CN111836631A - 粪便收集程序以及制备用于粪便微生物群移植的样品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备来源于至少两个预先选择的供者的粪便微生物群均质混合物的方法。如此获得的粪便微生物群均质混合物具有细菌多样性和提高的生存力。所述粪便微生物群均质混合物可以用于治疗肠道生态失调和用于治疗与此类生态失调相关的病理学状况。

Description

粪便收集程序以及制备用于粪便微生物群移植的样品的方法

本发明涉及收集多个供者的粪便的程序和制备粪便微生物群样品的方法。

本发明还涉及所述样品在粪便微生物群移植(FMT，也称为粪便微生物群转移)中的用途，优选地为了治疗肠道生态失调。

人肠道微生物群(通常称为“肠内微生物区系”)是存在于人胃肠系统(胃、肠和结肠)中的微生物(细菌、酵母和真菌)的全体。目前，细菌多样性据估计为大约10³个构成了成年个体的占优势的肠道微生物群的细菌物种，其中具有10¹⁴个细菌的丰度，其代表了在每个个体中200,000至800,000个基因的细菌宏基因组(metagenome)，即为人基因组的基因数目的10至50倍。肠道(在子宫中是无菌的)从生命的头几天起发生菌落移生，直至向独特的个体微生物群演变。每个人拥有就物种而言相对接近的细菌，但其微生物群的确切组成(物种、比例)在很大程度上(超过2/3的物种)是宿主所特异的。因此，人肠道微生物群是一个非常多样化的、复杂的且特异于每个个体的生态系统。

维持微生物群的大的多样性有助于其稳定性。然而，某些病理学状况或治疗使微生物群失衡：例如，抗生素，以及具有炎症性组分的疾病，例如慢性炎症性肠病(CIBD)，可以限制肠道中微生物群的多样性。抗生素治疗(或抗生素疗法)尤其导致微生物群的改变和其屏障功能的丧失，这可以有助于致病生物例如艰难梭菌(Clostridium difficile)的增殖。

许多病理学状况与肠道生态失调相关，例如移植物抗宿主病(GvHD)。造血干细胞的同种异体移植(allo-HSCT)是针对造血系统恶性疾病和遗传性造血障碍的有效治疗，并且它被认为是迄今为止最有效的肿瘤免疫疗法[Sung,A.D.和Chao,NJ.(2013),ConciseReview:Acute Graft-Versus-Host Disease:Immunobiology,Prevention,andTreatment,Stem Cells Transl.Med.2:25-32]。然而，源自经移植的干细胞的T淋巴细胞可能攻击宿主受者组织，从而导致GvHD，其是与重大死亡率(在allo-HSCT后15至25％的死亡)相关联的allo-HSCT的主要并发症。经历allo-HSCT的患者可以同时暴露于细胞毒性化学疗法、全身辐射、免疫抑制剂和广谱抗生素，它们可以引起肠道微生物群的重大改变。这是因为，在allo-HSCT后的患者中经常观察到肠球菌科(Enterococcaceae)的重大富集，以及乳杆菌目(Lactobacillales)的增加和梭菌目(Clostridiales)的减少。因此，通常遇见的占优势的细菌，例如抗万古霉素的肠球菌属(Enterococcus)细菌、绿色组的链球菌属(Streptococcus)细菌和各种变形菌门细菌，可以进入血液中并引起败血症。令人感兴趣的是，注意到该变化在随后发展出难治性移植物抗宿主病(GvHD)的患者中是特别重大的[Holler等人,(2014),Biol Blood Marrow Transplant.20(5):640-645；和Peled,J.(2017)59^th Annual Meeting of the American Society of Hematology,Atlanta,USA,Dec 9-11]。

为了重建肠道微生物群并因此重建内环境稳定(即，共生)，考虑并测试了粪便微生物群移植(FMT)。它在于将来自健康供者的粪便引入到受者患者的消化道中，以便使宿主的经改变的肠道微生物群重新平衡。该粪便微生物群移植可以是同种异体的(即从健康供者个体至患者)或者自体的(即从个体至自身)。对于艰难梭菌类型的感染所获得的结果是令人鼓舞的，并且某些患者已被成功地治疗(Tauxe等人,Lab Medicine,2015年冬,第46卷,第1期)。近期研究也证明，用FMT进行治疗的GvHD患者已经具有胃肠道症状的改善和已经具有腹泻的减少或消失，其与微生物群重构相关联[Kakihana等人,(2017)Transplantation128:2083-2089；和Spindelboeck等人,(2017)Hematologica 102:e210]。

在同种异体移植的情况下，重要的是所移植的样品具有在细菌的生存力和多样性方面可接受的特性谱，因为在其稀释剂中的微生物群悬浮液是药物的活性成分(活性物质)。目前的移植方法经常是经验性的，并且没有采取特别的预防措施以确保在所使用的粪便微生物群样品中存在的细菌的多样性，或者最好地保存厌氧细菌(其是肠道微生物群的主要组分)的生存力。

美国专利申请US 2017/239303描述了用于恢复肠道微生物群的组合物，以及其制备方法和其施用。该文献公开，包含样品的组合物具有大约0.4-2.5的香农多样性指数，其中计算在“科”的水平上进行。按照计算多样性所根据的分类学水平(门、物种等)，所述指数具有1-8的级别。

Paramsothy等人的出版物[Paramsothy S.等人,(2017),Multidonor intensivefaecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis:a randomisedplacebo-controlled trial,Lancet,Mar25,389(10075):1218-1228]描述了在治疗活动性溃疡性结肠炎中粪便微生物群组合物的制备。所述组合物通过下述方式来产生：混合并均质化3-7个供者的粪便，随后向所获得的混合物添加盐水水溶液(参见第122页，左栏，“程序”)。Paramsothy等人的出版物的图3(上面右边的图版)显示了所述组合物的系统发生多样性。在所产生的批次(在该图中由“供者批次”所指示的)之间总是存在大的方差，甚至在将供者的粪便样品归并在一起之后。该方差看起来与个体供者(在该图中由“个体供者”所指示的)之间的方差一样大。因此，在旨在治疗患者的样品之间存在重大的异质性。这样的异质性对于药用组合物来说不是所希望的。这是因为，为了确保患者对于其所接受的每一个粪便微生物群剂量(或样品)以相同的方式作出应答，必需的是，所述剂量尽可能地是均质的，并且所述批次也是均质的。

因此，对于提供使人安心的、可重现的、有效的且易于施行的粪便微生物群移植方法存在需要，尤其是以工业规模。此外，对于这样的粪便微生物群移植方法存在需要，其中所移植的产品的细菌多样性是尽可能高的，并且其中在向相同的人移植的产品的不同剂量(样品)之间存在均质性。因此，必需的是，在来自相同粪便微生物群批次的不同剂量之间存在均质性(批次内均质性)和在所产生的不同批次之间存在均质性(批次间均质性)。在该方法的过程中和在贮存期间，应当尽可能保存细菌的生存力。

对于提供具有最佳的细菌多样性和生存力的粪便微生物群样品以进行施用从而用于治疗和预防细菌肠道生态失调(医源性的或非医源性的)和/或相关的病理学状况存在需要。对于提供此类样品的制备方法存在需要。所涉及的病理学状况可以为难治性移植物抗宿主病(GvHD)、艰难梭菌感染、出血性直肠结肠炎、炎症性肠病、肠易激惹综合征、克罗恩病、II型糖尿病、食物变态反应、癌症，其中包括白血病，肥胖症和病态肥胖症。与生态失调相关的其他病理学状况包括孤独症、硬化症、旅行者腹泻、慢性阴道感染(膀胱炎、真菌病)、骨和关节感染、与医院重症监护相关的生态失调、帕金森病、阿尔茨海默病、精神分裂症、与抗癌化学疗法或与免疫疗法相关的肠道生态失调、与酒精性或非酒精性肝病相关的生态失调。

必需的是，提供用于在治疗和预防医源性肠道生态失调和/或相关的病理学状况和并发症中使用的粪便微生物群样品，所述相关的病理学状况和并发症包括但不限于败血症、败血症性休克和胃肠道病症，所述胃肠道病症包括但不限于腹泻、粘膜炎、腹痛和胃肠道出血。

本发明满足了上面所描述的需要。

因此，本发明的一个目标是提供具有最佳的多样性和足够的细菌生存力的粪便微生物群样品，其用于其在FMT(粪便微生物群转移)中使用，并且其可以以可靠且可重现的方式容易地产生。

