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CN111812066A - 基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途 - Google Patents

基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途 Download PDF

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CN111812066A CN201910285607.1A CN201910285607A CN111812066A CN 111812066 A CN111812066 A CN 111812066A CN 201910285607 A CN201910285607 A CN 201910285607A CN 111812066 A CN111812066 A CN 111812066A
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梁敏东
王为善
刘家坤
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East China University of Science and Technology
Institute of Microbiology of CAS
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Abstract

本发明涉及包含别构转录因子和CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、组合物、试剂盒及其相关的方法和用途。所述生物传感器的机理在于，采用别构转录因子与CRISPR/Cas12a介导的小分子检测工具，通过目标小分子与别构转录因子的结合使得别构转录因子与双链DNA的亲和力发生变化以及采用CRISPR/Cas12a的顺式切割活性和/或反式单链DNA切割活性，对dsDNA探针和/或ssDNA探针进行切割，将目标小分子信号转变为相应的光信号。本发明的生物传感器、组合物、试剂盒及其相关的方法在体外检测小分子时不仅能节约时间和成本，而且灵敏度高并具有高通量检测的潜力。

Description

基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子 检测中的用途
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及借助于别构转录因子(allosterictranscription factor，aTF)与CRISPR/Cas12a系统，通过CRISPR/Cas12a的顺式切割切割和反式切割活性将小分子信号转化为光信号的生物传感器、组合物和试剂盒，以及使用其的体外(in vitro)检测小分子的方法。
背景技术
小分子检测之所以如此重要，主要体现在临床诊断、药物研发、食品安全以及环境监测等各个领域的应用。例如，尿酸作为嘌呤代谢终产物，一般在机体内的生成与排出处于动态平衡，过多积累则影响人体细胞的正常功能。其中，高尿酸血症和痛风肾病等都是以尿酸作为指标，是检测方面的生物标志物，在疾病监测领域发挥重要作用。对羟基苯甲酸(p-HBA)因其在真菌及细菌方面的抑制作用，广泛应用于食品防腐剂、药物合成及化妆品领域的使用，一旦超标危害同样巨大。因此开发新的小分子检测方法至关重要。
对样品中小分子的有效检测，在环境污染监控、食品质量控制和疾病诊断等领域都极为重要。现有技术中的小分子检测方法主要分为两大类：理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法主要通过波谱法、色谱法及其联用技术。这些技术分离效能高、选择性好、定性和定量能力强。然而，其样品制备过程复杂，仪器价格昂贵，耗时长。即便熟练的操作人员也需要较长时间才能得到结果，且不适用于现场分析。
生物分析方法通常借助体内固有的小分子与蛋白/核酸的特异性相互作用，在较小的体系或芯片上实现信号的生成、放大、信号转换和读出。这样的方法能够实现现场、实时检测。特别地，通常通过模拟激动剂/拮抗剂-受体、或者抗原-抗体相互作用对，利用与小分子相互作用的受体或抗体对小分子进行抓取。或者，通过筛选或进化获得能够与小分子特异性相互作用的核酸(例如适体)，实现对小分子的特异性识别。随后，通过抗体级联放大、石英晶体微量天平等方式，将此类相互作用的信号转化并放大为光/显色/电化学信号，从而读出小分子的定性或定量的信息。
为了扩大能够分析的小分子的范围，已经提出利用别构转录因子与其靶DNA片段以及效应物小分子的相互作用，将小分子的有无或浓度等信息转换为别构转录因子-靶DNA-小分子三者相互作用的结合信号。目前最新报道的aTF-NAST(aTF-based nicked DNA-template-assiated signal transduction)等系统进一步提高了尿酸和对羟基苯甲酸的灵敏度，但是样品分析周期长，成本高，难以实现快速，批量检测。因此，目前本领域仍然急需建立一种简单、快速、灵敏度高、特异性强以及适合于高通量体外检测小分子化合物的方法。
CRISPR/Cas系统是细菌及古细菌在RNA引导下利用Cas蛋白抵御外源核酸入侵的过程中演化而来的一种获得性免疫防御机制。1978年首次报道了一种功能未知的成簇的重复DNA序列，直至2001年正式命名为成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspersed Palindromic Repeats，CRISPR)。随着近年来科研工作者的不懈探索，对CRISPR系统的分类和作用机制等得到初步解析并且已广泛应用于基因编辑、DNA组装以及基因表达调控等各个领域。
根据Cas(CRISPR-associated proteins，CRISPR相关蛋白)基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR/Cas系统被分为了2类5型；1类CRISPR/Cas系统利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因；2类CRISPR/Cas系统利用单一的效应蛋白抵御外源核酸的入侵，因其简单高效受到广泛关注。其中，Cas9和Cas12a(也称为Cpf1)作为2类CRISPR/Cas系统的典型，已成功应用于原核/真核细胞基因编辑和基因调控领域。近期基于Cas12a的反式切割活性，Doudna团队开发的“DETECTR”(DNAendonuclease targeted CRISPR trans reporter)以及赵国屏团队表征的“HOLMES”(an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)的诊断系统，进一步推进了CRISPR/Cas12a系统在核酸检测领域的应用前景。但是目前仍未有将CRISPR/Cas系统用于检测小分子化合物的相关报道。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种用于检测小分子的生物传感器，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，
A：所述识别元件包含别构转录因子(aTF)和激活双链DNA(激活dsDNA)，所述激活dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点(即，原型间隔区邻近基序，PAM)以及与向导RNA至少部分互补的序列，以及
所述换能元件包含所述CRISPR/Cas12a系统以及单链DNA探针(ssDNA探针)，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白和所述向导RNA(gRNA)，所述ssDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团；
或者
B：所述识别元件包含别构转录因子(aTF)和双链DNA探针(dsDNA探针)，所述dsDNA探针包含所述别构转录因子的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA(gRNA)至少部分互补的序列，并且所述dsDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团，以及
所述换能元件包含所述CRISPR/Cas12a系统，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述gRNA。
在本发明的实施方式中，当所述生物传感器与目标小分子接触后，所述aTF与目标小分子的结合使得所述别构转录因子与所述激活dsDNA和/或dsDNA探针的结合亲和力升高或降低，从而使游离形式的激活dsDNA和/或dsDNA探针减少或增加；所述游离形式的激活dsDNA作为激活剂与CRISPR/Cas12a蛋白和所述gRNA形成三元复合物，从而激活CRISPR/Cas12a蛋白的反式ssDNA切割活性，使得ssDNA探针被切割并产生可检测的光信号，或者，所述游离形式的dsDNA探针被所述gRNA识别并被CRISPR/Cas12a蛋白通过顺式切割活性进行切割，从而产生可检测的光信号；通过所产生的光信号，可以对所述目标小分析的存在和/或含量进行检测。
在第二方面，本发明提供了一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的生物传感器。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含用于对光信号进行检测的检测元件。
在第三方面，本发明提供了一种对样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括：将所述样品与第一方面所述的生物传感器接触，以生成光信号，以及对所产生的光信号进行检测，从而检测所述样品中的小分子。
在第四方面，本发明提供了一种用于对小分子进行检测的组合物，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中，
A：所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和激活双链DNA(激活dsDNA)，所述激活dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列，以及
