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CN111826318A - 一种铜绿微囊藻溶解菌及其应用 - Google Patents

一种铜绿微囊藻溶解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种铜绿微囊藻溶解菌及其应用，具体的，该菌株为耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，保藏名称为耐热芽孢杆菌Z‑1；本发明还优化了该菌株适用条件培养体系，探讨了其溶藻机理，研究了温度、投加菌液浓度、pH值等参数对溶藻效率的影响，经过测定该菌株对铜绿微囊藻具有很好的溶解和消除作用，主要是通过胞外产物发挥溶藻作用，在温度25～40℃，光照强度为1800～2200lux，光暗周期为10～15h∶10～15h，pH在6～9下处理铜绿微囊藻溶藻效率最高，可应用于铜绿微囊藻污染水体的治理。

Description

一种铜绿微囊藻溶解菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种铜绿微囊藻溶解菌及其对受藻类污染水体 的修复应用。
背景技术
水体富营养化引起藻类的大量繁殖，从而导致水华和赤潮的爆发，恶化了水质，影响了水 体的功能，甚至威胁到了饮用水的安全。藻类危害主要表现为：藻类大面积覆盖水面，引起水 质腐败，致使鱼类等窒息；许多蓝-绿藻可产生藻毒素，会造成人体神经系统的损伤，引起惊 厥、呼吸困难甚至呼吸衰竭，还有可能导致腹泻、呕吐以及对肝肾等器官的损害；影响水体透 明度、溶解氧等环境指标，导致水质恶化，影响水资源的合理利用。
藻类污染导致的生态问题逐渐引起了公众重视。目前常用的除藻方法主要有物理法、化学 法与生物法三种，物理方法不能从根本上解决问题并且成本较高；化学除藻法见效快，但是化 学药剂容易产生二次污染，对生态系统造成不利影响；微生物控藻技术是一种新兴生态修复技 术，具有高效、对环境安全、无污染等优势，应用前景广阔。
20世纪70年代，人们研究发现富营养化水体中藻类叶绿素的含量和溶藻菌的数量之间存 在较好相关性。筛选和应用溶藻菌已成为生物控藻领域一个较为活跃的研究方向。目前，已分 离的具有溶藻效应的细菌主要有弧菌、假单胞菌、交替单胞菌、芽孢杆菌和球菌等，其主要作 用对象包括蓝藻、甲藻和硅藻等淡水或海洋藻类。
铜绿微囊藻是我国富营养化水体中最常见的藻类之一，筛选一种高效的铜绿微囊藻溶解菌 并优化其培养应用技术体系，对于实现铜绿微囊藻污染的绿色生物防控至关重要，可助力于我 国水体富营养化绿色整治技术发展，具有广阔应用前景。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是针对水体藻类污染严重的问题，提供一种可应用于藻类污 染水体修复治理的微生物菌株。
具体的，本发明涉及一株溶解铜绿微囊藻的耐热芽孢杆菌Z-1，其特征是：该菌株为耐热 芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，保藏名称为Z-1溶藻菌，保藏单位为中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO:20070，保藏日期为2020年06月11日。
本发明还涉及一种微生物菌剂，其特征在于包含上述所述的耐热芽孢杆菌Z-1微生物菌株。
本发明还涉及一种耐热芽孢杆菌Z-1或含耐热芽孢杆菌Z-1的微生物菌剂在处理铜绿微囊 藻中的应用。
优选的，所述的耐热芽孢杆菌Z-1或含耐热芽孢杆菌Z-1的微生物菌剂在处理蓝藻水华治 理中的应用；所述蓝藻选自铜绿微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻的一种或多种。
优选的，本发明所述一种耐热芽孢杆菌Z-1或含耐热芽孢杆菌Z-1的微生物菌剂在处理铜绿 微囊藻中的应用，其特征在于：按照菌藻液体积比5％～10％向铜绿微囊藻水体中加入耐热芽孢 杆菌Z-1，在温度25～40℃，光照强度为1800～2200lux，优选为1800lux、1900lux、2000lux、 2100lux、2200lux；光暗周期为10～15h∶10～15h，优选为10～12h∶10～12h，pH在6～9下处理 铜绿微囊藻。
进一步优选的，耐热芽孢杆菌Z-1在应用前，可在温度为25～37℃，摇床转速为100～280r/min 条件下培养18～24h至对数生长期。
本发明还涉及上述所述的耐热芽孢杆菌Z-1的分离筛选方法，包括：
溶藻菌的筛选：将取自安徽省马鞍山市第二污水处理厂的活性污泥，静止去除上清，取 5mL活性污泥，接种至LB培养基中，置恒温培养箱中30℃，150rpm培养；再取5mL培养液 至新的LB培养基中培养；将培养好对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，置光照培 养箱中培养，温度为25℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h；每天摇动2次，观察微囊藻颜色的变化情况；如藻颜色变为黄绿色或黄白色，且瓶底有少量褐色沉淀，提示体系 中可能存在溶藻菌；
