CN111867721A

CN111867721A - 使用固-液相系统分离和纯化核酸的方法

Info

Publication number: CN111867721A
Application number: CN201980016846.5A
Authority: CN
Inventors: 招彦焘
Original assignee: Xiangda Biotechnology International Co ltd
Current assignee: Xiangda Biotechnology International Co ltd
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-10-30
Also published as: EP3740588A4; US20210079376A1; WO2019144030A1; JP2021511032A; US11643646B2; JP7370987B2; EP3740588A1

Abstract

本发明提供了一种使用改性多孔材料从含核酸材料中分离和纯化核酸的方法和系统，该改性多孔材料含有固‑液相系统中的阳离子基团。在一些实施方式中，本发明能够以相对简单的方式获得足够纯度和数量的核酸以能够进行后续的准确分析或处理。在一些实施方式中，该液相包含双水相系统(ATPS)，该双水相系统包含第一相和第二相，和包含多孔材料的固相，其中该两个相经过多孔材料。在一些实施方式中，核酸进入多孔材料的孔中并进而穿过多孔材料，同时优先分配到两相中的一相。

Description

使用固-液相系统分离和纯化核酸的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求申请日为2018年1月19日的美国临时专利申请No.62/619,274的优先权。该申请的全部内容和披露以引用的形式并入本申请。

本申请引用了多个出版物。该等出版物的全文披露以引用的形式在此并入本申请以更全面地描述本发明涉及的现有技术。

技术领域

本发明涉及一种用于从含核酸材料中分离和纯化核酸的方法。在一些实施方式中，该方法包括在固-液相系统中使用含有一个或多个阳离子基团的改性多孔材料。通过有效地捕获和保持核酸，该改性多孔材料有助于显著增加目标核酸的浓度。

背景技术

分离和纯化高质量核酸是许多生物技术应用中的关键步骤。与特定介质中存在的核酸测试相关的许多分析检定的结果很大程度上取决于样本中目标核酸(例如血液或口腔细胞)的纯度和数量。如果样本中目标核酸的量或浓度过低，或者样本中存在过量或少量的干扰分子(如非目标核酸)、其他大分子(如蛋白质)或小分子(如盐和去污剂)，结果的可靠性就会降低。因此，从原始样本中的其他组分中分离出高纯度和高数量的核酸对于确保核酸的高质量分析至关重要。

已经开发出一些对生物分子具有增强亲和力或结合能力的离子交换膜(如美国专利号No.4,473,474和No.4,601,828中所公开)。然而，改性仅限于膜的表面。迄今为止，还没有关于对多孔膜内的孔和/或毛细系统进行改性以增强亲和力或结合能力的报道。

美国专利号No.6,780,327公开了一种阳离子荷电膜。该膜包括亲水性底物和交联涂层，以将正电荷固定到膜上。然而，这类膜的制备涉及复杂的化学过程和很高的加工成本。部分膜的化学过程(例如交联度)控制较为困难且费时费力。

从生物样本中提取和纯化核酸的现有方法通常耗时、繁琐、且成本昂贵，并且涉及有害有机溶剂的使用。此外，所收集核酸的最终数量或浓度并不总是满足下游生物技术应用和分析的要求。因此，这些方法在临床检验或工业环境中的应用可能有限。这些方法的局限性还可能包括缺乏处理大量样本的能力以及与快速医疗诊断自动化的低兼容性。

为了解决本领域中的一些不足，本发明提供了一种新颖简单的与各种工业、临床和研究用途高度兼容的用于核酸分离和纯化的方法和系统。

发明内容

在一些实施方式中，本发明提供了一种用于从含核酸材料中快速分离和纯化核酸的固-液相系统。该系统包括作为固相的多孔材料和作为液相的双水相系统(ATPS)。在一些实施方式中，该多孔材料包括表面和多个孔，其中该表面和该孔包括多个阳离子基团，该双水相系统包括第一相和第二相。

在一些实施方式中，本发明提供了一种使用固-液相系统从含核酸材料中分离和纯化核酸的方法，该固-液相系统包括含有阳离子基团的改性多孔材料。通过有效捕获和保持目标核酸，该改性多孔材料能够显著增加目标核酸的浓度。

在一些实施方式中，本发明能够使用改性多孔材料有效且高效地分离和纯化存在于生物材料中的核酸，其中该改性多孔材料的表面和孔/毛细管系统均被改性以包含阳离子基团。

在一些实施方式中，本发明能够使用含有阳离子基团的改性多孔材料有效和高效地分离和纯化生物材料中存在的核酸。在一些实施方式中，阳离子基团可以是脂族胺(aliphatic amine)(伯胺、仲胺或叔胺)，例如二甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺和十二烷胺及其组合。在一些实施方式中，脂族胺包含1至12个碳原子。在一些实施方式中，阳离子基团是芳香胺，诸如苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚和二乙基苯胺或其组合。在一些实施方式中，阳离子基团是多胺，诸如亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、和三(2-氨基乙基)胺及其组合。

在一些实施方式中，本发明提供了一种用于从含核酸材料中纯化核酸的方法，包括以下步骤:

a)获得包含固相和液相的固-液相系统，其中固相包含具有表面和多个孔的多孔材料，其中该表面和该孔包含多个阳离子基团，并且其中该液相包含具有第一相和第二相的双水相系统(ATPS)；

b)将该含核酸材料与该液相混合，从而得到混合物；和

c)将步骤b)中得到的混合物与该固相接触，

其中核酸能够与该固相结合，并随后穿过多孔材料的孔，进而纯化该核酸。

由于多孔材料的表面和孔/毛细管系统被改性以包含带正电荷的阳离子基团，多孔材料对带负电荷的核酸具有较高的结合亲和力。因此该种多孔材料在捕获/保持核酸方面更有效，与使用未改性多孔材料相比，可以增加核酸的可收集量。在一些实施方式中，与原始样本相比，所收集核酸的最终浓度可以增加10倍到1000倍。

附图说明

图1示出了向水中添加聚合物和盐导致的相分离的照片。当特定盐和聚合物在水溶液中混合时，双水相系统(ATPS)形成，随后进行自发相分离。在屏(panel)A1和B1所示的管中，两相混合形成混合相，然后富盐相和富聚合物相逐渐分离形成不同的层，如屏A2和B2所示。本实施例中的富盐相沉淀在管的底部，而富聚合物相位于富盐相的上方。不同分子(例如核酸)因其性质不同可能会有差别地分布在两相。可以通过改变聚合物与盐的比例改变两相的体积比使得目标分子浓缩在体积较小的相中。例如，屏A2示出了上层相与下层相的比例为1:1，而屏B2示出了该比例为9:1。屏B2显示目标分子(在本例中，纳米金颗粒)浓缩在下层相(富盐相)，这从屏B2中下层相的目标分子浓度高于屏A2中下层相的目标分子浓度所导致的较深颜色中可以明显看出。