本发明涉及制备来源于至少两个预先选择的供者的粪便微生物群均质混合物的方法，所述方法包括下列步骤：

a.从所述预先选择的供者中提取至少一个粪便微生物群样品，

b.在取样后少于5分钟的时限内，将在a)中获得的样品放置在不透氧的收集装置中，

c.对所提取的样品进行质量控制并且排除不符合质量标准的样品，

d.向在控制步骤c)之后被保留的样品中的每一个添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液，

e.过滤在步骤d)结束后所获得的样品以形成一系列接种物，

f.将所述接种物归并在一起以形成接种物混合物，

g.使在步骤f)中获得的所述混合物均质化，尤其是通过手动搅拌或者借助于搅拌装置，

步骤b)和d)至g)在厌氧生活条件下进行。

根据本发明的一个实施方案，所述供者根据下列预先选择标准来进行预先选择：

i.具有18至60岁的年龄，

ii.具有18至30的体重指数(BMI)，

iii.没有严重感染性疾病(例如AIDS、肝炎等)、代谢和神经学病症或者抑郁的个人病史，

iv.没有近期服用能够损害肠道微生物群的组成的药物，

v.没有近期出现与胃肠道疾病相关的症状，例如发热、腹泻、恶心、呕吐、腹痛、黄疸，没有严重感染性疾病，尤其是AIDS、肝炎等的历史，

vi.没有近期在热带国家中旅行，

vii.没有危险的性行为，

viii.没有近期(典型地，在最近三个月内)受伤、穿刺和/或文身，

ix.没有近期(典型地，在最近三个月内)的慢性疲劳，

x.没有近期(典型地，在最近三个月内)的变应性反应，

xi.任选地，具有多样的膳食。

根据本发明的一个实施方案，步骤c)的样品质量标准包括：

-按照布里斯托尔量表处于1至6的样品稠度，

-在样品中没有血液和尿。

根据本发明的一个实施方案，步骤c)的样品质量标准包括：

-没有下列细菌：弯曲杆菌属(Campylobacter)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)(毒素A/B)，沙门氏菌属(Salmonella)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，弧菌属物种(Vibrio sp.)，产志贺样毒素大肠杆菌(E.coli)(STEC)stx1/stx2，多抗性细菌，超广谱β-内酰胺酶(ESBL)—抗万古霉素和抗糖肽的肠球菌(VRE，GRE)，和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，抗碳青霉烯酶的细菌，

-没有下列寄生虫：小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、环孢子虫属物种(Cyclospora sp.)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、兰伯贾第虫(Giardialamblia)、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、蠕虫、粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)、等孢子球虫属物种(Isospora sp.)、微孢子目(Microsporidies)和脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)，

-没有下列病毒：腺病毒F40/41、星状病毒、诺如病毒(Norovirus)、轮状病毒A、札幌病毒(Sapovirus)和小RNA病毒(爱知病毒(Aichi Virus)和肠道病毒)，

-没有下列细菌：肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)It/st、志贺氏菌属(Shigella)/肠侵染性大肠杆菌(EIEC)和类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。

根据本发明的一个实施方案，步骤d)的所述至少一种冷冻保护剂和/或填充剂为多元醇、二糖、三糖或多糖或者其混合物，和填充剂。

根据本发明的一个实施方案，所述盐水水溶液包含麦芽糖糊精和海藻糖。

根据本发明的一个实施方案，步骤e)中的过滤用包含直径小于或等于0.5mm，优选地小于或等于265μm的孔的过滤器来进行。

根据本发明的一个实施方案，在样品收集和步骤g)结束之间的时间小于76小时。

根据本发明的一个实施方案，均质化步骤g)在2℃至25℃，优选地大约2℃至6℃，更优选地大约4℃的温度下进行。

根据本发明的一个实施方案，所述方法包括下述的转移步骤：

h.将在步骤g)中获得的经均质化的混合物：

i.转移到袋中，以便贮存于大约-50℃至-80℃，优选地-80℃的温度下，或者以便贮存于大约2℃至6℃的温度下以在大约16小时内使用所述混合物，或者以便贮存于10℃至25℃的温度下以在大约4小时内使用所述混合物，

ii.转移到冻干装置中，以便进行冻干。

根据本发明的一个实施方案，所述粪便微生物群均质混合物来源于至少四个供者，优选地至少五个供者。

根据另一个方面，本发明涉及能够按照本发明的方法而获得的粪便微生物群均质混合物在同种异体粪便微生物群移植(FMT)中的用途。

根据本发明的一个实施方案，所述粪便微生物群均质混合物来源于至少四个供者，并且包含下列产丁酸细菌属：布劳特氏菌属(Blautia)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、别样棒杆菌属(Alistipes)、真杆菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、梭菌属(Clostridium)、粪球菌属(Coprococcus)、臭味杆菌属(Odoribacter)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、摆动杆菌属(Oscillibacter)、欺骗性小粒菌属(Subdoligranulum)和丁酸弧菌属(Butyrivibrio)。

根据本发明的一个实施方案，所述粪便微生物群均质混合物具有高的多样性，其中具有大于15，优选地大于20的辛普森指数。

本发明涉及能够按照本发明的方法而获得的粪便微生物群均质混合物在治疗肠道生态失调中的用途。

本发明涉及能够按照本发明的方法而获得的粪便微生物群均质混合物在治疗移植物抗宿主病(GvHD)中的用途。

本发明涉及能够按照本发明的方法而获得的粪便微生物群均质混合物在治疗医源性肠道生态失调和/或相关的病理学状况和并发症中的用途，所述相关的病理学状况和并发症包括败血症、败血症性休克和胃肠道病症，所述胃肠道病症包括肠道炎症、腹泻、粘膜炎、腹痛和胃肠道出血。

本发明涉及能够按照本发明的方法而获得的粪便微生物群均质混合物在治疗艰难梭菌感染和相关的腹泻(CDI)、炎症性肠病(IBD)、肠易激惹综合征(IBS)、特发性便秘、乳糜泻、克罗恩病、肥胖症和病态肥胖症、孤独症、多发性硬化症、旅行者腹泻、慢性阴道感染(包括膀胱炎和真菌病)、骨和关节感染、帕金森病、II型糖尿病、食物变态反应、癌症、难治性白血病、阿尔茨海默病、精神分裂症和双相性精神障碍、与抗癌化学疗法或与免疫疗法相关的肠道生态失调以及酒精性和非酒精性肝病中的用途。

附图描述

图1是从几个供者的粪便微生物群样品开始制备粪便微生物群均质混合物以用于在同种异体FMT中使用的方法的示意性图示。

图2是直方图，其描绘了接种物(接种物1、4、5、6和2+8)以及在用于贮存的接种物袋1至15中的接种物混合物(活性物质)的微生物群的生存力百分比。

图3是直方图，其描绘了对于四个批次的产品，独个接种物和接种物混合物(归并在一起的接种物)的微生物群的生存力百分比。批次编号4是与用于实施例1的(并且在图2中图解说明的)那种相同的批次。

图4a和4b显示了接种物的细菌丰富度和多样性。

图4a：对于批次(批次编号1至批次编号4)，对于独个接种物和还有对于接种物混合物所测量的丰富度(细菌物种数目)。已经用16S核糖体RNA(16S rRNA)评价了操作分类单位(OTU)。对于个体供者，所述丰富度为100至350个物种。

图4b：每个批次的独个接种物(“供者”)、在批次之间进行比较的接种物(“批次间”)和在相同批次中的归并在袋中的接种物(“批次内”)的Bray-Curtis相似性。

图5是实施例3的比较实验的示意性图示，其中使用相同的粪便用于进行样品批次的两次制备，一次制备按照本发明的实施方案(“本发明方法”)，其与对于实施例3所描述的方法相同，和一次制备按照在Paramsothy等人[Paramsothy S.等人,(2017),Multidonorintensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis:arandomised placebo-controlled trial,Lancet,Mar 25,389(10075):1218-1228]中所描述的方法，或“参照方法”。

图6描绘了以箱线图形式的按照在实施例3的两组样品中的辛普森指数的倒数所测量的多样性。图6a显示了每个样品的多样性，和图6b显示了所述两组样品的多样性。

图7是堆叠直方图，其描绘了最多地存在于实施例3的两组样品中的10个细菌科的相对丰度。右边的组(样品Inv-01至Inv-10)是按照本发明的实施方案产生的。左边的组，“参照”(样品Ref-01至Ref-10)，是按照现有技术(Paramsothy等人)的方法产生的。

图8显示了在供者的粪便中(左边第一个箱)，随后在分别从3、4、5和6个供者的粪便开始而获得的均质混合物批次中，15个产丁酸细菌属的相对丰度：即布劳特氏菌属、栖粪杆菌属、别样棒杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、臭味杆菌属、罗斯伯里氏菌属、霍尔德曼氏菌属、厌氧棒杆菌属、摆动杆菌属、欺骗性小粒菌属和丁酸弧菌属。

图9显示了在从4、5和6个供者的粪便开始而获得的不同的均质混合物批次中的物种丰富度。

发明详述

本发明涉及收集和制备几个供者的粪便微生物群均质混合物的方法。本发明还涉及所述均质混合物在同种异体粪便微生物群移植中的用途，尤其是为了治疗肠道生态失调，和特别是与此类生态失调相关的疾病。

