CN111876512A

CN111876512A - 等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111876512A
Application number: CN202010745529.1A
Authority: CN
Inventors: 张仁利; 张岩; 陈木新; 黄达娜; 艾琳; 陈燕旌; 边素莹; 唐屹君; 郑惠文; 张倩; 陈家旭; 苏川; 周晓农
Original assignee: Micro Rock Medical Technology Beijing Co ltd; SHENZHEN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: Shenzhen Center For Disease Control And Prevention (shenzhen Health Inspection Center Shenzhen Institute Of Preventive Medicine)
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2020-11-03

Abstract

本申请公开了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒和检测方法。所述试剂包括如下用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5；用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第三外引物SEQ ID No.6、第四外引物SEQ ID No.7、第三内引物SEQ ID No.8、第四内引物SEQ ID No.9、第二环引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11。所述试剂盒包括所述试剂。所述试剂和试剂盒用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。

Description

等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒及其应用

技术领域

本申请属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒及其应用。

背景技术

利什曼病是由利什曼原虫引起的一种疾病，它通过一些蛉的叮咬进行传播。该疾病以三种主要方式出现：皮肤、粘膜皮肤或内脏。因此利什曼病又被分为皮肤利什曼病和内脏利什曼病(即黑热病)。

黑热病是最严重的利什曼病形式，如果不加以治疗可能致命。在感染后数月至数年内还可能发生发烧、脾脏和肝脏受损以及贫血，也有可能会出现“黑热病后皮肤利什曼病”。该疾病是世界上第二大寄生虫杀手(仅次于疟疾)，估计每年导致全世界2万到3万例的死亡。

目前全世界上已知的有两种利什曼原虫引起内脏疾病。在东非和印度常见的种类是杜氏利什曼原虫，在欧洲、北非和拉丁美洲常见的婴儿利什曼原虫。

诊断的金标准是可视化脾脏抽吸物或骨髓抽吸物中的寄生虫。这是一个技术难题，在世界上内脏利什曼病流行的地区通常不可用。血清学检测存在许多问题，在高度流行的地区，并非每个被感染的人都会实际患上临床疾病或需要治疗。实际上，多达32％的健康人群可能会呈阳性反应，但不需要治疗。相反，由于血清学检测只针对免疫反应而不是生物体本身，因此在患者治愈后该检测不会变为阴性，因此不能用作治愈检查或再感染或复发的检查。同样，免疫系统异常(例如HIV感染)的患者将接受假阴性检测。

多种不同的聚合酶链反应(PCR)测试可用于检测利什曼原虫DNA。借助该测定，最终可能实现特异性且灵敏的诊断程序。使用这种特定方法，即使寄生虫的量非常低，仍然可以检测利什曼原虫。当需要诊断特定的利什曼原虫物种时，与检测有无相比，分子生物学方法更为出色。但目前PCR是荧光染料，其检测的通病就是需要专业人员操作和专业昂贵仪器。

另外，现有待测样品核酸的需要移液器、枪头、离心机、恒温金属浴和PCR仪等昂贵且不便于携带的仪器，且提取需要专业人士进行专业操作，这直接导致现有样本核酸提取和PCR检测不方便，且需要专业人员操作，且成本高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种检测等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒以及其应用，旨在解决现有技术荧光PCR检测方法操作需要专业操作，而且成本高，检测不方便的技术问题。

为了实现本发明的发明目的，本发明的一方面，提供了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂。所述等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂包括如下用于检测杜氏利什曼原虫环介导等温核酸扩增引物组：

第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5；

用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组：

第三外引物SEQ ID No.6、第四外引物SEQ ID No.7、第三内引物SEQ ID No.8、第四内引物SEQ ID No.9、第二环引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11。

优选地，所述等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

本发明的另一方面，提供了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂盒。所述等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂盒包括本发明等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂。

