CN111849911A

CN111849911A - 一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN111849911A
Application number: CN202010599710.6A
Authority: CN
Inventors: 段海峰; 薛冰华; 于婷婷; 解晶; 鲁飞; 肖秀孝; 张群伟; 庞如梦; 栾佳蒙; 秦亚茹
Original assignee: Beijing Niulaifu Biological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Niulaifu Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途，所述干细胞可以实现在细胞植入受损部位前期持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来的负面影响。本发明还提供了一种培养物、药物组合物及其在制备骨修复药物方面的应用。

Description

一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及一种用于软骨修复治疗的双基因修饰干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，是肿瘤和心血管疾病及其他恶性疾病研究或治疗的重要手段。干细胞治疗在生命科学、新药试验和疾病研究这三大领域中具有巨大研究和应用价值，现已广泛应用于医药再生细胞替代治疗和药物筛选等领域。

软骨缺损如椎间盘和膝关节的退化是关节残疾的常见原因，能够影响世界各地许多人的生活质量。关节软骨在损伤后自发修复的能力有限，接种自体软骨细胞以促进软骨再造具有一些优于同种异体软骨细胞或固体组织移植的好处。但由于在体外扩张期间软骨细胞去分化以及需要大量软骨样品，其应用受到限制。同时，骨骼疾病、肿瘤切除、创伤和先天性畸形也是需要骨重建的骨缺损的主要原因。几十年来，自体骨移植已经是临床上治疗骨缺损的金标准。由于自体骨移植物的有限的可用性和供体位点的发病率，基于干细胞的组织工程策略作为替代性治疗方法是非常有希望的。但是，由于免疫排斥、早期再吸收和可能的感染传播等原因，限制了同种异体移植的使用。

近年来，骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子在骨折愈合中的使用越来越广泛。骨形态发生蛋白(BMP)，除了BMP-1(730个氨基酸组成的富含半胱氨酸的前胶原C蛋白酶)外，均属于转化生长因子-β(TGF-β)超基因家族。目前体内外实验均证实，BMP能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，在骨形成的数个阶段均起作用，由形态发生的早期阶段开始，并延续至出生后，在中枢神经的发生中也起着关键作用。BMP在临床的价值无可限量，近年来基因重组的骨BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组BMP2用于脊柱融合，基于骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家BMP已进入大规模的临床实验阶段。

成纤维细胞生长因子(FGFs)——约150-200个氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。两种FGF都刺激分离大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞的DNA合成，同时bFGF刺激分化软骨细胞在琼脂中的集落形成，起丝裂原和形态作用，FGF在活体内增加分化较差的前成骨细胞的数量。将FGF加入鸡胚，可使成骨细胞、软骨细胞增殖及骨基质形成。

但是，在应用过程中，骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子存在一些不良作用，特别是在高剂量下，主要体现在以下方面：(1)更高的骨折不连续率；(2)局部炎症反应；(3)伤口愈合并发症；(4)血肿形成；(5)异位骨形成。这些不良作用仍然需要进一步研究，以期在今后的临床应用中逐渐减少。同时，由于骨形态发生蛋白在体内被机体的酶类降解可以很快失去作用，促使许多研究者将目光投向了骨形态发生蛋白的基因治疗研究，即用基因转移(genetransfer)和基因转染(genetransfection)。但是，由于未做长期的实验观察，对于其后期的组织衍变过程尚缺乏实验资料，且对于基因治疗中存在的不可控性和基因突变等问题都需要长期的观察。

基于上述原因，有必要对干细胞进行改进以提高其向成骨和成软骨分化诱导效率，同时提高其在骨修复中的安全性。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，设计出一种经修饰的间充质干细胞，其通过将目的基因FGF18和BMP2构建到Tet-on系统，并转染至间充质干细胞得到，可以实现在细胞植入受损部位前期持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来的负面影响，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一种经修饰的干细胞，其中，所述干细胞包括能够表达第一蛋白和第二蛋白，

所述第一蛋白选自FGF18、FGF18变体或者包含所述FGF18或FGF18变体的第一融合蛋白；

所述第二蛋白选自BMP2、BMP2变体或者包含所述BMP2或BMP2变体的第二融合蛋白。

第二方面、提供了一种干细胞的制备方法，优选用于制备第一方面所述的经修饰的干细胞，所述方法包括以下步骤：

步骤1，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的表达载体；

步骤2，将表达载体转染至干细胞，获得经修饰的干细胞。

第三方面、提供了一种培养物，所述培养物包括第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞，以及培养基。

第四方面，提供了一种药物组合物，其中，所述组合物包括第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞，或者包括第三方面所述的培养物。

第五方面，提供了一种第一方面所述的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞、第三方面所述的培养物或第四方面所述的药物组合物在制备骨修复药物方面的应用。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的经修饰的干细胞，在改进BMP2联合MSC应用安全性的同时，进一步联合本身即具有促进成骨和成软发生、又可在上游调控BMP发生和表达的FGF18基因，通过两个因子的共同作用，显著提高了MSC细胞像成骨和成软分化诱导的效率，实现了多功能且安全的MSC细胞在骨修复中的应用；

(2)本发明提供的经修饰的干细胞，采用Tet-Off/Tet-On系统进行基因转染，实现了再细胞植入受损部位后，瞬时启动短暂表达骨修复基因，在诱导骨发生后，即可停止诱导目的基因FGF18和BMP2的表达，从而可在前期将持续分泌细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来负面影响。

