CN111836622A

CN111836622A - 线粒体-氯尼达明、组合物和使用方法

Info

Publication number: CN111836622A
Application number: CN201980013108.5A
Authority: CN
Inventors: B·卡利耶纳拉曼; M·J·哈迪; O·瓦利
Original assignee: Aix Marseille Universite; Medical College of Wisconsin
Current assignee: Aix Marseille Universite; Medical College of Wisconsin
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2020-10-27
Also published as: US20210061830A1; EP3735246A4; WO2019136154A1; US11352382B2; EP3735246A1

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的线粒体‑氯尼达明化合物、组合物和方法。

Description

线粒体-氯尼达明、组合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月3日提交的美国临时申请62/613,188的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

无

背景技术

本发明的领域涉及用于治疗癌症的化合物及其使用方法。更具体地，本发明涉及线粒体-氯尼达明化合物和组合物。

癌症是全球发病率和死亡率的主要原因之一，2012年约有1400万新病例。癌症是全球第二大死亡原因，2015年造成880万人死亡。在全球，近六分之一的死亡是由于癌症。肺癌是美国癌症死亡的主要原因。

氯尼达明(也称为LND或LON：1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羧酸)已与常规化学疗法(紫杉醇，顺铂，阿霉素)结合使用，并与放射疗法结合使用可治疗多种癌症(乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌和脑癌)(参见De Lena M,Lorusso V,Latorre A,Fanizza G,Gargano G,Caporusso L,Guida M,Catino A,Crucitta E,Sambiasi D,Mazzei A.紫杉醇，顺铂和氯尼达明在晚期卵巢癌中的II期研究(Paclitaxel,cisplatin and lonidamine in advancedovarian cancer.A phase II study).Eur J Cancer 37:364-8,2001,Di Cosimo S,Ferretti G,Papaldo P,Carlini P,Fabi A,Cognetti F.氯尼达明：在治疗实体瘤的临床试验中的疗效和安全性(Lonidamine:efficacy and safety in clinical trials forthe treatment of solid tumors).Drugs Today(Barc)39:157-74,2003)。LND对人类具有很大的安全性(见同上)。尽管实际的作用机理仍在积极研究中，但大多数研究表明，LND抑制癌细胞中的糖酵解，从而限制了癌细胞利用的中枢能量代谢途径(例如Warburg机制)(参见Floridi A,Bruno T,Miccadei S,Fanciulli M,Federico A,Paggi MG.抗肿瘤药氯尼达明通过调节能量代谢来增强耐药性艾氏腹水肿瘤细胞中阿霉素的含量(Enhancement ofdoxorubicin content by the antitumor drug lonidamine in resistant Ehrlichascites tumor cells through modulation of energy metabolism).BiochemPharmacol 56:841-9,1998；Natali PG,Salsano F,Viora M,Nista A,Malorni W,MarollaA,De Martino C.氯尼达明[1-(2,4-二氯苄基)-I-H-吲唑-3-羧酸]诱导的正常和赘生淋巴样细胞中需氧糖酵解的抑制作用(Inhibition of aerobic glycolysis in normal andneoplastic lymphoid cells induced by Lonidamine[1-(2,4-dichlorobenzyl)-I-H-indazol-3-carboxylic acid]).Oncology 41增补1:7-14,1984)。最初认为LND可抑制葡萄糖的磷酸化为6-磷酸葡萄糖，这是由己糖激酶(HK)催化的，特别是与线粒体膜相关的己糖激酶II催化的(参见Floridi A,Paggi MG,D'Atri S,De Martino C,Marcante ML,Silvestrini B,Caputo A.氯尼达明对艾氏腹水肿瘤细胞能量代谢的影响(Effect oflonidamine on the energy metabolism of Ehrlich ascites tumor cells).CancerRes 41(11Pt1):4661-6,1981)。还显示LND增强了单羧酸转运蛋白(MCT-1)抑制引起的细胞内酸化作用(增强的乳酸水平)，从而防止了乳酸从细胞中流出。最近的报告表明LND抑制线粒体呼吸链中存在的线粒体复合物II酶(Guo L,Shestov AA,Worth AJ,Nath K,NelsonDS,Leeper DB,Glickson JD,Blair IA.抗癌剂氯尼达明对线粒体复合物II的抑制作用(Inhibition of Mitochondrial Complex II by the Anticancer Agent Lonidamine).JBiol Chem 291:42-57,2016)。先前的研究组已经通过涉及纳米颗粒的靶向递送系统提高了LND的疗效(参见，Milane L,Duan ZF,Amiji M.在多药耐药性乳腺癌的原位动物模型中，以氯尼达明/紫杉醇加载的EGFR靶向的纳米颗粒的药代动力学和生物分布(Pharmacokinetics and biodistribution of lonidamine/paclitaxel loaded,EGFR-targeted nanoparticles in an orthotopic animal model of multi-drug resistantbreast cancer).Nanomedicine 7:435-44,2011；Milane L,Duan Z,Amiji M.紫杉醇/氯尼达明加载的EGFR靶向纳米颗粒治疗多药耐药癌症的疗效和安全性(Therapeutic efficacyand safety of paclitaxel/lonidamine loaded EGFR-targeted nanoparticles forthe treatment of multi-drug resistant cancer).PLoS One 6(9):e24075,2011)。使用靶向EGF受体的纳米颗粒可显著改善LND的肿瘤抑制作用(Milane等，2011)。使用纳米颗粒载体，LND抗肿瘤作用的功效提高了约100倍(Milane等，2011)。

然而，仍然需要用于癌症治疗的改善和增强的LND功效。

发明内容

本发明通过提供一种在抑制肿瘤生长和转移方面具有增加的功效的线粒体-氯尼达明(mito-lonidamine)克服了上述缺点。

一方面，本发明提供了式I的线粒体-氯尼达明化合物：

其中L是接头，选自：C2-C20烷基、氨基酸、苄基、烷基侧链的分支、C2-C20烯烃或PEG，n是选自2-20的正整数，并且X是任何卤素、2,2,2-三氟乙酸(TFA)或乙酸。

另一方面，本发明提供了式Ia的线粒体-氯尼达明化合物：

(Ia)

其中n是选自2至20的整数，并且其中X是任何卤素、2,2,2-三氟乙酸(TFA)或乙酸。一方面，X是溴。另一方面，n为10。

在一些方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含本文所述的线粒体-氯尼达明化合物和药学上可接受的运载体。