本发明的再一方面，提供了一种检测两种利什曼原虫的方法。所述检测两种利什曼原虫的方法包括如下步骤：

获取待检测样品的核酸；

将所述待测样本核酸与本发明试剂或本发明试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；

根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。

与现有技术相比，本发明等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂同时含有杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组，两种环介导等温核酸扩增引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强，从而使得本发明试剂用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，两种环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断以简易快速检测两种利什曼原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

优选地，本发明试剂还包括聚合酶、pH染料等可视化恒温扩增试剂时，其与所述环介导等温核酸扩增引物组构成扩增反应体系，用于检测两种利什曼原虫在具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测两种利什曼原虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测两种利什曼原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

本发明等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂盒由于采用本发明等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，两种环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，从而使得所述试剂能够简易快速检测两种利什曼原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。当所述试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测两种利什曼原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

本发明检测两种利什曼原虫的方法由于是利用本发明试剂盒进行检测，因此，所述检测两种利什曼原虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。优选的当本发明试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述检测两种利什曼原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得本发明检测两种利什曼原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的杜氏利什曼原虫阳性质控品和无核酸酶水阴性质控品以杜氏利什曼原虫的检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；图1中的1-6号孔为杜氏利什曼原虫阳性质控品扩增体系最终显色照片；7-8孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片；

图2为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的杜氏利什曼原虫阳性质控品设置1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL时浓度梯度和无核酸酶水阴性质控品以杜氏利什曼原虫的检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；图2中的1-2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3-4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；5-6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7-8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片；

图3为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的婴儿利什曼原虫阳性质控品设置1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL时浓度梯度和无核酸酶水阴性质控品以婴儿利什曼原虫的检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；图3中的1-2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3-4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；5-6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；7-8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片；

图4为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物分别LAMP扩增“无核酸酶水”的结果显色照片，图4中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

图5为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增“杜氏利什曼原虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果显色照片，图5中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；

图6为本发明实施例可视化LAMP扩增体系中的杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增“婴儿利什曼原虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果显色照片，图6中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本发明涉及的专业名称说明：

环介导等温核酸扩增技术：(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。

一方面，本发明实施例提供了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂(下文均简称为试剂)。所述试剂包括根据两种利什曼原虫靶基因设计的引物序列。两种所述利什曼原虫包括杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫。因此，所述试剂包括用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组和用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组。

其中，用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组包括如下引物：

用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组包括如下引物：

这样本发明实施例所述试剂同时含有杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组，两种环介导等温核酸扩增引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强，从而使得本发明实施例所述试剂用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，两种环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断以简易快速检测两种利什曼原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

另外，上述用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组是根据杜氏利什曼原虫靶基因设计的，所述杜氏利什曼原虫靶基因可以根据基因资源获得。同理，上述用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组是根据婴儿利什曼原虫靶基因设计的，所述婴儿利什曼原虫靶基因可以根据基因资源获得。如在一实施例中，所述杜氏利什曼原虫靶基因和婴儿利什曼原虫靶基因可以均为KM DNA基因，KM DNA基因全长在800bp左右，具体可以从GenBank上直接获取。其中，杜氏利什曼原虫引物设计区域在该基因的1201-1784bp之间；婴儿利什曼原虫引物设计区域在该基因的322-1164bp之间。

因此，在一实施例中，杜氏利什曼原虫靶序列KM DNA基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.12所示。

在另一实施例中，婴儿利什曼原虫靶序列KM DNA基因的引物设计区域序列为SEQID No.13所示。

上文所述SEQ ID No.1至SEQ ID No.13的具体序列如下表1所示：

表1

在进一步实施例中，本发明实施例所述试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

由于本发明实施例所述试剂含有上述环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.11。因此，当本发明实施例所述试剂采用LAMP进行扩增时，其LAMP扩增反应过程中会释放出大量的H⁺，致使LAMP扩增反应体系的pH值发生变化。本发明实施例所述试剂所含的pH染料会根据LAMP扩增反应体系的pH值发生颜色变化。因此，所述可视化恒温扩增试剂与所述环介导等温核酸扩增引物组构成扩增反应体系，在实现检测两种利什曼原虫在具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测两种利什曼原虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测两种利什曼原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。从而避免传统的采用荧光PCR检测需要专业的人员和专业仪器从而导致检测受条件限制而不便利和成本高的问题。