附图说明

图1示出本发明实施例1制备的Fuw-FGF18-BMP2的图谱；图2示出本发明实施例1制备重组慢病毒时的转染效率电镜图；图3示出本发明实施例1制备的重组慢病毒的活性及基因侧漏表达验证结果图；图4示出本发明实验例1中DOX的使用浓度检测结果；图5示出本发明实验例2中修饰干细胞的表型检测结果；图6示出本发明实验例3中细胞因子表达检测(蛋白水平)结果；图7示出本发明实验例3中细胞因子表达检测结果(分子水平)；图8示出本发明实验例4中成软骨、成骨和成脂诱导21天的染色结果；图9示出本发明实验例4中成软骨诱导21天的染色结果；图10示出本发明实验例4中成骨诱导14天的染色结果。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明人研究发现，成纤维细胞生长因子(FGFs)中的成员FGF18是一个由207个氨基酸组成的高度保守蛋白，与已发现的FGF其他成员有30％～70％的同源性。FGF18与FGF8、FGF17相似，为同一亚家族成员，具有70％-80％的氨基酸序列同源性。FGF18蛋白在骨骼生长发育和发展过程中扮演着重要的角色，同时也参与到皮质神经元活动，腺垂体的生存、分化和增殖，以及调节头发的生长和皮肤修复过程中。作为生长因子家族中的一员，FGF18在血管形成、形态发生、肿瘤生长和其他细胞组织发育过程中发挥着重要的作用，相对于其他生长因子，除了外创伤面修复，FGF18对治疗软骨障碍，软骨发育不全及骨骼修复等骨骼性疾病具有潜在的临床价值，作用范围更广。

正常骨代谢周期中，破骨细胞(OC)的骨吸收与成骨细胞(OB)的骨形成相互偶联，维持一种动态平衡，不断进行骨重建。当OC的骨吸收相对增强或OB的骨形成相对减弱，骨吸收大于骨形成导致骨质丢失时，将导致骨质疏松。细胞因子调控骨代谢过程中OB和OC的分化、增殖与功能活性，并通过自分泌、旁分泌和细胞黏附方式在骨重建中发挥重要作用。BMP参与了骨代谢的各个阶段，BMP-2即是其中重要的骨形成因子。在脊椎动物中，骨形成可以通过成膜细胞在膜性骨化中的直接分化来实现，或者在软骨内骨化中从软骨细胞的分化开始。这两个过程由BMPs控制，BMP2和BMP4作为成骨细胞和软骨细胞表型的主分化诱导，导致骨和软骨形成。在人类骨髓来源(BM)MSCs中，BMP2(在TGF-β3存在下)是软骨形成最有效的诱导物，与BMP4和BMP6相比，更能诱导富含蛋白多糖的软骨的产生。

基于上述研究，本发明的第一方面，提供了一种经修饰的干细胞，所述干细胞能够表达第一蛋白和第二蛋白，

其中，所述FGF18的变体保留FGF18的活性，即保留其参与皮质神经元活动，腺垂体的生存、分化和增殖，调节头发的生长和皮肤修复过程的能力，以及保留其在血管形成、形态发生、肿瘤生长和其他细胞组织发育过程中发挥重要作用的能力等。

优选地，所述FGF18的变体与其所源自的序列相比，具有一个或多个氨基酸的替换、插入或删除，或者具有80％以上，优选99％以上的序列同源性。

所述BMP2的变体保留BMP2的活性，即保留其在骨代谢过程中重要骨形成因子的能力，以及诱导软骨形成的能力等。

优选地，所述BMP2的变体与其所源自的序列相比，具有一个或多个氨基酸的替换、插入或删除，或者具有80％以上，优选99％以上的序列同源性。

根据本发明一种优选的实施方式，所述第一蛋白为FGF18或者包含所述FGF18的第一融合蛋白；

所述第二蛋白为BMP2或者包含所述BMP2的第二融合蛋白。

在进一步优选的实施方式中，所述第一蛋白为FGF18；

所述第二蛋白为BMP2。

优选地，所述FGF18具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述BMP2具有如SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述经修饰的干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，

其中，所述第一外源核酸包含编码第一蛋白的核苷酸序列；

所述第二外源核酸包含编码第二蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述第一外源核酸编码第一蛋白，第二外源核酸编码第二蛋白。

更优选地，所述第一外源核酸为FGF18基因，具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

所述第二外源核酸为BMP2基因，具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述第一外源核酸和第二外源核酸独立于干细胞的基因组，

优选地，所述第一外源核酸和第二外源核酸位于表达载体上。

在进一步优选的实施方式中，所述第一外源核酸和第二外源核酸通过连接序列连接，并位于同一表达载体上。

优选地，所述连接序列为编码自剪切肽的序列，所述自剪切肽优选为2A肽。

在本发明中，所述2A肽优选源自褐翅蛾病毒。

更优选地，所述连接序列具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞为间充质干细胞，来源于脂肪组织、脐带、骨髓或脐血，优选来源于脐带。