图2示出了利用如实施例2中所述的本发明的一些实施方式从掺入了DNA梯状条带(DNA ladder)的溶液中分离DNA的示意图。从由改性玻璃纤维纸形成的纸堆叠(paperstack)的六个片段中的每一个片段提取DNA。可以看出，从嵌入了ATPS的纸提取出的DNA多于空白纸，并且大部分DNA浓缩在嵌入了ATPS的纸的上段。利用本发明的实施方式，成功提取出存在于掺入了DNA梯状条带中所有大小的片段。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的术语(包括技术和科学术语)的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同，并且省略了可能模糊本发明主旨的公知功能和构造的详细描述。

在核酸的分离过程中，各种因素(例如分离系统材料的选择、温度、压力、酸碱度、化学或酶水解以及污染物的存在)可能导致核酸降解并损害其结构和功能的完整性。

本发明提供了一种用于从含核酸材料中纯化核酸的固-液相系统。该系统包括作为固相的多孔材料和作为液相的双水相系统(ATPS)。在一些实施方式中，该多孔材料包括表面和多个孔，其中该表面和该孔被改性以包含多个阳离子基团。在一些实施方式中，该ATPS包含第一相和第二相。

在一些实施方式中，本发明提供的方法稳健、成本低、简单、易操作、安全、用户友好且快速。在一些实施方式中，本发明方法能够以简单的方式获得高纯度和高浓度的目标核酸以用于下游生物技术应用和分析。它确保使用所分离核酸的下游应用的性能不会受到原始样本中杂质的影响。一些实施方式不需要任何额外的电源、复杂的仪器或电子硬件来操作，因此提供了一种快速和经济上可负担的核酸分离和纯化方法。

本发明提供的固液相系统中的液相是ATPS。ATPS由两种不同理化性质的相组成。不同分子(例如核酸)因其性质不同而有差异地分布两相，从而使得能够以最少的设置和人为干预来分离和浓缩目标分子。当ATPS应用于多孔材料时，该两相以不同的速率穿过多孔材料。因此，目标分子可以浓缩在多孔材料的特定部分，并随后从中收集。

在一些实施方式中，本发明的固相由包含阳离子基团的改性多孔材料组成，并与包含本文所述ATPS的液相结合使用，以从含核酸材料中分离和纯化目标核酸。目标核酸能够进入多孔材料的孔中并穿过多孔材料，同时优先分配到ATPS两相中的一相。最后，目标核酸移动到多孔材料的一端，并且可以从那里收集；非目标核酸和非核酸材料留在ATPS的另一个相中。

在一些实施方式中，可以使用洗脱缓冲液或水从多孔材料中洗脱目标核酸。可以通过调节用于洗脱目标核酸的缓冲液或水的量控制目标核酸的浓度。洗脱缓冲液或水的量越小，目标核酸的浓度越高；量越大，浓度越低。在一些实施方式中，不需要使用水或洗脱缓冲液，并且可以通过简单地从多孔材料中吸取含有目标核酸的ATPS液相来收集目标核酸。

一般来说，决定分子(包括核酸)在ATPS两相中分配范围的可以有多种因素，诸如分子的性质(例如大小、电荷、各自对两相的亲和力)、ATPS的性质(例如ATPS组分的浓度和电荷、以及两相间的界面张力)、操作条件(例如温度)。在一组条件下操作的优先分配到特定ATPS中一个相的特定分子在条件改变的情况下可以优先分配到另一个相。与本发明相关地，目标核酸更有可能存留在ATPS的上层相中。

在一些实施方式中，多孔材料的表面和孔/毛细管系统均被改性以包含阳离子基团。与不含阳离子基团的多孔材料相比，含带正电荷的阳离子基团的多孔材料对带负电荷的核酸具有更高的结合亲和力。可以使用本发明的改性多孔材料通过有效捕获和保持目标核酸来显著增加目标核酸的浓度，即使目标核酸在原始样本中的数量很低。本发明的优点在于，一些实施方式允许以比使用常规方法更简单的方式获得更高纯度和更高数量的目标核酸，并且所得核酸适用于各种下游生物技术应用。

在一些实施方式中，本发明提供了一种简单的方法来改性多孔材料的表面和孔/毛细管系统。发明人出乎意料地发现，通过将多孔材料浸泡在胺水溶液中，然后剧烈搅拌，可以将多孔材料改性成包含阳离子的胺基团。在一些实施方式中，阳离子胺基团是脂族胺，诸如伯、仲或叔脂族胺或其组合。脂族胺的例子包括但不限于二甲胺、乙二胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺或十二烷胺。在一些实施方式中，脂族胺包含1至12个碳原子。在一些实施方式中，阳离子胺基团是芳族胺，诸如苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚或二乙基苯胺。在一些实施方式中，阳离子基团是多胺，诸如亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺和三(2-氨基乙基)胺及其组合。在一些实施方式中，多孔材料被改性以包含脂族胺、芳香胺和多胺。在一些实施方式中，多孔材料被改性以包含除去脂族或芳族胺或多胺之外的阳离子基团，包括但不限于铵、锍(sulfonium)或鏻(phsophonium)。

在一些实施方式中，本发明方法通过简化或省略普通纯化过程中的一个或多个步骤来简化核酸的分离。在一些实施方式中，省略使用有机溶剂如醇进行提取或洗涤。在一些实施方式中，本发明方法允许在短时间内同时从溶液中提取核酸和从杂质中分离核酸，并产生高纯度的可立即用于进一步表征和下游处理的核酸。

本发明的一些实施方式允许获得可用于广泛下游应用的核酸，诸如在法医、诊断或治疗应用中的核酸检测或分析，以及实验方法，诸如测序、扩增、逆转录、标记、消化、印迹方法等。本发明的一些实施方式预期能够保持目标核酸的结构和功能完整性，从而确保所分离核酸的下游表征或处理的准确进行。

由于本文所述的独特特征，本发明的一些实施方式可用于从小体积样本和含有非常少量目标核酸的样本中方便、快速地分离目标核酸，而无需使用外部电源或复杂的仪器。此外，本发明方法易于适配自动化系统，包括高通量筛选系统。