所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统和单链DNA探针(ssDNA探针)，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)，所述ssDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团；
或者
B：所述识别试剂包含aTF和双链DNA探针(dsDNA探针)，所述dsDNA探针包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA(gRNA)至少部分互补的序列，并且所述dsDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团，以及
所述换能试剂包含CRISPR/Cas12a系统，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述gRNA。
在第五方面，本发明提供了一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含第五方面所述的组合物。
在第六方面，本发明提供了一种用于对小分子进行检测的方法，所述方法包括使用第五方面所述的组合物或第六方面的试剂盒与待测样品接触，以生成光信号，以及对所产生的光信号进行检测，从而检测所述小分子。
第七方面，本发明提供了第一方面所述的生物传感器、第四方面所述的组合物和第二方面或第五方面所述的试剂盒在检测小分子方面的用途。
有益效果
相比传统的小分子检测方法，本发明采用aTF与CRISPR/Cas12a介导的小分子检测工具(CRISPR/Cas12a-and aTF-mediated small molecule detector，简称为“CaT-SMelor”)，通过目标小分子与aTF的结合使得aTF与双链DNA的亲和力变化以及CRISPR/Cas12a的顺式切割活性和反式单链DNA切割活性，对dsDNA探针和/或ssDNA探针进行切割，将目标小分子信号转变为相应的光信号，而不涉及aTF-靶DNA结合的DNA转录调控过程。本发明所述的检测方法不仅操作简便、节约时间(至多25分钟，甚至只需要5-10分钟)和节约成本(每次反应只需不到2元)，而且灵敏度高(检测极限降至nM级)、准确度高以及反应体系小(例如，血液样品仅需1μL)，可于96孔板或384孔板上进行操作，因此适合于诊断目的和非诊断目的的高通量精确检测。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施方式，利用本发明的生物传感器进行小分子检测的原理示意图。在本实施方式中，为了便于后续操作和提高检测灵敏度，对aTF进行了固定化。具体而言，将aTF与纤维素结构域(CBD)融合表达，然后将融合蛋白aTF-CBD与微晶纤维素(MC)混合使其固定在MC上；融合蛋白aTF-CBD与激活dsDNA结合形成aTF-CBD-DNA复合物；小分子与aTF的结合导致aTF变构效应，使得激活dsDNA从aTF上脱离，得到游离形式的激活dsDNA(也称为“游离dsDNA”)；将游离形式的激活dsDNA加入CRISPR/Cas12a系统和ssDNA探针(报告子：FQ标记的ssDNA)中，游离的激活dsDNA激活CRISPR/Cas12a系统并使其反式切割探针，使得发出光信号(荧光信号)；然后对光信号进行检测。根据本发明的实施方式，使用的血液样品需求量较少(～1μL)，而且反应体系体积少，可在96/384孔板上进行操作。使用酶标仪等常用仪器检测光信号，从而实现对小分子的定性/定量分析。
图2为说明根据本发明的实施方式，通过凝胶阻滞实验(EMSA)对实施例1-实施例2中制备的融合蛋白CBD-aTF(CBD-HucR、CBD-HosA和CBD-TetR)与dsDNA的结合能力，以及在存在特定小分子的情况下CBD-aTF-dsDNA的解离的图。图2A：融合蛋白CBD-HosA、CBD-HucR和CBD-TetR的结构示意图。别构转录因子HucR、HosA和TetR与CBD之间通过接头连接(所述接头的氨基酸序列可如SEQ ID NO：12所示)；为了便于纯化和识别，融合蛋白上还具有His标签。图2B-图2C：示出了在不存在或存在尿酸的情况下，融合蛋白CBD-HucR与激活dsDNA(dsDNA(HucR))的结合的图(采用EMSA测量)。图2D-图2E：示出了在不存在或存在四环素的情况下，融合蛋白CBD-TetR与激活dsDNA(dsDNA(TetR))的结合的图(采用EMSA测量)。图2F-图2G：示出了在不存在或存在对羟基苯甲酸(p-HBA)的情况下，融合蛋白CBD-HosA与激活dsDNA(dsDNA(HosA))的结合的图(采用EMSA测量)。
图3为示出了根据本发明的一个实施方式，使用本发明实施例1-实施例2的生物传感器检测靶小分子的图表。图3A：示出了使用本发明实施例1-实施例2的生物传感器检测小分子的流程图。图3B：示出了在存在500μM尿酸及其结构类似物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤)的情况下，融合蛋白CBD-HucR与激活dsDNA(dsDNA(HucR))的结合的图(采用EMSA测量)。图3C：示出了以500μM尿酸(UA)及其结构类似物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤)作为样品，使用本发明实施例1的尿酸生物传感器所检测到的荧光强度的图表，其中，以40nM游离的激活dsDNA(dsDNA(HucR))作为阳性对照(PC)。图3D：示出了在存在1.8mM对羟基苯甲酸(p-HBA)及其结构类似物(酪醇(Tyrosol，也称为“对羟苯基乙醇”)、对氨基苯甲酸(p-ABA)、对羟基苯甲酸甲酯(p-MHB)、对羟基苯甲醇(p-HBnOH))的情况下，融合蛋白CBD-HosA与激活dsDNA(dsDNA(HosA))的结合的图(采用EMSA测量)。图3E：示出了以1.8mM p-HBA及其结构类似物(Tyrosol、p-ABA、p-MHB、p-HBnOH)作为样品，使用本发明实施例2的p-HBA生物传感器所检测到的荧光强度的图表，其中，以40nM游离的激活dsDNA(dsDNA(HosA))作为阳性对照(PC)。
图4为示出了根据本发明的实施方式，使用本发明实施例1-实施例2的生物传感器对靶小分子进行检测的图表。图4A：不同浓度的激活dsDNA对荧光强度变化的影响的检测结果，并且取荧光值线性增加区间的斜率，以激活dsDNA浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标计算出表示激活dsDNA线性检测范围的回归方程。图4B：不同浓度的尿酸对荧光强度变化的影响的检测结果，并且取荧光值线性增加区间的斜率，以尿酸浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标计算出尿酸的线性检测范围为25-500nM。图4C：不同浓度的p-HBA对荧光强度变化的影响的检测结果，并且取荧光值线性增加区间的斜率，以p-HBA浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标计算出p-HBA的线性检测范围为9-180nM。
图5为示出了根据本发明的实施方式，与传统尿酸浓度测量方法(HPLC以及Backman试剂盒)相比，使用本发明实施例1的尿酸生物传感器对人血液样品中的尿酸浓度进行测定的图表。图5A：示出了使用本发明的尿酸生物传感器与HPLC方法检测人血液样品的尿酸的图表。图5B：示出了使用本发明的尿酸生物传感器与临床上使用的Backman试剂盒检测人血液样品中的尿酸的图表。图5C：示例性地说明了在血液样品分析中使用本发明的生物传感器的流程图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明利用本发明采用CaT-SMelor，通过目标小分子与aTF的结合使得aTF与双链DNA的亲和力变化以及CRISPR/Cas12a的顺式切割活性和反式单链DNA切割活性，对dsDNA探针和/或ssDNA探针进行切割，将目标小分子信号转变为相应的光信号，实现对小分子的定性检测。进一步，本发明人发现，对于目标小分析而言，在一定浓度范围内，所产生的荧光曲线斜率的变化与小分子的浓度成正比，因此通过对含有目标小分子的样品的荧光曲线斜率进行测量可实现对样品中目标小分子的精确定量检测。
组合物
本发明提供了一种用于对小分子进行检测的组合物，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中，
所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列；以及所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统，
其中，所述组合物中还含有发光/生色基团。
在一个实施方式中，所述换能试剂进一步包含单链DNA(ssDNA)。
具体而言，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)。
在本发明的具体实施方式中，所述dsDNA可作为激活dsDNA，或dsDNA探针。在另一实施方式中，所述ssDNA也可作为探针使用。在作为探针使用的情况中，所述dsDNA探针或ssDNA探针的两端可缀合有发光/生色基团及其淬灭基团。
在一个实施方式中，本发明的组合物包含识别试剂和换能试剂，所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和激活双链DNA(激活dsDNA)，所述激活dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列，以及
所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统和单链DNA探针(ssDNA探针)，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)，所述ssDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团。
在另一实施方式中，本发明的组合物包含识别试剂和换能试剂，所述识别试剂包含aTF和双链DNA探针(dsDNA探针)，所述dsDNA探针包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA(gRNA)至少部分互补的序列，并且所述dsDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团，以及
