CN111848813A

CN111848813A - 一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111848813A
Application number: CN202010502780.5A
Authority: CN
Inventors: 郑飞剑; 吴丽萍; 查长春; 唐静秋; 朱锦秀; 张婧
Original assignee: Hundred English Bio Tech Ltd Of Taizhou City
Current assignee: Hundred English Bio Tech Ltd Of Taizhou City
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了一种IL7‑Fc‑GMCSF融合蛋白及其应用，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过IL7和GMCSF刺激外周血淋巴细胞增殖的作用进行外周血淋巴细胞的体外培养。

Description

一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用。

背景技术

IL7(interleukin7,白介素7)是白介素家族成员之一，为多潜能的细胞因子，主要由胸腺基质细胞产生，具有广泛的免疫效应，在T细胞生长、存活及分化中具有重要作用。IL7的主要功能是促进B细胞和T细胞生长及抗凋亡作用，是B细胞生长和preB细胞生存、分化、增殖因子。在T细胞发育、增殖及稳态调节中起关键作用。其效应细胞主要为CD8+亚群。IL7支持记忆CD8+T细胞稳态扩展和生存还可刺激外周血单核细胞的裂解活性。提高机体的免疫能力对于DC和NK细胞的产生有促进作用。

粒细胞-巨噬细胞集落因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GMCSF)是一种细胞因子，可促进造血祖细胞分化为粒细胞、巨噬细胞，并且可以通过调节抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs)尤其是树突状细胞的数量和功能来增强机体的免疫应答。GMCSF可通过增强特异性抗体应答和促进T细胞增殖增强机体的免疫反应。rhGM-CSF的生理作用十分广泛，一方面为刺激骨髓的造血功能，刺激粒细胞、树突细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟另一方面促进单核巨噬细胞与中性粒细胞释放大量的细胞因子参与机体的免疫调节，促进中性粒细胞的粘附因子的表达。因此，rhGM-CSF可通过刺激DC细胞的增殖，增强其抗原提呈功能，促进其与淋巴细胞结合，促进淋巴细胞的增殖及分化，进而促进免疫应答的发生；同时，可直接刺激T细胞的增殖，促进免疫应答的发生。

抗体的Fc端，具有高稳定性，长效性，能够有效保证融合蛋白的活性同时增加融合蛋白的效用。

目前尚未见IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及利用Knob-in-hole方式进行表达IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的相关报道。

发明内容

为此，本发明了提供一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白和应用。

本发明采取的具体技术方案是：

本发明的第一方面提供了一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述融合蛋白由Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接。

IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。

本发明的第二方面是提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三方面是提供了一种含有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的表达载体，在表达载体中插入IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，表达载体优选pCDNA3.4载体。

本发明的第三方面是提供了上述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)对pCDNA3.4载体进行处理：用NotI/XbaI酶切

(2)构建IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白基因片段，以全基因合成的分段引物作为模板进行PCR扩增，回收PCR产物,克隆至处理后的pCDNA3.4载体NotI/XbaI酶切位点，得含有IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白的表达载体；

(3)将含有IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白的表达载体转化至宿主菌中进行扩大培养，得低内毒素质粒；

(4)细胞培养：采用HEK293细胞，依次进行细胞复苏、细胞初次传代、细胞再次传代培养，得细胞液；

(5)瞬时转染与表达：用培养液稀释低内毒素质粒IL7-Fc-Flag和质粒GMCSF-Fc-His，混匀得溶液一；用培养液稀释转染试剂，混匀得溶液二；将溶液二加入溶液一中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养；

(6)培养表达一周，收集上清，8000rpm离心5min；分离提纯所表达的融合蛋白。

优选地，质粒宿主菌选自TOP10。

优选地，分离提纯所表达的融合蛋白的方法为上Ni亲和层析柱纯化和Flag填料纯化，去除同源二聚体，得到IL7-Fc-GMCSF的异源二聚体结构。

本发明的第四方面是提供了上述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白在制备治疗用免疫细胞培养的药物中的应用。

所述免疫细胞优选为外周血淋巴细胞。

本发明的第五方面是提供了一种外周血淋巴细胞培养试剂，包含权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白。

有益效果：本发明构建了人IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，通过IL7和GMCSF刺激外周血淋巴细胞增殖的作用进行外周血淋巴细胞的体外培养。

附图说明

图1显示为目标克隆PCR片段；

图2显示为重组质粒阳性PCR鉴定；

泳道M：DL5000DNA Marker，泳道1-2：重组质粒PCR。

图3显示为融合蛋白SDS-PAGE检测图；

泳道1：还原样品(Reducing)泳道2：非还原样品(Non-Reducing)