在一个实施方式中，本发明提供了一种在固-液相系统中使用含有阳离子基团的改性多孔材料从含核酸材料中快速纯化一种或多种核酸的方法，该方法包括:

a)将含核酸材料与包含第一相和第二相的ATPS混合，从而获得混合物；和

b)将从步骤a)获得的混合物与包含含有阳离子基团的改性多孔材料的固相接触，

其中该混合物中的一种或多种核酸与固相结合，并随后穿过改性多孔材料中的孔，从而将核酸与含核酸材料中的其他分子分离。

由于本发明多孔材料的表面和/或孔/毛细管系统被改性为包含带正电荷的阳离子基团，其对带负电荷的核酸具有更高的结合亲和力。结果，以这种方式改性的多孔材料在捕获/保持核酸方面更有效，并且显著增加了所收集核酸的最终数量。在一些实施方式中，当溶液中阳离子的浓度增加时(例如当溶液被浓缩时)，结合到多孔材料的正电荷表面的一些或全部核酸被释放并进入溶液。

在一些实施方式中，通过本发明获得的核酸的最终浓度是原始样本中浓度的10至1000倍。在一些实施方式中，使用合适的缓冲液从多孔材料中提取或洗脱本发明捕获的核酸，从而获得纯化的样本。可以通过测量原始样本和纯化样本中核酸的浓度估计原始样本和纯化样本之间核酸浓度的倍数变化。在另一个实施方式中，核酸浓度的倍数变化是通过基于原始样本和纯化样本的体积和其中所含核酸的量来估算的。

在一些实施方式中，利用本发明分离和/或纯化的核酸是DNA，诸如基因组DNA、质粒DNA、无细胞DNA或任何长度、大小或构型的其他DNA产物。在另一实施方式中，利用本发明分离的核酸是核糖核酸(RNA)，诸如总RNA、信使RNA、核糖体RNA、无细胞RNA、miRNA、siRNA或任何长度、大小或构型的其他RNA产物。在另一个实施方式中，核酸是任何长度、大小或构型的肽核酸(PNA)。在一些实施方式中，使用本发明分离的核酸是任何上述核酸的组合。

在一些实施方式中，本发明可以分离具有20至1000个碱基对/核苷酸的核酸。在一些实施方式中，核酸是单链、双链或带切口的。

本发明可以从取自生物或非生物来源的含核酸材料中提取核酸。在一些实施方式中，含核酸材料包括但不限于血液、血浆、血清、组织、细菌、病毒、核糖核酸病毒、涂片制剂、细菌培养物、细胞培养物、尿液、唾液、粪便、和分泌物(例如眼泪、痰、鼻咽粘液、阴道分泌物、阴茎分泌物)、细胞悬液、贴壁细胞、聚合酶链反应(PCR)混合物和体外核酸改性或反应混合物。在另一个实施方式中，含核酸材料包括人、动物和/或植物材料。

在一些实施方式中，本发明用于从大肠杆菌或其他微生物(例如细菌和病毒)中提取质粒DNA以用于随后的克隆或测序或其他分子生物学分析。在一些实施方式中，本发明用于提取任何大小的(包括短或长的RNA或DNA，单链或双链)，其来源于生物体、细胞或来源于测序反应或其他类似反应的核酸。从血液样本中分离的核酸，尤其是DNA，可用于遗传病的诊断、血液传播寄生虫病如疟疾的诊断和监测、亲子关系的确定以及某些肿瘤中可能发生的血液中异常细胞群的监测。

在一些实施方式中，含核酸材料和包含含有阳离子基团的改性多孔材料的固相之间的接触约为10秒至5分钟以使核酸吸附在固相上。在另一个实施方式中，接触时间是15、30或45秒。在另一个实施方式中，接触时间是1、2、3、4或5分钟。在各种实施方式中，可以根据待提取目标核酸的类型和含核酸材料中目标核酸的丰度选择接触时间。可以通过测定在不同时间点吸附在固相上的核酸量来进一步优化接触时间。在本发明中，由于核酸对具有阳离子基团的改性多孔材料的结合亲和力显著增强，接触时间可显著减少，而不会损害最终产物中核酸的收率和纯度。

在一些实施方式中，本发明可以分离浓度低至1pg/mL的溶液中存在的核酸。在一些实施方式中，本发明可以将核酸从相对大体积的样本溶液中分离成低至lμL的小体积。

固相

在一些实施方式中，本发明提供了包含改性多孔材料的固相，该材料允许核酸在其孔或毛细管系统内穿过。在一些实施方式中，本发明不需要在固相上对核酸进行任何化学吸附。多孔材料可以由任何合适的、可供目标核酸穿过的多孔材料制成，包括但不限于各种类型的纸、聚合物泡沫、纤维素泡沫、其他类型的泡沫、人造丝织物、棉织物、其他类型的织物、木材、石头、陶瓷、金属、琼脂糖凝胶和碳纤维。在一些实施方式中，使用包括但不限于玻璃纤维纸、棉基纸、单层基质纸或聚烯烃泡沫垫的材料。这种材料可以更好地保持核酸结构和功能的完整性。

在一些实施方式中，用于本发明的多孔材料是由非纤维素纤维制成的纸。不同于传统的纸色谱分析法，本发明使用单一的流动相，即双水相系统(ATPS)，其包括两相，并在穿过固相(例如纸)时进行相分离。多孔材料可以从市场上购买，也可以内部制造。

在一些实施方式中，本发明不需要任何分子探针或纳米颗粒来捕获目标核酸，这与传统的基于纸/膜的侧向流动分析(LFA)不同，后者使用薄层纸、膜、抗体、分子探针和/或金纳米颗粒来分离混合物中的分子，并基于抗原和抗体之间的生化相互作用或基于分子探针和目的DNA之间的杂交来检测目标分子。相反，通过本发明获得的产品可以用于任何下游处理或分析，包括LFA分析。

在一些实施方式中，选择多孔材料，使得小分子核酸可以自由进入多孔材料的孔，而大分子如大基因组DNA或非核酸大分子被排除在孔之外，从而有效地将这些不需要的材料与目标核酸分离。在一些实施方式中，根据等温动力学原理，来自含核酸材料的目标核酸可以通过毛细作用穿过多孔材料，不需要外部动力或额外设备。

在本发明中，未预期地发现，通过选择合适的固相材料并结合本文所述的ATPS方法使用固相，常规的基于纸或膜的色谱分析法中通常需要的洗脱步骤对于核酸的分离和纯化可能不是必需的。本领域普通技术人员可以基于包括目标核酸的长度、尺寸和/或构型在内的因素容易地选择多孔材料内的孔或毛细通道的尺寸，该尺寸也可以进一步取决于样本中存在的非目标分子的尺寸和构型。在一些实施方式中，孔径在0.1-100μm的范围内。在各种实施方式中，孔径可以是20、30、40、50、60、70、80或90μm。在一些实施方式中，该多孔材料是直径为10-100μm的纸。在另一个实施方式中，多孔材料是直径为4-5μm的纸。