所述换能试剂包含CRISPR/Cas12a系统，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述gRNA。
在本发明的实施方式中，本发明的组合物可处于生物传感器的形式。
生物传感器
生物传感器(biosenser)通常被认为是对生物材料(如组织、微生物细胞、细胞器、细胞受体、酶、抗体、核酸等)或生物衍生材料或生物模拟材料进行分析的一类器件，它将生物材料等与物理化学传感器或传感微系统(可以是光学的、电化学的、热学的、压电的或磁学的)密切结合或联系起来，能够产生间断或连续的信号(光信号、电信号等)，信号强度与被分析物成比例(例如线性关系)，从而行使分析功能。在本领域中，生物传感器具有通用的定义，通常由两部分构成：识别元件(又称为分子识别元件)和换能元件(又称为换能器)。在本文中，术语“生物传感器”即指包含识别元件和换能元件的器件或设备，也称为“生物传感平台(biosening platform)”。不受理论地束缚，本文所述的生物传感器可包括进一步提高检测灵敏度的放大元件和/或直接进行检测的检测元件。此外，本文所述的生物传感器并不限于具体的形式，只要包含下面描述的识别元件和换能元件的任何形式均包含在本文术语“生物传感器”的范围内。
识别试剂或识别元件
识别元件是生物传感器的关键元件，其识别待分析物，发生生物学反应，直接决定传感器的功能与质量。在本文中，所述识别元件包含aTF和激活dsDNA，或者aTF和dsDNA探针。
本发明所使用的术语“别构转录因子”具有本领域公知的含义。为适应外界环境的改变并及时做出应答，微生物进化出别构蛋白aTF作为感知环境的重要输入元件，aTF通常包含一个DNA结合结构域(DBD)和效应物结合结构域(EBD)，其中效应物的结合改变aTF与靶基因序列的结合，从而调控相关基因的表达，快速响应外界的变化。根据aTF序列相似性以及结构和功能的不同，可分为不同家族如AraC、LacI、TetR等，这些aTF往往能够特异性感知各类小分子化合物，对于维持新陈代谢的稳定发挥重要作用。
别构转录因子包含与效应物(通常为小分子)结合的结构域(EBD)以及DNA结合结构域(DBD)，其与效应物的结合引起构象改变，使得该别构转录因子和与其特异性相互作用的DNA片段(天然状态下通常为启动子操纵序列)的结合亲和力发生改变，从而增强或减弱由该操纵序列控制的DNA序列的转录(Nat Methods.2016，13(2)：177-183)，通过这样的方式使得基因的转录依赖于小分子的浓度。在原核生物中，操纵序列通常出现在与代谢有关的操纵子或报告基因的上游；别构转录因子常常起到针对细胞内效应物小分子的传感器的作用，反馈小分子的浓度信息，从而对细胞内的生物合成途径进行动态调控。在真核生物中，此类别构转录因子常存在于控制细胞分化与个体发育的通路中。鉴于本发明中别构转录因子与DNA的相互作用发生在体外，原核和真核来源的别构转录因子均可作为本发明的识别元件。在本发明中，转录因子结合位点也称为转录因子作用位点、转录因子操作位点或转录因子结合基序。不希望被理论所限地，转录因子作用位点通常为互补的双链DNA。此外，本领域技术人员应当知晓，转录因子作用位点附近存在单个3',5'-磷酸二酯键断裂(缺口)不影响别构转录因子与其作用位点的结合。
天然转录系统中转录因子作用位点的序列是已知的。不同物种的转录因子结合位点长度略有不同。转录因子结合位点在大肠杆菌中的平均长度为24.5bp，在果蝇中为12.5bp(J Mol Biol.1998，284(2)：241-54；Nucleic Acids Res.2003，31(1)：374-8)。在本发明中，转录因子作用位点的长度优选10-40bp、更优选15-25bp、最优选17-19bp。与别构转录因子作用的DNA片段并不限于在天然系统中存在的别构转录因子作用位点。通过对作用位点序列进行随机或定向突变，或者结合计算机模拟选出数条候选序列并验证别构转录因子与各DNA片段的结合能力是本领域成熟的技术(Mol Microbiol.2005，55(3)：712-23.)。另外，也可对别构转录因子的小分子结合结构域和/或DNA结合结构域进行突变，优化别构转录因子与小分子和/或DNA的结合亲和力。可通过定向突变和进化，提高别构转录因子和与该别构转录因子作用的DNA片段之间的平衡解离常数和/或降低别构转录因子与小分子之间的平衡解离常数，进一步提高本发明传感器的灵敏度。
如上所述，别构转录因子与小分子的结合可使得所述别构转录因子与靶dsDNA片段(即包含别构转录因子作用位点的DNA片段，在本文中也称为“激活dsDNA”或“dsDNA探针”)的结合亲和力升高(激活系统)或降低(阻遏系统)。在一些实施方式中，本发明的别构转录因子为激活系统的别构转录因子。在该系统中，别构转录因子与效应物小分子的结合使得其与靶dsDNA的结合亲和力增强(即，小分子的结合使得别构转录因子能够结合于靶dsDNA片段)，从而使游离的靶dsDNA(即未与别构转录因子结合的靶dsDNA)的量减少。优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合后形成的转录因子-小分子复合体与所述靶dsDNA片段结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述靶dsDNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子-小分子复合体与靶dsDNA片段结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与所述靶dsDNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。在一些实施方式中，本发明的别构转录因子为阻遏系统的别构转录因子。在该系统中，别构转录因子与效应物小分子的结合使得其与靶dsDNA的结合亲和力减弱(即，小分子的结合使得别构转录因子从其作用位点处脱离，游离的靶dsDNA的量增加)。优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数大于所述别构转录因子与所述靶dsDNA片段结合的平衡解离常数；优选地，所述别构转录因子与所述小分子结合的平衡解离常数是所述别构转录因子与本发明的别构转录因子为所述靶dsDNA片段结合的平衡解离常数的10-10000倍、优选20-5000倍、更优选50-1000倍。在一些实施方式中，所述别构转录因子和靶dsDNA作为组合物或结合成复合体提供。在另一些实施方式中，所述别构转录因子和靶dsDNA作为单独的化合物提供。应当特别指出的是，虽然在本发明的具体实施例中仅采用阻遏系统的别构转录因子，但是其仅仅是说明性的，而基于本申请的教导，本领域技术人员可根据实际需要采用不同的别构转录因子(例如其它的阻遏系统的别构转录因子或者激活系统的别构转录因子)来实施本发明。
本发明的生物传感器、组合物、试剂盒和方法可用于诊断用途或非诊断用途、或者非临床用途，例如用于环境污染监控、食品和化妆品质量控制和疾病诊断。在本发明中，作为检测对象的小分子为使得别构转录因子构象变化的效应物。一般而言，小分子的特征在于它具有大于约50道尔顿但小于约5000道尔顿(5kD)的分子量。优选小分子具有小于1kD的分子量。在本发明中，小分子可为例如环境指标、疾病指标或健康指标，包括但不限于重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物等。小分子可存在于环境中或为细菌、真菌、植物或动物源性，或者为人工合成。甚至对于不存在相对应的别构转录因子的效应物小分子，本领域技术人员能够通过计算机模拟设计将效应物结合结构域添加至DNA结合结构域，或改造天然转录因子的效应物结合结构域，构建人工的别构转录因子(NatMethods.2016，13(2)：177–183)。
在本发明中，待检测的小分子可存在于任何液体样品或可通过适当操作转换为液体样品的固体样品中。样品可为环境样品，例如为地下水、中水、海水、废水、采矿废料的样品。或者，样品可为生物样品，特别是来自受试者的样品，例如以下样品中的一种或多种：血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液。样品也可来自于食品、饮用水、化妆品或饲料。
在一些实施方式中，可对样品进行预处理，从而对待检测的小分子进行富集和提取，或者去除可能干扰检测的杂质。例如，可通过离心、过滤、超声、匀浆化、加热、冷冻、解冻、机械处理或多种操作方法的组合，和/或加入预处理的试剂。本领域技术人员知晓针对特定样品的常见预处理方法和预处理试剂。例如，常用的预处理试剂包括表面活性剂和洗涤剂、盐、细胞裂解剂、抗凝血剂、降解酶(例如蛋白酶、脂酶、核酸酶、脂肪酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶等)以及溶液(例如缓冲液)等。
表1列出了多种别构转录因子、与其相互作用的DNA序列及对应的效应物小分子。本领域技术人员能够理解的是，用于本发明的别构转录因子并不限于所列举的这些。另外，也可对与所列举的别构转录因子相互作用的DNA序列的一个或多个碱基进行替换、删除或加入一个或多个碱基，从而改变别构转录因子和与其相互作用的DNA序列的结合强度。
表1：示例性的别构转录因子、与其相互作用的DNA序列以及所对应的效应物
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Figure BDA0002023167970000071
在本发明的一些实施方式中，所述识别元件包含可固定在介质上的别构转录因子和/或可固定在介质上的激活dsDNA或dsDNA探针。在一些实施方式中，所述识别元件包含可固定在介质上的别构转录因子。在一些实施方式中，所述识别元件包含可固定在介质上的激活dsDNA或dsDNA探针。在一些实施方式中，所述识别元件包含可固定在介质上的别构转录因子和可固定在介质上的激活dsDNA或dsDNA探针。术语“介质”是指支撑各个元件并为各个元件提供反应空间从而便于携带、运输、包装或操作的物质。本领域技术人员通常通过固定化技术将需要固定的元件固定在介质上，例如吸附法、共价键合法、物理包埋法和交联法等本领域通常使用的方法。介质的实例包括但不限于硝化纤维素膜或尼龙膜、亲和柱层析基质、磁珠、固体填料、微晶纤维素、或可商购的蛋白质固定化介质等。在优选的实施方式中，所述介质为微晶纤维素。在一些优选的实施方式中，本发明所述的识别元件包含可固定在微晶纤维素上的别构转录因子。在进一步优选的实施方式中，所述可固定在微晶纤维素上的别构转录因子是与纤维素结构域(以下简称“CBD”)融合表达的别构转录因子，该融合蛋白通过CBD与微晶纤维素之间的吸附作用而可固定在微晶纤维素上。