在另一方面，本发明提供了一种在有需要的对象中治疗癌症的方法，该方法包括给予有效量的式I的线粒体-氯尼达明化合物：

其中L是接头，选自：C2-C20烷基、氨基酸、苄基、烷基侧链的分支、C2-C20烯烃或PEG，n是选自2-20的正整数，并且X是任何卤素、2,2,2-三氟乙酸(TFA)或乙酸。在一些方面，该方法使用的线粒体-氯尼达明化合物为式IIa的线粒体-氯尼达明：

其中n选自2至20的整数，并且X是卤素。

在另一个方面，本发明提供了一种减少对象中癌细胞生长的方法，该方法包括给予有效量的式I的线粒体-氯尼达明化合物：

在另一个方面，本发明提供了一种减少对象中癌症转移的方法，该方法包括给予有效量的式I的线粒体-氯尼达明化合物：

通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付所需费用之后由政府机关提供。

图1A至图1B分别示出了线粒体-氯尼达明和线粒体₁₀-氯尼达明的合成示意图。

图2是线粒体-氯尼达明的HPLC图。

图3是线粒体-氯尼达明的³¹P NMR谱(400.13MHz，CDCl₃)。

图4是线粒体-氯尼达明的¹H NMR谱(400.13MHz，CDCl₃)。

图5是线粒体-氯尼达明的¹³C NMR谱(75MHz，CDCl₃)。

图6A-6C证明了LND和Mito-LND在胰腺肿瘤细胞中的相对抗增殖作用。

图7证明了在胰腺癌细胞中氯尼达明和Mito-LND对线粒体复合物I的相对抑制。

图8显示了使用Seahorse分析仪监测的氯尼达明和线粒体-氯尼达明对线粒体呼吸的影响。

图9A-9B证明了LON和Mito-LON对H2030BrM3细胞中线粒体复合物活性的影响。(A)复合物I-IV测定中线粒体底物和抑制剂对氧消耗率(OCR)的影响；(B)在存在复合物I(顶部)和复合物II(底部)底物的情况下，LON和Mito-LON进行24小时预处理对OCR的影响。

图10是TPP⁺-连接的化合物摄取到癌细胞线粒体中的示意性表征。

图11描述了LON/Mito-LON对生物能功能和氧化还原信号的靶向。LON抑制己糖激酶II(HKII)，单羧酸转运蛋白(MCT)和线粒体丙酮酸载体(MPC)及复合物II。Mito-LON抑制线粒体复合物I。LON和Mito-LON的组合导致细胞ATP消耗和ROS的刺激，从而导致细胞增殖和侵袭的抑制。由治疗引起的变化以红色(减少)和绿色(增加)箭头显示。HE氧化为2-OH-E+，oMitoPBA氧化为oMitoPhOH以及过氧化物还原蛋白(peroxiredoxin)(以蓝色显示)分别用于检测超氧化物，过氧化氢和特定于隔室的氧化还原状态。

图12A-12B描绘了LON和Mito-LON对细胞ROS产生的影响，通过基于HPLC的二氢乙啶(HE)探针的氧化的分析进行测量。(A)记录的HPLC痕迹；(B)定量数据。*p＜0.05。

图13描绘了LON和Mito-LON对胞质(Prx1)和线粒体(Prx3)过氧化物还原蛋白的氧化还原状态的影响。**p＜0.01。

图14描绘了LON和Mito-LON对H2030BrM3细胞增殖的影响。

图15A-15B描绘了LON和Mito-LON对脑转移性人肺癌细胞侵袭的作用。A.Transwell分析(H2030BrM3细胞)的代表性图片。B.定量分析数据。

图16A-16B描绘了LON和Mito-LON的组合对脑转移性人肺癌细胞侵袭的作用。A.Transwell分析的代表性图片。B.定量分析数据。*p＜0.05；***p＜0.001。

图17A-17B描绘了ERK1在LON和Mito-LON的抗增殖作用中的作用。A，用Mito-LON处理的H2030BrM3细胞的受体酪氨酸激酶测定的结果。B，LON和Mito-LON对H2030BrM3细胞中AKT和ERK1/2磷酸化以及己糖激酶的表达水平的影响。

图18描绘了Mito-LON诱导肺癌细胞死亡，*P<0.05。

图19A-19C描绘了Mito-LON随着时间的推移在H2030和H2030BrM3(一种肺来源的转移性脑细胞系)中诱导自噬。图2A，Mito-LON处理后自噬和与线粒体自噬相关蛋白的改变。2B，Mito-LON在H2030肺细胞中诱导自噬液泡；a-c中用载剂处理或d-f中用Mito-LON[2.0μM]的处理的H2030细胞的显微照片；MDC染色用于检测酸性自噬液泡，载剂在“c”中显示，对于Mito-LON处理的H2030细胞显示在“f”中，箭头指示在明场(b和e)和匹配的FL MDC标记的细胞(c和f)中的自噬液泡。2C，Mito-LON诱导了与自噬信号转导相关的能量感应分子的调节。

图20描绘了细胞中的Mito-LON凋亡。

图21描绘了Kaplan-Meier生存曲线。促自噬标志物的高表达与患者生存期的改善有关。

图22A-22C描绘了8周治疗后测得的Mito-LON的最大耐受剂量(MTD)。(A)测得的体重。(B)血清AST水平。(C)血清ALT水平。

图23描绘了Mito-LON对A/J小鼠中VC诱导的肺肿瘤发生的作用。测量肿瘤负荷。对照(n＝4)和Mito-LON(n＝4)。***P＜0.001。

图24A-24C描绘了LON或Mito-LON对原位小鼠模型中肺肿瘤生长的抑制剂作用。(A)用载剂(玉米油)，LON或Mito-LON处理的原位J2030-BrM3肺肿瘤小鼠的代表性实时图像，每周5次，连续治疗3周。(B)对照小鼠和经LON和Mito-LON治疗的小鼠的纵隔淋巴结的重量。(C)H&E染色后肝组织切片的代表性图像(放大倍数10X)。

图25A-25C描绘了LON和Mito-LON对肺癌脑转移的抑制。A.使用高分辨率超声心动图显示针头。B.取自对照组、LON和Mito-LON处理组的大脑的代表性生物发光图像。C.脑转移瘤生长的生物发光成像的定量数据。n＝6，与对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01。