为了便于提取核酸或排除非目标分子，可以使用合适的材料处理固相以改变多孔材料的理化性质。在一些实施方式中，可以使用诸如盐溶液、聚乙二醇溶液或Triton(曲拉通)-X的试剂以改性多孔材料的微结构。可以通过将阳离子基团永久和/或暂时地附着到多孔材料上改性多孔材料。例如，除了永久阳离子基团之外，瞬时带正电荷的部分也可以附着到多孔材料上，以进一步增强核酸结合。在用纸作固相的一些实施方式中，带正电荷的部分可以永久或暂时地附着到纸的纤维分子上。

在一些实施方式中，多孔材料涂覆有带正电荷的部分。在一些实施方式中，改性多孔材料使得当与多孔材料接触的溶液的酸碱度改变时，形成额外的带正电荷的基团(例如，在面向溶液的一侧或在孔内)。因此，带负电荷的核酸将被吸引到多孔材料表面的阳离子部分，而带正电荷的杂质将被排除。

在一些实施方式中，本发明提供了一种改性多孔材料的表面和孔/毛细管系统的方法，包括将多孔材料浸泡在胺水溶液中然后剧烈搅拌的步骤。在一些实施方式中，纸的纤维分子通过以下制备过程用胺改性:将胺溶解在水溶液中以获得5M胺水溶液。将多孔纸浸泡在5M胺水溶液中，然后以至少700转/分的速度剧烈搅拌1小时。该纸在80℃的溶液中保持24小时。然后将纸取出，用水洗涤两次，并在压缩空气下干燥。本领域普通技术人员可基于各种因素(包括阳离子基团的预期偶联程度、多孔材料的类型和尺寸等)容易地选择胺溶液的浓度、混合或搅拌的时间和其它反应条件。通常，胺溶液的浓度越高或混合时间越长，阳离子基团与多孔材料的偶联程度越高。

在一些实施方式中，用于改性多孔材料的胺是脂族胺，诸如伯、仲或叔脂族胺或其组合。脂族胺的例子包括，但不限于，二甲胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺或十二烷胺。在一些实施方式中，脂族胺包含1至12个碳原子。在一些实施方式中，胺是芳族胺，诸如苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚或二乙基苯胺。在一些实施方式中，阳离子基团是多胺，诸如亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺和三(2-氨基乙基)胺及其组合。在一些实施方式中，脂族胺、芳族胺和多胺用于改性多孔材料。在一些实施方式中，一种或多种不同于胺基的阳离子基团附着到本发明的多孔材料上。

在一些实施方式中，多孔材料被改性以减少多孔材料和溶液中的非目标分子(如蛋白质)之间的非特异性结合。在各种实施方式中，多孔材料的上述改性可以均匀地、随机地或限制在多孔材料的特定(一个或多个)区域内进行。

在一些实施方式中，可以使用多层多孔材料。在其他实施方式中，仅使用一层多孔材料。所用的多孔材料可以为任何合适的尺寸。在一些实施方式中，多孔材料为矩形，尺寸为0.5×4×0.083cm。在一些实施方式中，多孔材料的厚度可以是0.5mm至5mm。本领域技术人员将理解，本发明中使用的多孔材料的尺寸可以基于容器的尺寸、样本的体积和/或其他因素来选择，该容器中包含待从中分离目标核酸的样本。

在一些实施方式中，含纤维纸或其他多孔材料或其组合的层形成堆叠(stack)。这些堆叠可以通过堆叠材料层(或片材)并将所得堆叠切割成合适的尺寸来形成。堆叠可以由两层或多层(或多片)多孔材料形成。在一些实施方式中，堆叠由四层多孔材料形成。在一些实施方式中，这种多孔材料是含纤维的纸。在一些实施方式中，多孔材料是玻璃纤维纸。由含纤维纸形成的堆叠在本文中有时被称为纸堆叠。在一些实施方式中，堆叠是尺寸为0.5cm×4cm的矩形。

液相

本发明的液相是包含第一相和第二相的双水相系统(ATPS)。在一些实施方式中，ATPS的一个相包含胶束溶液，而另一个相包含一种或多种聚合物。在一些实施方式中，ATPS的一个相包含胶束溶液，而另一个相包含一种或多种盐。在一些实施方式中，胶束溶液是Triton-X溶液。在一些实施方式中，一相包含第一聚合物，另一相包含第二聚合物。在一些实施方式中，第一和/或第二聚合物选自聚乙二醇和葡聚糖。在一些实施方式中，一相包含一种或多种聚合物，另一相包含一种或多种盐。在一些实施方式中，一相包含聚乙二醇，另一相包含磷酸钾。在一些实施方式中，一相包含一种或多种盐，另一相包含一种或多种盐。在一些实施方式中，一相包含一种或多种亲液盐，而另一相包含一种或多种离散盐。在一些实施方式中，一相包含一种或多种醇，另一相包含一种或多种盐。

在下文中，ATPS组分(例如聚合物、盐、醇和其它)的浓度表示为重量百分比(w/w)(即组分的重量除以溶液的总重量)，或者表示为摩尔浓度(M)(即一升溶液中组分的摩尔数)。

在一些实施方式中，第一和第二相包括一种或多种聚合物。可用于本发明的聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇(诸如疏水改性聚亚烷基二醇)、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物(诸如疏水改性聚(氧化烯)共聚物)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己内酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性剂、烷氧基化淀粉、烷氧基化纤维素、烷基羟烷基纤维素、硅氧烷改性聚醚、和聚N-异丙基丙烯酰胺及其共聚物。在一些实施方式中，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇或葡聚糖。

在一些实施方式中，聚合物浓度在水溶液总重量(w/w)的约0.01重量％至约90重量％的范围内。在各种实施方式中，聚合物浓度可以是约0.01％w/w、约0.05％w/w、约0.1％w/w、约0.15％w/w、约0.2％w/w、约0.25％w/w、约0.3％w/w、约0.35％w/w、约0.4％w/w、约0.45％w/w、约0.5％w/w、约0.55％w/w、约0.6％w/w、约0.65％w/w、约0.7％w/w、约0.75％w/w、约0.8％w/w、约0.85％w/w、约0.9％w/w、约0.95％w/w、或约1％w/w。在一些实施方式中，聚合物浓度可以是约1％w/w、约2％w/w、约3％w/w、约4％w/w、约5％w/w、约6％w/w、约7％w/w、约8％w/w、约9％w/w、约10％w/w、约1 1％w/w、约12％w/w、约13％w/w、约14％w/w、约15％w/w、约16％w/w、、约17％w/w、约18％w/w、约19％w/w、约20％w/w、约21％w/w、约22％w/w、约23％w/w、约24％w/w、约25％w/w、约26％w/w、约27％w/w、约28％w/w、约29％w/w、约30％w/w、约31％w/w、约32％w/w、约33％w/w、约34％w/w、约35％w/w、约36％w/w、约37％w/w、约38％w/w、约39％w/w、约40％w/w、约41％w/w、约42％w/w、约43％w/w、约44％w/w、约45％w/w、约46％w/w、约47％w/w、约48％w/w、约49％w/w、和约50％w/w。