在本发明的一些实施方式中，所述识别元件包含与CBD融合蛋白表达的别构转录因子。如具体实施例所示的，本发明人将纤维素结构域与别构转录因子进行融合表达，从而获得可固定在微晶纤维素上的融合蛋白。例如，此类融合蛋白的结构示意图如图2A所示，将别构转录因子(如HucR、HosA、TetR，其氨基酸序列可分别如SEQ ID NOs:1-3所示)与CBD(其氨基酸序列可如SEQ ID NO:4所示)以接头连接。所述接头的目的仅仅是将aTF与CBD连接起来，其氨基酸序列可如图2A所示(SEQ ID NO:12)，但并不限于此，本领域技术人员可根据实际需要选择其它接头。本发明人通过实验证实了，结构转录因子以融合蛋白形式表达(CBD-HucR、CBD-HosA和CBD-TetR)并没有不利地影响其与激活dsDNA的结合能力以及变构活性(如图2B-图2G所示)。并且，比较融合蛋白和单独表达的别构转录因子之间的DNA结合能力和变构活性，发现两者之间也没有明显区别。这说明CBD仅仅起到将别构转录因子固定至微晶纤维素的目的，而并不对别构转录因子的功能产生影响。将别构转录因子与CBD融合表达并纯化的方法是本领域熟知的。例如，将编码氨基酸序列如SEQ ID NOs:1-3所示的别构转录因子的基因和编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的纤维素结构域的基因克隆至表达载体(例如含有His-标签的pET23b载体)上，构建pET23b-aTF-CBD质粒；将该质粒转入表达菌(大肠杆菌BL21)，诱导表达即可获得融合蛋白。进一步，可采用亲和柱层析、快速蛋白液相色谱等本领域通常使用的蛋白质纯化方法进行纯化。在本发明中，融合蛋白包含经纯化的融合蛋白。不受具体理论的束缚，也可将本发明的其它元件(例如下文所述的换能元件或检测元件)固定在介质上，本领域技术人员可根据实际需要进行修改或改进，这些改进或修改也包含在本发明的范围内。
本发明所使用的术语“激活dsDNA”或“激活dsDNA片段”为包含别构转录因子作用位点、CRISPR/Cas12a蛋白识别位点PAM的DNA片段和与gRNA至少部分互补的序列的核苷酸，其至少在别构转录因子作用位点、CRISPR/Cas12a蛋白识别位点和与gRNA至少部分互补的序列处为双链。所述激活dsDNA可作为激活剂激活CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性，因此在本文中将其称为“激活dsDNA”，也因其介导换能元件启动，也可被称为“换能DNA”。在本发明中，所述激活dsDNA的长度优选为20-80bp、更优选55-65bp，最优选58-60bp。其中，关于别构转录因子结合位点的定义如上所述。
本文所述的CRISPR/Cas12a蛋白识别位点PAM是指可被CRISPR/Cas12a系统识别并因此激活CRISPR/Cas12a系统的切割活性的序列，该序列称为原型间隔区邻近基序(PAM)，一般富含T(对于CRISPR/Cas12a)。
在本发明中，PAM的长度优选3-8bp、更优选3-6bp、最优选4bp。PAM序列并不限于在天然系统中存在的PAM。通过对作用位点序列进行随机或定向突变，或者结合计算机模拟选出数条候选序列并验证PAM与CRISPR/Cas12a的结合能力是本领域已知的技术。例如，在本发明的实施方式中，所述激活dsDNA中的别构转录因子作用位点的核苷酸序列以及PAM序列如下所示(SEQ ID NO:5-7)：tactgagccatgtatccaggtcattgTACTTAGATGTCTACCTAagctctgacagttcca、tactgagccatgtatccaggtcattgCGTTCGTATACGAACAgtagctctgacagttcca、tgagccatgtatccaggtcatttgTCCCTATCAGTGATAGAGAagctctgacagttcca(其中，下划线部分为PAM，黑体部分为别构转录因子结合位点，所述别构转录因子结合位点即为与gRNA互补的部分)。
在本发明中，所述与gRNA“至少部分互补”是指与所述gRNA至少50％以上互补，例如至少70％以上互补，例如80％、85％、90％、95％、99％以上或100％互补的序列。
在本发明的实施方式中，在激活dsDNA中，所述与gRNA至少部分互补的序列可在转录因子结合位点和PAM之前、之后或者之间，或者与转录因子结合位点和/或PAM至少部分重叠，或者位于别构转录因子结合位点之内。例如，在激活dsDNA中，别构转录因子结合位点即为所述所述与gRNA至少部分互补的序列。因此，在一个优选的实施方式中，激活dsDNA中可仅包含PAM和别构转录因子结合位点(其中，含有与gRNA互补的序列)。因此，激活dsDNA的长度可低至13或14bp。
在本发明中，在“激活dsDNA”中，所述别构转录因子作用位点与PAM序列之间可间隔数个核苷酸，例如可间隔0-20bp、更优选5-10bp、最优选6-9bp。在一个实施方式中，所述别构转录因子作用位点与PAM序列之间可直接连接，或者可部分或完全重叠。或者，PAM序列可位于别构转录因子作用位点中。
在本文中，所述“激活dsDNA”上同时存在别构转录因子作用位点和CRISPR/Cas12a蛋白识别位点PAM，因而可以同时与别构转录因子和Cas12a蛋白结合。所述别构转录因子与所述激活dsDNA片段结合的平衡解离常数可高于、低于或相似于所述与CRISPR/Cas12a蛋白与所述激活dsDNA片段结合的平衡解离常数。在本发明的一些实施方式中，所述别构转录因子与所述激活dsDNA片段结合的平衡解离常数低于所述CRISPR/Cas12a蛋白与所述激活dsDNA片段结合的平衡解离常数，即相比于别构转录因子，所述激活DNA片段更容易结合至CRISPR/Cas12a蛋白。因此为了减少别构转录因子和CRISPR/Cas12a系统对彼此功能的干扰，降低噪音、提高灵敏度，本发明的别构转录因子和CRISPR/Cas系统可以单独的形式提供并且在不同的空间进行反应。在一些实施方式中，所述激活dsDNA可通过如下方法制备：例如采用靶向特定别构转录因子作用位点和CRISPR/Cas蛋白识别位点的引物对(例如，核苷酸序列如SEQ ID NOs:5-18、6-19或7-20所示)通过退火(例如95℃预变性5min；95℃变性30s，每个循环降低1℃，70个循环；25℃保存)形成双链DNA；或者也可通过人工合成，例如人工合成核苷酸序列如SEQ ID NOs:5-7所示的双链DNA。所述激活dsDNA也可通过本领域已知的其它方式进行制备。
在一个实施方式中，为了避免在相同反应体系中aTF与CRISPR/Cas12a蛋白竞争性结合激活dsDNA，可通过将aTF与不影响其活性的其它蛋白(例如，CBD)融合表达，或者使得激活dsDNA中别构转录因子作用位点与PAM序列存在重叠。
在本文中可互换使用的“探针”或“DNA探针”是指与gRNA互补，并被所述CRISPR/Cas12a系统切割并且具有在被切割后可产生可检测光信号的基团(在本文中也称为“标记”)的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述探针具有双链区域，或者为双链DNA探针(均称为dsDNA探针)，所述双链DNA区域含有别构转录因子作用位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM和可被gRNA和/或crRNA识别的特定核苷酸序列，即与gRNA和/或crRNA至少互补的序列。在一个实施方式中，所述dsDNA探针的长度例如为13-100bp、更优选20-50bp、最优选20-30bp。其中，关于别构转录因子结合位点的定义如上所述。在具体的实施方式中，dsDNA探针的核苷酸序列部分可与所述激活dsDNA相同。在本发明中，可被gRNA和/或crRNA识别的序列长度优选15-70bp、更优选15-30bp、最优选17-24bp。在优选的实施方式中，dsDNA探针包含与gRNA和/或crRNA至少70％以上互补，例如80％、85％、90％、95％、99％以上或100％互补的序列。
在本发明中，在“dsDNA探针”中，所述别构转录因子作用位点与可被gRNA和/或crRNA识别的序列之间可间隔数个核苷酸，例如可间隔0-20bp、更优选5-10bp、最优选6-9bp。在一个实施方式中，所述别构转录因子作用位点与可被gRNA和/或crRNA识别的序列之间可直接连接，或者可部分或完全重叠。或者，可被gRNA和/或crRNA识别的序列可位于别构转录因子作用位点中。
所述在一些实施方式中，所述探针是单链DNA，所述单链DNA可以为任意核苷酸序列，例如长度为约10-30bp、优选约20bp的核苷酸序列，如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。不受具体理论的限制，在本发明的激活DNA是双链DNA且可设计成被gRNA和/或crRNA所识别的情况下，根据本发明的意图和原理，本领域技术人员可将本发明的激活dsDNA设计成双链DNA探针(例如在激活DNA两端进行荧光标记)来实施本发明，这一修改也应包括在本发明的范围内。
换能试剂或换能元件
在本文中，所述“CRISPR/Cas系统”是指2类CRISPR/Cas系统，其利用单一的效应蛋白抵御外源核酸的入侵，能够简单高效进行基因编辑和核酸检测。其中，最典型的2类CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas12a(Cpf1)系统。在本文中，CRISPR/Cas系统通常至少包含CRISPR/Cas蛋白和向导RNA。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)是含有短碱基序列重复的原核DNA片段。每个重复之后是来自以前暴露于细菌病毒或质粒的“间隔子DNA”的短片段。Cas(CRISPR相关蛋白)是一种RNA(向导RNA)引导的DNA核酸内切酶。向导RNA(gRNA或sgRNA)是引导CRISPR/Cas蛋白识别和切割目标核酸分子的特定RNA序列，可通过体外转录或者人工化学合成。向导RNA可由CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)杂交形成，或者可作为单独的连续RNA提供。gRNA经由crRNA部分中的靶特异性序列(例如，间隔序列“间隔子”)特异性结合至互补靶序列，而CRISPR/Cas蛋白自身结合至PAM，然后Cas核酸酶介导靶核酸(例如DNA探针)的切割。然而，对于CRISPR/Cas12a，仅需要crRNA引导即可，而不需要tracrRNA；并且CRISPR/Cas12a不仅对特定序列的DNA双链(dsDNA，其含有与crRNA互补的序列被crRNA所识别)进行切割而且在被特定序列的DNA双链(如本文的激活DNA)激活形成CRISPR/Cas/dsDNA三元复合物时可对任意的单链DNA(ssDNA)进行切割。这些特性使得CRISPR/Cas12a能够提高检测的灵敏性、特异性和速度。因此，在一些实施方式中，CRISPR/Cas12a系统是优选的。就本发明人所知，Cas12a自身并不能用于在疾病诊断、药物研发、食品安全以及环境监测等各个领域对小分子化合物进行检测。而在本发明中，本发明人借助识别元件(别构转录因子-激活dsDNA复合体)，当激活dsDNA上的PAM结合CRISPR/Cas蛋白激活CRISPR/Cas对探针(靶核酸)进行切割，从而产生可检测的光信号，得以实现对小分子化合物的检测。