具体实施方式

一般描述。在描述本发明的材料和方法之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体方法学，方案，材料和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。

缩写LON和LND在本文中可互换使用以指代氯尼达明。缩写Mito-LON和Mito-LND也可互换使用，并且是指本发明的改性的氯尼达明。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述的是优选的方法和材料。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述的是优选的方法和材料。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不是先于这些公开内容的在先发明。

本发明。

化合物和组合物。在一个实施方案中，本发明提供了经改性以选择性地和协同地抑制癌症的增殖和发展的新型的线粒体-氯尼达明(Mito-LND或Mito-LON)化合物。具体地，发明人已经表明，与单独使用氯尼达明的治疗相比，在非常低的剂量下将带正电荷的基团连接至氯尼达明极大地增强了化合物的抗肿瘤功效。

在一个实施方案中，本发明的Mito-LND化合物包含经改性以包括烷基阳离子部分的氯尼达明。具体地，通过经由烷基链添加三苯基鏻阳离子(TPP+)来改性氯尼达明。这些改性的Mito-LND靶向线粒体，并导致LND的形式更为有效，可用于治疗癌症和转移瘤。烷基链可包含2至20个碳，以提供不抑制LND功能的灵活性。

如实施例中所证明的，在体外抑制癌细胞(人胰腺癌、肺癌和脑转移)的增殖中，线粒体-氯尼达明(IC50＝0.64微摩尔)比氯尼达明(IC50＝327微摩尔)更有效。此外，非小细胞肺癌的体内小鼠模型表明，Mito-LDN能够抑制肺癌细胞的生长和脑转移。在抑制肿瘤细胞的线粒体复合物I活性方面，线粒体-氯尼达明比氯尼达明强超过500倍。发明人惊奇地发现，在H2030BrM3肺癌细胞(图9)中，Mito-LDN不仅可以靶向呼吸复合物I和II的琥珀酸-泛醌还原酶活性，而且Mito-LDN比LDN更有效，IC₅₀分别为1.2和2.7μM，显示效能比LDN高超过100倍。Mito-LDN对复合物I(和II)的抑制作用会刺激ROS生成(图12)并氧化肺癌细胞中的线粒体Prx3。这些发现首次表明抑制线粒体复合物导致肿瘤前细胞和肿瘤细胞自噬性细胞死亡是Mito-LDN的关键抗肿瘤机制。与LDN对复合物I和II的影响相比，这是令人惊讶的，后者的浓度(约400μM，图7)远高于患者的典型峰值血浆水平(17-127μM)。该实施例进一步证明，在抑制线粒体氧消耗方面，Mito-LON比LON有效100倍以上(图9)。Mito-LON在抑制肺癌增殖和侵袭方面的功效也比LON高100倍以上。

本发明提供了线粒体-氯尼达明及其用于治疗癌症的方法。在一些实施方案中，可以单独或与其他化学治疗剂、放射线或其他治疗方式组合给予线粒体-氯尼达明，以治疗各种类型的癌症，特别是高代谢癌症。例如，在一个实施方案中，可以将氯尼达明与常规化学疗法联合使用以治疗癌症，所述化学疗法例如但不限于紫杉醇，顺铂，阿霉素，吉西他滨等。

在一个实施方案中，本发明提供了一种式I的线粒体-氯尼达明：

其中L是接头，n选自2-20的正整数，X是任何卤素、2,2,2-三氟乙酸(TFA)或乙酸。

合适的接头包括2至20个碳的烷基，氨基酸(例如精氨酸，赖氨酸等)，苄基，烷基侧链的分支，烯烃(例如具有2至20个碳的烯烃)，双键，PEG等。

在一个优选的实施方案中，式I的线粒体-氯尼达明化合物包含烷基L，其中n选自2至20，优选在一个实施方案中n为1。

在一个实施方案中，X是卤素，并且卤素选自溴(Br)、氟(F)、氯(Cl)、碘(I)和砹(At)。在一个优选的实施方案中，卤素是溴。

在另一个实施方案中，本发明提供了式I的线粒体-氯尼达明化合物，其中L是烷基，n选自2-20的正整数，如下式Ia所示：

(Ia)

在一个优选的实施方案中，式Ia的线粒体-氯尼达明化合物包括X为溴，n为5-20的正整数，或者n为10-20的正整数。在一个优选的实施方案中，n为10。

在另一个实施方案中，本发明提供了式I的线粒体-氯尼达明化合物，其中L是烷基，X是溴，如式(Ib)所示：

(Ib)

其中n选自2至20的正整数。在优选的实施方案中，n选自5至15的正整数。在一些实施方式中，n为10。

在另一个实施方案中，线粒体-氯尼达明化合物为式Ic的线粒体₁₀-氯尼达明：

(Ic)

在另一个实施方案中，线粒体-氯尼达明化合物为式II：

其中L是接头，n选自2-20的正整数，X是任何卤素、2,2,2-三氟乙酸(TFA)或乙酸。在一个实施方案中，X是卤素，并且卤素选自溴(Br)、氟(F)、氯(Cl)、碘(I)和砹(At)。在一个优选的实施方案中，卤素是溴。

合适的接头(L)包括2至20个碳的烷基，苄基，烷基侧链的分支，氨基酸，双键，烯烃(例如具有2至20个碳的烯烃)，PEG等。

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito12-LND的异构体)

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito10-LND的异构体)

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito₉-LND的异构体)

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito₈-LND的异构体)

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito₇-LND的异构体)

在替代实施方案中，本发明包括根据以下结构的Mito-LND化合物(Mito₆-LND的异构体)

在一些实施方案中，本公开内容提供了包含至少一种本发明的线粒体-氯尼达明化合物的组合物。该组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，线粒体-氯尼达明化合物为式II的Mito₁₀-氯尼达明。

“药学上可接受的”载体是本领域已知的，包括但不限于例如合适的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，脂质体，纳米颗粒和佐剂。药学上可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于0.01至0.1M，优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。另外，这种药学上可接受的载体可以是水性或非水性的溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括等渗溶液，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。