可用于本发明的盐包括，但不限于，亲液盐、离散盐、含有阳离子的无机盐(诸如直链或支链三甲基铵、三乙基铵、三丙基铵、三丁基铵、四甲基铵、四乙基铵、四丙基铵和四丁基铵)，以及阴离子(诸如磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物和碳酸氢盐)。在一些实施方式中，盐选自氯化钠、磷酸三钠、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠及其组合。也可以使用其他盐(如乙酸铵)。

在一些实施方式中，总盐浓度在0.001mM至100mM的范围内。在各种实施方式中，盐浓度可以是约0.001％至90％w/w。在各种实施方式中，盐浓度可以是约0.01％w/w、约0.05％w/w、约0.1％w/w、约0.15％w/w、约0.2％w/w、约0.25％w/w、约0.3％w/w、约0.35％w/w、约0.4％w/w、约0.45％w/w、约0.5％w/w、约0.55％w/w、约0.6％w/w、约0.65％w/w、约0.7％w/w、约0.75％w/w、约0.8％w/w、约0.85％w/w、约0.9％w/w、约0.95％w/w、或约1％w/w。在一些实施方式中，盐浓度可以是约1％w/w、约2％w/w、约3％w/w、约4％w/w、约5％w/w、约6％w/w、约7％w/w、约8％w/w、约9％w/w、约10％w/w、约1 1％w/w、约12％w/w、约13％w/w、约14％w/w、约15％w/w、约16％w/w、、约17％w/w、约18％w/w、约19％w/w、约20％w/w、约21％w/w、约22％w/w、约23％w/w、约24％w/w、约25％w/w、约26％w/w、约27％w/w、约28％w/w、约29％w/w、约30％w/w、约31％w/w、约32％w/w、约33％w/w、约34％w/w、约35％w/w、约36％w/w、约37％w/w、约38％w/w、约39％w/w、约40％w/w、约41％w/w、约42％w/w、约43％w/w、约44％w/w、约45％w/w、约46％w/w、约47％w/w、约48％w/w、约49％w/w、和约50％w/w。

本领域技术人员将会理解，当ATPS的一个相包含聚合物而另一个相包含盐时，形成ATPS所需的盐的量受聚合物的分子量、浓度和物理状态的影响。

在一些实施方式中，液相中的第一相和/或第二相包含与水不混溶的溶剂。在一些实施方式中，该溶剂是非极性有机溶剂。在一些实施方式中，该溶剂是油。在一些实施方式中，该溶剂选自戊烷、环戊烷、苯、1，4-二恶烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯和己烷。

在一些实施方式中，ATPS的第一相和/或第二相包含胶束溶液。在一些实施方式中，该胶束溶液包含一种或多种非离子表面活性剂。在一些实施方式中，该胶束溶液包含一种或多种洗涤剂。在一些实施方式中，该胶束溶液包含Triton-X。在一些实施方式中，该胶束溶液包含类似于Triton-X的聚合物(诸如Igepal CA-630和Nonitet P-40)。在一些实施方式中，该胶束溶液主要由Triton-X组成。

在一些实施方式中，ATPS的第一相和/或第二相的酸碱度为6.5-8.5。在一些实施方式中，该ATPS第一相和/或第二相的酸碱度为7.0。

在一些实施方式中，第一相与第二相的比例在1∶1至1∶1000的范围内。在一些实施方式中，第一相与第二相的比例选自约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9和约1∶10的比例。在一些实施方式中，第一相与第二相的比例选自约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90和约1∶100的比例。在一些实施方式中，第一相与第二相的比例选自约1∶200、约1∶300、约1∶400、约1∶500、约1∶600、约1∶700、约1∶800、约1∶900和约1∶1000的比例。

在一些实施方式中，第二相与第一相的比例选自约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9和约1∶10的比例。在一些实施方式中，第二相与第一相的比例选自约1∶20、约1∶30、约1∶40、约1∶50、约1∶60、约1∶70、约1∶80、约1∶90和约1∶100的比例。在一些实施方式中，第二相与第一相的比例选自约1∶200、约1∶300、约1∶400、约1∶500、约1∶600、约1∶700、约1∶800、约1∶900和约1∶1000的比例。

在一些实施方式中，通过在水溶液中混合ATPS组分(例如盐、聚合物、醇和如上所述的其它组分)来制备ATPS。在一些实施方式中，通过混合第一溶液和包含不同ATPS组分的第二溶液来制备ATPS。在其他实施方式中，第一相和第二相的组分嵌入改性多孔材料中。当水或水溶液(例如含有目标核酸的水溶液)流过改性多孔材料时，嵌入材料中的ATPS组分溶解并形成ATPS。由此产生的ATPS然后进行相分离。

ATPS组分可以多种方式嵌入改性多孔材料中。其中的一些方式如下文描述。在一些实施方式中，ATPS在多孔材料上进行脱水。在一些实施方式中，将多孔材料插入ATPS，然后风干。在一些实施方式中，将多孔基质插入预混合的ATPS，然后通过热空气、冻干或超临界干燥进行干燥。在一些实施方式中，预混合的ATPS组分被喷涂到多孔材料上，然后通过任何上述干燥方法或其它方法进行干燥。在一些实施方式中，不同类型或浓度的ATPS组分被喷涂到多孔材料的相同或不同区域上，然后进行干燥。在一些实施方式中，在使用多层多孔材料的情况下，将不同类型或浓度的ATPS组分分别喷涂到多孔材料的不同层上，然后进行干燥。在一些实施方式中，不同类型或浓度的ATPS组分被分别喷涂到多孔材料的不同区域上，然后进行干燥。

在各种实施方式中，本发明可以与一种或多种方法或试剂结合使用，以洗涤和洗脱存留在多孔材料中的目标核酸，或者对存留核酸进行后分离处理。

在一些实施方式中，在含核酸溶液与固相接触之后，一次或多次对固相施用洗涤缓冲液以从多孔材料中洗掉非目标分子或杂质。洗涤缓冲液可包含不同离子强度和酸碱度的溶液，并可包含添加剂(如洗涤剂)。洗涤缓冲液的例子包括但不限于含有20％-50％乙醇和20％-50％异丙醇的溶液；含有约0.1-4.0M盐酸胍的溶液；含有洗涤剂和高达约80％乙醇的溶液；或含有约80％乙醇的溶液。