溶藻菌的分离：取存在溶藻菌体系中上清液1mL，用无菌蒸馏水按浓度梯度依次稀释， 取稀释好的样品100μL，玻璃棒均匀涂布在LB固体平板上，倒置放入30℃培养箱中培养，待 菌落长出后挑取外观形态差别较大的10个单菌落，并以同样的方法接种于固体LB培养基中 直到形成单一的纯化菌落，将其接种于斜面培养基并保存于4℃冰箱；
溶藻菌的初筛：将分别培养至对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，在温度为 30℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h条件下培养，观察藻类的生长状况，变黄 的藻类样品所对应的菌株，初步筛选为溶藻菌；
溶藻菌的复筛：将培养至对数生长期的初筛菌株按10％的菌藻液体积比接入液体培养的微 囊藻中，并设置加相同体积培养基作为对照组，其他处理条件均相同；；每天观察水体颜色变 化，微囊藻是否黄化，藻体是否凝集；如果接入菌液后与对照组相比如水体出现黄化现象，藻 细胞有所减少，将该细菌定义为有溶藻作用；一段时间内微囊藻出现黄化现象，与对照组相比 较微囊藻细胞密度明显降低，甚至藻细胞消失，但一段时间后又开始繁殖的视为有抑制作用但 不完全；
铜绿微囊藻的叶绿素a的测定：在藻-菌共培养实验中选取叶绿素a作为铜绿微囊藻的生 长指标，主要操作为：取一定体积的藻液(V1)于5,000rpm室温离心10min，收集菌体后 反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；用一定体积的95％乙醇(V2)重悬，置于4℃冰箱过夜；5,000rpm室温离心10min，上清液于波长665nm、649nm、750nm处 测定吸光值，计算叶绿素a的含量，根据叶绿素a的含量计算溶藻率，溶藻率最高的菌株为 耐热芽孢杆菌Z-1。
更具体的，耐热芽孢杆菌Z-1按照实施例1所述方法分离筛选得到。
所述溶藻菌经过溶藻机理的探索，溶藻菌滤液和菌体都可以溶藻，所以Z1的溶藻方式属 于释放杀藻物质间接溶藻的途径。
所述溶藻菌还可以对实验室培养的铜绿微囊藻具有较好的溶藻效果，其溶藻效率随环境条 件不同会发生改变。
本发明的溶藻细菌对包括鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻在内的大多数水华蓝藻均有非常好 的杀伤效果，该溶藻细菌在18-35℃范围内均具有较好的溶藻效果，能够适应水华发生的自然 条件，可考虑在实际水华治理中的应用。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1是实施例1不同溶藻菌株溶藻率；
图2是实施例3不同温度条件下Z-1菌株对铜绿微囊藻的溶藻率；
图3是实施例4不同浓度Z-1菌株对铜绿微囊藻的溶藻率；
图4是实施例5不同pH值条件下Z-1菌株对铜绿微囊藻的溶藻率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。所描述的实施例及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：耐热芽孢杆菌Z-1的分离筛选及鉴定
1.实验材料
安徽省马鞍山市第二污水厂活性污泥
所用铜绿微囊藻购买于中国科学院武汉水生所，藻种经活化后，在25℃，光照强度为2000lx 及光暗比为12h:12h条件下培养。
2.培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L。
培养藻BG11培养基：
Figure BDA0002608972030000041
3.溶藻菌的筛选将取自安徽省马鞍山市第二污水处理厂的活性污泥，静止去除上清，取 5mL活性污泥，接种至LB培养基中，置恒温培养箱中30℃，150rpm培养。再取5mL培养液 至新的LB培养基中培养。将培养好对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，置光照培 养箱中培养，温度为25℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h。每天摇动2次，观察微囊藻颜色的变化情况。如藻颜色变为黄绿色或黄白色，且瓶底有少量褐色沉淀，提示体系 中可能存在溶藻菌。
4.溶藻菌的分离取存在溶藻菌体系中上清液1mL，用无菌蒸馏水按浓度梯度依次稀释， 取稀释好的样品100μL，玻璃棒均匀涂布在LB固体平板上，倒置放入30℃培养箱中培养，待 菌落长出后挑取外观形态差别较大的10个单菌落，并以同样的方法接种于固体LB培养基中 直到形成单一的纯化菌落，将其接种于斜面培养基并保存于4℃冰箱。