本发明的药物组合物包括液体或冻干或其他干燥的制剂，包括各种缓冲内含物(例如Tris-Hcl、乙酸盐、磷酸盐)的稀释剂，pH和离子强度，添加剂例如白蛋白或明胶，以防止吸附到表面，去污剂(例如Tween20、Tween80、Pluronic F68、胆酸盐)，增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)，抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)，防腐剂(例如硫柳汞，苯甲醇，对羟基苯甲酸酯),膨胀物质或张力调节剂(例如乳糖，甘露糖醇)，聚合物例如聚乙二醇对蛋白质的共价附着，与金属离子的络合，或物质掺入到聚合物化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸、或水凝胶等)的颗粒制剂内或上，或脂质体、微乳液、单层或多层微囊、血影或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态，溶解度，稳定性，体内释放速率和体内清除速率。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸，蜡，油)中的制剂。

在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体，例如缓冲盐水等。可以通过常规的、众所周知的灭菌技术对组合物进行灭菌。所述组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的其他物质，例如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等。

合成方法：通过图1所示或以下所述的两步法制备使用本发明的烷基接头的线粒体-氯尼达明化合物。在回流下加热氯尼达明、草酰氯和催化量的DMF在CH₂Cl₂中的溶液。减压除去未反应的草酰氯和溶剂，得到1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羰基氯。随后在室温下将1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羰基氯与相应的氨基烷基三苯基溴化鏻反应，以生产线粒体-氯尼达明(Mito-LDN)。通过快速色谱法或HPLC纯化Mito-LDN。

使用方法：在一个实施方案中，本发明提供了一种在对象中治疗癌症的方法，该方法包括向该对象给予治疗有效量的包含至少一种本发明的线粒体-氯尼达明化合物的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含一种本发明的线粒体-氯尼达明化合物。在一个优选的实施方案中，线粒体-氯尼达明化合物是式II的Mito₁₀-氯尼达明化合物。在另一个实施方案中，该组合物包含两种或更多种本发明的线粒体-氯尼达明化合物。

就本发明目的而言，“治疗”或“处理”描述了以对抗疾病、病症、或紊乱为目的对对象的管理和护理。治疗或处理包括给予本发明的抑制剂以防止所述症状或并发症的发作、缓解所述症状或并发症、或消除所述疾病、病症、或紊乱。治疗还包括治疗性和姑息性治疗。治疗的目的包括减轻或预防症状，减慢或停止疾病、病症或病状的发展或恶化和/或疾病、病症或病状的缓解。在某些实施方案中，治疗包括抗癌疗法和/或治疗。术语“治疗”的特征在于以下至少之一：(a)减少、减慢或抑制癌细胞和癌细胞的生长，包括减慢或抑制转移性癌细胞的生长；(b)防止肿瘤进一步生长；(c)减少或预防对象体内癌细胞的转移；(d)减轻或改善至少一种癌症症状。在一些实施方案中，本领域技术人员可以使用常规实验容易地确定最佳有效量。

术语“有效量”或“治疗有效量”指足以产生有益或所需生物和/或临床结果的量。该结果可以是减少、抑制或预防癌细胞的生长，减少、抑制或预防癌细胞的转移或癌细胞的侵袭或转移，或减少、减轻、抑制或预防癌症或癌症转移的至少一种症状，或任何其他所需的生物系统改变。“有效治疗”是指产生有益作用，例如改善至少一种癌症症状的治疗。有益效果可以采取相对于基线改善的形式，即相对于根据该方法开始治疗之前进行的测量或观察的改善。有益效果还可以采取减少、抑制或预防癌细胞进一步生长，减少、抑制或预防癌细胞转移或癌细胞侵袭或转移，或减少、减轻、抑制或预防癌症或癌症转移的至少一种症状的形式。这种有效的治疗可以例如减轻患者的痛苦，减少癌细胞的大小或数量，可以减少或防止癌细胞的转移，或者可以减慢癌症或转移性细胞的生长。

如本文所用，术语“给予”和“给药”是指向对象提供药物制剂的任何方法。此类方法是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于口服给药，透皮给药，通过吸入给药，鼻腔给药，局部给药，阴道内给药，耳内给药，脑内给药，直肠给药，舌下给药，口腔给药和胃肠外给药，包括注射剂，例如静脉内给药，动脉内给药，肌肉内给药，皮内给药，鞘内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，制剂可以治疗性地给予；即用于治疗已经存在的疾病或状况。在一个优选的实施方案中，化合物或组合物通过静脉内、口服或吸入给药。

对于口服给药，可以将活性成分与至少一种固体非活性成分混合以制备片剂，胶囊剂，丸剂，散剂，颗粒剂或其他合适的口服剂型。例如，可以将活性剂与至少一种赋形剂如填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，溶液阻滞剂，吸收促进剂，湿润剂吸收剂或润滑剂组合。

如本领域中已知的，癌症通常被认为是不受控制的细胞生长。本发明的方法可用于治疗任何癌症，其任何转移以及其任何化学残留的生长，包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。能够通过本文所述的组合物、方法和试剂盒治疗的合适的癌症包括但不限于：乳腺癌，前列腺癌，结肠癌，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，宫颈癌，胃肠道癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，大肠癌，子宫宫颈癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，间皮瘤，肾癌，外阴癌，胰腺癌，甲状腺癌，肝细胞癌，皮肤癌，黑色素瘤，脑癌，神经母细胞瘤，骨髓瘤，各种类型的头颈癌，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，尤因肉瘤和周围神经上皮瘤。在一个实施方案中，所述癌症选自：黑色素瘤，非小细胞肺癌，头颈部鳞状细胞癌，卵巢癌，胰腺癌，肾细胞癌，肝细胞癌，膀胱癌，恶性神经胶质瘤，结直肠癌和子宫内膜癌。

在一些实施方案中，癌症是胰腺癌，非小细胞肺癌或脑癌。在一个实施方案中，癌症是胰腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，癌症是来自NSCLC的脑转移。

在一个实施方案中，癌症是脑癌。据信，线粒体-氯尼达明能够穿过血脑屏障，从而提供了脑癌的治疗方法。在一些实施方案中，将至少一种线粒体-氯尼达明化合物与标准的癌症治疗例如放射线结合以治疗脑癌。

术语“转移”或“继发性肿瘤”是指已经扩散到继发部位，例如在原始原发癌部位之外的癌细胞。继发部位包括但不限于例如淋巴系统，皮肤，远处器官(例如，肝，胃，胰腺，脑等)等，并且会根据原发部位而有所不同瘤。

