易小体病、癫痫、脑炎、脑积水、中风、慢性创伤性脑病(CTE)；突触核蛋白病；tau蛋白病、海绵状脑病；家族性淀粉样变性多发性神经病；荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变性；嗜刚果红性血管病；皮质基底节变性；皮克氏病；进行性核上性麻痹；克雅氏病；格斯特曼综合征；致命性家族性失眠症；库鲁病；牛海绵状脑病；痒病；慢性消耗性疾病；阿尔茨海默氏病的路易小体变异型；弥漫性路易小体病；路易小体痴呆；多系统萎缩症；I型神经退变伴脑铁沉积；弥漫性路易小体病；额颞叶退变；遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症；肯尼迪病；亚历山大病；科克因综合征；和冰岛型遗传性淀粉样变脑出血。
76.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的所述配体结合部分结合至在具有帕金森氏病的个体中存在的神经退变或神经炎症位点处的异常蛋白质或异常表达的蛋白质。
77.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的所述配体结合部分结合至在具有阿尔茨海默氏病的个体中存在的神经退变或神经炎症位点处的异常蛋白质或异常表达的蛋白质。
78.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的所述配体结合部分结合至在具有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的个体中存在的神经退变或神经炎症位点处的异常蛋白质或异常表达的蛋白质。
79.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述CAR中的配体结合部分结合至以下中的一者或多者：人β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白1-42、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶-1(SOD-1)、超磷酸化tau蛋白；TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)：9号染色体开放阅读框72(c9orf72)；β-突触核蛋白；γ-突触核蛋白；肉瘤融合的RNA结合蛋白(FUS)；泛素；泛醌蛋白-2、p62；视神经蛋白(optineurin)；ataxin-2；parkin；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1；以及富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2)、具有串联谷氨酰胺重复的亨廷顿蛋白；朊病毒蛋白；转甲状腺素蛋白；齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)蛋白；雄激素受体；ataxin；P/Q型钙通道α1A亚基；TATA盒结合蛋白；神经胶质纤维酸性蛋白；DNA切除修复蛋白ERCC-6；运动神经元存活蛋白；和胱抑素C。
80.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含编码选自以下的至少一种促神经元因子、神经营养因子或神经生长因子的核酸：脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)；白介素-6(IL-6)；活化蛋白C(APC)；血栓调节蛋白；组织纤溶酶原激活剂(tPA)；蛋白质去糖化酶DJ-1；组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
81.根据前述权利要求任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含编码抗氧化蛋白的核酸，所述抗氧化蛋白选自超氧化物歧化酶诸如人超氧化物歧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、HO-1、铁蛋白、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白(H)、金属硫蛋白I、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶(Prx)诸如过氧化物还原酶MSP23；活性依赖性神经保护因子同源盒(ADNP)；藻蓝蛋白；神经珠蛋白、过氧化氢酶和NRF2。
82.一种重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞包含至少一种编码根据前述细胞任一者的CAR的核酸。
83.根据权利要求82所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含人免疫细胞，例如T细胞或T细胞祖细胞或NK细胞。
84.根据权利要求82所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含Treg细胞，例如FoxP3+Treg细胞。
85.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞不表达功能性TCR。
86.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞包含自杀基因，所述自杀基因任选地在诱导型启动子的控制下表达。
87.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞进一步经工程改造以表达至少一种抗氧化剂、神经生长因子或非典型神经营养因子，所述至少一种抗氧化剂、神经生长因子或非典型神经营养因子的表达任选地在诱导型启动子的控制下。
88.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用时穿过BBB。
89.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞拥有Treg效应子功能。
90.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞表达Treg表面标志物和/或表达IL-10或IL-10的病毒变体。
91.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，至少一种CAR在其表面上表达。
92.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞表达以下构建体中的至少一者：DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQ ID NO:2)、DG03(SEQ IDNO:3)、DG04(SEQ ID NO:4)、DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQ ID NO:6)，和/或DG07(SEQ IDNO:7)、DG08(SEQ ID NO:8)、DG09(SEQ ID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
93.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞表达以下构建体中的至少一者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
94.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞表达以下构建体中的至少一者：NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)(SEQ ID NO:51)；NDMM人过氧化氢酶(SEQ ID NO:52)；NDMM BDNF(SEQ ID NO:53)；NDMM IGF-1(SEQ ID NO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
95.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在包含所述CAR所结合的抗原的神经退变位点处引发以下特性中的一者或多者：(i)抑制巨噬细胞活性或活化(其中过度活化包括这样的小神经胶质细胞：其拥有至少一种活化小神经胶质细胞特征性的活性或活化小神经胶质细胞特征性的活性增加，诸如(1)形态变化、(2)迁移至炎症位点、(3)产生神经毒性或炎性细胞因子诸如IL-1、(4)与神经斑块或β淀粉样蛋白沉积物相互作用、(5)合成神经毒性蛋白、(6)分泌蛋白酶和/或活性氧类、(7)诱导邻近的细胞产生淀粉样蛋白、(8)破坏髓鞘)，(ii)抑制巨噬细胞，(iii)抑制巨噬细胞或小神经胶质细胞分泌炎性细胞因子、蛋白酶和氧化剂诸如IL-1β、TNFα、NO和其他神经毒素，(iv)促进分泌更多的IL-10、IL-4和TGF-β中的一者或多者，以及(v)抑制炎症或神经退变。
96.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在CNS中的炎症位点处抑制炎症和/或产生抗炎介体。
97.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在神经退变位点处抑制或防止以下中的至少一者：
(i)小神经胶质细胞过度活化(如上所定义的)，
(ii)神经毒性巨噬细胞活性和/或因此的神经毒性部分的分泌；
(iii)神经元功能的丧失；
(iv)小神经胶质细胞数量或巨噬细胞数量增加；
(v)在神经退变位点处产生炎性蛋白质或炎性活性，以及
(vi)神经元死亡。
98.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给有神经退行性疾病发展风险的受试者时，减缓所述神经退行性疾病的发作。
99.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，减缓所述神经退行性疾病的进展。