在进一步优选的实施方式中，所述经修饰的干细胞通过将所述第一外源核酸和第二外源核酸导入干细胞获得。

本发明所述的经修饰的干细胞，优选在改进BMP2联合MSC应用安全性的同时，进一步联合本身即具有促进成骨和成软发生、又可在上游调控BMP发生和表达的FGF18基因，通过两个因子的共同作用，能够显著提高MSC细胞向成骨和成软分化诱导效率的同时，实现多功能且安全的MSC细胞在骨修复中的应用。

本发明的第二方面，提供了一种干细胞的制备方法，优选用于制备上述经修饰的干细胞，所述方法包括以下步骤：

步骤1，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的表达载体；

步骤2，将表达载体转染至干细胞，获得经修饰的干细胞。

以下进一步描述所述经修饰的干细胞的制备方法：

步骤1，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的表达载体。

其中，步骤1包括以下子步骤：

步骤1-1，获得第一外源核酸和第二外源核酸的合成序列。

其中，所述第一外源核酸优选为FGF18基因，具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；第二外源核酸为BMP2基因，具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

第一外源核酸和第二外源核酸优选通过T2A序列连接合成，如：合成FGF18-BMP2序列，其具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

采用聚合酶链式反应(PCR)扩增得到上述合成序列的目的片段，胶回收。

优选地，PCR扩增采用的引物为XbaI-FGF18-F和BMP2-EcoRI-R，分别具有如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

步骤1-2，构建重组克隆质粒。

根据本发明一种优选的实施方式，采用Fuw-tet-Dsred作为载体质粒，使得合成的第一外源核酸和第二外源核酸序列构建到Fuw-tet-on系统中。

其中，Tet-On系统是一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系，它是用大肠杆菌Tn10转座子中四环素操纵子原理来实施调控的。这种表达系统使目的基因在诱导情况下才会表达，即能人为控制其表达时间。此外，该系统具有高效、无毒、开/关较严密等特点。

本发明中采用上述系统进行基因转染，可以实现在将修饰的干细胞植入受损部位后，瞬时启动短暂表达骨修复基因，在诱导发生后，即可停止诱导目的基因(第一外源核酸和第二外源核酸)的表达。这就实现了既可在前期通过细胞分泌双因子诱导MSC细胞分化，同时可在前期将持续分泌的细胞因子释放到骨受损局部微环境抵消快速降解作用，并促进本身骨及软骨的修复，又可避免在后期转入的目的基因持续表达所带来的负面影响等。

采用现有技术中常用方法，对上述Fuw-tet-Dsred载体质粒进行双酶切、胶回收，获得载体片段；将步骤1-1获得的目的片段与载体片段重组连接、转化至大肠杆菌E.coliDH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，正确菌落测序、测序正确的菌落进行质粒提取，获得重组克隆质粒。例如：Fuw-FGF18-BMP2质粒。

在本发明中，对上述双酶切、连接、转化、鉴定菌落、测序、质粒提取的方法不作特别限定，可以采用现有技术中常用的方法进行。

优选地，所述双酶切的酶为XbaI和EcoRI。

步骤1-3，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的病毒载体。

在本发明中，所述病毒载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体，优选为慢病毒载体。

其中，步骤1-3包括以下子步骤：

步骤1-3-1，培养包装细胞。

在本发明中，所述包装细胞优选为293T细胞，对293T细胞进行重悬，接种至培养皿中培养，待细胞汇合度达90％以上时，进行传代培养；终止消化后，对细胞进行离心、重悬，在每个包被过的培养皿中接种细胞用于包装病毒，优选每个培养皿(150mm)接种1×10⁷～1.5×10⁷个细胞。

步骤1-3-2，转染包装细胞。

在本发明中，优选所述包装质粒为PMD.2G和PSPAX，穿梭质粒为步骤1-2中合成的重组质粒，包装质粒和穿梭质粒的质量比为1:1。

将包装质粒和穿梭质粒混合后，向其中加入转染试剂(如PEI)，混合后温育，形成DNA-转染试剂复合物，再将复合物与包装细胞混匀，培养，培养过程中定时换液，换液后收集上清液存储于4℃。

步骤1-3-3，重组病毒收集与浓缩。

具体地，将步骤1-3-2收集到的液体低温离心，将上清与聚乙二醇(PEG)混合，静置后弃上清，重悬沉淀。

在获得重组病毒后，优选地，按照下述方法对其滴度进行测定：

滴度测定当天，在6孔板每孔中接种为1*10⁶个293T细胞，加入2ml无抗生素的293T培养基，，加浓缩的病毒，梯度分别设为0ul(对照组)、0.1ul、0.2ul、0.3ul、0.4ul和0.5ul，每孔加入1.6ug聚凝胺，37℃、5％CO₂饱和湿度培养；72h后消化6孔板中的细胞(方法同“细胞传代”)，通过流式分析测定Dsred细胞的阳性率，获得病毒的滴度，判断其是否可用。

步骤2，将表达载体转染至干细胞，获得经修饰的干细胞。

优选地，采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞。

具体地：将正常分娩的离体脐带放入含有200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的PBS缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。用20mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块。收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置1-2h。待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液(购自Gibco)，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％EDTA)消化，所得细胞为原代细胞。脐带组织块爬片法分离培养MSC，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆。

制得的间充质干细胞冻存。

所述步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，对干细胞进行培养，接种。

对预先冻存的干细胞进行复苏培养，待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，终止消化后，离心、重悬细胞。然后接种细胞至培养皿，优选每个培养皿(150mm)接种2×10⁶～2.5×10⁶个细胞，接种后第二天更换培养基。