在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物用于治疗癌症的转移，特别是脑转移。

本公开内容还提供了减少癌细胞生长的方法，该方法包括将癌细胞与治疗有效量的至少一种式I的线粒体-氯尼达明化合物接触或给予，以减少癌细胞的生长。

在另一个实施方案中，本公开内容提供了一种减少或抑制对象中癌症转移的方法，该方法包括给予有效量的本文所述的线粒体-氯尼达明化合物或组合物。

在一些实施方案中，至少一种线粒体-氯尼达明化合物与放射或化学疗法组合使用。合适的化学治疗剂是本领域已知的，并且可以根据要治疗的癌症类型而变化。合适的化学治疗剂包括但不限于例如紫杉醇，顺铂，阿霉素，吉西他滨等。

如本文所用，“对象”或“患者”是指哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”指的是任意的哺乳动物纲成员，包括但不限于人类、非人灵长类，例如大猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，例如牛、马、山羊、绵羊和猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包含啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳动物的示例包括但不限于鸟类等。术语“对象”不表示特定年龄或性别。在一个具体的实施方案中，对象是哺乳动物，优选人。

在一些实施方案中，提供了用于实施本文所述方法的试剂盒。提供的试剂盒可包含必要的组件，用于执行上述一种或多种方法。在一个实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的试剂盒。所述试剂盒可包含至少一种本发明的线粒体-氯尼达明化合物和使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包含一种或多种常规的癌症治疗剂，以与至少一种线粒体-氯尼达明化合物组合使用。在一个实施方案中，试剂盒包含Mito₁₀-氯尼达明。

对本领域技术人员显而易见的是，除了已描述的那些外，在不背离所述发明理念的前提下可以进行更多的改良。在解释本公开时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。术语“包含”的变体应该被解释为以非排他的方式引用元件，组件或步骤，因此引用的元件，组件或步骤可以与不明确引用的其他元件，组件或步骤组合。称之为“包含”某些元件的实施方式也被认为是“基本上由(这些元件)组成”和“由(这些元件)组成”。术语“基本上由......组成”和“由...组成”应根据MPEP和相关联邦巡回法院的解释进行解释。过渡术语“基本由……组成”将权利要求的范围限制到指定的物质或步骤以及要求保护的发明的“本质上不影响基本和新特征的那些”。由......组成是一个封闭的术语，不包括权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分。

已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解，除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。

在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。

实施例

实施例1：线粒体-氯尼达明的制备和线粒体-氯尼达明的线粒体靶向

图1A显示了制备线粒体-氯尼达明的一般示意图。图1B显示了Mito₁₀-氯尼达明的具体制备。所有化学药品和有机溶剂都可以从市场上买到，并按原样使用。使用硅胶Merck⁶⁰F254通过TLC监测反应。粗物质通过快速色谱在Merck硅胶60(0.040-0.063mm)上纯化。使用配备有QNP探针的Bruker DPX AVANCE 400光谱仪分别在400.13MHz处记录¹H NMR谱。分别使用CDCl₃和TMS作为内标，在CDCl₃中获得¹H NMR和³¹P。化学位移(δ)以ppm为单位，J值以赫兹为单。

图1A和1B显示了线粒体-氯尼达明的合成。1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羧酸(0.35g，1.1mmol)、草酰氯(2mL)和催化量的DMF(0.1mL)的CH₂Cl₂(20mL)溶液在回流下加热2小时。减压除去未反应的草酰氯和溶剂，得到1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羰基氯，为黄色固体。将(10-氨基癸基)三苯基溴化鏻(0.54g，1.1mmol)和三乙胺(160μL，1.1mmol)添加到酰氯在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌12小时，然后用水(30mL)洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥，并在减压下蒸馏溶剂。通过快速色谱在硅胶上纯化粗产物(CH₂Cl₂/EtOH 90:10)，得到黄色粉末(0.4g，46％)，对应于Mito₁₀-氯尼达明(Mito₁₀-LDN)。

通过长烷基链将LDN分子连接到TPP⁺，可增加其亲脂性并增强细胞摄取。将TPP⁺基团与LON分开的长烷基链使TPP⁺对LDN的药效基团活性的影响最小化。如图1B所示，由LON合成了Mito₁₀-LDN，并通过NMR和质谱法对其进行了表征(图3-5)。根据Nernst方程(图10)，TPP⁺连接的化合物在癌细胞的线粒体中选择性地积累并且高水平⁵³，这与在低μM浓度下Mito-LON对复合物I和II的显著作用一致(图9)。

计算的Mito₁₀-氯尼达明C₄₃H₄₅Cl₂N₃OP的HRMS[M]⁺720.2672，实测值为720.2672。

³¹P(400.13MHz,CDCl₃)δ24.38,24.54.¹H NMR(400.13MHz,CDCl₃)δ8.40(1H,d,J＝8.1),7.88-7.78(9H,m),7.74-7.69(6H,m),7.43(1H,d,J＝2.2),7.42-7.33(2H,m),7.30-7.26(1H,m),7.1(1H,dd,J＝2.0,8.3),7.03(1H,bt,J＝5.9),6.66(1H,d,J＝8.3),5.66(2H,s),3.78-3.71(2H,m),3.45(2H,dt,J＝6.8,7.1),1.70-1.56(6H,m),1.31-1.17(10H,m).¹³C NMR(75.47MHz,CDCl₃)δ162.4,141.1,138.6,135.0,134.9,134.4,133.7,133.6,133.1,132.4,130.5,130.4,129.4,129.4,127.6,127.3,123.1,123.0,122.8,118.8,117.9,109.2,50.0,39.0,30.4,30.3,29.7,29.3,29.2,29.1,29.0,26.9,23.0,22.7,22.6,22.5.HPLC示于图2。

使用相同的方法，可以合成含有各种烷基接头侧链(n＝2-20)的线粒体-氯尼达明或使用其他接头(例如苄基，烷基侧链的分支，双键，PEG，氨基酸等)合成。具体地，如图所示合成了各种烷基接头侧链(图1A)。如图3-5所示，分别使用CDCL₃和TMS作为内标，在CDCl₃中获得'¹H NMR和³¹P。

根据以下反应合成本发明的Mito_n-氯尼达明化合物：

方案。试剂和条件：i,PPh₃,ACN,回流；ii,NH₂-NH₂,EtOH,回流；iii,氯尼达明,(COCl)₂,CH₂Cl₂,回流,2h,TEA,CH₂Cl₂。