100.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，修复或增加神经细胞功能或者减缓神经细胞功能的丧失。
101.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在受治疗的所述受试者中增加认知或者抑制或减缓认知丧失。
102.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在受治疗的所述受试者中减少或减缓神经运动功能的丧失和/或瘫痪。
103.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在受治疗的所述受试者中减少神经损伤或斑块的数量或大小。
104.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给患有神经退行性疾病的受试者时，在受治疗的所述受试者中减少癫痫发作的次数或严重程度。
105.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应mSOD1抗原而表达增加水平的IL-10。
106.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应mSOD1抗原而表达增加水平的GITR、PD-1和/或CTLA-4中任一者或多者的细胞表面标志物。
107.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应mSOD1抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。
108.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应mSOD1抗原而抑制TNF-α产生。
109.根据权利要求105至108中任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达包含DG05(SEQ ID NO:5)的构建体。
110.根据权利要求105至109中任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ IDNO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
111.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原而表达增加水平的IL-10和/或IL-4。
112.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制超氧化物生成。
113.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，在所述受试者中响应β淀粉样蛋白抗原和/或抗CD3而抑制IL-6产生。
114.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，保护所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性。
115.根据权利要求111至114中任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达包含DG03(SEQ ID NO:3)的构建体。
116.根据权利要求111至115中任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下中的一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；DG03-CD28tm(SEQID NO:50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
117.根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞在施用给受试者时，保护所述受试者的细胞免受过氧化氢毒性。
118.根据权利要求117所述的重组细胞或经工程改造细胞，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ ID NO:52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO:51)、NDMM BDNF构建体(SEQ ID NO:53)、NDMM IGF-1构建体(SEQ ID NO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
119.一种合适用于疗法的组合物，其特征在于，所述组合物包含根据前述权利要求任一项所述的重组细胞或经工程改造细胞和药学上可接受的载体。
120.根据权利要求75所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含至少一种稳定剂。
121.根据权利要求75或76所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含添加剂，所述添加剂促进其中所含的细胞穿过BBB的能力，或者所述细胞与可促进所述细胞穿过BBB的能力的添加剂部分附接或复合。
122.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(例如过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质。
123.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQ ID NO:2)、DG03(SEQ ID NO:3)、DG04(SEQ ID NO:4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
124.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且所述细胞经工程改造以表达以下中的任一者或多者：DG03(SEQ ID NO:3)；DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ ID NO:49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO:50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
125.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQ ID NO:2)、DG03(SEQ ID NO:3)、DG04(SEQ ID NO:4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
126.根据权利要求125所述的方法，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ ID NO:52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO:51)、NDMM BDNF构建体(SEQ ID NO:53)和/或NDMM IGF-1构建体(SEQ ID NO:54)和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
127.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质。
128.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQID NO:6)、DG07(SEQ ID NO:7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
129.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和NDMM可由相同细胞或不同细胞表达，所述CAR和NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且所述细胞经工程改造以表达以下中的任一者或多者：DG05(SEQ ID NO:5)；DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
130.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与ALS相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQID NO:6)、DG07(SEQ ID NO:7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
131.根据权利要求130所述的方法，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ ID NO:52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO:51)、NDMM BDNF构建体(SEQ ID NO:53)、NDMM IGF-1构建体(SEQ IDNO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
132.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质。
133.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG08(SEQ ID NO:8)、DG09(SEQ ID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