通常，根据本发明，所述供者为健康的人受试者。“健康的受试者”是指未罹患肠道微生物群失衡或者由医务人员所诊断/识别出的病理学状况的受试者。

因此，为了选择潜在的供者，定义了许多标准。这些标准如下：

i.具有18至60岁的年龄，

ii.具有18至30的体重指数(BMI)，

iii.没有严重感染性疾病(例如AIDS或病毒性肝炎)、代谢和神经系统障碍或抑郁的个人病史，

iv.没有近期(在捐献前大约3个月期间)服用能够损害肠道微生物群的组成的药物，例如抗生素，

v.没有近期(在捐献前大约3个月期间)出现与胃肠道疾病相关的症状，例如发热、腹泻、恶心、呕吐、腹痛、黄疸，没有严重感染性疾病，尤其是AIDS、肝炎等的历史，

vi.没有近期(在捐献前大约3个月期间)在热带国家中旅行，

vii.没有危险的性行为，

viii.没有近期(在捐献前大约3个月期间)与人血液相接触，例如通过受伤、穿刺和/或文身，

ix.没有近期(在捐献前大约3个月期间)的慢性疲劳，

x.没有近期(在捐献前大约3个月期间)的变应性反应，

xi.任选地，具有多样的膳食。

供者的选择标准基于在欧洲对于献血通常使用的那些，但具有对于粪便捐献和对于粪便微生物群移植的情景所特异的额外标准。因此，定义了标准(i)至(xi)以用于选择供者。

与多样的膳食有关的任选的标准的目的在于改善在粪便微生物群样品中具有重大的细菌多样性的可能性。因此，优选的是，供者具有多样的膳食。

“多样的膳食”是指由多种多样的蔬菜和不同的谷物(其允许调节纤维摄入)，以及水果和肉类组成的膳食。

“细菌多样性”是指在属或物种水平上测量的多样性或可变性。细菌多样性可以用诸如“丰富度”(在样品中所观察到的物种数目)、“香农指数(Shannon index)”和“辛普森指数(Simpson index)”的术语来表示。香农指数给出了下述概念：比多样性，即样品的物种数目(比丰富度)，和个体在这些物种内的分布(比均匀度)。辛普森指数源自丰富度，并且考虑了每个物种的相对丰度。它在0(低多样性)和1(高多样性)之间。辛普森指数的倒数使得能够反映多样性(通过考虑物种的丰富度和相对丰度，如对于辛普森指数那样)，其中具有从0(低多样性)到无穷大(高多样性)变动的值范围。

典型地，根据本发明的方法包括从供者受试者中提取至少一个包含粪便微生物群的粪便样品的步骤a)。因此，提取至少一个粪便样品的步骤a)可以由供者自己来施行，例如在家中，或者由卫生专业人员来施行。

提取至少一个粪便样品优选地用被设计用于该功能的收集装置来进行，以便将粪便样品包封在厌氧环境中。因此，可以提及在专利申请WO2016/170290中所描述的收集装置。因此，典型地，将家用粪便收集装置与使用指南一起交给所选择的供者。优选地，粪便样品具有至少20g的质量。

在该提取步骤之后，并且在快速的时限内，例如在取样后少于5分钟，优选地少于3分钟，更优选地少于1分钟，将样品放置在不透氧的收集装置中：这正是步骤b)。

根据本发明的一个实施方案，提取至少一个粪便微生物群样品的步骤通过将粪便样品直接存放在收集装置(例如，在专利申请WO2016/170290中所描述的那种)中来进行。

然后，通常从此之后，所述方法在厌氧生活条件下(在厌氧气氛中)或者在其中空气暴露受到限制的封闭条件下施行。控制步骤c)可以在厌氧生活条件下或者在有氧生活条件下或者在其中空气暴露受到限制的封闭条件下进行。根据本发明的一个实施方案，用于进行控制测试的样品提取在有氧生活条件下进行。根据本发明的一个实施方案，所述方法的步骤b)和d)至g)在厌氧生活条件下或者在其中空气暴露受到限制的封闭条件下进行。通过限制空气暴露，构成粪便微生物群且存在于样品中的细菌的生存力因此得到保护。

优选地，所述不透气的收集装置以包含下述部分的类型的形式存在：

-容器，其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体，和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部，和

-盖子，其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间，其中所述容器的本体由柔软的袋子构成，并且其中所述容器和所述盖子之中的至少一个配备有排放机构，其适合于排出包含在所述容器的本体的内部空间中的气体的至少一部分。

优选地，所述装置的排放机构包含通过所述容器和所述盖子之一设置的通道，和用于阻止外部液体渗透入所述容器的本体的内部空间中的阻塞所述通道的元件。优选地，所述装置的排放机构另外还包含布置在所述通道中的微孔过滤膜。

备选地，所述不透气的收集装置以包含下列部分的类型的形式存在：

-容器，其包含具有适合于接纳来自供者受试者的粪便微生物群样品的内部空间的本体，和界定出进入本体的内部空间的开口的颈部，和

-盖子，其适合于可拆卸地且密封地安装在所述容器的颈部上以便阻塞颈部的进入开口并封闭本体的内部空间，

其中所述容器的本体的内部空间任选地包含中和氧气的化学装置。

例如，为了施行所述方法的步骤a)至d)(甚至e))，根据本发明的一个实施方案，可以使用装备有至少一个附属装置(例如，适合于供给内部空间以液体(例如，在步骤d)中所添加的溶液)的附属给料装置)的收集装置，如在文献WO 2016/170290中所描述的。

此外，所述附属装置还可以为分析管，其用于取出样品以进行分析(例如，根据步骤c)的质量控制)。

优选地，所述不透气的收集装置用于步骤a)和b)：步骤a)的样品提取直接在所述装置中，尤其是在所述容器中施行，并且所述容器的封闭(尤其是借助于所述盖子)将样品放置在无氧的气氛中(步骤b))。

特别地，在步骤b)中所使用的上面提及的装置使得能够在厌氧生活条件下施行步骤b)、d)和e)。

任选地，可以因此进行运输步骤。该运输步骤使得能够将样品从取样点送回到实验室，以用于以后处理和分析。

在步骤b)之后，优选地在步骤b)之后24小时之内，对于所提取的样品进行质量控制的步骤c)。该质量控制的目的在于去除不符合预先规定的质量标准的粪便微生物群样品。因此，在控制之后被保留的取样物被认为对于形成所希望的粪便微生物群均质混合物来说是可接受的。

通常，受到控制的质量标准包括：

-通过目视检查的按照布里斯托尔量表处于1至6的样品稠度，

-在样品中没有血液和尿。

所述标准还可以包括：

-没有下列细菌：弯曲杆菌属，艰难梭菌(毒素A/B)，沙门氏菌属，小肠结肠炎耶尔森氏菌，弧菌属物种，产志贺样毒素大肠杆菌(STEC)stx1/stx2，多抗性细菌：超广谱β-内酰胺酶(ESBL)—抗万古霉素和抗糖肽的肠球菌(VRE，GRE)，和单核细胞增生利斯特氏菌，抗碳青霉烯酶的细菌，

-没有下列寄生虫：小隐孢子虫、环孢子虫属物种、溶组织内阿米巴、兰伯贾第虫、人芽囊原虫、蠕虫、粪类圆线虫、等孢子球虫属物种、微孢子目和脆弱双核阿米巴，

-没有下列病毒：腺病毒F40/41、星状病毒、诺如病毒、轮状病毒A、札幌病毒和小RNA病毒(爱知病毒和肠道病毒)，

-没有下列细菌：肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)It/st、志贺氏菌属/肠侵染性大肠杆菌(EIEC)和类志贺邻单胞菌。

样品稠度的控制通常通过目视检查来进行。如果按照布里斯托尔量表[Lewis,S.J.；Heaton,K.W.(September 1997)."Stool form scale as a useful guide tointestinal transit time".Scand.J.Gastroenterol.]，样品具有1至6，优选地5的外观，那么它是可接受的并且将被保留。

在样品中没有血液和尿的控制可以通过目视检查或者通过其他手段来进行。例如，可以使用快速免疫学测试。例如，OC

测试(在法国的MAST Diagnostic可得)，一种借助于人珠蛋白的特异性抗体来检测血红蛋白的定量免疫学测试。

如果看到存在血液和/或尿，就去除该样品。

根据本发明的一个实施方案，还可以进行样品没有某些寄生虫、病毒和细菌的控制。典型地，样品没有某些寄生虫、病毒和细菌的控制由供者每周进行一次。这意味着，典型地，对于例如在一周中提供五个样品的供者，五个样品中的一个将会受到控制。根据本发明的一个实施方案，对于每个样品进行样品没有某些寄生虫、病毒和细菌的控制步骤。

样品没有某些细菌、某些寄生虫和某些病毒的控制按照本领域技术人员已知的方法来进行。

优选地，样品应当没有下列细菌：弯曲杆菌属，艰难梭菌(毒素A/B)，沙门氏菌属，小肠结肠炎耶尔森氏菌，弧菌属物种，产志贺样毒素大肠杆菌(STEC)stx1/stx2，单核细胞增生利斯特氏菌，和多抗性细菌，例如产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的革兰氏阴性细菌和抗万古霉素和抗糖肽的肠球菌(VRE，GRE)，单核细胞增生利斯特氏菌，抗碳青霉烯酶的细菌，肠聚集性大肠杆菌(EAEC)，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)It/st，志贺氏菌属/肠侵染性大肠杆菌(EIEC)，和类志贺邻单胞菌。

优选地，上面所列举的细菌是病原体，其在所采集的粪便微生物群样品中的存在将会把所述样品的供者排除出选择。

类似地，优选地，所述粪便微生物群样品应当没有下列寄生虫：隐孢子虫属(Cryptosporidium)、卡耶塔诺环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)、溶组织内阿米巴、兰伯贾第虫、人芽囊原虫、蠕虫、粪类圆线虫、等孢子球虫属物种、微孢子目和脆弱双核阿米巴。

类似地，优选地，所述粪便微生物群样品应当没有下列病毒：腺病毒F40/41、星状病毒、诺如病毒、轮状病毒A、札幌病毒和小RNA病毒(爱知病毒和肠道病毒)。

细菌、寄生虫和病毒的存在的控制按照本领域技术人员已知的方法来进行。作为例子，可以提及下列方法：在选择性条件下进行培养，用抗体检测细菌、寄生虫或病毒，扩增(用例如PCR)和分析存在于样品中的DNA序列。作为DNA序列的分析系统，可以提及BioMerieux(France)的