在一个具体的实施方案中，反应是：

其中，i,PPh₃,ACN,回流；ii,NH₂-NH₂,EtOH,回流；iii,氯尼达明,(COCl)₂,CH₂Cl₂,回流,2h,TEA,CH₂Cl₂。

根据以下反应合成本发明的Mito-PEG-LND化合物：

方案。试剂和条件：i,PBr₃；ii,邻苯二甲酰亚胺钾,DMF；iii,PPh₃,ACN,回流；iv,NH₂-NH₂,EtOH,回流；v,氯尼达明,(COCl)₂,CH₂Cl₂,回流,2h,TEA,CH₂Cl₂。

在一些实施例中，n是选自1至10的整数。

本发明的线粒体-Phen-LND化合物是根据以下反应合成的：

试剂和条件：i,PPh₃,ACN,回流；ii,邻苯二甲酰亚胺钾,DMF；iii,NH₂-NH₂,EtOH,回流；iv,氯尼达明,(COCl)₂,CH₂Cl₂,回流,2h,TEA,CH₂Cl₂。

在一些实施例中，n是选自1至10的整数。

本发明的线粒体-Cy-LND化合物是根据以下反应合成的：

实施例2：线粒体-氯尼达明在胰腺癌中的抗肿瘤作用

本实施例显示了对氯尼达明的结构进行改性，使得改性的化合物表现出相似或超过掺入纳米颗粒的LND的抗肿瘤作用。改性的LND(线粒体-氯尼达明(MLND或Mito-LND))在机制上与LND有很大不同。Mito-LND抗肿瘤作用的增强归因于线粒体能量代谢抑制机制的意外变化。

LND和Mito-LND在肿瘤细胞中的相对抗增殖作用。

用不同浓度的LND或Mito-LND处理胰腺癌细胞，并随时间测定细胞数。如图6所示，在胰腺癌细胞的抗增殖作用中，Mito-LND的效力提高了近500倍。

为了研究线粒体抑制的机制，我们测量了肿瘤细胞中线粒体复合物的活性。细胞膜被透化，并且在加入底物和线粒体复合物I-II的抑制剂后测量OCR。令人惊讶地，如图7所示，相比复合物II，Mito-LND更有效地抑制复合物I，并且Mito-LND在抑制肿瘤细胞的复合物I活性方面比LND有效＞500倍(图7和8)。

实施例3：Mito-LND在肺癌模型中的抗增殖作用

非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌⁹，约40％的NSCLC是腺癌(LUAD)。吸烟和有吸烟史的对象都增加了LUAD风险。脑转移是与LUAD相关的最棘手的临床问题之一，也是LUAD死亡的主要原因之一^6,10。中枢神经系统(CNS)转移的唯一可用疗法是全脑/CNS照射或手术切除，或在EGFR突变患者中进行抗EGFR药物治疗⁶。这些疗法纯属姑息疗法，并具有明显的毒性。

该实施例证实，在使用Mito₁₀-氯尼达明的小鼠模型中，Mito-LND能够减少肺肿瘤的发生和相关的脑转移。

发明人惊奇地发现，在H2030BrM3肺癌细胞(图9)中，Mito-LON不仅可以靶向呼吸复合物I和II的琥珀酸-泛醌还原酶活性，而且线粒体-LON比LON更有效，IC₅₀分别为1.2和2.7μM。线粒体-LON对复合物I(和II)的抑制作用会刺激ROS生成(图12)并氧化肺癌细胞中的线粒体Prx3。这些发现首次表明抑制线粒体复合物导致肿瘤前细胞和肿瘤细胞自噬性细胞死亡是线粒体-LON的关键抗肿瘤机制。与LON对复合物I和II的影响相比令人惊讶，后者的浓度(约400μM，图7)远高于患者的典型峰值血浆水平(17-127μM)^19,20。

体外研究表明，LON本身在临床相关浓度(<130μM)时仅中等有效³。虽然LON也可以抑制线粒体复合物II^3，17，但其抑制水平远高于临床上达到的水平。

该实施例显示，在抑制线粒体氧消耗方面，线粒体-LON比LON有效100倍以上(图9)。从机制上讲，Mito-LON的效力是LON的100倍以上，与复合物II(K_i＝2.7μM)相比，它对复合物I(K_i＝1.2μM)的抑制作用更大(图9)。Mito-LON在抑制肺癌增殖和侵袭方面的功效也比LON高100倍以上。用LON

或Mito-LON

预处理H2030BrM3细胞会抑制复合物I和II(图2B)。进一步地，Mito-LON诱导线粒体中ROS的产生(图12和13)。

图11描绘了Mito-LON可通过抑制线粒体生物能从而激活ROS介导的导致癌细胞ACD的信号转导途径而在肺癌细胞中发挥增强的抗增殖功效的机制。图12表明，Mito-LON增强了肺癌细胞中O₂ ^·–的特异性标志物2-羟基乙锭的形成。

LON和Mito-LON抑制线粒体复合物I的活性。在完整的肺癌细胞中，线粒体-LON以比LON低100倍的浓度抑制细胞呼吸(耗氧率，OCR)(图9)。基线呼吸和线粒体应激源(寡霉素，二硝基苯酚)的反应都被Mito-LON减弱(未显示)。为了研究线粒体抑制的机制，我们测量了H2030BrM3细胞(NSCLC细胞系)中线粒体复合物的活性。细胞膜被透化，并且在加入底物和线粒体复合物I-IV的抑制剂后测量OCR(图9A)。这些研究确定了透化细胞在复合物活性测定中的最佳应用⁵⁴。接下来，将细胞用LON和Mito-LON预处理24小时，并按照图9A进行实验。对于复合物I和II，Mito-LON的效力分别比LON高370倍和144倍(图9B)，这反映了增强的Mito-LON的线粒体累积。我们假设线粒体复合物I和II的抑制是Mito-LON对肺癌细胞抗增殖作用的主要机制。

抑制线粒体呼吸导致增加的O₂ ^·–和其他氧化剂。Mito-LON增加了肺癌细胞中ROS的产生：LON(200μM)和Mito-LON(0.2μM)都引起H2030BrM3细胞中细胞内2-OH-E⁺(HE氧化的O₂ ^·–特异性产物)水平升高(图11)。Mito-LON还强烈诱导了二乙锭(E⁺-E⁺)的形成，这是其他更强氧化剂的指示剂^48，55。Mito-LON诱导的ROS大部分位于线粒体内：Mito-LON引起线粒体Prx3的明显氧化，而没有对胞质Prx1有显著影响(图12)。由于Prx3约占线粒体过氧化物酶总活性的90％，这些数据表明Mito-LON压倒了线粒体降解过氧化物的能力。