在一些实施方式中，目标核酸进入固相的多孔材料并流到多孔材料的一端。在一些实施方式中，使用合适的洗脱缓冲液或去离子水将根据本发明分离的核酸从多孔材料中洗脱出来。在一些实施方式中，所分离核酸不被洗脱，而是储存在多孔材料中以备将来使用。例如，在使用本发明对核酸进行分离之后，含有目标核酸的纸可以被干燥和储存。在一些实施方式中，保留在多孔材料(例如纸)上的核酸可以被洗脱以用于进一步分析或处理。洗脱缓冲液的选择可能取决于纯化核酸的预期用途。合适的洗脱缓冲液的例子包括，但不限于，三-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液、水剂净化剂(aqua bidest)和聚合酶链反应(PCR)缓冲液。在一些实施方式中，多孔纸上的纯化核酸在含有TE缓冲液(10mM Tris-Cl，1mM EDTA溶液，pH 7.5)的试管中洗脱，从而以相对小的体积(例如小于100μl)回收该纯化核酸。

纯化核酸的下游应用包括但不限于核酸检测或分析、司法鉴定、诊断或治疗应用，和实验室方法，诸如测序、扩增(例如，PCR(聚合酶链反应)、RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)、实时PCR和实时RT-PCR)、逆转录、标记、消化、印迹方法等。

在本发明中，溶液中的含核酸材料可以由人、植物、动物、病毒或细菌来源的细胞制备。对于某些应用，有必要将核酸与非核酸物质(例如，肽、蛋白质、寡糖、木脂素、小分子天然产物和其他典型的天然来源的物质)分开。预期本发明的一些实施方式可以有效和高效地分离核酸和非核酸物质，并且可以获得高收率和高纯度的核酸产物。如Glasel J.(1995)在《BioTechniques》中所述，DNA的纯度可以通过260nm和280nm的吸光度值比(A_260/280)来估算。表2显示了根据(A_260/280)比预测的样本中核酸和蛋白质的百分比。

在一些实施方式中，通过本发明分离的核酸具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高的纯度。

因此，本发明的一些实施方式适于去除含核酸样本中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的非核酸物质。

表2核酸和蛋白质的吸光度和百分比

A<sub>260/280</sub>	％核酸	％蛋白质
			0.57	0	100
1.06	5	95
			1.32	10	90
1.59	20	80
			1.72	30	70
1.75	40	60
			1.81	50	50
1.85	60	40
			1.85	70	30
1.81	80	20
			1.82	90	10
1.88	95	5
			1.86	100	0

在一些实施方式中，本发明提供了一种用于从含核酸材料中纯化核酸的固-液相系统，该系统包括多孔材料和双水相系统(ATPS)，其中该多孔材料包括表面和多个孔，其中该表面和孔包括多个阳离子基团，该双水相系统包括第一相和第二相。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，多个阳离子基团选自脂族胺、芳香胺、多胺及其组合。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，多个阳离子基团选自二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺和十二烷胺、苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚、二乙基苯胺、亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，多孔材料是纸、聚合物、泡沫、织物、木材、石头、陶瓷、金属、琼脂糖凝胶或碳纤维。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，多孔材料是玻璃纤维纸、棉基纸、单层基质纸或聚烯烃泡沫垫。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，多孔材料的平均孔径在0.1至100μm的范围内。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，ATPS的第一相和第二相独立地选自聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液和聚电解质溶液。在一些实施方式中，第一相是聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液或聚电解质溶液。在一些实施方式中，第二相是聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液或聚电解质溶液。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，ATPS的第一相的体积和第二相的体积比为1∶1至1∶1000。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，待纯化的核酸具有约20至1000个碱基对的大小。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，该系统可以在10秒至5分钟内纯化目标核酸。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，使用本发明固-液相系统纯化后的目标核酸的浓度是含核酸材料中目标核酸的浓度的10至1000倍。

在根据本发明的固-液相系统的一些实施方式中，待纯化的核酸以1pg/mL或更高的浓度存在于含核酸材料中。

在一些实施方式中，本发明提供了一种制备包含多个阳离子基团的多孔材料的方法，该方法包括以下步骤：

(a)通过将胺溶解在缓冲液中制备胺溶液；

(b)将多孔材料浸泡在从步骤(a)获得的胺溶液中；

(c)用水洗涤从步骤(b)获得的多孔材料；和

(d)干燥从步骤(c)获得的多孔材料，从而获得包含多个阳离子基团的多孔材料。

在本发明方法的一些实施方式中，步骤(a)中的胺是二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺、十二烷胺、苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚和二乙基苯胺或其组合。

在本发明方法的一些实施方式中，多孔材料是纸。

在一些实施方式中，本发明提供了一种使用固-液相系统从含核酸材料中快速纯化和浓缩核酸的方法。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从含核酸材料中纯化核酸的方法，该方法包括以下步骤:

(a)获得包含固相和液相的固-液相系统，其中该固相包含多孔材料，该多孔材料包含表面和多个孔，该表面和孔包含多个阳离子基团，并且其中该液相包含双水相系统(ATPS)；

(b)将含核酸材料与液相混合，从而获得混合物；和

(c)将步骤(b)获得的混合物与固相接触，其中核酸能够与固相结合并随后穿过多孔材料的孔，其中该核酸浓缩在多孔材料上。

在一些实施方式中，本发明方法进一步包括从固相的多孔材料中洗脱核酸的步骤。

在本发明方法的一些实施方式中，多个阳离子基团选自脂族胺、芳族胺、多胺及其组合。

在本发明方法的一些实施方式中，多个阳离子基团选自二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺和十二烷胺、亚苯基二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚、二乙基苯胺、亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。

在本发明方法的一些实施方式中，多孔材料是纸、聚合物、泡沫、织物、木材、石头、陶瓷、金属、琼脂糖凝胶或碳纤维。

在本发明方法的一些实施方式中，多孔材料是玻璃纤维纸、棉基纸、单层基质纸或聚烯烃泡沫垫。

在本发明方法的一些实施方式中，多孔材料的平均孔径在0.1至100μm的范围内。

在本发明方法的一些实施方式中，第一相是聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液或聚电解质溶液。

在本发明方法的一些实施方式中，第二相是聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液或聚电解质溶液。

在本发明方法的一些实施方式中，第一相的体积和第二相的体积比为1∶1至1∶1000。

在本发明方法的一些实施方式中，待纯化的核酸具有约20至1000个碱基对的大小。

在本发明方法的一些实施方式中，该方法可以在10秒至5分钟内纯化目标核酸。

在本发明方法的一些实施方式中，使用本发明固-液相系统纯化的目标核酸的浓度是含核酸材料中目标核酸的浓度的10至1000倍。

在本发明方法的一些实施方式中，待纯化的核酸以1pg/mL或更高的浓度存在于含核酸材料中。

通过参考下面的实施例，将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易理解，所提供的实施例仅仅是为说明之目的，并非有意限制本发明范围，本发明范围由后附的权利要求限定。