其是一种可以用于检测细菌、寄生虫和病毒的自动化系统。例如，可以借助于该系统来检测下列寄生虫：隐孢子虫属、卡耶塔诺环孢子虫、溶组织内阿米巴和兰伯贾第虫。还可以提及从Eurobio(France)可得的PCR测试系列“Allplex-GI”。

其他寄生虫例如人芽囊原虫、等孢子球虫属物种、微孢子目和脆弱双核阿米巴可以通过显微镜检查来进行检测，其中如果需要，浓缩样品。粪类圆线虫可以用例如选择性染色来进行检测，如果需要，在浓缩样品后。

多抗性细菌，例如ESBL、VRE和GRE，可以通过在特定的条件下，例如在商购(例如从BioMerieux)可得的ESBL、VRE或ALOA培养基中进行培养，来进行检测。

对于某些细菌和病毒物种，并不要求其不存在于样品中。根据本发明的一个实施方案，下列细菌的存在不是用于排除样品的标准：肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)It/st、志贺氏菌属/肠侵染性大肠杆菌(EIEC)和类志贺邻单胞菌。根据本发明的一个实施方案，EBV病毒的存在不是排除的标准，因为现今这种病毒在普通人群中是普遍存在的。

通常，将在控制步骤c)(包括样品中没有血液和尿的控制，和任选地样品中没有某些寄生虫、病毒和细菌的控制)之后被保留的样品转到步骤d)。步骤d)包括添加冷冻保护稀释剂。

通常，对于步骤d)，通过添加冷冻保护稀释剂来分开地将样品转变为液体接种物。通常，向在控制步骤c)之后被保留的样品中的每一个添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液。

任何合适的稀释剂/冷冻保护剂可以用于制备接种物。优选地，可以使用多元醇或者二糖、三糖或多糖，或者其混合物。作为多元醇，可以提及甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇或乙二醇。作为二糖、三糖或多糖，可以提及不同或相同单元的二聚体、三聚体、四聚体和五聚体，所述单元选自葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸。在可以使用的二糖之中，可以提及海藻糖或其类似物之一或者蔗糖。优选地，所述冷冻保护剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇、乙二醇、海藻糖及其类似物、蔗糖、半乳糖-乳糖以及其混合物。更优选地，所述冷冻保护剂为半乳糖-乳糖或海藻糖。

典型地，存在于所述盐水水溶液中的冷冻保护剂的量为相对于最终接种物的总体积而言以重量计3-30％(w/v)，优选地4-20％(w/v)。

作为填充剂，可以提及例如淀粉(尤其是小麦或玉米淀粉)的部分水解产物，以及含有丰富淀粉的食物例如马铃薯的部分水解产物，其包含大量的麦芽糖糊精。优选地，所述填充剂为麦芽糖糊精的混合物，其中所述麦芽糖糊精以3-30％，优选地4-20％(相对于最终接种物的总体积而言，重量/体积)存在。

根据本发明的一个实施方案，所述稀释剂/冷冻保护剂为包含至少一种冷冻保护剂和填充剂的盐水水溶液。

典型地，所述溶液包含水和在生理学上可接受的盐。典型地，所述溶液将会包含钙盐、钠盐、钾盐或镁盐，与铁的氯化物、葡糖酸盐、乙酸盐或碳酸氢盐一起。任选地，所述盐水水溶液还可以包含至少一种抗氧化剂。所述抗氧化剂可以选自抗坏血酸及其盐，生育酚，半胱氨酸及其盐，尤其是盐酸盐，以及其混合物。优选地，所述盐水水溶液包含至少一种选自氯化钠、氯化钙、氯化镁、氟化钾、葡糖酸钠和乙酸钠的盐，和任选地至少一种选自L-抗坏血酸钠、生育酚、盐酸半胱氨酸一水合物以及其混合物的抗氧化剂。典型地，所述盐以大约5-20g/L，优选地7-10g/L(相对于最终接种物的总体积而言)的浓度存在于所述盐水水溶液中。典型地，所述抗氧化剂以0.3-1％(重量/体积)，优选地0.4-0.6％(重量/体积)(相对于最终接种物的总体积而言)的量存在于所述盐水水溶液中。

通常，向粪便微生物群样品添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液，以1:0.5至1:10，优选地1:2至1:8，更优选地1:4的重量(g)/体积(ml)比。等于0.5重量:10体积的样品:溶液的重量/体积比意味着，将样品以0.5重量(例如0.5g)与10体积的溶液(例如10ml)进行混合。

优选地，添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液的步骤d)在厌氧生活条件下或者在其中空气暴露受到限制的封闭条件下进行。根据本发明的一个实施方案，在下面提及的收集装置的附属装置中添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水溶液，并且通过封闭的管道向粪便样品添加所述溶液。样品与至少一种包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液的混合可以尤其通过拌合来进行，以便获得均质混合物。

然后，在步骤e)中过滤在该稀释步骤之后获得的样品。优选地，该过滤步骤用一个(或多个，其具有大小越来越小的孔)包含直径小于或等于0.5mm，优选地小于或等于265μm的孔的过滤器来进行。在使用多个过滤器的情况下，孔的大小逐渐减小。优选地，所使用的第一个过滤器包含直径小于或等于2mm，优选地小于或等于1mm的孔。优选地，所使用的最后一个过滤器包含直径小于或等于0.5mm，优选地小于或等于265μm的孔。如此，获得独个接种物。优选地，该过滤步骤e)在厌氧生活条件下或者在其中空气暴露受到限制的封闭条件下进行。在过滤时，可以手动地、通过机械作用、通过重力、通过真空或通过其他合适的手段将来自步骤d)的样品推动通过过滤器。

根据本发明的一个实施方案，使用相同量(在重量方面)的粪便/供者来形成接种物，即为了进行步骤d)和e)。作为合适的量，可以提及例如25-80g，优选地40g。因此，每个独个接种物通过使用相同量的粪便微生物群样品来产生。

步骤f)在于将来自过滤步骤e)的接种物归并在一起。特别地，典型地，将独个接种物转移到容器(优选地，柔软的袋子)中。典型地，该将接种物归并在一起的容器的体积为1L至5L，优选地3L或5L。该体积可以依照该方法的工业化规模而是更大的。所述转移可以手动地或通过使用机械手段来进行。优选地，接种物的转移通过使用机械手段，例如注射器，更优选地用蠕动泵来施行。合适的蠕动泵是商购可得的，例如从Interscience(France)。

一旦归并在一起，就混合接种物以便形成均质混合物(均质化步骤g))。因此，该均质混合物被认为是一个粪便微生物群“批次”。接种物的混合可以通过任何手段来进行。接种物的混合可以手动地或通过本领域技术人员已知的机械手段来进行。例如，可以提及搅拌台，其例如从Stuart(England)可得。

通常，可以使用80-200rpm，优选地90-150rpm，更优选地100-135rpm的搅拌速率。通常，均质化可以在10分钟至2小时，优选地20分钟至1小时的时间段期间，更优选地在30分钟期间进行。该持续时间取决于搅拌速度。本领域技术人员知道根据其所使用的均质化方法来确定必需的均质化时间。可以使用比色测试来验证该混合物是否是均质的。也可以使用目视检查。优选地，进行比色测试和随后的目视检查以确定该混合物是否是均质的。

均质化步骤可以在2℃至25℃，优选地2℃至8℃的温度下，更优选地在大约4℃下进行。

根据本发明的一个实施方案，可以对于在步骤g)之后获得的均质混合物进行分析步骤，在储存或冻干该混合物(参见下面的细节)之前。可以测量pH和pO₂。使用本领域技术人员已知的方法来施行这些测量。典型地，混合物的pO₂小于10％，优选地小于5％；典型地，pH为4至7，优选地4.5至6.5。

优选地，在步骤a)开始和步骤g)结束之间所经过的时间小于76小时。

通常，最终产品(均质混合物)符合下列规格：

外观：均质的有色悬浮液，其具有黄色/栗色。

生存力：大于20％，优选地大于40％，用于冻干。

(细菌的)事件数目：大于10⁹个细菌/ml。

细菌多样性：辛普森指数的倒数大于或等于4。优选地，接种物混合物的辛普森指数大于或等于10，更优选地大于15，更加优选地大于20。

通常，转移均质混合物(转移步骤h))以进行贮存或冻干。因此，可以将所述混合物转移到袋子中：

-以便贮存于大约-50℃至-80℃，优选地大约-80℃的温度下，以在超过16小时之后使用所述混合物，或者

-以便贮存于2℃至6℃的温度下，以在大约16小时内使用，或者

-以便贮存于10℃至25℃的温度下，以在接下来的四小时中使用所述混合物。在环境温度下超过四小时之后，细菌数目增加并且接种物的均质性可能降低。

不然的话，可以将所述均质混合物转移到冻干装置中，以便在以后或立即进行冻干。

根据本发明的一个实施方案，可以对于在将均质混合物转移到其贮存地点(典型地，袋子)或其冻干地点(典型地，在冻干装置中)的步骤h)后获得的均质混合物进行分析步骤i)。特别地，该分析步骤包括目视检查、生存力的测量、分类学分析和事件数目/ml的测量。该分析步骤的目的在于确定该样品是否符合质量标准以将其用于FMT疗法。

