CN111876510A - 一种用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中的应用。本申请用于粪便微生物检测的试剂包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物。本申请用于粪便微生物检测的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸进行粪便拟杆菌属检测，从而准确有效的判断粪便样品中是否含有粪便拟杆菌属，减小或避免了因粪便核酸提取不稳定性造成的漏检或假阴性等问题，能够更好的满足临床使用需求。

Description

一种用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中 的应用

技术领域

本申请涉及粪便微生物检测领域，特别是涉及一种用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中的应用。

背景技术

人类的肠道中生存着数量庞大的不同种类的微生物，这些微生物形成的微生态菌膜屏障，对维持人体正常免疫防御功能具有重要作用。肠道微生物是人体内最庞大、最复杂的微生态系统。肠道微生物及其代谢产物能够调节人体健康，是人体健康或疾病的重要参考指标。

目前，对肠道微生物的检测主要以粪便微生物为主，即提取粪便中的基因组核酸，对其进行微生物基因组检测和分析。但是，现有的肠道微生物定性或定量检测中基因组核酸提取效率普遍较低，且稳定性差；以至于粪便微生物的检测效果较差，特别是在一些特殊情况下，对一些重要的微生物指标检测不能满足临床分析使用需求。并且，现有的微生物基因组检测流程，主要是对待测样品中的多种基因组微生物进行分析检测，缺乏对某些重要微生物的针对性检测；再加上核酸提取的不稳定性，容易产生漏检或假阴性。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中的应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种用于粪便微生物检测的试剂，包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物，

Seq ID No.1：5’-ATGGATAGGGGTTCTGAGAG-3’

Seq ID No.2：5’-TATTCCTCACTGCTGCCTC-3’。

需要说明的是，本申请的试剂能够特异性的针对粪便微生物中的粪便拟杆菌属进行检测。研究显示，在特定条件下粪便拟杆菌属和其他无芽胞厌氧菌会引起疾病感染；因此，需要特别对粪便微生物中的粪便拟杆菌属进行检测。为此本申请特别研发了一种新的用于粪便微生物检测的试剂，采用本申请的试剂能够高效准确的检测粪便样品中的粪便拟杆菌属。

还需要说明的是，本申请用于粪便微生物检测的试剂，其检测对象是提取自粪便样品的核酸；原则上，这些核酸中包含来自于人的基因组信息，以及来自于粪便中的各种微生物的基因组信息。但是，具体的粪便核酸样本中含有哪些微生物的基因组信息，是不确定的；本申请的试剂只是用于确定或排除粪便核酸样本中是否含有粪便拟杆菌属。从检测原理上来说，本申请是采用粪便拟杆菌属的属特异性检测引物通过PCR扩增进行检测，现有技术中也有关于拟杆菌PCR检测的相关研究，但是，现有的拟杆菌PCR检测方案不能有效的对粪便核酸样本中的粪便拟杆菌属进行检测。因此，本申请研发了一种新的能够特异性的针对粪便微生物中的粪便拟杆菌属进行检测的粪便微生物检测试剂。

本申请的一种实现方式中，本申请的试剂还包括用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂。

本申请的一种实现方式中，用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂包括TBGreen Premix Ex Taq反应液和ROX参比染料。

需要说明的是，本申请将用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂组合在一起可以方便使用，从而便于粪便微生物检测；可以理解，用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂也可以通过市售购买获得。

本申请的第二方面公开了本申请用于粪便微生物检测的试剂在非诊断治疗目的的粪便拟杆菌属检测中的应用。

本申请的第三方面公开了一种非诊断治疗目的的粪便拟杆菌属的检测方法，包括采用本申请的用于粪便微生物检测的试剂，对获取自粪便样品的核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果判断粪便样品中是否含有粪便拟杆菌属。

本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增结果进行融解曲线分析，融解曲线出峰单一则判断检测结果特异性强，出峰不单一则判断检测结果存在非特异性扩增或引物二聚体。