泳道M：Protein Marker(Fermentas,SM0661)

图4显示为融合蛋白SEC-HPLC检测图；

图5显示为IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的异二聚化形式。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

基因的合成：将同一个Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接，获得二聚体(如图5所示),即IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，其中，IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。所述融合蛋白包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1:

HumanIL7-(G4S)3-Fc(Knob)-Flag–Avitag

MHSSALLCCLVLLTGVRADCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHGGGGSGGGGSGGGGSEPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDYKDDDDKGLNDIFEAQKIEWHE

SEQ ID NO.2:

HumanGM-CSF-(G4S)3-Fc(Hole)-His-Avitag

MHSSALLCCLVLLTGVRAAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQEGGGGSGGGGSGGGGSEPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHHGLNDIFEAQKIEWHE

SEQ ID NO.3：

HumanIL7-(G4S)3-Fc(Knob)-Flag–Avitag

atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacggcggaggtggcagtggaggcggaggtagtggaggcggtgggtctgagcccaaatctgccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaagactacaaggacgacgatgataagggcctgaacgacatcttcgaggcccagaagatcgagtggcacgagtga

SEQ ID NO.4

HumanGM-CSF-(G4S)3-Fc(Hole)-His-Avitag

atgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagggcggaggtggcagtggaggcggaggtagtggaggcggtgggtctgagcccaaatctgccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgagctgcgccgtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtgagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaacaccatcaccatcatcacggcctgaacgacatcttcgaggcccagaagatcgagtggcacgagtga

实施例1

实验材料：引物(TSINGKE)，pCDNA3.4载体质粒(Biointron),高保真PCR聚合酶(Biointron),重组酶(Biointron),胶回收试剂盒(Biointron)，dNTP(生工生物)，限制性内切酶(NEB)。

实验方法：

1引物设计：

2 PCR获取克隆目标序列

获得的目标克隆片段(图1)

载体酶切线性

pCDNA3.4	6ul(1.5ug)
		10×buffer	10μl
NotI	2μl
		XbaI	2μl
ddH2O	30μl
		共计	50μl

pcDNA3.4质粒用NotI/XbaI酶切。酶切反应体系：载体6μL，10×buffer 10μL，NotI2μL，XbaI 2μl，ddH2O 30μL将上述体系置37℃水浴2h，然后65℃，15min灭活限制性内切酶。酶切产物胶回收。

3重组反应体系：

4菌落筛选实验

1)挑取过夜平板中单菌落。

2)用CMV_F(CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG)和BI-Seq_R引物(AGCGTAAAAGGAGCAACATAGT)进行菌落PCR。

3)所得产物以1.2％琼脂糖电泳鉴定阳性克隆(图2)。1～4泳道表明扩增得到大小约为1300bp特异性DNA分子片段与B270401-1片段大小一致，表明B270401-1片段成功插入pcDNA3.4质粒中；5～8泳道表明扩增得到大小约为1300bp特异性DNA分子片段与B270401-2片段大小一致，表明B270401-2片段成功插入pcDNA3.4质粒中。

4)选择4个阳性菌，阳性菌液用CMV-F/BI-Seq-R测序。

5)选择测序正确克隆的阳性菌液，扩大培养后抽提低内毒素质粒，测序验证

实施例2蛋白表达

实验名称：细胞培养与表达

实验材料：摇床、离心机、水浴锅、293CD05 Medium培养液、转染试剂(PEI)、各种规格的移液管、各种规格的摇瓶。

实验方法：

1细胞培养:HEK293细胞

2瞬时转染与表达

溶液1：用培养液稀释质粒，混匀

溶液2：用培养液稀释转染试剂，混匀

将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养。

培养表达一周，收集上清，8000rpm离心5min。

实施例3

3.1蛋白纯化

实验名称：细胞培养上清纯化

实验材料：蠕动泵、搅拌器、玻璃纯化柱、1XPBS、咪唑、甘氨酸、Ni Smart Beads6FF、Flag填料、各种规格的离心管

3.1.1实验方法：Ni亲和层析柱纯化

1)装柱：填料混匀后，用移液枪吸取填料悬浮液加入层析柱中。将泵，连接管路，层析柱三者连接好，做好柱子标签。

2)用1XPBS溶液平衡层析柱。

3)平衡后上样。

4)上样结束后，先用1XPBS溶液洗杂，再用2.5mM咪唑洗杂。

5)洗杂结束后，2.5mM咪唑走净，用250mM咪唑洗脱，分管收集，每管约500ul。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。