典型地，所述混合物具有黄色/褐色。典型地，所述生存力应当>20％。根据本发明的一个实施方案，所述生存力优选地>40％。如果应当冻干所述混合物，那么优选的是，所述生存力>40％。通常，通过流式细胞术测量的细胞浓度大于10⁶个细菌/ml，优选地大于10⁷个细菌/ml，和更优选地大于10⁹个细菌/ml。在分类学分析方面，通常，优选的是，香农指数大于3.5，优选地大于4。

由申请人已经证明了来自根据本发明的一个实施方案的方法的混合物的良好质量。根据本发明的一个实施方案用健康供者的六份新鲜粪便进行的方法的质量评价结果显示在实施例1中。在归并步骤f)之前和在均质化步骤g)之后，对于每个接种物施行微生物群的生存力测试。

申请人已看到，由归并在一起的接种物组成的均质混合物具有其自身的且比可以期望的更高的细菌生存力。

图2是直方图，其描绘了实施例1的接种物(接种物1、4、5、6和2+8)以及在旨在进行贮存的接种物袋1至15中的接种物混合物(均质混合物)的微生物群的生存力百分比。图2显示，独个接种物(接种物1、4、5、6、2+8)不具有相同的独个生存力，而接种物混合物具有不同于独个接种物的其自身的生存力。此外，根据本发明的方法确保了最终混合物袋的良好可重现性，因为对于每个袋子来说微生物群的生存力是大致相同的(大于40％)。

对于均质混合物袋的统计学分析表明，根据t-检验和根据秩检验不存在显著差异，无论对于微生物群的生存力还是对于事件数目/μL。因此，申请人显示了，所有所制备的混合物袋相互之间是均质的。

根据本发明的一个实施方案用四个不同批次(批次编号1至批次编号4)的健康供者的新鲜粪便进行的方法的质量评价结果显示在实施例2中。批次编号4与用于实施例1(并且在图2中图解说明)的那种相同。在实施例2中，对于批次编号1、批次编号2、批次编号3和批次编号4，供者的数目分别为2、7、4和6。申请人测量了独个接种物(在步骤e)结束时)、经均质化的归并在一起的接种物(在步骤g)结束时)和在贮存前装满的袋子的细菌生存力和多样性。

图3再次证明，独个接种物发生变化，而接种物混合物具有不同于独个接种物的其自身的生存力。批次编号1至4的生存力位于46.1％和60.1％之间，这是极好的。

图4a显示了样品的丰富度。对于每个接种物计算了变异系数(CV)。CV(变异系数或相对偏差)是在平均值附近的数据的分散度的量度。它涉及计算标准偏差与平均值的比例。CV使得能够计算一个样品与另一个样品的变化程度。CV的值越小，所述值越均质或稳定。所述四个批次的独个接种物的CV在16％和81％之间变化。该差异是正常的，因为已知独个微生物群是非常不同的。对于每个归并在一起的接种物(在步骤g)结束时)，每个批次的变异系数为0.3％至2％。该小的变化表明，对于每个批次来说，接种物混合物是均质的且稳定的。

相比于独个接种物而言，在物种或属的水平上测量的丰富度在归并在一起的接种物中明显地更高。平均来说，相比于独个接种物而言，所述丰富度在批次编号4中增加了64％，和在批次编号1和3中增加了147％。

平均来说，相比于独个接种物而言，归并在一起的接种物的在属水平上测量的丰富度对于批次编号4增加了25％，和对于批次编号1和3增加了61％。批次1至4的丰富度是令人惊讶的，并且将不能从独个接种物的独个丰富度推导出；也就是说，接种物混合物(归并在一起的接种物)的该丰富度不是平均值，既非直接的，也非通过独个接种物的质量或甚至通过所测量的独个丰富度的份额进行加权的。该结果是出人意料的。

测量了存在于四个归并在一起的接种物中的变形菌门(Proteobacteria)的百分比(参见表5)。对于批次编号1、2、3和4，所述值分别为5.5％、3.7％、3.1％和3.4％。

总之，接种物的归并导致微生物群的丰富度的出人意料的增加。因此，接种物混合物是一种具有其自身的特征的粪便微生物群样品。

图4b显示，所述方法牵涉对于一个批次所获得的并且旨在在临床中使用的产品(均质混合物)的标准化。该图显示，对于每个批次在袋子(其包含归并在一起的接种物)之间的Bray-Curtis相似性大于96％。该结果显示，在分类学特性谱方面，接种物袋(均质混合物)是均质的。

通过使用辛普森指数的倒数和香农指数来测量细菌多样性(表5)。

结果表明，对于供者的辛普森指数的倒数在5和30之间变化。该差异是正常的，因为每个微生物群是不同的。根据表5中所呈现的数据，我们可以观察到，对于归并在一起的接种物的辛普森指数的倒数位于20.2和27.2之间。归并在一起的接种物(在步骤g)之后)的细菌多样性比个体供者的高(除了批次编号3之外，其中一个供者的多样性高于对于归并在一起的接种物的多样性)。

对于供者，香农指数在2.4和4.2之间。该差异是正常的，因为每个微生物群是不同的。对于归并在一起的接种物的香农指数在4和4.50之间(参见表5)。

我们还可以观察到，对于每个批次，归并在一起的接种物的多样性比个体供者的多样性更高。所获得的值(例如对于丰富度)无法被预测，并且对于每一个，是均质混合物的固有特征。

发明人进行了比较测试以证明，通常，能够按照本发明的方法而获得的接种物混合物具有相对于按照已知的方法(特别地，具有多个供者的方法)而获得的粪便微生物群样品而言有利的特征。因此，在实施例3中描述了发明人如何表征按照在现有技术[Paramsothy S.等人,(2017),Multidonor intensive faecal microbiotatransplantation for active ulcerative colitis:a randomized placebo-controlledtrial,Lancet,Mar 25,389(10075):1218-1228]中所描述的方法而产生的样品，以及他们如何将它们与根据本发明的一个实施方案而产生的那些进行比较。这两种产生方法描述在图5中。根据本发明的一个实施方案而产生的样品具有相对于按照现有技术的方法而产生的那些而言更好的生存力和更好的多样性。

测量了产品的生存力。在-80℃+/-10℃下贮存一个月之后，根据本发明的一个实施方案的归并在一起的接种物的生存力从41.8％(对于5个样品的平均)演变至41.4％。按照Paramsothy等人的方法而获得的样品从平均38.5％演变至37.5％。该生存力演变不是显著的，根据Wilcoxon检验，其中对于根据本发明的样品，p值为0.462，和对于参照样品(根据Paramsothy等人)，p值为0.1732。

但是，Wilcoxon检验显示了在T0(第0天)时(p值等于0.01193)以及在1个月时(p＝0.007937)在两组样品之间的生存力的显著差异。

此外，在0天时对于按照本发明的方法而制备的样品的变异系数(CV)为0.010，相比而言，对于根据现有技术(Paramsothy等人)的参照样品的变异系数为0.034。在一个月时，按照本发明的方法而制备的样品的CV为0.018，相比而言，对于参照样品的CV为0.028。如对于实施例1那样，发明人证明了，对于实施例2所产生的样品具有非常小的变化，这表明对于每个批次，接种物混合物是均质的且稳定的。相比之下，参照样品显示更大的CV。

发明人通过分析样品的16S rDNA而分析了实施例3的样品的微生物多样性。多样性用辛普森指数的倒数来表示，其同时考虑了丰富度(OTU数目/所鉴定的物种)和其各自的相对丰度。

图6显示，对于根据本发明的一个实施方案制备的样品，辛普森指数的倒数的值为30.96至33.69(中值＝32.56)，而对于根据Paramsothy等人制备的“参照”样品，辛普森指数的倒数的值为13.70至23.18(中值＝19.31)。因此，所观察到的多样性在根据本发明的一个实施方案制备的样品中是更高的。此外，根据本发明的一个实施方案制备的样品具有比“参照”样品更好的均质性，这通过变异系数而得到证实，其中变异系数对于前者为2.7％而对于后者为16.1％。秩检验评价出在所述两种方法之间的“非常高度显著的”差异(p<2.2e-16)。

图7显示了最多地存在于实施例3的两组样品中的10个细菌科的相对丰度。样品Inv-01至Inv-10具有相对于按照现有技术(Paramsothy等人)的方法而产生的样品Ref-01至Ref-10而言明显更好的均质性。虽然依靠目视，但是该图示使得能够观察通过Paramsothy等人的方法所产生的异质性的水平，以及在这两种方法之间对于某些科的丰度的偏差。

均质性、多样性和丰度的偏差出现在不同的分类学等级水平上。此外，如实施例3的表6所显示的，发明人看到，相比于样品Ref-01至Ref-10而言，某些被认为对健康有利的细菌物种在样品Inv-01至Inv-10中更好地得到保存。例如，对于放线菌门，在使用根据Paramsothy等人的方法时，相对丰度非常显著地下落，因为该中值丰度对于样品Inv-01至Inv-10为3.6％，而对于样品Ref-01至Ref-10为0.9％。在均质性方面，发明人观察到7.8％和14.5％的各自的变异系数。此外，在图7中，观察到在本发明的样品和参照样品之间科里氏杆菌科(Coriobacteriaceae)(放线菌门的科)的相对丰度的重大减小。