在具体实施例中，所述pH染料为间甲酚紫。这样，间甲酚紫作为结果显示剂能够根据PCR扩增反应体系的pH值的变化灵活发生颜色变化，提高检测的准确性和灵敏度，而且提高结果判断的便捷性和快速性。

在另具体实施例中，所述聚合酶为Bst聚合酶。该Bst聚合酶能够有效促进上文所述环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.11的LAMP扩增，并使得所述pH染料快速灵活发生显色反应，以便于可以用裸眼直接判断结果。

所述等温扩增缓冲液包括LAMP扩增所需的组分，所述一实施例中，所述等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO₄、吐温20、dNTPs和无核酸酶水(如无菌水)等组分。该等温扩增缓冲液与聚合酶、pH染料等组分构成可视化恒温扩增试剂，有效提高了本发明实施例试剂所含环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.11的LAMP扩增的稳定性。

本发明实施例试剂同时含有杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组，两种环介导等温核酸扩增引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强。当进一步含有可视化恒温扩增试剂时，实现检测两种利什曼原虫在具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测两种利什曼原虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测两种利什曼原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，而且还需专业人员、专业仪器进行而导致检测临场检测性差，而且成本高的不足。

另一方面，基于上文所述等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂，本发明实施例还提供了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂盒(下文统称试剂盒)。本发明实施例试剂盒包括上文所述的本发明实施例试剂。具体的如包括如上文所述的用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组和用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组。

进一步优选的还包括含有如上文所述聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液的可视化恒温扩增试剂。

这样，本发明实施例试剂盒由于采用本发明等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。优选当所述试剂盒含有本发明可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测两种利什曼原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

在进一步实施例中，本发明实施例试剂盒还可以增设包括核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品中的至少一种。

其中，增设所述核酸提取耗材以配合本发明实施例试剂盒所含的环介导等温核酸扩增引物组或进一步所包含的可视化恒温扩增试剂，以提高本发明实施例试剂盒的操作的便捷性。在一实施例中，所述核酸提取耗材包括核酸提取液和/或用于核酸提取的器件；其中，所述核酸提取液包括处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种；所述器件包括取液器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种。

在具体实施例中，所述核酸富集器包括硅胶膜和富集器壳体，所述富集器壳体设有液体进入口，在所述富集器壳体内且在液体进入通道上开设有一凹槽，所述硅胶膜填设于所述凹槽内。所述核酸富集器在使用时，将所述富集器壳体设有液体进入口连接所述取液器的液体出口。

在具体实施例中，洗脱液可以是无核酸酶水，核酸裂解容器可以是裂解管，取液器可以是螺旋口活塞注射器。

通过在本发明实施例试剂盒中设置核酸提取耗材，从而降低核酸提取的专业要求，使得本发明实施例试剂盒操作的便利性，可在实现在无专业人员和无专业设备的情况下，实现现场完成对样本的核酸提取。

所述阳性质控品可以是两种利什曼原虫核酸样本，其环介导等温扩增(LAMP)的模板。所述阴性质控品可以是无核酸酶水，当然也可以是无菌水，如DEPC水。所述清洗液可以是常用的核酸清洗液。

因此，在一实施例中，所述本发明实施例试剂盒可以按照如下表2中的规格进行配备个试剂：

表2

因此，上文本发明实施例试剂盒由于采用本发明实施例试剂或进一步配设可视化恒温扩增试剂，使得所述试剂盒用于检测两种利什曼原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。优选的当所述试剂盒含有可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，使得使用所述试剂盒检测两种利什曼原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得所述试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。

基于上文所述本发明实施例试剂和本发明实施例试剂盒，本发明实施例还提供了一种本发明实施例还提供了一种检测两种利什曼原虫的方法。所述检测两种利什曼原虫的方法包括如下步骤：