5.溶藻菌的初筛将分别培养至对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，在温度为30℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h条件下培养，观察藻类的生长状况，变黄 的藻类样品所对应的菌株Z-1，Z-3，Z-7，Z-8，初步筛选为溶藻菌。
6.溶藻菌的复筛将培养至对数生长期的4株初筛菌株按10％的菌藻液体积比接入液体 培养的微囊藻中，并设置未加菌液的作为对照。每天观察水体颜色变化，微囊藻是否黄化，藻 体是否凝集。如果接入菌液后与对照组相比如水体出现黄化现象，藻细胞有所减少，将该细菌 定义为有溶藻作用；一段时间内微囊藻出现黄化现象，与对照组相比较微囊藻细胞密度明显降 低，甚至藻细胞消失，但一段时间后又开始繁殖的视为有抑制作用但不完全。
7.铜绿微囊藻的叶绿素a的测定在藻-菌共培养实验中选取叶绿素a作为铜绿微囊藻 的生长指标，主要操作为：取一定体积的藻液(V1)于5,000rpm室温离心10min，收集菌体后反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；用一定体积的95％乙醇(V2) 重悬，置于4℃冰箱过夜；5,000rpm室温离心10min，上清液于波长665nm、649nm、750nm 处测定吸光值，根据下列公式计算叶绿素a的含量：
Chl-a(mg/L)＝[(A665-A750)×13.7-(A649-A750)×5.76]V2/V1
根据叶绿素a的含量计算溶藻率，如图1所示菌株Z-1溶藻率最高。
8.溶藻菌株的鉴定
将菌株Z-1接种于LB液体培养基上，于30℃、180rpm条件下培养48h。将所述菌株离心 收集菌体，采用细菌提取试剂盒提取细菌基因组DNA，并采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和引物1492R(5′-CGGGCGGTGTGTACAAG-3′)进行测序。在 GenBank中经NCBI Blast检索比对，本发明的菌株Z-1与Bacillus sporothermodurans的相似 度达到99％。根据菌株Z-1的形态特征和生理生化特征及16S rDNA基因序列特征，鉴定菌株 Z-1为耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，命名为Bacillus sporothermoduransZ-1。
实施例2溶藻方式的探讨
将液体培养的Z-1培养物1200r/min离心，将菌体与上清分离，取上清液用孔径为0.22nm 的微孔滤膜过滤，菌体经无菌蒸馏水洗两遍，取滤液按10％的体积比接入液体培养的微囊藻中， 同时取菌体加入培养好的微囊藻中，设置空白藻液作为对照。每天观察水体颜色变化，微囊藻 是否黄化，藻体是否凝集。同时对各组铜绿微囊藻的叶绿素a进行测定。
实验发现单独菌体与藻液的实验组，藻生长状况良好，而菌体上清液与菌液实验组，在处 理后第三天藻逐渐变黄，出现一定的凝集现象，底部可见褐色沉淀。
其中空白对照组叶绿素a的含量为2.6mg/L，菌液为0.6mg/L，上清液为0.7mg/L，菌体为 2.3mg/L。用菌体培养液的上清液处理后叶绿素a含量最低，说明抑制藻类生长的物质属于胞 外产物，溶藻方式属于释放杀藻物质间接溶藻的途径。
实施例3温度对溶藻效果的影响
温度是菌株生长代谢和能量代谢的重要环境条件，对菌株的溶藻效率影响很大，在应用过 程中确定最适的温度范围是保证菌株发挥最大潜力的关键。将培养好的菌体按5％的比例接种 微囊藻，分别放置在20℃、30℃、35℃、40℃的光照培养箱中，如图2所示一周后测定各实 验组的溶藻率分别为30％、64％、88％、83％。
结果显示温度在35℃左右溶藻效率最高，在实际应用过程中富营养化藻类的爆发一般发 生在温度较高的夏季，水温基本都在30℃以上，可以更好地发挥溶藻菌的潜力。
实施例4不同浓度菌液对溶藻效果的影响
本实例处理100mL新鲜的铜绿微囊藻，首先将菌株Z-1在温度为30℃，摇床转速为150r/min条件下培养24h至对数生长期，然后按照2％、5％、10％的菌藻液体积比接入100mL微囊藻中，并设置加LB培养基作为对照组。将体系放置在温度为35℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h条件下培养，一周后测定溶藻率。经过上述方法处理的藻液，如图3所示7d后溶藻率分别为60％、85％、90％。说明菌液投加量体积比为10％溶藻效果较好。
实施例5不同pH对溶藻效果的影响