在普雷沃氏菌属(Prevotella)(与拟杆菌门相关的属)水平上观察到相似的结果，并且确证了所述两种方法的在维持某些分类单元上以及在均质性方面的差异。相对于样品Ref-01至Ref-10(11％的中值)而言，普雷沃氏菌属的相对丰度在样品Inv-01至Inv-10中(13％的中值)是更高的。在均质性方面，发明人观察到3.3％和8.5％的各自的变异系数。

最后，双歧杆菌属(属于放线菌纲)也确证了已经在其他分类学水平上观察到的结果。发现双歧杆菌属其相对丰度显著降低(0.9％对0.6％)，并且在通过Paramsothy等人的方法所产生的样品之间的均质性比对于通过根据本发明的一个实施方案的方法所产生的那些的小(参见实施例3的表6)。

因此，这些要素显示，通常，所要求保护的方法允许更好地保存该门，这与好得多的均质性相关联，在对于每个批次所制备的样品的水平上，尤其是根据本发明的一个实施方案而产生的样品，相对于按照现有技术的方法而产生的那些而言。该更好的均质性对于作为药用产品的最终产品的表征来说是至关重要的。因此，接受相同批次的多个粪便微生物群样品的患者每次接受具有相同多样性和相同微生物生存力的均质产品。该可重现性由于用于产生所述样品的方法而得到确保。

总之，实施例3的宏基因组分析(16S rDNA的测序)使得能够证明，根据本发明的一个实施方案而获得的样品具有：

-通过非常更高的辛普森指数的倒数而阐明的多样性的更好保存，

-某些目的分类单元(例如放线菌纲，其包括熟知的双歧杆菌属)的显著更高的保存，

-相对于对于用根据Paramsothy等人的方法所产生的全体样品而获得的那种而言更大的在样品之间的均质性水平。

通常，根据本发明的方法具有相对于现有技术的方法而言更好的可重现性，这对于旨在制备药物的方法来说是非常重要的，对于这些药物来说，均质且可重现的批次的概念是制定规章的基础。实际上，对于不同批次所测量的丰富度值(参见图9)显示了在批次之间的大的可重现性，具有3.5％的变异系数。因此，这些结果证明，存在批次间以及批次内的粪便微生物群均质性。发明人观察到，如此获得的接种物混合物具有优于某些独个接种物的那些的分类学特性谱和细菌生存力，这意味着它十分适合于在同种异体FMT(粪便微生物群转移)中使用。按照本发明的方法而获得的接种物混合物对于在FMT中使用来说在质量方面是更优的，因为它以高且稳定的生存力以及非常高的多样性为特征。这些特征允许相对于通过使用独个接种物而获得的那种而言更高的合适微生物群重新菌落移生潜力。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述制备微生物群样品的方法使得能够获得包含下列15个产丁酸细菌属的微生物群均质混合物：即布劳特氏菌属、栖粪杆菌属、别样棒杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、臭味杆菌属、罗斯伯里氏菌属、霍尔德曼氏菌属、厌氧棒杆菌属、摆动杆菌属、欺骗性小粒菌属和丁酸弧菌属。该实施方案在实施例4中举例说明。

实施例4描述了这样的实验，其目的在于获得符合选择标准的八个供者的粪便的均质混合物(步骤c))。然后，通过下述方式来分开地处理已经通过了质量控制的每份粪便：添加冷冻保护稀释剂，随后过滤。然后，混合在同一天获得的独个接种物，以便获得均质的产品批次。

供者的粪便和所产生的混合物批次的分析显示，上述的15个产丁酸细菌属的浓度在所述混合物中是稳定的，无论为产生其所使用的粪便数目是多少。分析还显示，当所使用的粪便数目增加时，这15个产丁酸细菌属的丰度被标准化(图8和表7)。此外，所述15个产丁酸细菌属并非都存在于供者的独个粪便中，而所有用至少四份粪便的混合物制备的批次都包含它们全部。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述制备粪便微生物群均质混合物的方法来源于至少四个供者。根据本发明的一个优选的实施方案，所述微生物群均质混合物包含下列15个产丁酸细菌属：即布劳特氏菌属、栖粪杆菌属、别样棒杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、臭味杆菌属、罗斯伯里氏菌属、霍尔德曼氏菌属、厌氧棒杆菌属、摆动杆菌属、欺骗性小粒菌属和丁酸弧菌属。

上述的15个产丁酸细菌属在旨在施用给患者的产品中的存在是重要的，因为这些细菌属与抗炎特性相关。因此，从治疗的角度，它们在均质混合物中的存在对于在治疗肠道炎症(尤其是与肠道生态失调相关的那种)中使用这些均质混合物来说是有利的。

所述均质混合物可以以可靠且可重现的方式容易地产生。实施例1的结果显示了在所产生的所有混合物袋之间生存力和分类学特性谱的均质性。所施用的微生物群样品(均质混合物)的质量是可重现的，并且在来自一组供者的袋子之间是相同的。用每个袋子可以施用几乎相同的产品。因此，在数次治疗(如果多于一次的治疗是必需的)时，患者可以接受相同的产品。

通常，n个供者可以足够捐献用于装满大约3n个，优选地3.2n个袋子的均质混合物，每个袋子对于一次FMT治疗来说是足够的。

所述微生物群均质混合物(或归并在一起的接种物)可以在治疗肠道生态失调和相关的病理学状况中使用。这是因为，它是活性成分。用本发明的方法所产生的归并在一起的接种物的细菌多样性是高的，其可以具有4至4.50的香农指数，和位于20.2和27.2之间的辛普森指数。申请人还证明了，独个接种物具有非常多变的生存力，而接种物混合物(归并在一起的接种物)具有优异的生存力(从大约41％至60％)。根据本发明的一个实施方案，所述接种物均质混合物具有大于40％，优选地大于45％，更优选地大于50％，更加优选地大于55％的生存力。细菌多样性和生存力的标准在评价用于FMT的产品的质量中是非常重要的。

根据对于药用产品的规章标准，也重要的是，所述产品是均质的。在下面实施例中的数据证明，根据本发明的产品是均质的。

根据本发明的一个实施方案，所述微生物群均质混合物(或归并在一起的接种物)可以通过直肠途径进行施用。根据本发明的一个实施方案，所述微生物群均质混合物(或归并在一起的接种物)可以被配制成用于通过口服途径进行施用。作为口服制剂，可以提及在专利申请EP 17306602.8中所提及的制剂。

如上面所提及的，研究显示，FMT在治疗移植物抗宿主病(GvHD)中可以是有效的。因此，本发明的微生物群均质混合物可以在治疗GvHD中使用。此外，上述的15个产丁酸细菌属的存在可以对治疗移植物抗宿主病(GvHD)的功效做出贡献。因此，根据本发明的一个实施方案，罹患GvHD的患者可以接受包含本发明的均质混合物的同种异体FMT。例如，该患者可以通过直肠途径接受同种异体FMT。他还可以通过口服途径来接受它。

所述微生物群均质混合物可以在治疗医源性肠道生态失调和/或相关的病理学状况和并发症中使用，所述相关的病理学状况和并发症包括败血症、败血症性休克和胃肠道病症，所述胃肠道病症包括腹泻、粘膜炎、腹痛和胃肠道出血。此外，具有抗炎效应的上述的15个产丁酸细菌属的存在可以对该治疗的功效做出贡献。

所述微生物群均质混合物可以在治疗艰难梭菌感染和相关的腹泻(CDI)、炎症性肠病(IBD)、肠易激惹综合征(IBS)、特发性便秘、乳糜泻、克罗恩病、肥胖症和病态肥胖症、孤独症、多发性硬化症、旅行者腹泻、慢性阴道感染(包括膀胱炎和真菌病)、骨和关节感染、帕金森病、II型糖尿病、食物变态反应、癌症、难治性白血病、阿尔茨海默病、精神分裂症和双相性精神障碍、与抗癌化学疗法或与免疫疗法相关的肠道生态失调以及酒精性和非酒精性肝病中使用。

所述微生物群均质混合物可以在治疗由于重症监护住院而引起的并发症中使用。

此外，通过参考下面的实施例描述了本发明。将会理解的是，所要求保护的本发明无论如何不旨在受到这些实施例限制。

实施例

实施例1：

步骤a)和b)：将来自六个健康供者的八份新鲜粪便收集在描述于WO2016/170290中的医学装置之中，随后在+2℃/+8℃下保存72小时的时间段，其间进行质量控制(步骤c))。基于这些控制的结果，丢弃供者3和7的粪便。

通过添加冷冻保护稀释剂(盐水水溶液，其按20％的标准包含麦芽糖糊精和海藻糖的混合物)来将粪便1、4、5、6和2+8分开转移到液体接种物中，并且通过过滤器(265μm)进行澄清。鉴于所提取的粪便的量很低，合并粪便2和8以形成一个接种物。

测试了接种物1、4、5、6和2+8(五个接种物)的生存力。然后，通过使用蠕动泵将独个接种物转移到5L的柔软的袋子中。然后，将袋子放在调整至4℃的冷藏培养箱中的搅拌平台上，并且在125转/分钟+/-5％下进行接种物的混合30分钟。

一旦均质化结束，就将接种物混合物转移到一系列15个适合于冻干的袋子中并且保存于-80℃。在贮存之前，对于所述15个袋子中的每一个测试均质混合物的生存力和在不同条件下进行保存的影响。