与LON相比，Mito-LON在阻止肺癌细胞生长方面更有效，并且Mito-LON增强了ATP耗竭和LON的抗增殖作用。在针对LON提出的不同生物能机制中，其降低HK2水平的能力(参见图17)是其更敏感的效应之一

并且是以前未被认识的机制。相反，Mito-LON(1.2–2.7μM)靶向线粒体复合体I和II(图9)；它的线粒体作用得到了线粒体Prx3的隔室选择性氧化的支持(图13)。在H2030BrM3细胞中比较了Mito-LON和LON的抗增殖作用。使用提供实时细胞融合数据的IncuCyte^TM活细胞成像分析仪，我们测定Mito-LON(IC₅₀＝0.7μM)抑制细胞增殖的剂量比LON(IC₅₀＝140μM)低200倍(图14)，表明LON靶向线粒体的强大功能。因此，将LON连接到TPP⁺阳离子可促进线粒体积累，并显著改善其对线粒体复合物I和II的作用，从而显著提高针对肺癌细胞的抗增殖活性。

Mito-LON抑制脑转移性人类肺癌细胞的迁移和侵袭。为了研究Mito-LON和LON在肺癌转移中的潜力，我们首先使用PC9BrM3和H2030BrM3脑转移肺癌细胞系通过Boyden室侵袭试验在体外测试了其作用。Mito-LON(48h)在抑制入侵方面的功效比LON高约100倍(图15A-B)。同样，当两种试剂在各浓度下单独使用时，具有<10％的抑制作用，而将LON(100μM)与Mito-LON(0.6μM)组合导致抑制侵袭的显著增加(图16)。

HK2的作用以及其他可能导致Mito-LON影响的信号转导事件。LON在3至6小时内降低了两个肺癌系中的HK2水平(图17B，未显示PC9BrM3数据)，我们提出这是LON抑制HK2活性的关键机制。LON还使HK2mRNA表达降低了80％以上(未显示)。在受体酪氨酸激酶测定中鉴定其他潜在的信号转导事件(图17A)，Mito-LON降低了磷酸化ERK水平，这已通过蛋白质印迹法证实(图17B)。这可能有助于其作用，因为许多癌症具有组成型ERK激活，可促进生存和增殖，而ERK1在调节线粒体活性，凋亡，增殖和迁移中起重要作用。Mito-LON还降低了磷酸化AKT水平，这也可能有助于抗增殖作用。AKT是在许多癌症中组成型激活(磷酸化)的另一种促生存因子。

Mito-LON治疗会导致人肺癌和肺癌衍生的脑转移细胞系死亡。自噬在癌症中的作用存在看似自相矛盾的报道。在营养缺乏的条件下，自噬诱导可以促进细胞存活；然而，自噬响应其他环境应激因素(包括ROS的产生)时，会促进癌细胞死亡。我们用Mito-LON(1.6、2.0或2.4μM)处理了肺癌系(H2030，PC9，H460)和肺癌衍生的脑转移系(H2030BrM3，PC9BrM3)，并在24和48小时测量了细胞活力。我们确定Mito-LON的LD50为2.0μM，代表性结果如图18所示。基于钙黄绿素-AM活力染色，对H2030细胞进行Mito-LON[2.0μM]处理可在48小时降低约50％的细胞活力，支持Mito-LON会显著降低细胞活力并且不会增加肺癌细胞的存活。

Mito-LON诱导人肺癌细胞系和肺源性脑转移系中的自噬细胞死亡。为了研究Mito-LON抑制线粒体呼吸和诱导ROS导致癌细胞死亡的潜在机制，我们分析了Mito-LON[2.0μM]处理0、6、24和48小时的细胞裂解液。探查裂解液中靶向能量、凋亡和自噬的蛋白质，包括选择性线粒体自噬标志物。我们的数据(图19)显示，Mito-LON处理[2.0μM]调节关键的自噬蛋白，包括H2030肺癌细胞和相应的脑转移系(H2030BrM3)中的特定的线粒体自噬受体，适配蛋白和能量感应分子。LC3，微管相关蛋白轻链3，对于被载物募集至关重要。LC3前体通过泛素化样系统进行修饰，生成可溶性LC3-I，然后将其进一步修饰为LC3-II，即自噬诱导后的膜结合磷脂偶联物。LC3-II整合到自噬体膜中，被认为是自噬诱导的可靠早期标志物。Mito-LON处理(图19A)将整个细胞系中的LC3-II水平提高了1.9倍至4.4倍，并持续调节了48小时。LC3相互作用区(LIR)充当选择性自噬的机制基础，包括线粒体自噬，该线粒体自噬通过适配蛋白(p62，NBR1，OPTN，BNIP3L)的结合特异性靶向受损的线粒体。我们评估了线粒体对泛素结合的线粒体自噬受体(p62，NDP52，NBR1)的影响，这也表明自噬通量与自噬体转换的潜在损害。两种细胞系中Mito-LON调节P62指示自噬降解过程的完成。在Mito-LON处理的H2030细胞中，变化始终是双峰的，这可能是由于P62在线粒体聚集和下游降解中线粒体自噬的双重作用。Mito-LON诱导的NDP52变化与P62变化平行。包括PINK1作为PINK1-Parkin依赖线粒体自噬的指标。两种细胞系均指出，PINK1的基线水平通常较低，并且由于线粒体去极化、损伤和ATP改变的增加而增加。Beclin1(BECN1)是一种自噬调节剂，是包括NSCLC在内的多种癌症的潜在抑癌基因产物。