步骤2-2，加入重组病毒，继续培养。

向接种后的细胞中加入聚凝胺(Polybrene)，然后加入重组病毒，根据细胞MOI值及病毒滴度，加入相应体积的重组病毒，进行培养，其中，加入的重组病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。所述MOI指的是转导时病毒与细胞数量的比值，在本发明中，所述MOI优选为10～50，如40。

在37℃、5％CO₂饱和湿度培养6-8h，然后弃掉含有病毒的培养基，更换为无血清培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养2-3天。

步骤2-3，对细胞进行传代培养。

在本发明中，待修饰后的细胞长满，采用0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％CO₂培养3天至细胞长满，获得经修饰的干细胞。

优选地，将上述获得的干细胞用0.05％胰酶消化，PBS洗两遍后分别用小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体标记5×10⁵个MSCs，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4％多聚甲醛固定，FACS检测。鉴定合格的细胞冻存于液氮罐中，在使用时复苏即可。

更优选地，在经修饰的干细胞的培养过程中，可以根据具体需求，如成骨、成软骨或成脂等，在干细胞培养期间或分化诱导前，添加不同浓度的四环素类似物多西环素(doxycycline，DOX)对FGF18和BMP2进行诱导表达。

本发明优选在改进BMP2联合MSC应用安全性的同时，进一步联合本身即具有促进成骨和成软发生、又可在上游调控BMP发生和表达的FGF18基因，通过两个因子的共同作用，在显著提高MSC细胞向成骨和成软分化诱导效率的同时，实现多功能且安全的MSC细胞在骨修复中的应用。

本发明的第三方面，提供了一种培养物，其包括第一方面所述的经修饰的干细胞和培养基。

其中，所述培养基包括现有技术中常用的干细胞培养的培养基，如DMEM培养基、α-培养基、PRMI1640培养基等。

任选地，所述培养基还包括血清、抗生素、维生素等。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，其包括第一方面所述的经修饰的干细胞或第三方面所述的培养物。

优选地，所述药物组合物的剂型可以为医学领域已知的任何形式，优选为片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、注射剂、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或栓剂，更优选为注射剂。

本发明的第五方面，提供了一种第一方面所述的经修饰的干细胞、第二方面所述方法制备的干细胞、第三方面所述的培养物或第四方面所述的药物组合物在制备骨修复药物方面的应用。

优选地，所述骨修复药物为软骨修复药物和/或成骨修复药物，优选为软骨修复药物。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

按照下述步骤制备FGF18和BMP2修饰的间充质干细胞：

(1)合成人源FGF18-BMP2基因

由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成人源FGF18-BMP2基因，其中，FGF18的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，BMP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，两个基因靠T2A序列连接，T2A的核苷酸序列人如SEQ ID NO：5所示，合成得到的FGF18-BMP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

(2)构建重组克隆质粒

采用Fuw-tet-Dsred质粒(购自addgene)，利用XbaI和EcoRI进行双酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳胶回收8744bp左右的片段作为载体；

以FGF18-BMP2为模板，用引物对XbaI-FGF18-F(Tm＝65℃，核苷酸序列如SEQ IDNO：7所示)和BMP2-EcoRI-R(Tm＝66℃，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)进行PCR扩增，采用的酶为TakaraGXL酶；通过琼脂糖凝胶电泳胶回收1930bp左右的片段；

采用中美泰和生物技术(北京)有限公司的2×Master Assembly Mix重组连接，构建重组克隆质粒；将重组克隆质粒转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，引物为LNCXupseq(Tm＝60℃)和T2Adownseq(Tm＝57℃)，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，扩增试剂采用擎科2×TsingKe MasterMix(blue)，挑选正确菌落测序，测序引物采用通用引物LNCX-F和WPRE-R；测序正确的菌落进行质粒大提，获得的质粒(Fuw-FGF18-BMP2)图谱如图1所示。

(3)构建慢病毒载体

将构建好的Fuw-FGF18-BMP2和辅助质粒(20342)分别大提质粒包装病毒。

(3.1)293T细胞准备：从液氮中取出1支冻存的293T细胞(购自ATCC)迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293T培养基(10％FBS+1mM丙酮酸钠+2mM谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+DMEM)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。培养过程中，待细胞汇合度达90％以上时，进行传代培养，弃去旧培养基，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去PBS溶液，加入2ml 0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来；加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬。每个包被过的150mm培养皿细胞接种1.2×10⁷细胞用于包装慢病毒，37℃、5％CO2饱和湿度培养，20ml培养基/皿。

(3.2)转染293T细胞：转染前2小时，将293T细胞培养基更换为18mlDMEM培养基，向A灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，按照质量比例加入包装质粒(PMD.2G和PSPAX)和穿梭质粒(Fuw-FGF18-BMP2)混合物，吹打混匀。向B灭菌离心管中加入1ml预热的DMEM培养基，然后加入162μl转染试剂PEI，混合均匀。A管和B管分别在室温下温育5min。将B管中的液体成滴的加入到A管中，混合均匀，室温孵育10min，以便形成DNA-转染试剂复合物。将DNA-转染试剂复合物转移至预先换液的293T细胞中，混匀，37℃、5％CO2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％FBS和6‰丁酸钠的DMEM培养基，37℃、5％CO2饱和湿度培养。换液后分别在24h和48h收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。