生存力分析：

通过使用流式细胞术技术来进行生存力测试，其中使用Accuri 6流式细胞仪(BDScience)。将样品在0.9％的盐水水溶液中进行稀释，其中进行1:10系列稀释，直至1:10^-3。用荧光团碘化丙锭(PI)(10μL/mL)和

9(3μL/mL)标记样品。PI也靶向DNA，但是仅穿透入其膜受到损害的细胞中；它在470nm下激发后在635nm(红色)下发射。

穿透入所有完整或不完整的细胞中，固定至DNA，并且在470nm(蓝色激光)下激发后在540nm(绿色)下发射。在通过流式细胞术进行分析之前，用所述两种荧光团的混合物标记接种物或均质混合物的粪便样品。相对于总细菌数目(活的和死的)而言的活细菌的百分比使得能够获得样品的细菌生存力。每个批次的分析都用阳性对照(在-80℃下保存的参照接种物样品)和阴性对照(在-80℃下保存并且通过在70％异丙醇中(比例1/9)温育10分钟进行处理、离心、重悬浮在0.9％NaCl中并以10倍系列稀释进行稀释直至10^-3的参照样品)进行验证。

结果：

独个接种物的生存力的评价从30.5％至67.6％变化。用相同的接种物混合物制备的15个袋子显示出47.1％的平均生存力，其中标准偏差为1.98。独个接种物(接种物1、4、5、6和2+8，浅灰色着色)和在贮存袋1至15中的接种物混合物(黑色着色)的微生物群的生存力百分比呈现在图2中。

概括的结果呈现在表1中。

表1：所分析的同种异体接种物的微生物群生存力的概括

分析	生存力(％)
		平均值	47.1
标准偏差	1.98
		最小值	44.3
最大值	51.4

统计学分析：

对于15个均质混合物袋测量了生存力和事件数目。为了评价这两个测量在袋子之间是否是均质的，进行了500次对于A组(7个袋子)和B组(其余袋子)的测量的随机分配。

对于每一个迭代，使用t-检验和秩检验来将A组与B组进行比较。下面呈现的最终结果相应于其中所考虑的统计学检验不是显著的(>0.1)迭代比例。结论是：在生存力方面和在事件数目/μL方面，所述袋子是均质的。

表2：统计学结果

结果显示，对于t-检验和秩检验不存在显著差异，无论是对于微生物群生存力还是对于事件数目/μL。

可以得出结论：所制备的15个混合物袋彼此是均质的。

保存：

在制备混合物的方法的过程中，应当进行中间贮存，在此期间进行质量控制。为了确定该中间贮存对微生物群生存力的影响，进行下列评价：

-对照条件：一旦制备，就即刻将接种物保存于-80℃；

-在环境温度下的保存条件：一旦制备，就让接种物在环境温度下待16小时，进行采样以测定微生物群生存力、微生物群事件/μL以及pH和pO₂的大小，随后将接种物保存于-80℃；

-在4℃下的保存条件：一旦制备，就让接种物在4℃下待16小时，进行采样以测定微生物群生存力、微生物群事件/μL以及pH和pO₂的大小，随后将接种物保存于-80℃。

随后，将这三个接种物解冻，并且测量微生物群生存力。

数据显示，对于在环境温度下或在4℃下保存16小时的接种物，微生物群生存力的中值是相同的。在解冻后，对于在4℃下保存和在环境温度下保存的接种物，微生物群生存力的中值同时减小。预期的是，在冷冻后生存力降低。在这里看到，在这两种情况(4℃和环境温度)下，观察到相同的现象。

可以观察到，对于接种物和在4℃下保存的接种物，事件数目/μL是相同的，但是，如可以预期的那样，对于在环境温度下保存的接种物，事件数目/μL增加了。在接种物解冻后进行了相同的观察。

所有这些结果显示，当在4℃下或在环境温度下保存时，保存16个小时对于微生物群生存力没有影响；在环境温度下事件数目/μL增加，这表明微生物群在发展，而在4℃下，微生物群处于潜伏状态。在表3中指明了pH和pO₂的测量结果。

表3：pH和pO₂的测量结果

样品	pH	pO<sub>2</sub>(％)
			接种物	6.33	1.4
在环境温度下保存16小时	5.34	4.3
			在4℃下保存16小时	6.28	1.6
解冻对照	6.55	1.5
			解冻在环境温度下保存16小时的接种物	5.29	3.7
解冻在4℃下保存16小时的接种物	6.23	1.3

这些结果显示，保存16小时对于在4℃下保存的接种物的pH和pO₂没有影响。

实施例2：

通过使用与对于实施例1几乎相同的条件，对于四个批次(批次编号1至批次编号4)的粪便微生物群样品施行所述方法，其中对于批次编号1、批次编号2、批次编号3和批次编号4分别为2、8、4和6个供者。批次编号4相应于实施例1的那个批次。因此，对于批次编号4，鉴于所提取的粪便的量很低，合并所述六份粪便中的两份以形成一个接种物。

通过添加冷冻保护稀释剂(盐水水溶液，其按20％的标准包含麦芽糖糊精和海藻糖的混合物)来将所述粪便分开转移到液体接种物中，并且通过过滤器(265μm)进行澄清。

测试了接种物的生存力和分类学特性谱。然后，通过使用蠕动泵将独个接种物转移到3L或5L的柔软的袋子中。然后，将袋子放在调整至4℃的冷藏培养箱中的搅拌平台上，并且在调整至4℃的培养箱中在130转/分钟+/-5％下进行接种物的混合30分钟。

对于每个批次，一旦均质化结束，就将接种物混合物转移到一系列适合于冷冻的袋子中并且保存于-80℃。在贮存之前，测试均质混合物的生存力和分类学特性谱。对于批次编号1，收集了2份粪便并且装满了5个袋子。对于批次编号2，收集了8份粪便并且装满了29个袋子。对于批次编号3，收集了5份粪便并且装满了21个袋子。对于批次编号4，收集了6份粪便，合并了2份粪便以便具有足够材料以形成一个接种物，并且装满了15个袋子。

生存力分析：

如对于实施例1那样进行生存力测试。

宏基因组分析：

用试剂盒NucleoSpin Soil(Machery Nagel)从样品中提取基因组DNA。用试剂盒MyTaq HS-Mix(Bioline)对于每个样品构建测序文库。然后，将所述文库在MiSeq V3 2x300bp运行上进行测序。

在用Trimmomatic[Bolger等人,(2014)‘Trimmomatic:A flexible trimmer forIllumina sequence data’,Bioinformatics,30(15),第2114-2120页.doi:10.1093/bioinformatics/btu170]对经信息分离的序列进行质量控制后，通过使用Bowtie2软件(Langmead,Ben和Salzberg,(2013)‘Fast gapped-read alignment with Bowtie2’,Nature methods,9(4),第357-359页.doi:10.1038/nmeth.1923.Fast)来去除人序列。为了使得能够进行数据比较，将序列数目标准化至60,000个序列/样品。用VSEARCH进行序列的聚类，然后通过使用Silva 128数据库来进行分类学分配。用R软件(R Core Team 2015,3.4.4版,http://www.R-project.org)进行分类学分析和多样性测量。对于多样性测量，对于每一个样品进行60,000个序列的20次亚采样并且测量中值。

结果：

生存力：

下面的表4显示了批次的生存力。独个接种物的生存力的评价从16.8％至67.6％变化。在下面的表中给出了归并在一起的接种物批次的生存力，其位于46.1％和60.2％之间。

表4

分析	批次编号1	批次编号2	批次编号3	批次编号4
					供者数目	2	7	4	6
平均值(％)	60.2	46.1	53.2	47.1
					标准偏差	1.2	1.1	2.1	2.0
最小值	59.4	45.0	50.6	44.3
					最大值	61.6	48.3	58.2	51.4

下面的表5显示了结果。

表5

实施例3：

该研究的目的在于比较两种从多个供者中制备粪便微生物群样品的方法：

-在实施例2中所描述的方法，和

-Paramsothy等人的现有技术的方法[Paramsothy S.等人,(2017),Multidonorintensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis:arandomised placebo-controlled trial,Lancet,Mar25,389(10075):1218-1228]。图5显示了所使用的两种方法。

进行了生存力分析和宏基因组分析以便比较所获得的最终产品的生存力，以及其分类学均质性。

将来自四个健康供者的四份新鲜粪便各自收集在描述于WO2016/170290中的医学装置至中，随后在+2℃/+8℃下保存72小时的时间段，其间进行质量控制(步骤c))。

将所述四份粪便分为两个级分，一个级分用于根据本发明的一个实施方案的处理(“Inv”)，而另一个级分用于根据Paramsothy等人的现有技术的方法(“Ref”)。

通过添加冷冻保护稀释剂(盐水水溶液，其按20％的标准包含麦芽糖糊精和海藻糖的混合物)来将“Inv”粪便分开转移到液体接种物中，并且通过过滤器(265μm)进行澄清。

然后，通过使用蠕动泵将独个接种物转移到1L的柔软的袋子中。然后，将袋子放在调整至4℃的冷藏培养箱中的搅拌平台上，并且在125转/分钟+/-5％下进行接种物的混合30分钟。

一旦均质化结束，就将接种物混合物转移到一系列的10个冷冻管中并且保存于-80℃。

混合“Ref”粪便以便获得目视均质的产品，在等渗盐水溶液(0.9％的NaCl)中进行澄清，随后进行过滤。然后，向所述制备物添加10％的甘油以进行贮存。随后，将如此产生的样品转移到一系列的10个冷冻管中并且保存于-80℃。