可以理解，本申请的试剂能够特异性的检测粪便拟杆菌属，因此，只要有扩增曲线，就基本上可以判断粪便样品中含有粪便拟杆菌属；通过融解曲线进行判断，只是为了进一步的确定扩增产物的特异性，可以根据需求选择使用。

本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，根据测序结果判断是否为粪便拟杆菌属。

可以理解，测序是最直观的判断方法，测序结果与粪便拟杆菌属一致，就可以直接准确的说明粪便样品中含有粪便拟杆菌属。原则上，通过本申请的扩增曲线判断和融解曲线分析就可以准确的判断粪便拟杆菌属，可以根据需求选择测序分析。

本申请的一种实现方式中，对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，具体包括将染料法实时荧光定量PCR扩增产物与载体连接，然后对重组载体进行测序。

需要说明的是，将PCR扩增产物重组到载体中再进行测序，主要是为了保障PCR扩增产物的稳定性，以便于后续测序的准确分析和判断；理论上也可以直接对PCR扩增产物进行测序，在此不作具体限定。

本申请的一种实现方式中，载体为T载体。可以理解，T载体是常规使用的质粒载体，不排除还可以采用其它载体。

本申请的一种实现方式中，根据测序结果判断是否为粪便拟杆菌属，具体包括将测序结果用NCBI进行BLAST比对，根据比对结果判断是否为粪便拟杆菌属。

本申请的有益效果在于：

本申请用于粪便微生物检测的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸进行粪便拟杆菌属检测，从而准确有效的判断粪便样品中是否含有粪便拟杆菌属，减小或避免了因粪便核酸提取不稳定性造成的漏检或假阴性等问题，能够更好的满足临床使用需求。

附图说明

图1是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增曲线；

图2是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增融解曲线；

图3是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增产物测序结果的序列比对结果图；

图4是本申请实施例中粪便核酸样本染料法实时荧光定量PCR扩增产物测序结果的BLAST比对结果图。

具体实施方式

粪便微生物检测有利于了解人体健康情况或为疾病检测和分析提供参考依据。在一些特殊情况下粪便拟杆菌属和其他无芽胞厌氧菌会引起感染，影响人体健康，例如，①屏障作用受损：手术、拔牙和穿孔等使细菌侵入非正常寄居的部位；②菌群失调：长期使用抗生素使体内一种或几种厌氧菌得到优势增长，破坏了正常菌群的平衡，如脆弱拟杆菌对氨基糖苷类抗生素有耐药性；③机体抵抗力降低：在治疗中使用激素、免疫抑制剂或X射线，恶性肿瘤、糖尿病和大面积烧伤等均可造成免疫功能下降；④局部组织供血障碍：如血管损伤、造成局部厌氧微环境，有助于厌氧菌生长繁殖等。在这些情况下，通过检测粪便微生物中的粪便拟杆菌属可以对感染情况进行分析。现有的拟杆菌属检测方案不能很好的适用于粪便核酸样本检测，因此，本申请研发了一种新的能够特异性的针对粪便微生物中的粪便拟杆菌属进行检测的粪便微生物检测试剂，其中包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物。

本申请的试剂能够准确有效的从粪便核酸样本中检测粪便拟杆菌属，从而为临床分析提供重要的参考依据，避免了因粪便核酸提取不稳定性可能造成的对粪便拟杆菌属的漏检问题。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下可以省略，或者可以由其他试剂盒、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。以下实施例中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例

一、材料与方法

1.粪便核酸提取

本例采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行粪便核酸的提取，货号DP302-02，具体方法步骤参照该说明书。

本例提取了5份不同来源粪便的核酸样本，用于后续试验。

2.引物设计与合成

本例特别针对粪便微生物中的粪便拟杆菌属设计特异性检测引物，设计的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计的引物序列如表1所示。

表1粪便拟杆菌属特异性检测引物

引物名称	序列(5’→3’)	Seq ID No.
			Bacteroides-F	ATGGATAGGGGTTCTGAGAG	1
Bacteroides-R	TATTCCTCACTGCTGCCTC	2