(3.3)重组慢病毒收集与浓缩：将收集到的液体4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，将上清与5×PEG上下颠倒混匀，4℃放置24小时后，4℃3000rpm离心30min，弃上清，将沉淀重悬至500μlDMEM培养基中，进行病毒滴度测定，病毒命名为Lenti-BF。

(3.4)重组慢病毒滴度测定：滴度测定当天，在6孔板每孔中接种为1*10⁶个293T细胞，加入2ml无抗生素的293T培养基，加浓缩的病毒，梯度分别设为0ul(对照组)、0.1ul、0.2ul、0.3ul、0.4ul和0.5ul，每孔加入1.6ug聚凝胺(购自Sigma)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。72h后消化6孔板中的细胞(方法同“细胞传代”)，通过流式分析测定Dsred细胞的阳性率，结果表征慢病毒的滴度均在10⁸TU/ml以上，为可用慢病毒。病毒生产时的转染效率如图2所示，病毒活性及基因诱导表达验证如图3所示。

由图2可知，病毒生产时质粒的转染效率可达90％以上。

由图3可知，用40MOIs的Fuw-Dsred慢病毒感染MSC细胞，用DOX诱导表达后，可见MSC细胞能够成功表达Dsred蛋白，且不用DOX诱导表达时，该基因无表达。

(4)间充质干细胞的分离与培养

采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞(MSC)，具体方法如下：将正常分娩的离体脐带放入含有200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的PBS缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。用20mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块。收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置1-2h。待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液(购自Gibco)，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％EDTA)消化，所得细胞为原代细胞。脐带组织块爬片法分离培养MSC，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆，制得的间充质干细胞冻存。

(5)间充质干细胞的基因修饰

复苏预先冻存的P3代间充质干细胞至一个150mm培养皿，20ml无血清培养基37℃、5％CO₂饱和湿度培养。待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用MSC无血清培养基(购自Bioind)重悬。每个150mm培养皿细胞接种2-2.5×10⁶细胞，接种后的第二天吸取细胞的培养基弃掉，更换为无血清的α-MEM培养基，20ml培养基/皿，加入16μlPolybrene(购自Sigma)，按照40MOIs感染复数同时加入2中获得的Fuw-FGF18-BMP2和20342慢病毒(滴度为1×10⁸U/ml)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养6-8h。6-8小时后弃掉含有病毒的α-MEM培养基，更换为无血清培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养2-3天。待基因编辑后的细胞长满，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％CO₂培养3天。Fuw-FGF18-BMP2基因修饰的间充质干细胞命名为MSC-BF。

对比例

对比例1

本对比例所用方法与实施例1相似，区别在于，构建慢病毒载体的质粒为Fuw-Dsred，其制备的修饰后的细胞记为MSC-Dsred。

实验例

实验例1DOX添加浓度检测

在实施例1的双基因修饰的间充质干细胞的培养过程中，在细胞汇合度为80％时，添加不同浓度的DOX(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256μg/ml)对FGF18和BMP2基因进行诱导表达，结果如图4所示。

由图4可知，当DOX的添加浓度达到32μg/ml和64μg/ml时，细胞阳性率较高且细胞活性较好，故后期均选用该浓度进行实验。

实验例2细胞表型鉴定

将添加有浓度为64ug/ml的DOX诱导的实施例1制备得到的双基因修饰的间充质干细胞(MSC-BF90(+DOX))、未添加DOX诱导的实施例1制备得到的双基因修饰的间充质干细胞(MSC-BF90(-DOX))和未经修饰的间充质干细胞(MSCs)，用0.05％胰酶消化，PBS洗两遍后均分别用小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体标记5×10⁵个MSCs，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4％多聚甲醛固定，流式细胞仪(FACS)检测，检测结果如图5所示。

由图5可知，基因修饰后的MSC细胞表型不受影响。

鉴定合格的细胞冻存于液氮罐中，用时复苏并做后期处理。

实验例3修饰的间充质干细胞中FGF18和BMP2的表达量检测

在100mm培养皿中，分别培养实施例1和对比例1制备的细胞，当细胞汇合度达70％-80％时，吸弃原有MSC无血清培养基，加入10mlα-MEM培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度继续培养48h。收集两种细胞的培养上清，4℃保存备用。

其中，在细胞汇合度达80％时，分别加入0、16、32、64μg/ml的DOX进行诱导表达。

用人源BMP2检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)按照说明书分别检测MSC-BF细胞和MSC-Dsred细胞对BMP2因子的分泌量，结果如图6所示。

在6孔板中，分别培养实施例1和对比例1制备的细胞，当细胞汇合度达70％-80％时，吸弃原有MSC无血清培养基，消化细胞，终止离心后，收集细胞用于Trizol法RNA提取，测量RNA浓度后，利用反转录试剂盒(All-in-One cDNA Synthesis SuperMix)将500ng总RNA反转为cDNA。进行RT-qPCR检测，根据Takara的荧光实时定量试剂盒(