如在实施例2中所描述的那样，进行生存力和16S宏基因组分析。在下面的文本中对结果进行了评论。

下面的表6显示了在“Inv”和“Ref”样品中放线菌纲、普雷沃氏菌属和双歧杆菌的相对丰度。

表6

实施例4：

如在实施例1所描述的那样进行目的在于获得粪便均质混合物的产生活动。在5周的时间段内每天收集符合步骤c)的选择标准的8个供者的粪便。通过添加冷冻保护稀释剂(盐水水溶液，其按20％的标准包含麦芽糖糊精和海藻糖的混合物)来将所述粪便分开转移到液体接种物中，并且通过过滤器(265μm)进行澄清。

然后，将在同一天获得的独个接种物混合，以便获得均质产品批次。

DNA提取、宏基因组测序和生物信息学分析

用试剂盒NucleoSpin Soil(Macherey Nagel)从粪便混合物中提取基因组DNA。按照供应商的建议，通过使用试剂盒TruSeq(Illumina)，对于每个基因组DNA样品构建测序文库。然后，将所述文库以成对末端(paired-end)在HiSeq2500(Illumina)运行上同时进行测序。

在用Trimmomatic[Bolger等人,(2014)‘Trimmomatic:A flexible trimmer forIllumina sequence data’,Bioinformatics,30(15),第2114-2120页.doi:10.1093/bioinformatics/btu170]对经信息分离的序列进行质量控制后，通过使用Bowtie2软件(Langmead,Ben和Salzberg,(2013)‘Fast gapped-read alignment with Bowtie2’,Nature methods,9(4),第357-359页.doi:10.1038/nmeth.1923.Fast)来去除人序列。为了使得能够进行数据比较，将序列数目标准化至20,000,000个“成对末端”序列/样品。然后，通过使用RefSeq基因组数据库(2017年9月,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)，用Kraken v.0.10.5-beta(Wood和Salzberg,2014‘Kraken:ultrafast metagenomicsequence classification using exact alignments’,Genome Biology,15(3),pp.R46.doi:10.1186/gb-2014-15-3-r46)来进行分类学分配。

结果：

图8显示了在供者的粪便中(左边第一个柱条)，随后在分别从3、4、5和6个供者的粪便开始而获得的均质混合物批次中，15个产丁酸细菌属的相对丰度：即布劳特氏菌属、栖粪杆菌属、别样棒杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、臭味杆菌属、罗斯伯里氏菌属、霍尔德曼氏菌属、厌氧棒杆菌属、摆动杆菌属、欺骗性小粒菌属和丁酸弧菌属。这些属的相对丰度在每个批次中是稳定的，并且在当用于获得均质混合物的粪便数目增加时被标准化(参见下面的表7)。

表7：在供者中和在不同批次中15个产丁酸细菌属的变异系数

供者	3份粪便的批次	4份粪便的批次	5份粪便的批次	6份粪便的批次
					0.376	0.196	0.093	0.086	0.039

虽然15个产丁酸细菌属没有全部存在于所有独个粪便中，但是相反地，用至少四份粪便的混合物制备的批次包含它们全部(数据未显示)。

Claims (18)

1.制备来源于至少两个预先选择的供者的粪便微生物群均质混合物的方法，所述方法包括下列步骤：

a.从所述预先选择的供者中提取至少一个粪便微生物群样品，

b.在取样后少于5分钟的时限内，将在a)中获得的样品放置在不透氧的收集装置中，

c.对所提取的样品进行质量控制并且排除不符合质量标准的样品，

d.向在控制步骤c)之后被保留的样品中的每一个添加包含至少一种冷冻保护剂和/或填充剂的盐水水溶液，

e.过滤在步骤d)结束后所获得的样品以形成一系列接种物，

f.将所述接种物归并在一起以形成接种物混合物，

g.使在步骤f)中获得的所述混合物均质化，尤其是通过手动搅拌或者借助于搅拌装置，

步骤b)和d)至g)在厌氧生活条件下进行。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述粪便微生物群均质混合物来源于至少四个供者。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述供者根据下列预先选择标准来进行预先选择：

i.具有18至60岁的年龄，

ii.具有18至30的体重指数(BMI)，

iii.没有严重感染性疾病、代谢和神经学病症或者抑郁的个人病史，

iv.没有近期服用能够损害肠道微生物群的组成的药物，

v.没有近期出现与胃肠道疾病相关的症状，例如发热、腹泻、恶心、呕吐、腹痛、黄疸，没有严重感染性疾病，尤其是AIDS、肝炎等的历史，

vi.没有近期在热带国家中旅行，

vii.没有危险的性行为，

viii.没有近期受伤、穿刺和/或文身，

ix.没有近期的慢性疲劳，

x.没有近期的变应性反应，

xi.任选地，具有多样的膳食。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其特征在于，步骤c)的样品质量标准包括：

-按照布里斯托尔量表处于1至6的样品稠度，

-在样品中没有血液和尿。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，步骤c)的样品质量标准包括：

-没有下列细菌：弯曲杆菌属(Campylobacter)，艰难梭菌(Clostridium difficile)(毒素A/B)，沙门氏菌属(Salmonella)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，弧菌属物种(Vibrio sp.)，产志贺样毒素大肠杆菌(E.coli)(STEC)stx1/stx2，多抗性细菌，超广谱β-内酰胺酶(ESBL)—抗万古霉素和抗糖肽的肠球菌(VRE，GRE)，和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，抗碳青霉烯酶的细菌，

-没有下列寄生虫：小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、环孢子虫属物种(Cyclospora sp.)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、兰伯贾第虫(Giardialamblia)、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、蠕虫、粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)、等孢子球虫属物种(Isospora sp.)、微孢子目(Microsporidies)和脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)，

-没有下列病毒：腺病毒F40/41、星状病毒、诺如病毒、轮状病毒A、札幌病毒和小RNA病毒(爱知病毒和肠道病毒)，

-没有下列细菌：肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)It/st、志贺氏菌属(Shigella)/肠侵染性大肠杆菌(EIEC)和类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。

6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述至少一种冷冻保护剂和/或填充剂为多元醇，二糖、三糖或多糖或者其混合物，和填充剂。

7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于，所述盐水水溶液包含麦芽糖糊精和海藻糖。

8.根据权利要求1至7之一的方法，其特征在于，步骤e)中的过滤用包含直径小于或等于0.5mm，优选地小于或等于265μm的孔的过滤器来进行。

9.根据权利要求1至8之一的方法，其特征在于，在样品收集和步骤g)结束之间的时间小于76小时。

10.根据权利要求1至9之一的方法，其特征在于，均质化步骤g)在2℃至25℃，优选地大约2℃至6℃，更优选地大约4℃的温度下进行。

11.根据权利要求1至10之一的方法，其特征在于，所述方法包括下述的转移步骤：

h.将在步骤g)中获得的经均质化的混合物：

i.转移到接种物袋中，以便贮存于大约-50℃至-80℃，优选地-80℃的温度下，或者以便贮存于大约2℃至6℃的温度下以在大约16小时内使用所述混合物，或者以便贮存于10℃至25℃的温度下以在大约4小时内使用所述混合物，

ii.转移到冻干装置中，以便进行冻干。

12.根据权利要求2至11之一的方法，其特征在于，所述粪便微生物群均质混合物包含15个细菌属：布劳特氏菌属(Blautia)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、别样棒杆菌属(Alistipes)、真杆菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、梭菌属(Clostridium)、粪球菌属(Coprococcus)、臭味杆菌属(Odoribacter)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、厌氧棒杆菌属(Anaerostipes)、摆动杆菌属(Oscillibacter)、欺骗性小粒菌属(Subdoligranulum)和丁酸弧菌属(Butyrivibrio)。

13.能够根据权利要求1至12之一而获得的粪便微生物群均质混合物，其用于在同种异体粪便微生物群的移植中使用。

14.能够根据权利要求1至12之一而获得的粪便微生物群均质混合物，其特征在于，所述混合物具有大于15，优选地20的辛普森指数。

15.根据权利要求13或14的微生物群均质混合物，其用于在治疗肠道生态失调中使用。

16.根据权利要求13或14的微生物群均质混合物，其用于在治疗移植物抗宿主病(GvHD)中使用。

17.根据权利要求13或14的微生物群均质混合物，其用于在治疗医源性肠道生态失调和/或相关的病理学状况和并发症中使用，所述相关的病理学状况和并发症包括败血症、败血症性休克和胃肠道病症，所述胃肠道病症包括肠道炎症、腹泻、粘膜炎、腹痛和胃肠道出血。

18.根据权利要求13或14的微生物群均质混合物，其用于为了治疗艰难梭菌感染和相关的腹泻(CDI)、炎症性肠病(IBD)、肠易激惹综合征(IBS)、特发性便秘、乳糜泻、克罗恩病、肥胖症和病态肥胖症、孤独症、多发性硬化症、旅行者腹泻、慢性阴道感染(包括膀胱炎和真菌病)、骨和关节感染、帕金森病、II型糖尿病、食物变态反应、癌症、难治性白血病、阿尔茨海默病、精神分裂症和双相性精神障碍、与抗癌化学疗法或与免疫疗法相关的肠道生态失调以及酒精性和非酒精性肝病而使用。

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