6)混合蛋白：将有浓度的蛋白混合到适宜的离心管中，进行透析前体积浓度记录。

7)蛋白透析：将混合蛋白吸至透析袋中，扎紧透析袋，做好标记，放至含1XPBS溶液的1L烧杯中置于搅拌器上帮助透析。

8)透析结束后，用一次性无菌注射器将蛋白取出并取样，交于质控。3.1.2实验方法：Flag填料纯化

2)用1XPBS溶液平衡层析柱。

3)平衡后上样。

4)上样结束后，先用1XPBS溶液洗杂。

5)洗杂结束后，1XPBS溶液走净，用甘氨酸洗脱液洗脱，分管收集，每管约500ul。共收集5管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。

8)透析结束后，用一次性无菌注射器将蛋白取出并取样，交于质控。

3.2纯度检测

A.SDS-PAGE检测

实验材料：电泳仪、垂直电泳槽、恒温金属浴，30％丙烯酰胺，1.5MTris-HCl，1MTris-HCl，10％SDS，2×SDS-PAGELoading Buffer，10％AP，5×SDS-PAGE电泳缓冲液，脱色液，染色液

实验方法：

1)样品处理

还原样品处理：还原上样缓冲液中入3.0ug蛋白，99℃处理10分钟。非还原样品处理：非还原上样缓冲液中入3.0ug蛋白。

2)电泳

先用80V电压跑15min，再用170V电压跑40min。

3)凝胶的染色及脱色

将凝胶放入染色液中，沸水中煮15min后置60rpm摇床摇晃1h。换脱色液在沸水中煮15min后置60rpm摇床摇晃1h，更换脱色液，置60rpm摇床继续摇晃2h，拍照保存。

实验结果：见图3

可知：该蛋白理论还原分子量为47Kda和44Kda，实际还原分子量约为60Kda和55Kda，纯度＞95％。

3.3 SEC-HPLC检测

实验仪器及材料：高效液相色谱仪、凝胶色谱柱、去离子水、流动相(Na₂HPO₄.12H₂0、NaH₂PO₄.2H₂O、NaCl)

实验方法：

使用高效液相色谱仪LC-20AT及凝胶色谱柱进行SEC实验，实验条件如下：

参数	数值
		流速	1ml/min
样品浓度	<u>0.6</u>mg/ml
		进样量	20μl
柱温	35℃
		检测波长	214nm，280nm
采集时间	15min

将水更换为流动相，流速缓慢升至1.000ml/min，至基线平稳。取50ul蛋白至对应编号的进样瓶中，将样品瓶放入仪器相应的位置，进样时间是15min，分析处理数据并保存，将流动相更换成去离子水，冲洗1.5h。

实验结果：见图4。

由图4可知：214nm纯度是90.1％，280nm纯度是89.9％。

3.4内毒素检测

实验材料：旋涡振荡器、电热恒温培养箱、内毒素工作标准品、鲎试剂、内毒素检查用水(安度斯)

实验方法：

1)样品阳性对照液配制：2倍供试液浓度溶液+内毒素标准品(0.12EU/ml)，1:1混合

2)供试液制备：

供试液制备：样品稀释倍数：MVD＝C·L/λ＝(0.6mg/ml*1EU/mg)÷0.03EU/ml＝20

*注：MVD：供试品最大有效稀释倍数

L：供试品细菌内毒素限值(1EU/mg)

C:供试品浓度

λ：鲎试剂标示灵敏度(0.03EU/ml)

110ul供试液取样量＝0.6mg/ml÷20*110ul＝3.3ug

鲎试剂(0.03EU/ml)	内毒素检查用水	样品
			阴性对照管	200ul	无
阳性对照管	100ul	100ul内毒素标准品(0.06EU/ml)
			样品阳性对照管	100ul	100ul样品阳性对照液
供试品管	100ul	100ul供试液

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温培养箱孵育60min

实验结果：鲎试剂状态是澄清透明不凝固，通过内毒素检测，结果是<1EU/mg。

实施例4细胞试验

实验验证：人IL7-Fc-GMCSF融合蛋白对外周血淋巴细胞的增殖效果的验证。

1检测器材及试剂

淋巴血外周细胞，IL7-Fc-GMCSF融合蛋白、PBS、MTT,酶标仪，细胞培养箱等。

2实验方法

2.1获取PBMC细胞

2.2用基础培养基(10％FBS RPMI1640 P/L)将细胞洗涤三次

2.3用基础培养基重悬细胞，制成密度为4X105个/ml的细胞悬液

2.4向加有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的96孔板中加入细胞悬液50ul(预加PHA)(即20000个/孔)