PremixExTaq^TM)说明书进行。具体检测FGF18和BMP2 mRNA的表达量，结果如图7所示。

由图6和图7可知，FGF18和BMP2基因修饰后的MSC在分子水平上和蛋白水平上均可高表达两个因子。

实验例4成骨、成软骨和成脂分化检测

分别将对照细胞(未经修饰的间充质干细胞)、诱导前激活的实施例1制备的双基因修饰的间充质干细胞、诱导中激活的实施例1制备的双基因修饰的间充质干细胞进行成骨分化、成软骨分化和成脂分化检测，

其中，诱导前激活指的是加入诱导分化培养基培养之前加入DOX；诱导中激活指的是加入诱导分化培养基培养过程中加入DOX；

具体如下：

成骨分化：

接种hMSC：用MSC Attachment solution(BI；P/N:05-752-1，1:100DPBS稀释)预包被24孔盘，每孔加入

接种6x10⁴细胞(3x10⁴cells/cm²)；置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

以成骨分化培养基诱导分化：培养24h后确认细胞融合度达到80-90％，将维持培养基吸除，每孔(24孔盘)加入0.5ml分化培养基；置于37℃，5％CO₂培养箱中培养10-21天，每2-3天换液。

成骨评价：使用2％的ARS染色液，吸除培养基，用DPBS(BI；02-023-1)洗一次(1ml/well)；固定：吸除DPBS，每孔加入1ml70％EtOH，室温固定30-60分钟；吸除EtOH，用蒸馏水洗涤3次(1ml/well)；吸除蒸馏水，每孔加入1ml2％ARS染色工作液；室温静置30-60分钟；吸除染色液，用1ml蒸馏水洗涤4次(1ml/well)；每孔加入1ml蒸馏水避免细胞干燥。观察成骨染色效果、图像采集及进行成骨评价，结果如图8和10所示。

其中，图8中，BF-1、BF-2和BF-3分别指的是修饰后的干细胞(MSC-BF)3组独立重复实验的结果；图10中，BF指的是修饰后的干细胞(MSC-BF)。

成软骨分化：

以维持培养基接种hMSC：细胞以1x10⁵/(10μl培养基)接种进1孔U底的96孔盘(非TC-treated)，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱2小时后(促进细胞聚集成团)，小心加入0.1ml培养基；小微团的培养方式有助于球状细胞团形成，放回37℃，5％CO₂细胞培养箱继续培养。

以成软骨分化培养基诱导分化：培养24小时后，将维持培养基吸除，每孔(96孔盘)加入0.2ml分化培养基球状细胞团会在24-48小时形成；置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养14-21天；每3-4天更换一次分化培养基。注意：培养时间长，可以得到更多成熟的软骨细胞。

AlcianBlue染色过程：吸除培养基，用DPBS洗一次(BI；02-023-1，0.2ml/well)；固定：吸除DPBS，每孔加入0.2ml的10％福尔马林(4％甲醛)；室温固定30-60分钟；吸除福尔马林，每孔用0.2ml蒸馏水洗涤2次；吸除蒸馏水，每孔加入0.2ml的AlcianBlue染色工作液；室温避光过夜；吸除染液，每孔用0.2mlNHCl洗涤2-3次；吸除HCl，每孔加入0.2ml蒸馏水；观察成软骨染色效果，图像采集，及进行软骨形成评估，结果如图8和9所示。

其中，图9中的BF指的是修饰后的干细胞(MSC-BF)。

成脂分化：

以维持培养基接种hMSC：用MSCAttachmentsolution(BI；P/N:05-752-1，1:100DPBS稀释)预包被24孔盘，每孔加入

以成脂分化培养基诱导分化：培养24h后确认细胞融合度达到80-90％，将维持培养基吸除，每孔(24孔盘)加入0.5ml分化培养基；置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养14-21天；期间换液操作如下，使用完全分化培养基培养6-8天，期间每3-4天换液。分化完成后，换液成维持培养基。观察到成熟脂肪细胞(即脂滴的形成)，即可染色。

Oilred-O染色过程：吸除培养基，用DPBS洗一次(1ml/well,24孔盘)。固定：吸除DPBS，加入10％福尔马林(4％甲醛；1ml/well,24孔盘)；室温固定30-60分钟；吸除福尔马林，用60％的异丙醇洗涤2-3分钟(1ml/well,24孔盘)；吸除异丙醇，加入Oilred-O染色工作液(1ml/well,24孔盘)；室温静置10-30分钟；用蒸馏水洗涤，去除多余的染料；置于显微镜下观察成脂染色效果及图像采集，结果如图8所示。

由图8～10可以看出，FGF18和BMP2双基因修饰后的干细胞可迅速分化为成骨细胞和成软骨细胞，且效率要明显高于未修饰的MSC细胞；对成脂分化无显著影响。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京纽莱福生物科技有限公司

<120> 一种经修饰的干细胞及其制备方法和用途

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> FGF18氨基酸序列（人工序列）

<400> 1

Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp

20 25 30

Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser

35 40 45

Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys

50 55 60

His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln

85 90 95

Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg

100 105 110

Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val

115 120 125

Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala

130 135 140

Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg

145 150 155 160

Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys

165 170 175

Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr

180 185 190

Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala

195 200 205

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> BMP2氨基酸序列（人工序列）

<400> 2

Met Val Ala Gly Thr Arg Cys Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Gln Val

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Glu Leu Gly Arg Arg Lys

20 25 30

Phe Ala Ala Ala Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ser Gln Pro Ser Asp Glu