S01：提取待测样本核酸；

S02：将所述待测样本核酸与上文本发明实施例试剂盒提供的本发明实施例试剂进行混合并进行LAMP处理；

S03：根据所述LAMP处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。

其中，上述步骤S01中用于提取待测样本核酸的待测样本可以是脱离人体物，如全血、血浆或血清等，还可以是食用原料、食品，还可以设计公共卫生安全的使用物品等。也即是说，该步骤S01中待测样本还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断为目标的来源。提取方式可以按照本领域核酸常规提取方式即可。

在发明实施例中，可以直接用本发明实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取。具体的采用本发明实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取核酸的方法可以按照如下步骤进行如下实施例中的核酸提取方法进行自行提取。这样可以实现在非专业人员和非专业设备的条件下实现快速提取待测样本核酸。

上述步骤S02中，将所述待测样本核酸与上文本发明实施例试剂盒提供的本发明实施例试剂混合处理后，形成LAMP扩增体系。具体可以按照上文表2中的LAMP扩增试剂来配制LAMP扩增体系。在一实施例中，所述LAMP处理的温度优选设定为60℃-70℃，具体如65℃，时间应该是充分的，如为50min。由于所述LAMP处理是等温扩增，因此所述LAMP处理的温度可以采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持一段时间的设备来提供，从而显著的降低了检测两种利什曼原虫的方法的非专业检测人员和非专业设备的要求。

上述步骤S03中，由于在步骤S02中LAMP扩增体系含有可视化的pH染料，因此，待所述LAMP处理结束后，所述LAMP扩增体系的颜色会显示一定的颜色。从而根据取待测样本核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色，与含质控品核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色比较，从而直接用裸眼判断待测样本中是否含有利什曼原虫。

因此，所述检测两种利什曼原虫的方法利用本发明试剂盒进行检测，使得所述检测两种利什曼原虫的方法灵敏度高，重复性好，假阴性及假阳性低，检测准确率高。且所述检测两种利什曼原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察LAMP扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得所述检测两种利什曼原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例

本实施例提供了一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒和利用所述试剂盒检测两种利什曼原虫的方法。

试剂盒包括如下试剂和核酸提取耗材：

试剂包括用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组和用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组以及可视化恒温扩增试剂，其中所述环介导等温核酸扩增引物组和可视化恒温扩增试剂的规格如上文表2中所示。

所述核酸提取耗材：包括提取试剂、菌吸管、核酸富集器；其中，提取试剂包括样品处理液、核酸裂解液、清洗液、核酸洗脱液(无核酸酶水)；

核酸富集器为自组装耗材，是用打孔器将硅胶膜进行剪裁成规则的圆形结构，装入富集器壳体内，该富集器壳体内中间位置为凹槽，将裁剪好的硅胶膜装入凹槽内，组成核酸富集器。

螺口活塞注射器：5ml、1ml的螺口活塞注射器。

其中，所述检测两种利什曼原虫的方法包括如下步骤：

S11.样品核酸的提取方法

待检测样品：全血3份；血浆3份；血清3份；

样本前处理：分别用1ml吸管吸取待检测样品200μL-1000μL到处理管中(含有处理液)，充分混匀室温放置5min，进行第一次的裂解；

样本裂解：将处理后的全血样本转入装有裂解液的裂解管中混匀(裂解液体积为0.6ml)，56℃孵育10-15min充分裂解；

核酸吸附及清洗：分别待经裂解处理后的待检测样品冷却至室温，分别加入1.4ml95％乙醇混匀，用一次性核酸提取装置缓慢吸取裂解后的全血样本，全部吸入5ml注射器，然后缓慢推弃(不反复推吸)；注意：使用前不可将核酸富集器从5ml注射器前端取下；取2ml清洗液至2ml离心管中，用一次性核酸提取装置缓慢吸取全部液体，再缓慢推弃(不反复推吸)；注意：操作前请确认清晰液已加入响应体己的95％乙醇；缓慢推戏注射器活塞5次，充分去除残留的液体；