在本发明中，gRNA的长度优选20-70bp、更优选30-50bp、最优选38-45bp。gRNA可基于使用者的需求进行设计。优选结合生物信息学软件来进行设计。在一些实施方式中，所述光信号包括荧光信号或吸收光信号。本领域技术人员应当理解，为了量化在分析中出现的颜色变化，通常采用特定波长的光进行激发后检测吸收光强度。因此，在本发明中，术语“吸收光信号”也可指产生的颜色变化(比色分析)。在一些实施方式中，所述探针可携带标记从而在被CRISPR/Cas切割后产生可检测的光信号。标记的实例包括但不限于：发光有机化合物(如荧光素、萝卜素)、发光无机化合物(例如，化学染料)、荧光团(如FAM荧光团)等；纳米颗粒和量子点等；或者生色团等。利用上述物质对核酸序列进行标记使其产生可检测的光信号的技术是本领域技术人员熟知的，并且可根据实际需要进行选择和改进，这一点并不会对本发明进行限制。在一些优选的实施方式中，所述光信号为荧光信号。在进一步优选的实施方式中，所述标记为发光团和淬灭团，分别标记在探针的两端(3’端或5’端)。优选地，所述发光团为FAM荧光团，所述淬灭团为BHQ荧光淬灭团。在另一些优选的实施方式中，所述光信号为吸收光信号。在进一步优选的实施方式中，所述标记为生色团和淬灭团，分别标记在探针的两端(3’端或5’端)。
检测元件
在本发明中，利用各种检测设备对上述光信号进行检测是本领域技术人员所熟知的。
检测方法
在本发明的实施方式中，使用本发明所述的生物感受器或本发明所述的组合物对样品中的小分子进行检测。在本发明中，可对样品中的小分子进行定性或定量检测。
本发明提供了一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括：
将待测样品与识别试剂进行混合并孵育；从所得的混合物中分离游离的dsDNA片段；将分离的游离dsDNA加入换能试剂中，并检测所产生的光信号；以及，基于所产生的信号来检测所述小分子的存在或含量。
在一个实施方式中，本发明提供了一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括：
(1)将待测样品、aTF和dsDNA进行混合并孵育；(2)从所得的混合物中分离游离的dsDNA片段；(3)将分离的游离dsDNA加入CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA中，并检测所产生的光信号；以及(4)基于所产生的信号来检测所述小分子的存在或含量。
在一个方面，本发明提供了一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括：
(1)将待测样品、aTF和激活dsDNA片段进行混合并孵育；
(2)从步骤(1)中的混合物分离游离的激活dsDNA片段；
(3)向步骤(2)中分离的游离激活DNA片段中加入CRISPR/Cas12a蛋白、向导RNA和ssDNA探针，并检测所产生的光信号；以及
(4)基于所产生的信号，对所述小分子的存在或含量进行检测。
在另一方面，本发明提供了一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括：
(1)将待测样品、aTF和dsDNA探针进行混合并孵育；
(2)从步骤(1)中的混合物分离游离的dsDNA探针；
(3)向步骤(2)中分离的游离dsDNA探针中加入CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA，并检测所产生的光信号；以及
(4)基于所产生的信号，对所述小分子的存在或含量进行检测。
其中，步骤(1)中进行混合和孵育的具体条件可由本领域技术人员根据实际需要选择，只要保证别构转录因子和激活dsDNA或dsDNA探针能充分结合成复合体并且待测样品中的特定小分子化合物可以与别构转录因子-激活dsDNA或dsDNA探针复合物充分结合即可，例如在室温下反应1min以上，例如15-20min(但不限于此)。对于别构转录因子和激活dsDNA或dsDNA探针的比例，根据实际需求可以进行调整。在本发明的一些实施方式中，别构转录因子和激活dsDNA或dsDNA探针的摩尔比≥5:1是优选的，此时，别构转录因子可与激活dsDNA或dsDNA探针完全结合形成蛋白-DNA复合物。
在一些实施方式中，所述别构转录因子为阻遏系统的别构转录因子(即，当小分子与别构转录因子结合时，别构转录因子与靶dsDNA的结合亲和力减弱，使得靶dsDNA从aTF-DNA复合体脱离)，当加入待测样品后，游离的dsDNA含量增加。因此，在一个优选实施方式中，为了减少背景噪音，提高本发明的灵敏度，先将别构转录因子与dsDNA混合形成aTF-dsDNA复合体，然后移除未结合的dsDNA，再加入待测样品。在这一实施方式中，由于加入待测样品之前，别构转录因子与dsDNA完全结合成aTF-dsDNA复合体，而基本上不存在游离的dsDNA，则加入待测样品后游离出来的dsDNA直接反映待测样品中的小分子的存在或含量。
在另一些实施方式中，所述别构转录因子为激活系统的别构转录因子(即，当小分子与别构转录因子结合时，别构转录因子与dsDNA的结合亲和力增强，使得dsDNA与别构转录因子结合成更多的aTF-dsDNA复合体)，当加入待测样品后，游离的dsDNA含量减少。本领域技术人员应理解的是，在这样的实施方式中，在步骤(1)之前应确定加入的dsDNA的量，由计算出减少的游离dsDNA间接反映待测样品中的小分子的存在或含量。在一些实施方式中，可在将dsDNA与别构转录因子混合之前、同时或之后加入待测样品。
在一个优选的实施方式中，所述别构转录因子是可固定在介质上的别构转录因子。因此，在步骤(1)中可进一步包括加入介质，例如，当所述可固定在介质上的别构转录因子是与纤维素结构域融合表达的别构转录因子时，所述介质为微晶纤维素。优选地，在加入待测样品和dsDNA之前，使别构转录因子与介质预先结合，将别构转录因子固定在介质上，便于后续操作。例如，将可商购的介质(例如微晶纤维素)与可固定在介质上的别构转录因子(例如与纤维素结构域融合表达的别构转录因子)混合并孵育，进行混合和孵育的具体条件可由本领域技术人员根据实际需要选择，只要保证与可固定在介质上的别构转录因子可充分固定在所述介质上即可，例如室温反应5-15min(但不限于此)。优选地，在加入待测样品和dsDNA之前，将未固定的别构转录因子除去。进一步，可对固定在介质上的别构转录因子的含量或浓度进行测定，例如使用本领域已知的蛋白质浓度检测方法(如使用Bradford分析试剂盒)。
步骤(2)中将游离dsDNA与步骤(1)中的蛋白质、小分子化合物和核酸混合物分离的方法是本领域熟知的，例如包括但不限于离心、沉降、磁珠法、层析法、亲和柱法等等。本领域技术人员可以根据实际情况选择具体的分离方法和参数，这一点并不会对本发明进行限制。在所述别构转录因子是可固定在介质上的别构转录因子的实施方式中，仅仅通过过滤或离心(例如室温下，7000rpm)即可将游离的dsDNA片段分离，操作简单、节约时间和成本，在经济上是可行的。也可省略步骤(2)的分离步骤，直接在步骤(1)的混合物中加入CRISPR/Cas12a系统和任选的ssDNA探针。
步骤(3)中，采用本领域中常用的检测荧光信号或吸收光信号的方法和仪器来检测产生的光信号。例如，当产生的信号为荧光信号时，采用酶标仪来测量。应当指出的是，当对所需检测的样品或小分子化合物进行定性分析时，产生的颜色变化(如上文所述，包括在“吸收光信号”的范围内)可不进行量化分析，而仅仅进行比色分析，这一点也在本发明请求保护的范围内。
步骤(4)中，可基于参比水平，对所产生的信号进行分析，从而对所述小分子的存在或含量进行检测。所述“参比水平”在本发明中与“参比样品”、“参照水平”可互换使用，是指条件的对照。例如，在对小分子进行定性检测(检测存在或不存在)的上下文中，参比水平可以是不含所述小分子的样品的水平。在对小分子进行定量检测(检测含量)的上下文中，参比水平可以是含有已知量的小分子的样品的水平。就对包含小分子的样本的存在和含量进行确定而言，参比水平是参照值，能够将样品归一化至合适的标准，以推断样品中小分子的存在、不存在或含量。在一些实施方式中，参比水平可以是之前确定的水平，例如可以是预先确定的数量或比例，而不需要以本文所述的检测方法的相同的物理迭代进行确定。
在本发明中，所述样品以及所述试剂可处于溶液形式，所述溶液只要不影响aTF与效应物/dsDNA结合和CRISPR/Cas12a的切割即可。本领域技术人员可根据实际应用或需求对其进行选择或调整。
试剂盒
本发明还提供了一种检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的生物传感器以及检测元件。在本文中，所述检测元件是指对本发明的生物传感器产生的光信号进行检测的元件、设备或系统。在一些实施方式中，所述检测元件用于通过荧光分析或吸收光分析(包括比色分析)对所述DNA探针产生的光信号进行分析，从而获得对小分子的定性或定量检测结果。
另一方面，本发明还提供了一种检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含本发明所述的试剂以及检测试剂。在本发明中，所述检测试剂是指对使用本发明的试剂所产生的光信号进行检测的试剂。在一些实施方式中，所述检测试剂用于通过荧光分析或吸收光分析(包括比色分析)对所述DNA探针产生的光信号进行分析，从而获得对小分子的定性或定量检测结果。
在一些实施方式中，本发明所述的试剂盒进一步包含使用本发明的生物传感器和/或试剂检测小分子的递送工具或装置(例如移液枪)、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、终止缓冲液(例如，用于终止显色)、微滴定板(例如98孔或384孔，用于进行反应和检测)、一个或多个容器、记载使用说明的数据载体(例如说明书或计算机可读介质)、标准品(例如含有已知量的小分子的样品)，以及它们的组合等等。