35 40 45

Val Leu Ser Glu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Phe Gly Leu Lys

50 55 60

Gln Arg Pro Thr Pro Ser Arg Asp Ala Val Val Pro Pro Tyr Met Leu

65 70 75 80

Asp Leu Tyr Arg Arg His Ser Gly Gln Pro Gly Ser Pro Ala Pro Asp

85 90 95

His Arg Leu Glu Arg Ala Ala Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe

100 105 110

His His Glu Glu Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Thr Ser Gly Lys Thr

115 120 125

Thr Arg Arg Phe Phe Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Thr Glu Glu Phe

130 135 140

Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg Glu Gln Met Gln Asp Ala

145 150 155 160

Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Ile

165 170 175

Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr Arg Leu Leu

180 185 190

Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser Arg Trp Glu Ser Phe Asp

195 200 205

Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala Gln Gly His Ala Asn His

210 215 220

Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu Glu Lys Gln Gly Val Ser

225 230 235 240

Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu His Gln Asp Glu His Ser

245 250 255

Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe Gly His Asp Gly Lys

260 265 270

Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His Lys Gln

275 280 285

Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp

290 295 300

Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr

305 310 315 320

His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

325 330 335

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val

340 345 350

Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala

355 360 365

Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn

370 375 380

Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

385 390 395

<210> 3

<211> 621

<212> DNA

<213> FGF18核苷酸序列（人工序列）

<400> 3

atgtattcag cgccctccgc ctgcacttgc ctgtgtttac acttcctgct gctgtgcttc 60

caggtacagg tgctggttgc cgaggagaac gtggacttcc gcatccacgt ggagaaccag 120

acgcgggctc gggacgatgt gagccgtaag cagctgcggc tgtaccagct ctacagccgg 180

accagtggga aacacatcca ggtcctgggc cgcaggatca gtgcccgcgg cgaggatggg 240

gacaagtatg cccagctcct agtggagaca gacaccttcg gtagtcaagt ccggatcaag 300

ggcaaggaga cggaattcta cctgtgcatg aaccgcaaag gcaagctcgt ggggaagccc 360

gatggcacca gcaaggagtg tgtgttcatc gagaaggttc tggagaacaa ctacacggcc 420

ctgatgtcgg ctaagtactc cggctggtac gtgggcttca ccaagaaggg gcggccgcgg 480

aagggcccca agacccggga gaaccagcag gacgtgcatt tcatgaagcg ctaccccaag 540

gggcagccgg agcttcagaa gcccttcaag tacacgacgg tgaccaagag gtcccgtcgg 600

atccggccca cacaccctgc c 621

<210> 4

<211> 1191

<212> DNA

<213> BMP2核苷酸序列（人工序列）

<400> 4

atggtggccg ggacccgctg tcttctagcg ttgctgcttc cccaggtcct cctgggcggc 60

gcggctggcc tcgttccgga gctgggccgc aggaagttcg cggcggcgtc gtcgggccgc 120

ccctcatccc agccctctga cgaggtcctg agcgagttcg agttgcggct gctcagcatg 180

ttcggcctga aacagagacc cacccccagc agggacgccg tggtgccccc ctacatgcta 240

gacctgtatc gcaggcactc aggtcagccg ggctcacccg ccccagacca ccggttggag 300

agggcagcca gccgagccaa cactgtgcgc agcttccacc atgaagaatc tttggaagaa 360

ctaccagaaa cgagtgggaa aacaacccgg agattcttct ttaatttaag ttctatcccc 420

acggaggagt ttatcacctc agcagagctt caggttttcc gagaacagat gcaagatgct 480

ttaggaaaca atagcagttt ccatcaccga attaatattt atgaaatcat aaaacctgca 540

acagccaact cgaaattccc cgtgaccaga cttttggaca ccaggttggt gaatcagaat 600

gcaagcaggt gggaaagttt tgatgtcacc cccgctgtga tgcggtggac tgcacaggga 660

cacgccaacc atggattcgt ggtggaagtg gcccacttgg aggagaaaca aggtgtctcc 720

aagagacatg ttaggataag caggtctttg caccaagatg aacacagctg gtcacagata 780

aggccattgc tagtaacttt tggccatgat ggaaaagggc atcctctcca caaaagagaa 840

aaacgtcaag ccaaacacaa acagcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 900