3.粪便核酸样本检测

采用本例设计的粪便拟杆菌属特异性检测引物，对提取的粪便核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增(QPCR)检测，并设置一个水阴性对照，QPCR反应体系如表2所示，QPCR反应条件如表3所示。

表2 QPCR反应体系

反应物名称	用量
		TB Green Premix Ex Taq(2×)	5.0μL
ROX	1.0μL
		10mM Bacteroides-F	0.2μL
10mM Bacteroides-R	0.2μL
		DNA模板	1.0μL
ddH<sub>2</sub>O	2.6μL
		总计	10μL

表3 QPCR反应条件

本例将所有核酸样本的QPCR产物纯化后连接T载体，并送金唯智测序公司进行测序，将测序结果用NCBI进行BLAST，分析QPCR产物的具体种属情况。其中，QPCR产物纯化采用康为世纪的DNA Clean-up Kit进行QPCR产物的纯化，货号CW2301M，具体方法步骤参照该说明书。T载体连接采用全式金的pEASY-T5 Cloning Kit进行连接转化，货号CT501，具体方法步骤参照该说明书。

二、结果与分析

1.染料法实时荧光定量PCR扩增结果

本例对5个核酸样本的QPCR检测结果如图1所示，结果显示，5个核酸样本都有检出粪便拟杆菌属。并且，5个核酸样本QPCR的融解曲线如图2所示，可见，所有粪便核酸样本的QPCR融解曲线出峰单一，说明有按照预期特异性的扩增获得粪便拟杆菌属靶标序列。

2.测序和序列比对结果

对5个核酸样本的QPCR产物进行测序，并采用NCBI进行BLAST比对，结果如图3和图4所示。图3为测序结果部分序列的比对结果，图4为BLAST比对结果。比对结果显示，5个核酸样本的QPCR产物都是粪便拟杆菌属，与预期相符，说明本例设计的引物能成功的在粪便核酸样本中检测出粪便拟杆菌属。

因此，本例设计的特异性检测引物能够作为针对粪便微生物中的粪便拟杆菌属进行检测的试剂，采用本例的试剂，能够准确有效的从提取自粪便样品的核酸样本中检出粪便拟杆菌属，避免了因粪便核酸提取不稳定性造成的粪便拟杆菌属漏检问题。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 壹宏（深圳）基因有限公司

<120> 一种用于粪便微生物检测的试剂及其在粪便拟杆菌属检测中的应用

<130> 20I30393

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggataggg gttctgagag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tattcctcac tgctgcctc 19

Claims (10)

1.一种用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：包括Seq ID No.1所示序列的上游引物和Seq ID No.2所示序列的下游引物，

Seq ID No.1：5’-ATGGATAGGGGTTCTGAGAG-3’

Seq ID No.2：5’-TATTCCTCACTGCTGCCTC-3’。

2.根据权利要求1所述的用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：还包括用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂。

3.根据权利要求2所述的用于粪便微生物检测的试剂，其特征在于：所述用于染料法实时荧光定量PCR扩增的试剂包括TB Green Premix Ex Taq反应液和ROX参比染料。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于粪便微生物检测的试剂在非诊断治疗目的的粪便拟杆菌属检测中的应用。

5.一种非诊断治疗目的的粪便拟杆菌属的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的用于粪便微生物检测的试剂，对获取自粪便样品的核酸样本进行染料法实时荧光定量PCR扩增，根据扩增结果判断粪便样品中是否含有粪便拟杆菌属。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增结果进行融解曲线分析，融解曲线出峰单一则判断检测结果特异性强，出峰不单一则判断检测结果存在非特异性扩增或引物二聚体。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：还包括对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，根据测序结果判断是否为粪便拟杆菌属。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述对染料法实时荧光定量PCR扩增产物进行测序，具体包括将染料法实时荧光定量PCR扩增产物与载体连接，然后对重组载体进行测序。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述载体为T载体。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述根据测序结果判断是否为粪便拟杆菌属，具体包括将测序结果用NCBI进行BLAST比对，根据比对结果判断是否为粪便拟杆菌属。

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