本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：
1.一种用于检测小分子的组合物，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中，
所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列；以及所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统，
其中，所述组合物中还含有发光/生色基团。
2.如段落1所述的组合物，其中，所述换能试剂进一步包含单链DNA(ssDNA)。
3.如段落1或2所述的组合物，其中，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)。
4.如段落1-3任一段所述的组合物，其中，所述dsDNA为激活dsDNA。
5.如段落1-4任一段所述的组合物，其中，所述dsDNA为dsDNA探针，并具有发光/生色基团及其淬灭基团。
6.如段落2所述的组合物，其中，所述ssDNA为ssDNA探针，并具有发光/生色基团及其淬灭基团。
7.如段落5或6所述的组合物，其中，所述dsDNA探针或所述ssDNA探针的两端缀合有发光/生色基团及其淬灭基团。
8.如段落1-7中任一段所述的组合物，其中，所述小分子具有50-5000道尔顿、优选50-1000道尔顿的分子量。
9.如段落1-8中任一段所述的组合物，其中，所述小分子为重金属离子、毒素、药物、代谢物、污染物或上述物质的分解产物。
10.如段落1-9中任一段所述的组合物，其中，所述小分子的存在通过所述aTF与所述dsDNA触发CRISPR/Cas12a的切割活性。
11.如段落1-10中任一段所述的组合物，其中，所述转录因子结合位点的长度为10-40bp、优选15-25bp、更优选17-19bp。
12.如段落1-11中任一段所述的组合物，其中，所述识别试剂包含可固定在介质上的别构转录因子和/或可固定在介质上的dsDNA。
13.如段落1-12中任一段所述的组合物，其中，所述识别试剂包含可固定在介质上的别构转录因子。
14.如段落1-13中任一段所述的组合物，其中，所述介质选自于由如下所组成的组：硝化纤维素膜或尼龙膜、亲和柱层析基质、磁珠、固体填料、微晶纤维素、或可商购的蛋白质固定化介质。
15.如段落13所述的组合物，其中，所述识别试剂包含可固定在微晶纤维素上的与微晶纤维素结构域融合表达的别构转录因子。
16.如段落1-15中任一段所述的组合物，其中，所述dsDNA的长度为20-80bp、更优选55-65bp，最优选58-60bp。
17.如段落1-16中任一段所述的组合物，其中，所述识别试剂和所述换能试剂以单独的形式提供并且在不同的空间进行反应。
18.如段落6-17中任一段所述的组合物，其中，所述ssDNA探针是长度为10-30bp任意单链DNA
19.如段落6-17中任一段所述的组合物，其中，所述ssDNA探针是长度为20bp的任意单链DNA。
20.如段落1-12中任一段所述的组合物，其中，所述发光/生色基团选自于由如下所组成的组：发光有机化合物、发光无机化合物、荧光团、纳米颗粒、量子点和生色团，以及它们的组合。
21.如段落1所述的组合物，其中，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中：
所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和激活双链DNA(激活dsDNA)，所述激活dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列，以及
所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统和单链DNA探针(ssDNA探针)，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)，所述ssDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团；
22.如段落1所述的组合物，其中，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中：
所述识别试剂包含aTF和双链DNA探针(dsDNA探针)，所述dsDNA探针包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA(gRNA)至少部分互补的序列，并且所述dsDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团，以及
所述换能试剂包含CRISPR/Cas12a系统，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述gRNA。
23.如段落1所述的组合物，其中，所述组合物处于生物传感器的形式。
24.如段落23所述的组合物，其中，所述生物传感器包含识别元件和换能元件，其中，
所述识别元件包含别构转录因子(aTF)和双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列；以及所述换能元件包含所述CRISPR/Cas12a系统，
其中，所述生物传感器中还含有发光/生色基团。
25.如段落24所述的组合物，其中，所述换能元件进一步包含单链DNA(ssDNA)。
26.如段落24或25所述的组合物，其中，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)。
27.如段落24-26任一段所述的组合物，其中，所述dsDNA为激活dsDNA。
28.如段落24-26任一段所述的组合物，其中，所述dsDNA为dsDNA探针，并具有发光/生色基团及其淬灭基团。
29.如段落25所述的组合物，其中，所述ssDNA为ssDNA探针，并具有发光/生色基团及其淬灭基团。
30.如段落28或29所述的组合物，其中，所述dsDNA探针或所述ssDNA探针的两端缀合有发光/生色基团及其淬灭基团。
31.如段落24所述的组合物，其中，所述识别元件包含别构转录因子(aTF)和激活双链DNA(激活dsDNA)，所述激活dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点(即，原型间隔区邻近基序，PAM)以及与向导RNA至少部分互补的序列，以及
所述换能元件包含所述CRISPR/Cas12a系统以及单链DNA探针(ssDNA探针)，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述向导RNA(gRNA)，所述ssDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团；
32.如段落24所述的组合物，其中，所述识别元件包含别构转录因子(aTF)和双链DNA探针(dsDNA探针)，所述dsDNA探针包含所述别构转录因子的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA(gRNA)至少部分互补互补的序列，并且所述dsDNA探针两端分别缀合有发光/生色基团及其淬灭基团，以及
所述换能元件包含所述CRISPR/Cas12a系统，所述CRISPR/Cas12a系统包含CRISPR/Cas12a蛋白与所述gRNA。
33.如段落1-32中任一段所述的组合物，其中，所述识别试剂和所述换能试剂以单独的形式提供并且在不同的空间进行反应。
34.如段落21所述的组合物，其中，所述别构转录因子和dsDNA，所述CRISPR/Cas12a蛋白、向导RNA(gRNA)和ssDNA探针作为单一试剂提供；或者
所述别构转录因子和激活dsDNA，所述CRISPR/Cas12a蛋白、向导RNA(gRNA)和ssDNA探针作为单独的试剂提供。
35.如段落22所述的组合物，其中，所述别构转录因子和dsDNA探针，所述CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA(gRNA)作为单一试剂提供；或者
所述别构转录因子和dsDNA探针，所述CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA(gRNA)作为单独的试剂提供。
36.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含如段落1-35中任一段所述的组合物。
37.如段落36所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含用于对光信号进行检测的检测装置。
38.如段落38或39所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含操作如段落1-35中任一段所述的生物传感器时所用的递送工具或装置、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、终止缓冲液、记载使用说明的数据载体、标准品或容器，以及它们的组合。
39.一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括用段落1-35中任一段所述的组合物或如段落36-38中任一段所述的试剂盒对所述待测样品中的小分子进行检测。
40.如段落39所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述待测样品与识别试剂进行混合并孵育；(2)从所得的混合物中分离游离的dsDNA片段；(3)将分离的游离dsDNA加入换能试剂中，并检测所产生的光信号；以及，(4)基于所产生的信号来检测所述小分子的存在或含量。
41.如段落39或40所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述待测样品、aTF和dsDNA进行混合并孵育；(2)从所得的混合物中分离游离的dsDNA片段；(3)将分离的游离dsDNA加入CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA中，并检测所产生的光信号；以及(4)基于所产生的信号来检测所述小分子的存在或含量。