核酸洗脱：取下与核酸富集器连接的5ml注射器，更换为1ml注射器。用1ml注射器缓慢吸取洗脱液；缓慢推吸1次，将1ml注射器静置1分钟，再推出洗脱的核酸到检测管中，或推出洗脱的核酸到0.6ml离心管中保存，-20℃保存，分别得到全血、血浆、血清核酸，用于后续的检测。

S12.可视化检测体系的建立

(1)可视化LAMP扩增试剂的配制：

1μl的8U/μl的Bst聚合酶；0.2μl的1M KCL；0.4μl的0.4M MgSO₄；0.2μl的10％吐温20；1.12μl的25mM dNTPs；5.52μl的无菌水；0.16μl的50mM可视化pH染料，用无核酸酶水至20μL体系。其中，pH染料为间甲酚紫。

(2)环介导等温核酸扩增引物组的建立

根据GenBank上收录的杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的KM DNA序列，分别进行收集。筛选保守区域(能有效区分杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫)，确定序列状态，并进行比较和筛选确定最终如上文表1中的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11。具体的根据上文表1中SEQ ID NO:12设计上文用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:5；根据上文表1中SEQ ID NO:13设计上文用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:11。

(3)可视化LAMP扩增体系的具体配制为：

0.3mM的外引物F3和外引物B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和内引物BIP各0.48μL；1mM的环引物LF和环引物LB各0.4μL；步骤(1)中配制的可视化LAMP扩增试剂的配制10μL(含染料与Bst酶)；加灭菌纯化水至20μL体系。

(4)LAMP扩增

所述等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。

待检测样品、杜氏利什曼原虫基因的核酸和婴儿利什曼原虫基因的核酸的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品，分别与(1)可视化LAMP扩增试剂按照(3)可视化LAMP扩增体系构建方法分别构件可视化LAMP扩增体系并进行LAMP扩增。

采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持1-2h的设备进行LAMP扩增，反应时间为50min，结束后观察颜色变化。

(5)判定环介导等温扩增反应结果的原则：

a.若LAMP扩增体系最终出现黄绿色，判定测试结果为阳性；

b.若出现紫色(颜色不变)，判定测试结果为阴性。

c.对其他种类的巴贝斯虫或其他物种，在反应的50分钟(min)时间内未检测出(颜色不变)，显示为阴性反应。

(6)LAMP扩增结果

a.质控品的检测结果：

杜氏利什曼原虫基因的核酸和婴儿利什曼原虫基因的核酸的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如下表3所示。

表3

其中，杜氏利什曼原虫阳性质控品(浓度为100copies/μl)和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增(所用的LAMP引物为杜氏利什曼原虫的检测引物组)结果如图1所示，图1中的1-6号孔为杜氏利什曼原虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；7-8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

杜氏利什曼原虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为杜氏利什曼原虫的检测引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图2所示。图2中的1-2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3-4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；5-6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色和淡洋紫色；7-8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

婴儿利什曼原虫的阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时，其浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为婴儿利什曼原虫的检测引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图3所示。图3中的1-2号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；3-4号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；5-6号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；7-8号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。

杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物分别LAMP扩增“无核酸酶水”的结果如图4所示，图4中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增“杜氏利什曼原虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图5所示，图5中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。

杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增“婴儿利什曼原虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果如图6所示，图6中的1号孔为杜氏利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；2号孔为婴儿利什曼原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色。

对于杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的LAMP引物分别LAMP扩增“全血、血浆、血清核酸待测样品”的结果如下

表4

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市疾病预防控制中心

<120> 等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂、试剂盒及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> LDO-F3

<400> 1

tctggtcctc cgggtagg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> LDO-B3

<400> 2

accccataca agtacaacc 19

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> LDO-FIP

<400> 3

ccgatttttg gcatttttgg ctacgaaaac cgaaaaatgg gtgc 44

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> LDO-BIP

<400> 4

ctccgaggcg ggaaactggt atccacacac gtccgagc 38

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> LDO-LB

<400> 5

gtcgggtgga ggggaaatt 19

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> LIN-F3

<400> 6

tccagacgca ttcagcc 17

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> LIN-B3

<400> 7

gaagttaggt ataacgtaag caa 23

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> LIN-FIP

<400> 8

agactagacg ggactagagt actaccaaat tccaatcgaa cagccac 47

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> LIN-BIP

<400> 9

ctagtaccac atcataaacc tagcgtctgt agaacgtcaa tgatagc 47

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> LIN-LF

<400> 10

tttgcctgaa ggtgctgggc 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> LIN-LB