ttgtacgtgg acttcagtga cgtggggtgg aatgactgga ttgtggctcc cccggggtat 960

cacgcctttt actgccacgg agaatgccct tttcctctgg ctgatcatct gaactccact 1020

aatcatgcca ttgttcagac gttggtcaac tctgttaact ctaagattcc taaggcatgc 1080

tgtgtcccga cagaactcag tgctatctcg atgctgtacc ttgacgagaa tgaaaaggtt 1140

gtattaaaga actatcagga catggttgtg gagggttgtg ggtgtcgcta g 1191

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 连接序列（人工序列）

<400> 5

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54

<210> 6

<211> 1875

<212> DNA

<213> FGF18-BMP2核苷酸序列（人工序列）

<400> 6

atgtattcag cgccctccgc ctgcacttgc ctgtgtttac acttcctgct gctgtgcttc 60

caggtacagg tgctggttgc cgaggagaac gtggacttcc gcatccacgt ggagaaccag 120

acgcgggctc gggacgatgt gagccgtaag cagctgcggc tgtaccagct ctacagccgg 180

accagtggga aacacatcca ggtcctgggc cgcaggatca gtgcccgcgg cgaggatggg 240

gacaagtatg cccagctcct agtggagaca gacaccttcg gtagtcaagt ccggatcaag 300

ggcaaggaga cggaattcta cctgtgcatg aaccgcaaag gcaagctcgt ggggaagccc 360

gatggcacca gcaaggagtg tgtgttcatc gagaaggttc tggagaacaa ctacacggcc 420

ctgatgtcgg ctaagtactc cggctggtac gtgggcttca ccaagaaggg gcggccgcgg 480

aagggcccca agacccggga gaaccagcag gacgtgcatt tcatgaagcg ctaccccaag 540

gggcagccgg agcttcagaa gcccttcaag tacacgacgg tgaccaagag gtcccgtcgg 600

atccggccca cacaccctgc cgagggcaga ggaagtctgc taacatgcgg tgacgtcgag 660

gagaatcctg gacctatggt ggccgggacc cgctgtcttc tagcgttgct gcttccccag 720

gtcctcctgg gcggcgcggc tggcctcgtt ccggagctgg gccgcaggaa gttcgcggcg 780

gcgtcgtcgg gccgcccctc atcccagccc tctgacgagg tcctgagcga gttcgagttg 840

cggctgctca gcatgttcgg cctgaaacag agacccaccc ccagcaggga cgccgtggtg 900

cccccctaca tgctagacct gtatcgcagg cactcaggtc agccgggctc acccgcccca 960

gaccaccggt tggagagggc agccagccga gccaacactg tgcgcagctt ccaccatgaa 1020

gaatctttgg aagaactacc agaaacgagt gggaaaacaa cccggagatt cttctttaat 1080

ttaagttcta tccccacgga ggagtttatc acctcagcag agcttcaggt tttccgagaa 1140

cagatgcaag atgctttagg aaacaatagc agtttccatc accgaattaa tatttatgaa 1200

atcataaaac ctgcaacagc caactcgaaa ttccccgtga ccagactttt ggacaccagg 1260

ttggtgaatc agaatgcaag caggtgggaa agttttgatg tcacccccgc tgtgatgcgg 1320

tggactgcac agggacacgc caaccatgga ttcgtggtgg aagtggccca cttggaggag 1380

aaacaaggtg tctccaagag acatgttagg ataagcaggt ctttgcacca agatgaacac 1440

agctggtcac agataaggcc attgctagta acttttggcc atgatggaaa agggcatcct 1500

ctccacaaaa gagaaaaacg tcaagccaaa cacaaacagc ggaaacgcct taagtccagc 1560

tgtaagagac accctttgta cgtggacttc agtgacgtgg ggtggaatga ctggattgtg 1620

gctcccccgg ggtatcacgc cttttactgc cacggagaat gcccttttcc tctggctgat 1680

catctgaact ccactaatca tgccattgtt cagacgttgg tcaactctgt taactctaag 1740

attcctaagg catgctgtgt cccgacagaa ctcagtgcta tctcgatgct gtaccttgac 1800

gagaatgaaa aggttgtatt aaagaactat caggacatgg ttgtggaggg ttgtgggtgt 1860

cgctagaagc ttggg 1875

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> XbaI-FGF18-F引物序列（人工序列）

<400> 7

cagcctccgc ggccccgaat tgtctagagc cgccaccatg tattcagcgc 50

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> BMP2-EcoRI-R引物序列（人工序列）

<400> 8

attatcgata agcttgatat cgaattccta gcgacaccca caaccctcca caac 54

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> LNCX引物序列（人工序列）

<400> 9

agctcgttta gtgaaccgtc agatc 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> T2A引物序列（人工序列）

<400> 10

gttagcagac ttcctctgcc 20

Claims

1.一种经修饰的干细胞，其特征在于，所述干细胞包括能够表达第一蛋白和第二蛋白，

2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述经修饰的干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，

所述第一外源核酸包含编码第一蛋白的核苷酸序列；

第二外源核酸包含编码第二蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的干细胞，其特征在于，所述第一外源核酸和第二外源核酸独立于干细胞的基因组，二者位于表达载体上，

优选地，所述第一外源核酸和第二外源核酸通过连接序列连接，并位于同一表达载体上。

4.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞，来源于脂肪组织、脐带、骨髓或脐血。

5.一种干细胞的制备方法，优选用于制备权利要求1至4之一所述的经修饰的干细胞，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，构建含有第一外源核酸和第二外源核酸的表达载体；

步骤2，将表达载体转染至干细胞，获得经修饰的干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1包括以下子步骤：

步骤1-1，获得第一外源核酸和第二外源核酸的合成序列；

步骤1-2，构建重组克隆质粒；

7.一种培养物，其特征在于，所述培养物包括权利要求1至4之一所述的干细胞或权利要求5或6所述方法制备的干细胞，以及培养基。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1至4之一所述的干细胞或权利要求5或6所述方法制备的干细胞，或者包括权利要求7所述的培养物。

9.一种权利要求1至4之一所述的干细胞或权利要求5或6所述方法制备的干细胞、权利要求7所述的培养物或权利要求8所述的药物组合物在制备骨修复药物方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨修复药物为软骨修复药物和/或成骨修复药物。