42.如段落39或40所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述待测样品、aTF和激活dsDNA片段进行混合并孵育；
(2)从步骤(1)中的混合物分离游离的激活dsDNA片段；
(3)向步骤(2)中分离的游离激活DNA片段中加入CRISPR/Cas12a蛋白、向导RNA和ssDNA探针，并检测所产生的光信号；以及
(4)基于所产生的信号，对所述小分子的存在或含量进行检测。
43.如段落39或40所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将所述待测样品、aTF和dsDNA探针进行混合并孵育；
(2)从步骤(1)中的混合物分离游离的dsDNA探针；
(3)向步骤(2)中分离的游离dsDNA探针中加入CRISPR/Cas12a蛋白和向导RNA，并检测所产生的光信号；以及
(4)基于所产生的信号，对所述小分子的存在或含量进行检测。
44.如段落42或43所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述别构转录因子和所述激活dsDNA的摩尔比为≥5:1；所述别构转录因子和所述dsDNA探针的摩尔比为≥5:1。
45.如段落42或43所述的方法，其中，在步骤(1)中，先将所述别构转录因子与所述激活dsDNA混合形成复合体，然后移除未结合的激活DNA，再加入所述待测样品；或者，先将所述别构转录因子与所述dsDNA探针混合形成复合体，然后移除未结合的是所述dsDNA探针，再加入所述待测样品。
46.如段落40-45中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述混合是在室温下1min以上。
47.如段落40-46中任一段所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述别构转录因子是可固定在介质上的别构转录因子。
48.如段落47所述的方法，其中，在步骤(1)之前，加入介质使所述可固定在介质上的别构转录因子固定至介质上。
49.如段落39-48中任一段所述的方法，其中，所述待测样品来自环境、受试者、食品、饮用水、化妆品或饲料。
50.如段落49所述的方法，其中，所述待测样品选自以下中的一种或多种：地下水、中水、海水、废水、采矿废料；血液、血清、血浆、痰、脑脊液流体、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、囊液、组织、唾液。
51.如段落40-50所述的方法，其中，在步骤(1)之前，对所述待测样品进行富集、提取和/或纯化的预处理。
52.如段落40-51中任一段所述的方法，其中，在步骤(2)中，通过过滤、离心、沉降、磁珠法、层析法、亲和柱法进行分离。
53.如段落40-52中任一段所述的方法，其中，在步骤(3)中，通过荧光分析或比色分析进行检测。
54.如段落40-53中任一段所述的方法，其中，在步骤(4)中，基于参比水平，对所述光信号进行分析，所述参比水平为不含所述小分子的样品的水平或含有已知量的小分子的样品的水平。
55.段落1-35中任一段所述的组合物在制备检测小分子的试剂盒中的用途。
56.如段落55所述的用途，其中，所述试剂盒用于环境污染监控、食品和化妆品质量控制和疾病诊断。
表1中的参考文献
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实施例
以下实施例中使用的dsDNA片段(如SEQ ID NOs:5-7所示的核苷酸序列)、向导RNA(如SEQ ID NOs:9-11所示的核苷酸序列)、引物(表2所示)以及探针(如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ)均由金斯瑞公司人工合成。
以下实施例中所使用的培养基和试剂如下：
LB培养基：1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母粉
LB平板：1％NaCl、1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1.5％琼脂粉
结合缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、500mM NaCl、20mM咪唑，2mM DTT、5％甘油
洗杂缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、500mM NaCl、40mM咪唑，2mM DTT、5％甘油
洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、500mM NaCl、500mM咪唑，2mM DTT、5％甘油
透析缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、500mM NaCl、2mM DTT、5％甘油
离子交换平衡缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、2mM DTT、5％甘油
离子交换洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、1M NaCl、2mM DTT、5％甘油
Tris-HCl缓冲液：50mM Tris-HCl(7.4)、200mM NaCl
表2实施例1-实施例2中使用的引物
Figure BDA0002023167970000141
Figure BDA0002023167970000151
实施例1尿酸生物传感器
在本实施例中，利用别构转录因子HucR和激活dsDNA片段(dsDNAhucR；其中，包含HucR结合位点(与gRNA互补的序列包含在其中)和CRISPR/Cas12a识别位点(PAM))作为识别元件，以CRISPR/Cas12a、gRNA和单链DNA(ssDNA；两端标记有FAM荧光团和BHQ荧光淬灭团，作为探针)作为换能元件，构建能够感应尿酸的生物传感器平台。
HucR蛋白为来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的阻遏蛋白，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:1所示。如图1所示，在无尿酸(UA)时，HucR能结合dsDNAhucR上的HucR作用位点形成HucR-dsDNAhucR复合体。当存在尿酸时，尿酸特异性地结合HucR，使dsDNAhucR从HucR释放获得游离形式的dsDNAhucR，游离形式的dsDNAhucR激活CRISPR/Cas12a系统，引起DNA探针切割，产生荧光信号。因此，可通过监控荧光信号确定样品中的尿酸浓度。
1.HucR-CBD融合蛋白的克隆、表达和纯化
以含有CBD基因(编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)的pET35b质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)为模版，用引物CBD-F/HucR-CBD-R扩增获得CBD片段；使用Xho I单酶切(反应体系：10x cutsmart buffer 2μL；质粒1μg；Xho I 1μL；H2O补充至20μL；37℃反应1h)对pET23b-HucR质粒(预先构建：使用Nde I和xho I对pET23b质粒和HucR基因片段进行双酶切(反应体系：10x cutsmart buffer 2μL；质粒/HucR基因片段1μg；Xho I 1μL；Nde I 1μL；H2O补充至20μL；37℃反应1h)，纯化回收后通过T4DNA连接酶连接(反应体系：10x T4ligasebuffer 1μL；质粒50-100ng；HucR基因片段50-100ng；H2O补充至10μL；22℃反应1h)所得)进行线性化处理；使用无缝克隆(单片段连接)试剂盒(Tolo Biotechnology，上海)，根据制造商提供的说明书用Exmax将CBD片段和线性化的pET23b-hucR进行组装，获得pET23b-HucR-CBD质粒，进行PCR和测序，确认为阳性质粒。采用钙转法将10ng质粒pET23b-HucR-CBD转入大肠杆菌BL21(天根生化科技有限公司，北京)，Amp抗性筛选阳性克隆。挑取单克隆菌落接种于100mL LB(Amp+)培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜(～12h)。取2.5mL(1v/v％接种量)培养液转接至250mL LB(Amp+)培养基，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃、180rpm低温诱导过夜，随后在4℃、9,000rpm离心15min，收集菌体并用洗杂缓冲液洗涤菌体。每2L菌体用50mL预冷的结合缓冲液悬浮。将悬浮液置于冰上，超声裂解菌体(超声波细胞粉碎机，超声3s，间歇5s，30W，20min)，4℃、12000rpm离心30min，取上清重复上述离心操作至澄清。将裂解物流经HisTrap FF柱(GE Healthcare)上，使用洗脱缓冲液进行洗脱。收集峰值级分并且进行透析(透析膜来自上海生工；透析缓冲液)。然后将透析后的溶液上样至HiTrap QHP柱(GE Healthcare)，用洗脱缓冲液进行洗脱。收集峰值级分并使用超滤管(milipore)进行浓缩。将浓缩液上样至HiLoad 16/600Superdex 200pg柱进行快速蛋白液相色谱(FPLC；AKTAExporer 100，GE Healthcare)。通过SDS-PAGE对纯化的HucR-CBD蛋白进行验证并且使用Bradford方法测定其浓度为3mg/mL。
2.HucR-CBD融合蛋白的活性分析
因CBD结构域与HucR分子量相近，为了分析CBD结构域对HucR蛋白的活性影响，利用凝胶阻滞实验(EMSA)对HucR-CBD与dsDNAHucR的结合进行分析。使用引物dsDNAHucR-1和dsDNAHucR-2退火(95℃预变性5min；95℃变性30s，75个循环，每个循环降低1℃)得到60bp大小的dsDNA(HucR)，用于EMSA分析。EMSA的实验条件和数据采集方法均根据Wang等，MolecularMicrobiology，2011，82(1)：236-250。将0、25、50、100、200nM的HucR-CBD与40nM dsDNAHucR混匀(处于20mL的缓冲液中：10mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM KCl，1mM EDTA，0.1mM DTT，5％v/v甘油，0.01mg/ml牛血清白蛋白，dsDNA与aTF的结合以及效应物与dsDNA和aTF的作用均在此种缓冲液中进行)，在室温下避光反应15min，1.5％琼脂糖胶进行电泳，检测融合蛋白HucR-CBD与dsDNAHucR的结合。