<400> 11

aaacgatgtg caagtatagg tgac 24

<210> 12

<211> 483

<212> DNA

<213> 杜氏利什曼原虫靶序列KM DNA基因的引物设计区域序列

<400> 12

gaattcgccg aaaaatgacc gaaaatgggc caaaaaccca aacttttctg gtcctccggg 60

taggggcgtt ctgcgaaaac cgaaaaatgg gtgcagaaat cccgttcaaa aaatagccaa 120

aaatgccaaa aatcggctcc gaggcgggaa actgggggtt ggtgtaaaat agggtcgggt 180

ggaggggaaa ttcggggctc ggacgtgtgt ggatatggcc tgggtgggga ctttggagtg 240

ggttgtactt gtatggggtt ttggacctgg cttggggttt gggggttggt gtgggaaagg 300

ggttggcgct atttggagtg acgttggctc ttttgataat tgatatttgt tttaaactgg 360

attggttcgg ctggatatac gttggttggg ttggatttgg attggatttg gattttgtac 420

ggggttggag gcttgatttg gggttgagga gtttgtgggg atagttttgg atgttagtat 480

gga 483

<210> 13

<211> 414

<212> DNA

<213> 婴儿利什曼原虫靶序列KM DNA基因的引物设计区域序列

<400> 13

agaacgcccc tcccccacgg accagaaaag tttggatttt taggccattt tttgggattt 60

tcagcgtttt ccagccaatc cagacgcatt cagcccaaat tccaatcgaa cagccacagc 120

ccagcacctt caggcaaagt agtactctag tcccgtctag tctagtacca catcataaac 180

ctagcataca aataaaacga tgtgcaagta taggtgacat ttagctatca ttgacgttct 240

acagaccttg cttacgttat acctaacttc agagatcttc gaacattata ataccatgga 300

actatagcat cccatgtcta tgcctaatag gcagtatacc cctgtaatta atattaaata 360

ttaattataa ggtgtaacaa gcccattacc ataacgaaac accgtatgtg tcta 414

Claims

1.一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下用于检测杜氏利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组：

用于检测婴儿利什曼原虫的环介导等温核酸扩增引物组：

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：

聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。

3.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述聚合酶为Bst聚合酶；和/或

所述pH染料为间甲酚紫；和/或

所述等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO₄、吐温20、dNTPs和无核酸酶水。

4.一种等温扩增检测两种利什曼原虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一所述的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取耗材包括核酸提取液和/或用于核酸提取的器件；其中，

所述核酸提取液包括处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种；

所述器件包括取液器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种；

所述阳性质控品为杜氏利什曼原虫的核酸模板和婴儿利什曼原虫的核酸模板；

所述阴性质控品为无核酸酶水。

7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第三外引物SEQ ID No.6和第四外引物SEQ ID No.7的使用浓度均为1.8μM；

所述第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第三内引物SEQ ID No.8和第四内引物SEQ ID No.9的使用浓度均为57.6μM；

第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.10、第三环引物SEQ ID No.11的使用浓度均为20μM。

8.一种检测两种利什曼原虫的方法，该方法包括如下步骤：

获取待检测样品的核酸；

将所述待测样本核酸与权利要求1-3任一所述的试剂或权利要求4-7任一项所述的试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，获取所述待检测样品的核酸的方法包括如下步骤：

对待检测样品进行裂解处理，获得含待检测样品核酸的裂解液；

将所述裂解液经过核酸富集器吸附处理，并对被吸附的待检测样品核酸进行清洗处理，后进行核酸洗脱处理。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述环介导等温核酸扩增处理的温度为60-70℃。