134.一种治疗具有神经退行性疾病或病症、表现出与神经退行性疾病或病症发展相关联的一种或多种风险因素和/或表现出与神经退行性疾病或病症的诊断相关联的一种或多种体征或症状的受试者的方法，其特征在于，包含施用有效量的经工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)或NDMM的细胞，其中所述CAR和所述NDMM可由相同的或不同的细胞表达，所述CAR和所述NDMM靶向至少一种(i)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处表达并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的异常蛋白质，和/或(ii)在中枢神经系统中在与特定神经退行性疾病相关联的神经退变位点处异常表达(过表达)并且与所述特定神经退行性疾病或病症的病理相关联的蛋白质，其中在所述细胞与包含所靶向的所述蛋白质的所述神经退变位点接触的条件下，施用所述细胞，从而防止、抑制或治疗所述神经退行性疾病或病症和/或与表征为异常的或异常表达的所述蛋白质的表达的所述神经退行性疾病或病症相关联的一种或多种症状，其中所靶向的所述蛋白质为与帕金森氏病相关联的蛋白质，并且表达CAR的所述细胞的CAR包括DG08(SEQ ID NO:8)、DG09(SEQ ID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体，并且进一步其中所述细胞经工程改造以表达一种或多种神经退行性疾病修饰分子(NDMM)。
135.根据权利要求134所述的方法，其特征在于，所述细胞经工程改造以表达以下构建体中的一者或多者：NDMM人过氧化氢酶构建体(SEQ ID NO:52)、NDMM Nrf2(Keap1抑制剂肽)构建体(SEQ ID NO:51)、NDMM BDNF构建体(SEQ ID NO:53)、NDMM IGF-1构建体(SEQ IDNO:54)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
136.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)和任选的NDMM，其包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与阿尔茨海默氏病相关联的蛋白质。
137.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与阿尔茨海默氏病相关联的β淀粉样蛋白的形式。
138.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与ALS病相关联的蛋白质。
139.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是突变的或异常表达的SOD1。
140.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与帕金森氏病相关联的蛋白质。
141.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述蛋白质是与帕金森氏病相关联的α-突触核蛋白的形式。
142.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG01(SEQ ID NO:1)、DG02(SEQID NO:2)、DG03(SEQ ID NO:3)、DG04(SEQ ID NO:4)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
143.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码以下中的任一者或多者：DG03-CD28-CD3ζ(也称为DG03-28-3ζ)(SEQ ID NO:22)；DG03-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG03-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:45)；DG03-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG03-28tm-44-3ζ)(SEQ IDNO:46)；DG03-CD28tm-4-1-BB-CD3ζ(也称为DG03-28tm-BB-3ζ)(SEQ ID NO:47)；DG03-CD28tm-CD3ζ(也称为DG03-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:48)；DG03-CD28(也称为DG03-28)(SEQ IDNO:49)；DG03-CD28tm(SEQ ID NO:50)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
144.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG05(SEQ ID NO:5)、DG06(SEQID NO:6)、DG07(SEQ ID NO:7)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
145.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码以下构建体中的任一者或多者：DG05-CD28-CD3ζ(也称为DG05-28-3ζ)(SEQ ID NO:24)；DG05-CD28tm-DAP10-CD3ζ(也称为DG05-28tm-10-3ζ)(SEQ ID NO:40)；DG05-CD28tm-CD44-CD3ζ(也称为DG05-28tm-44-3ζ)(SEQ ID NO:41)；DG05-CD28tm-CD3ζ(也称为DG05-28tm-3ζ)(SEQ ID NO:42)；DG05-CD28(也称为DG05-28)(SEQ ID NO:43)；DG05-CD28tm(也称为DG05-28tm)(SEQ ID NO:44)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
146.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(i)至少一个配体结合部分，所述配体结合部分结合至与神经退行性疾病的病理相关联的异常蛋白质或在中枢神经系统中在神经退变位点处异常表达的(过表达的)蛋白质，所述蛋白质与特定的神经退行性疾病或病症的病理相关联，和(ii)任选的至少一个信号转导结构域，例如共刺激信号转导结构域，以及(iii)进一步任选的NDMM，它们的表达任选地由相同或不同的诱导型或组成型启动子控制，其中所述核酸编码DG08(SEQ ID NO:8)、DG09(SEQID NO:9)、DG10(SEQ ID NO:10)、DG11(SEQ ID NO:11)，和/或与上述构建体中的任一者或多者包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的构建体。
147.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求136所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
148.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求137所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
149.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求138所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
150.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求139所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
151.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求140所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
152.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求141所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
153.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求142所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
154.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求143所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
155.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求144所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
156.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求145所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
157.一种经修饰Treg，其特征在于，包含编码根据权利要求146所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。
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