2.5 37℃5％CO2培养箱培养72h后，每孔加入20ul 5mg/ml的MTT，放入培养箱中反应4-5h

2.6取出96孔板，加入DMSO(100ul/孔)，培养箱反应15min后，用酶标仪在570nm处读数。

3实验结果

MTT实验检测结果：

由MTT实验检测结果可知，GMCSF-Fc-IL7融合蛋白具有刺激PBMC增殖的作用。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 泰州市百英生物科技有限公司

<120> 一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser

20 25 30

Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile

35 40 45

Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile

50 55 60

Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys

65 70 75 80

Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His

85 90 95

Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly

100 105 110

Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr

115 120 125

Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn

130 135 140

Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp

145 150 155 160

Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Gly Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys

180 185 190

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

195 200 205

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

210 215 220

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

225 230 235 240

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

245 250 255

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

260 265 270

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

275 280 285

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

290 295 300

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

305 310 315 320

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

325 330 335

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

340 345 350

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

355 360 365

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

370 375 380

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

385 390 395 400

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

405 410 415

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu

420 425 430

Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

435 440

<210> 2

<211> 413

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu

20 25 30

His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg

35 40 45

Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met

50 55 60

Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr

65 70 75 80

Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr

85 90 95

Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr

100 105 110

Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu

115 120 125

Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln

130 135 140

Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

165 170 175

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

180 185 190

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

195 200 205

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

210 215 220

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

225 230 235 240

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

245 250 255

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

260 265 270

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

275 280 285

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

290 295 300

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

305 310 315 320

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

325 330 335

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

340 345 350

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

355 360 365

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

370 375 380

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His Gly Leu

385 390 395 400

Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

405 410

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccgattgt 60

gatattgaag gtaaagatgg caaacaatat gagagtgttc taatggtcag catcgatcaa 120

ttattggaca gcatgaaaga aattggtagc aattgcctga ataatgaatt taactttttt 180

aaaagacata tctgtgatgc taataaggaa ggtatgtttt tattccgtgc tgctcgcaag 240

ttgaggcaat ttcttaaaat gaatagcact ggtgattttg atctccactt attaaaagtt 300

tcagaaggca caacaatact gttgaactgc actggccagg ttaaaggaag aaaaccagct 360

gccctgggtg aagcccaacc aacaaagagt ttggaagaaa ataaatcttt aaaggaacag 420

aaaaaactga atgacttgtg tttcctaaag agactattac aagagataaa aacttgttgg 480

aataaaattt tgatgggcac taaagaacac ggcggaggtg gcagtggagg cggaggtagt 540

ggaggcggtg ggtctgagcc caaatctgcc gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 600

gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 660

ctcatgatct cccggacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 720

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 780

ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 840

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 900

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 960

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1020

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1080

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1140

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1200

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa agactacaag 1260

gacgacgatg ataagggcct gaacgacatc ttcgaggccc agaagatcga gtggcacgag 1320

tga 1323

<210> 4

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccgcaccc 60

gcccgctcgc ccagccccag cacgcagccc tgggagcatg tgaatgccat ccaggaggcc 120

cggcgtctcc tgaacctgag tagagacact gctgctgaga tgaatgaaac agtagaagtc 180

atctcagaaa tgtttgacct ccaggagccg acctgcctac agacccgcct ggagctgtac 240

aagcagggcc tgcggggcag cctcaccaag ctcaagggcc ccttgaccat gatggccagc 300

cactacaagc agcactgccc tccaaccccg gaaacttcct gtgcaaccca gattatcacc 360

tttgaaagtt tcaaagagaa cctgaaggac tttctgcttg tcatcccctt tgactgctgg 420

gagccagtcc aggagggcgg aggtggcagt ggaggcggag gtagtggagg cggtgggtct 480

gagcccaaat ctgccgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 540

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 600

acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 660

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 720

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 780

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 840

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 900

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg agctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 960

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1020

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 1080

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1140

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaacacc atcaccatca tcacggcctg 1200

aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgagt ga 1242

Claims

1.一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。

4.编码权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

5.一种含有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的表达载体，其特征在于，在表达载体中插入IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白，表达载体优选pCDNA3.4载体。

6.权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)对pCDNA3.4载体进行处理：用NotI/XbaI酶切

(3)将含有IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白的表达载体转化至质粒宿主菌中进行扩大培养，得低内毒素质粒；

7.根据权利要求6所述含有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的表达载体的制备方法，其特征在于，质粒宿主菌选自TOP10，和/或

分离提纯所表达的融合蛋白的方法为上Ni亲和层析柱纯化和Flag填料纯化，去除同源二聚体，得到IL7-Fc-GMCSF的异源二聚体结构。

8.权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白在制备治疗用免疫细胞培养的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为外周血淋巴细胞。

10.一种外周血淋巴细胞培养试剂，包含权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白。