pH是菌株生长代谢的重要环境条件，不同的pH会对菌株的溶藻效果产生影响。本实例 对不同pH条件下对溶藻效果进行了测试，分别培养了在pH为5、6、8、9、10条件下的铜绿 微囊藻，结果在pH为5和10条件下微囊藻的生长状况不佳。取pH为6、8、9条件下生长状况较好的藻液进行溶藻菌的测试。取新鲜培养的不同pH条件培养下的藻液100mL，取培养至对数生长期的Z-1菌株按照10％的菌藻液体积比接入100mL不同pH的藻液中，设置并设置无菌水作为空白对照。将体系放置在温度为35℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h∶12h条件下培养，一周后测定溶藻率。经过上述方法处理的藻液，如图4所示pH为6、8、9条 件下7d后溶藻率分别为72％、91％、90％。说明该菌株可适用于广泛的pH水体中，可用于藻 类污染的修复。

Claims (7)

1.一株溶解铜绿微囊藻的耐热芽孢杆菌Z-1，其特征是：该菌株为耐热芽孢杆菌(Bacillus sporothermodurans)，保藏名称为Z-1溶藻菌，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京，保藏编号为CGMCC NO:20070，保藏日期为2020年06月11日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于包含有权利要求1所述的耐热芽孢杆菌Z-1微生物菌株。
3.一种耐热芽孢杆菌Z-1或含耐热芽孢杆菌Z-1的微生物菌剂在处理铜绿微囊藻中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的耐热芽孢杆菌Z-1或含耐热芽孢杆菌Z-1的微生物菌剂在处理蓝藻水华治理中的应用；所述蓝藻选自铜绿微囊藻、鱼腥藻、拟柱孢藻和微囊藻的一种或多种。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：按照菌藻液体积比5％～10％向铜绿微囊藻水体中加入耐热芽孢杆菌Z-1，在温度25～40℃，光照强度为1800～2200lux，光暗周期为10～15h∶10～15h，pH在6～9下处理铜绿微囊藻。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：耐热芽孢杆菌Z-1在应用前，可在温度为25～37℃，摇床转速为100～280r/min条件下培养18～24h至对数生长期。
7.一种权利要求1所述的耐热芽孢杆菌Z-1的分离筛选方法，包括：
溶藻菌的筛选：将取自安徽省马鞍山市第二污水处理厂的活性污泥，静止去除上清，取5mL活性污泥，接种至LB培养基中，置恒温培养箱中30℃，150rpm培养；再取5mL培养液至新的LB培养基中培养；将培养好对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，置光照培养箱中培养，温度为25℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h；每天摇动2次，观察微囊藻颜色的变化情况；如藻颜色变为黄绿色或黄白色，且瓶底有少量褐色沉淀，提示体系中可能存在溶藻菌；
溶藻菌的分离：取存在溶藻菌体系中上清液1mL，用无菌蒸馏水按浓度梯度依次稀释，取稀释好的样品100μL，玻璃棒均匀涂布在LB固体平板上，倒置放入30℃培养箱中培养，待菌落长出后挑取外观形态差别较大的10个单菌落，并以同样的方法接种于固体LB培养基中直到形成单一的纯化菌落，将其接种于斜面培养基并保存于4℃冰箱；
溶藻菌的初筛：将分别培养至对数生长期的菌液加入到培养的铜绿微囊藻中，在温度为30℃，光照强度为2000lux，光暗周期为12h:12h条件下培养，观察藻类的生长状况，变黄的藻类样品所对应的菌株，初步筛选为溶藻菌；
溶藻菌的复筛：将培养至对数生长期的初筛菌株按10％的菌藻液体积比接入液体培养的微囊藻中，并设置加相同体积培养基作为对照组，其他处理条件均相同；每天观察水体颜色变化，微囊藻是否黄化，藻体是否凝集；如果接入菌液后与对照组相比如水体出现黄化现象，藻细胞有所减少，将该细菌定义为有溶藻作用；一段时间内微囊藻出现黄化现象，与对照组相比较微囊藻细胞密度明显降低，甚至藻细胞消失，但一段时间后又开始繁殖的视为有抑制作用但不完全；
铜绿微囊藻的叶绿素a的测定：在藻-菌共培养实验中选取叶绿素a作为铜绿微囊藻的生长指标，主要操作为：取一定体积的藻液(V1)于5,000rpm室温离心10min，收集菌体后反复冻融3次，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；用一定体积的95％乙醇(V2)重悬，置于4℃冰箱过夜；5,000rpm室温离心10min，上清液于波长665nm、649nm、750nm处测定吸光值，计算叶绿素a的含量，根据叶绿素a的含量计算溶藻率，溶藻率最高的菌株为耐热芽孢杆菌Z-1。
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