在本申请中，应当注意的是，与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未描述的组分或方法步骤。

实施例

实施例1

改性多孔材料的制备

在本实施例中，以如下方式制备改性多孔材料。将亚精胺溶于Milli-Q超纯水中，得到5M胺水溶液。用制备的溶液喷涂四片玻璃纤维纸，每片0.37mm厚，孔直径为2μm。通过将四张预处理过的纸堆叠在一起，并将层叠的纸切成4cm×0.5cm大小的矩形，制成纸堆叠。然后用水洗涤纸堆叠两次，并用冻干机干燥。

除了亚精胺之外，在上述过程中还可以使用其他胺，例如三甲胺、三甲胺、三亚乙基四胺、辛胺、癸胺、二辛胺、十二烷胺、苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚和二乙基苯胺等。

本实施方式中描述的方法也可用于改性其他多孔材料，如棉基纸、单层基质纸、聚烯烃泡沫垫等。

实施例2

使用液-固相系统分离PBS溶液中掺入的DNA

如实施例1所述制备纸堆叠。制成的纸堆叠以如下方式嵌入ATPS组分。制备ATPS组分的水溶液，其包含12％(w/w)的PEG(聚乙二醇)400、14.5％(w/w)的Na₂SO₄、2％(w/w)的SDS(十二烷基硫酸钠)和0.16％(w/w)的Triton-X 114。将纸堆叠浸泡在该溶液中，然后在压缩空气中进行干燥。通过这种方式，ATPS组分被嵌入到纸张中。嵌入有ATPS组分的纸堆叠在这里被称为ATPS嵌入纸堆叠。

然后，将ATPS嵌入纸堆叠和对照纸堆叠(由未用胺溶液处理且没有嵌入ATPS组分的未改性纸制成)插入含有预混合DNA梯状条带的各个管中，该预混合DNA梯状条带包含具有25-500个碱基对(bp)的DNA片段(

100bp的DNA梯状条带)，其中缓冲液为1xPBS(磷酸缓冲盐溶液)，DNA最终浓度为7.5μg/ml。插入纸堆叠的方式为每个纸堆叠有大约7毫米长部分不浸没在溶液中(如图2示意性所示)。该插入纸堆叠吸液约2分钟，直至溶液到达顶部。当PBS中的DNA溶液通过ATPS嵌入纸时，ATPS组分溶解形成ATPS。该两个相以不同的速率穿过纸堆叠。观察到上层相和下层相的比例约为1∶1。然后将每个纸堆叠分成6个长度约为7mm的部分，用移液管从每个部分吸出5-7μL的溶液。DNA用乙醇沉淀，再悬浮于Milli-Q超纯水中，用琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果如图2所示。可以看出，从ATPS嵌入纸堆叠中提取的DNA多于空白纸堆叠，并且大部分DNA浓缩在ATPS嵌入纸堆叠的顶部。利用本发明的实施方式，成功提取了标记DNA梯状条带中存在的所有大小的片段。

实施例3

使用本发明液-固相系统从血液模拟混合物中分离DNA

如实施例1所述制备纸堆叠。将如下ATPS组分嵌入纸堆叠中。制备ATPS组分的水溶液，其包含12％(w/w)的PEG(聚乙二醇)400、14.5％(w/w)的Na₂SO₄、2％(w/w)的十二烷基硫酸钠(SDS)和0.16％(w/w)的Triton-X114。如实施例2所述将ATPS组分嵌入纸堆叠中。将ATPS嵌入纸堆叠和对照纸堆叠(由未用胺溶液处理且没有嵌入ATPS组分的未改性纸制成)插入到包含预混合的血液模拟混合物的各管中(以与实施方式2中所述相同的方式)，所述混合物包含掺入最终浓度为60-80mg/mL的蛋白质的pH 7.4缓冲溶液和最终浓度为200ng/mL的DNA阶梯状条带，并吸液约2分钟，直至溶液到达顶部。观察到上层相和下层相的比例约为1∶1。

用移液管从每个纸堆叠的顶部吸出长度约7毫米的5-7μl含DNA溶液。DNA用乙醇沉淀，再悬浮于Milli-Q超纯水中，用

(赛默飞，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国；用于分析的样本体积为1μl，使用Milli-Q超纯水作空白样本)进行分析。用光谱测定法测定原始样本和纯化样本中蛋白质和DNA的浓度，并根据样本的实际体积计算出DNA和蛋白质的收率。作为比较，使用

循环核酸试剂盒

提取的样本也以类似的方式进行分析。DNA浓度的倍数变化是纯化样本中DNA浓度与经上文所述

测定的原始样本中DNA浓度的比。表3中的结果表明，与所用商业试剂盒相比，本发明能够以更高的收率和纯度分离核酸。

表3使用本发明或

循环核酸试剂盒分离的DNA和蛋白质的收率。

实施例4

小DNA的分离

本实施例使用50bp的DNA梯状条带和100bp的DNA梯状条带作为小DNA样本。将1μg50bp的DNA梯状条带和1μg 100bp的DNA梯状条带掺入200μL的1xPBS溶液中，使最终浓度为10μg/mL。使用本发明的方法或

循环核酸试剂盒

从混合物中纯化DNA。如实施例1所述制备纸堆叠，并如实施例2所述嵌入ATPS组分。将ATPS嵌入纸堆叠和对照纸(由未用胺溶液处理且没有嵌入ATPS组分的未改性纸制成)插入含有DNA梯状条带的溶液的各个管中(以与实施例2中所述相同的方式)，并吸液大约2分钟，直至溶液到达顶部。观察到上层相和下层相的比例约为1∶1。切掉每个纸堆叠的顶部约7mm长的部分，用移液管从该部分吸出5-7μL含DNA的溶液。DNA用乙醇沉淀，再悬浮于Milli-Q超纯水中，用

分析。将结果与使用

循环核酸试剂盒

获得的结果进行比较。表4中的结果表明，本发明能够以比所用商业试剂盒更高的收率分离小的DNA。

表4使用本发明或

循环核酸试剂盒分离小的DNA片段

实施例5

血清中循环游离DNA的浓度

从患者和健康个体中收集血清样本。使用本发明或

循环核酸试剂盒从血清样本中纯化ccfDNA(循环游离DNA)。如实施例1所述制备纸堆叠，并如实施例2所述嵌入ATPS组分。将ATPS嵌入纸堆叠和对照纸堆叠(由未用胺溶液处理且没有嵌入ATPS组分的未改性纸制成)插入含有血清样本的各个管中(以与实施例2中所述相同的方式)，并吸液约2分钟，直至溶液到达顶部。观察到上层相和下层相的比例约为1∶1至1∶3。与实施例2-4中使用的模拟样本相比，当使用真实生物样本(例如，本实施例5中使用的血清、实施例6中使用的拭子样本、和尿液)时，两相比例的波动较大，因为在单个生物样本中各组分的浓度存在波动。切掉每个纸堆叠的顶部约7毫米长的部分，用移液管从该部分吸出5-7μL含DNA的溶液。DNA用乙醇沉淀，再悬浮于Milli-Q超纯水中，用