Mito-LON增加了H2030细胞中的Beclin-1水平，但没有增加H2030-BrM3细胞中的Beclin-1水平(图19A)。因此，肺源性脑转移系中的自噬诱导可能与BECN1无关。H2030BrM3细胞对Mito-LON的独特反应是RAB7水平升高(图19A)，RAB7是晚期自噬的标志物，可能是由于持续的ROS诱导所致。NRF2是细胞应激反应的主要调节剂，在任一细胞系中均未检测到。图19B进一步支持Mito-LON的自噬诱导。载剂处理的H2030细胞没有形成自噬液泡，如明场显微照片所示(图19B，图a和b)，单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine，MDC)染色阴性(图19B，图c)。相反，Mito-LON[2.0μM]处理的H2030细胞显示自噬的空泡特性显著增加(图19B的图d和e)，MDC染色呈阳性(图19B的图f)，MDC是基于酸性细胞隔室和脂质分配的自噬液泡的标志物。图19C显示了Mito-LON使主导AKT/mTOR信号转导路径的一组自噬启动能量感应蛋白失活。具体而言，Mito-LON改变磷酸化事件且并行激活伴侣。例如，P-P70S6K^Thr389使mTOR^Ser2448磷酸化；在Mito-LON处理的细胞中两者均减少。类似地，ULK被AMPK激活，并且Mito-LON降低两种磷蛋白，就像P-PTEN一样。

Mito-LON诱导人肺癌细胞系及其肺源性脑转移系凋亡的作用。Mito-LON处理的H2030和H2030BrM3细胞的结果(图20)证明，细胞死亡诱导主要是通过自噬而不是半胱氨酸蛋白酶(caspase)依赖性凋亡。Mito-LON处理导致裂解的PARP和细胞色素c的水平增加，但不诱导半胱氨酸蛋白酶的裂解。

促自噬标志物与改善的肺癌存活率有关。自噬在人类肺癌进展、转移和预后中的作用仍未阐明。在对100多名患者的研究中，高BECN1表达与分化良好的非小细胞肺癌和减少的淋巴结转移相关。此外，该研究报告BECN1低表达加上p62高表达与患者生存时间缩短显著相关。我们查询了胸外科mRNA表达数据库(包含442例肺腺癌病例)中的促自噬标志物：BECN1，自噬相关12(ATG12)和DNA损伤调控的自噬调节剂1(DRAM1)。与文献强烈一致，我们的数据表明，每种促自噬标记物的高表达与肺腺癌患者生存率的提高显著相关(图21)。

Mito-LON的最大耐受剂量(MTD)。我们进行了为期8周的毒理学研究，以评估Mito-LON的可能毒性，尤其是使用针对神经和肌肉细胞的毒性的改良的Irwin筛查，该筛查是可广泛筛查药物的中枢神经系统(CNS)效应的作为全面观察组合而开发的。该测试方法的改良已广泛用于制药行业和学术研究中，以查明由于试剂中毒、神经毒性或基因操作而引起的神经功能变化。这里使用的筛查采用35种不同的测量方法来评估感觉运动、神经系统和自主神经系统功能⁷⁸。根据我们的初步数据，将Mito-LON的有效剂量(ED)指定为7.5μmol/kg(图24和25)。在8周的治疗果过程中，在测试的35个指标的任一个中(检测感觉运动，神经系统，运动和自主神经系统功能障碍)，在A/J小鼠中，在最高达50倍ED的条件下，对照组和Mito-LON处理的小鼠之间的体重(和器官重量)均未观察到任何显著差异(图22A-C)(参见附录)。通过组织病理学以及肝功能(AST和ALT血清水平)在神经(额叶皮层和小脑)或肌肉(骨骼肌，包括比目鱼肌，跖肌，腓肠肌，胫骨前肌和股四头肌)中均未观察到毒性作用(图22B和C)。因此，剂量最高达50倍ED的Mito-LON没有显示任何毒性。

使用后启动方案，Mito-LON对氨基甲酸乙烯酯(VC)诱导的肺癌发生的预防功效。我们评估了Mito-LON对A/J小鼠中VC诱导的肺部肿瘤的预防作用。在这项研究中使用了后启动方案，通过该方案，在VC一周后开始进行Mito-LON给药。通过口服管饲法给予Mito-LON，剂量15μmol/kg，5天/周，持续20周。我们显示，Mito-LON抑制了VC诱导的总肿瘤负荷中62％的肺肿瘤发展(图23)。此外，我们在Mito-LON处理的小鼠中未观察到任何体重变化。

Mito-LON在原位肺肿瘤小鼠模型中的抑制作用。我们使用裸鼠的肺腺癌(H2030BrM3细胞)原位模型进行了一项初步研究。将细胞(1×10⁶细胞/50μg生长因子减少的基质胶(Matrigel)在50μL RPMI-1640中)注入肺中。注射后一周，小鼠以相同剂量的LON或Mito-LON(7.5μmol/kg)或载剂(玉米油)经口服管饲进行处理，5次/周，连续3周。给予等摩尔剂量以说明Mito-LON相对于LON的效力显著增强。LON不能达到预期的效果，因为它的应用剂量(7.5μmol/kg)低于异种移植研究通常使用的剂量^16,18。相反，即使在非常低的剂量下，Mito-LON仍显著降低了肿瘤进展(>70％；图24A)和淋巴结转移(>50％；图24B)，表明其针对肺癌进展和转移的效力显著增强。用Mito-LON治疗的小鼠的H&E肝组织切片(4μm)(图24C，蓝色：核，粉红色：细胞质)未显示任何毒性的组织病理学迹象(增加的有丝分裂活性，嗜肾细胞浸润，脂肪变化，小叶中心充血或坏死)。

Mito-LON抑制Nod/Scid小鼠的肺癌脑转移。初步实验评估了Mito-LON及其相对于LON增强的效力对Nod/Scid小鼠的脑转移的影响，其中，通过心脏内插入注射表达荧光素酶的H2030BrM3细胞。为了确保注射的准确性和注射的细胞数量的精确性，我们使用高分辨率的超声心动图将针引导到左心室。在图25A中，可以清楚地看出针的位置。在注射后的多个时间使用IVIS 100成像系统对小鼠的荧光素酶表达进行成像(150μg/g D-荧光素)。手动在大脑上定义了感兴趣的区域，并使用LivingImage和Igor图像分析软件确定总光子通量。将H2030BrM3细胞移植到动脉循环中后一天(图19A)，通过口服管饲法给予LON或Mito-LON(每个7.5μmol/kg)，通过生物发光监测肿瘤的生长，并在终点测定离体GFP表达和H&E染色。H2030BrM3细胞迅速定居在大脑和小脑中(图25B)。在这种低剂量下的Mito-LON在抑制肺癌细胞的脑转移方面显示出显著的功效(图25B-C)，再次说明了Mito-LON的效力显著提高。

本公开中引用的每篇出版物，专利和专利公开均通过引用全文并入本文。本发明不受限于前述实施例，但涵盖落在权利要求范围内的全部修改形式和变化形式。