进行分析。将结果与用

循环核酸试剂盒获得的结果进行比较。表5显示，使用本发明，从患者或健康受试者获得的血清样本中分离出的ccfDNA的收率高于使用商业试剂盒。

表5从患者和健康受试者获得的血清样本中分离ccfDNA

实施例6

从口腔拭子中分离病毒RNA

口腔拭子样本由携带甲型H1N1病毒的患者和健康受试者自行收集。然后将每个拭子样本在各个试管中用500μL ATPS组分的水溶液培养5分钟，该ATPS组分包含12％(w/w)的PEG 400、14.5％(w/w)的Na₂SO₄、2％(w/w)的SDS和0.16％(w/w)的Triton-X114。然后使用本发明方法或

循环核酸试剂盒从该溶液中纯化病毒RNA。如实施例1所述制备纸堆叠，并将其分别插入到与患者拭子一起培养的溶液(患者样本)、与健康受试者拭子一起培养的溶液(健康对照)或等体积的PBS(阴性对照)中，使得每个纸堆叠的大约7mm长的部分不浸没在溶液中，并吸液大约2分钟直至溶液到达顶部。观察到上层相和下层相的比例约为1∶1至1∶3。切掉每个纸堆叠的顶部约7毫米长的部分，用移液管从该部分吸出5-7μL含DNA的溶液。DNA用乙醇沉淀，再悬浮于Milli-Q超纯水中，用

进行分析。将结果与从

循环核酸试剂盒获得的结果进行比较。表6显示，本发明能够以比所用商业试剂盒更高的收率从患者或健康受试者中分离病毒RNA。

表6从患者样本和健康受试者中分离病毒RNA

Claims

1.一种用于从含核酸材料中纯化核酸的固-液相的系统，所述系统包括多孔材料和双水相系统(ATPS)，其中所述多孔材料包括表面和多个孔，所述表面和所述孔包含多个阳离子基团，以及其中所述双水相系统包含第一相和第二相。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个阳离子基团从以下组成的组中选择：脂族胺、芳香胺、多胺及其组合。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个阳离子基团从以下组成的组中选择：二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺和十二烷胺、苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚、二乙基苯胺、亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。

4.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔材料从以下组成的组中选择：纸、聚合物、泡沫、织物、木材、石头、陶瓷、金属、琼脂糖凝胶和碳纤维。

5.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔材料从以下组成的组中选择：玻璃纤维纸、棉基纸、单层基质纸和聚烯烃泡沫垫。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔材料的平均孔径在0.1至100μm的范围内。

7.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一相和所述第二相独立地从以下组成的组中选择：聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液和聚电解质溶液。

8.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一相的体积和所述第二相的体积比为1∶1至1∶1000。

9.根据权利要求1所述的系统，其中待纯化的所述核酸具有约20至1000个碱基对的大小。

10.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统可以在10秒至5分钟内纯化目标核酸。

11.根据权利要求1所述的系统，其中使用所述固-液相的系统纯化后的目标核酸的浓度比含核酸材料中所述目标核酸的浓度高10至1000倍。

12.根据权利要求1所述的系统，其中待纯化的所述核酸以1pg/mL或更高的浓度存在于所述含核酸材料中。

13.一种制备包含多个阳离子基团的多孔材料的方法，包括步骤：

(a)通过将胺溶解在缓冲液中制备胺溶液；

(b)将多孔材料浸泡在从步骤(a)获得的所述胺溶液中；

(c)用水洗涤从步骤(b)获得的所述多孔材料；和

(d)干燥从步骤(c)获得的所述多孔材料，从而获得包含多个阳离子基团的多孔材料。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(a)中的所述胺从以下组成的组中选择：二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺、十二烷胺、苯二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚和二乙基苯胺及其组合。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多孔材料是纸。

16.一种使用如权利要求1所述的固-液相的系统从含核酸材料中快速纯化和浓缩核酸的方法。

17.一种从含核酸材料中纯化核酸的方法，包括步骤：

(a)获得包含固相和液相的固-液相系统，其中所述固相包含多孔材料，所述多孔材料包含表面和多个孔，所述表面和所述孔包含多个阳离子基团，并且其中所述液相包含双水相系统(ATPS)；

(b)将所述含核酸材料与所述液相混合，从而获得混合物；和

(c)将步骤(b)获得的所述混合物与所述固相接触，

其中所述核酸能够与所述固相结合并随后穿过所述多孔材料的所述孔，其中所述核酸浓缩在所述多孔材料上。

18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括从所述固相的所述多孔材料中洗脱所述核酸的步骤。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个阳离子基团从以下组成的组中选择：脂族胺、芳族胺、多胺及其组合。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个阳离子基团从以下组成的组中选择：二甲胺、亚精胺、精胺、三甲胺、三甲胺、辛胺、癸胺、二辛胺和十二烷胺、亚苯基二胺、二(甲基氨基甲基)苯酚、三(二甲基氨基甲基)苯酚、二乙基苯胺、亚精胺、精胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三(2-氨基乙基)胺及其组合。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述多孔材料从以下组成的组中选择：纸、聚合物、泡沫、织物、木材、石头、陶瓷、金属、琼脂糖凝胶和碳纤维。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述多孔材料从以下组成的组中选择：玻璃纤维纸、棉基纸、单层基质纸和聚烯烃泡沫垫。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述多孔材料的平均孔径在0.1至100μm的范围内。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一相和所述第二相独立地从以下组成的组中选择：聚合物溶液、盐溶液、非极性溶液、胶束溶液和聚电解质溶液。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一相的体积和所述第二相的体积比为1∶1至1∶1000。

26.根据权利要求17所述的方法，其中待纯化的所述核酸具有约20至1000个碱基对的大小。

27.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法可以在10秒至5分钟内纯化目标核酸。

28.根据权利要求17所述的方法，其中使用所述固-液相的系统纯化后的目标核酸的浓度比含核酸材料中所述目标核酸的浓度高10至1000倍。

29.根据权利要求17所述的方法，其中待纯化的所述核酸以1pg/mL或更高的浓度存在于所述含核酸材料中。