结果如图2B所示，当HucR-CBD:dsDNAHucR＝200nM:40nM(即5:1)时，dsDNAHucR可被HucR-CBD完全结合，可见与CBD结构域融合表达不影响HucR的功能。
3.HucR-CBD融合蛋白对尿酸的识别与响应
为了分析效应物尿酸对HucR-CBD-dsDNAHucR复合物的解离作用，向HucR-CBD:dsDNAHucR＝5:1的孵育体系中加入不同浓度的尿酸(0、0.05、0.5、5、50、500μM)，通过EMSA检测dsDNAHucR的解离。结果如图2C所示，随着尿酸浓度的增加，游离的dsDNAHucR不断增加。
4.Cas12a蛋白和gRNA的制备
构建pET28TEV-Cas12a质粒(LbCas12a，吐露港公司)，以与表达和纯化HucR-CBD融合蛋白步骤的相同的步骤，将pET28TEV-Cas12a质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，0.2mM IPTG诱导蛋白表达后，离心收集菌体并经超声波破碎仪超声破碎后收集细胞裂解物，进行纯化和浓缩，得到浓度为1mg/mL的Cas12a纯化蛋白。
在Taq DNA聚合酶缓冲液中使T7引物与crRNA-HucR引物退火(20μL体系：10x TaqDNA聚合酶缓冲液2μL；T7引物9μL；crRNA-HucR引物9μL；PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，每个循环降低1℃，70个循环)合成crRNA(即gRNA)的模板。然后用HiScribeTM T7快速高效RNA合成试剂盒(NEB)转录成crRNA并用RNA Clean&ConcentratorTM-5(ZymoResearch)进行纯化。使用NanoDrop2000分光光度仪(Thermo Fisher Scientific)测量所得的crRNA的浓度，为2000-3000ng/μL。
5.对尿酸的检测
取2mg微晶纤维素(上海生工；货号9004-34-6)用Tris-HCl缓冲液洗涤两次，与融合蛋白HucR-CBD(200nM)混合于NEB
Figure BDA0002023167970000161
缓冲液，室温混合孵育10分钟。室温、7000rpm离心后弃上清，使用NEB
Figure BDA0002023167970000162
缓冲液洗涤3次除去未结合的蛋白，使用Bradford分析试剂盒(天根生化科技公司)对固定化的蛋白质进行定量；加入100nM dsDNAHucR，室温反应～9分钟，室温、7000rpm离心弃上清，洗涤≥1次除去未结合的dsDNAHucR；在所得到的dsDNA-蛋白-纤维素复合物中各加入500μM尿酸及其类似物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤)，室温反应15min，室温、7000rpm离心取上清。将上清液(其中可能包含游离形式的dsDNAHucR，以40nM游离形式的dsDNAHucR作为阳性对照)加入Cas12a、gRNA以及经FAM/BHQ修饰的ssDNA(序列如SEQ ID NO:9所示)的混合物(50nM Cas12a、50nM gRNA以及250nM ssDNA，处于20μL NEB
Figure BDA0002023167970000163
缓冲液中)，混合后立即置于BMG CLARIOstar酶标仪(BMG Labtech，英国)中37℃反应，在480nm激发光和520nm发射光下测定并记录反应体系的荧光强度。结果如图3C所示，阳性对照(即游离形式的dsDNAHucR)和尿酸组获得了最强的荧光强度，而尿酸类似物(腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤)组的荧光强度小于阳性对照组的5％。并且该结果与EMSA的结果(图3B)类似，说明本发明的尿酸生物传感器能够准确地对小分子进行识别并且进行检测。
6.对生物传感器性能的分析
6.1dsDNA线性检测范围
为了探究不同浓度的dsDNA对荧光强度变化的影响，取不同浓度的dsDNAHucR(1、5、10、25、50、100pM)加入Cas12a、gRNA以及经FAM/HQ修饰的ssDNA(序列如SEQ ID NO:9所示)的混合物(50nM Cas12a、50nM gRNA以及250nM ssDNA，处于20μL NEB
Figure BDA0002023167970000172
缓冲液中)，混合后立即置于BMG CLARIOstar酶标仪(BMG Labtech，英国)中37℃反应，在480nm激发光和520nm发射光下测定并记录反应体系的荧光强度。结果如图4A(左栏)所示，随着dsDNA的浓度不断增加，反应体系的荧光强度也随之增加。为分析dsDNA与反应体系荧光强度变化之间的线性关系，取荧光值线性增加区间的斜率，以dsDNA浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标作图4A(右栏)，由此可知dsDNA的线性检测范围1-25pM。
6.2尿酸的线性检测范围
为了探究不同浓度的尿酸对荧光强度变化的影响，取不同浓度的尿酸以如上的方法进行检测，测定并记录反应体系荧光强度，结果如图4B(左栏)所示，随着尿酸浓度的增加，游离的dsDNA含量随之增多，荧光强度也随之提高。反应体系的荧光强度的变化随着尿酸的增加而逐渐增加，为分析尿酸浓度与反应体系荧光强度变化间的线性关系，取荧光值线性增加区间的斜率，以尿酸浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标作图4B(右栏)，可知尿酸的线性检测范围25-500nM，回归方程为：y＝10.7x+1289.8，R2＝0.992。本实施例传感器对尿酸的检测极限为nM级，而现有的尿酸生物传感器通常为μM级(如专利201810224843.8中所记载的尿酸生物传感器，1.71μM)，可见本发明的生物传感器具有出色的检测灵敏度(可低至25nM)。
6.3对临床血液样品的分析
取等量的血清和氯仿混合并且剧烈震荡，室温、10,000g离心10分钟，收集上清液。使用如上的方法采用本实施例的尿酸生物传感器对血清样品中的尿酸进行检测。为了避免吸取的时候的误差，用水将血清样品上清液稀释10倍，使用1μL稀释液进行检测。由于HPLC能够非常精确的检测血清中的尿酸含量，将样品进行HPLC作为对照。HPLC条件：AgilentSB-Aq柱(4.6mm×150mm，5μm，1mL/min)；水作为洗脱液，在284nm处检测(UV检测器；Agilent1260infinity II LC系统)。将由HPLC测得的尿酸浓度为纵坐标，本实施例的生物传感器检测方法得到的尿酸浓度为纵坐标做图(图5A)，可见两种方法测得的结果线性相关(y＝0.978x，R2＝0.993)，这说明本发明的检测方法具有较高的可信度。
进一步，将本实施例的检测方法与临床上使用的Backman尿酸检测试剂盒进行对比，同样将Backman测得的尿酸浓度为纵坐标，本实施例的生物传感器检测方法得到的尿酸浓度为纵坐标做图(图5B)，可见两种方法测得的结果线性相关(y＝1.023x，R2＝0.983)，也说明了本发明的检测方法具有较高的可信度。
人体血清中尿酸的正常范围为166.4μM-546.7μM，而由于本发明的生物传感器非常灵敏，仅需要非常少量的血液样品(约1μL)即可得到准确的结果(图5C)，使得反应体系体积较小，可以在96孔板甚至384孔板上进行该检测。并且，本发明的方法仅需15-25分钟，至多25分钟即可得到结果，不仅节约时间，而且成本低、操作简便，非常适合用于对血液等样品中的尿酸进行高通量检测。
6.4与其它检测方法的比较
为了进一步评估本实施例的尿酸生物传感器的优点，将其与现有技术中已报道的各种检测方法进行对比，并且将结果汇总与表3中。
表3.不同小分子检测方法的比价
Figure BDA0002023167970000171
RT-qPCR：实时荧光定量PCR；RCA：滚环扩增；RPA：重组酶聚合酶扩增；PGM：血糖仪；ISDA：等温链置换扩增；临床方法：Backman试剂盒；CaT-SMelor：本发明的生物传感器；Y：可适用；N：不可适用；NA：未获得。
而且，对于本实施的尿酸生物传感器，由于荧光信号相对稳定，因此该生物传感器的荧光半衰期超过200min，这为研究员或其他使用者提供更多的时间记录和分析实验结果。
综上所述，本发明的尿酸生物传感器具有出色的检测灵敏度、较高的可信度、节约时间和成本，操作简单，非常适合于需要高通量、高速、高灵敏度的小分子体外检测，在实验室以及医疗、工业应用中均具有广阔的应用前景。
实施例2四环素生物传感器和对羟基苯甲酸(p-HBA)传感器
为了验证本发明传感器和方法的普适性，采用实施例1的理念，设计了分别响应于四环素和p-HBA的传感器。响应于四环素的生物传感器利用别构转录因子TetR和双链激活DNA片段(dsDNATetR；其中包含TetR结合位点和CRISPR/Cas12a识别位点(PAM))作为识别元件，以CRISPR/Cas12a、gRNA和单链DNA(ssDNA；两端标记有FAM荧光团和BHQ荧光淬灭团，作为探针)作为换能元件。响应于p-HBA的生物传感器利用别构转录因子HosA和双链激活DNA片段(dsDNAHosA；其中包含HosA结合位点和CRISPR/Cas12a识别位点(PAM))作为识别元件，以CRISPR/Cas12a、gRNA和单链DNA(ssDNA；两端标记有FAM荧光团和BHQ荧光淬灭团，作为探针)作为换能元件。
根据实施例1的方法和步骤，制备TetR-CBD融合蛋白和HosA-CBD融合蛋白，构建四环素生物传感器和p-HBA传感器，并对p-HBA传感器的性能进行分析。
1.对p-HBA传感器性能的分析
1.1HosA-CBD融合蛋白活性分析
将不同浓度(0、25、50、100、200nM)的HosA-CBD与40nM的dsDNAHosA(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)混合，室温反应15min，进行EMSA检测HosA-CBD与dsDNAHosA的结合。结果如图2D所示，当HosA-CBD:dsDNAHosA＝5:1时，dsDNAHosA可被HosA-CBD完全结合，与CBD结构域融合表达不影响HosA的功能活性。
1.2融合蛋白HosA-CBD对p-HBA的识别与响应
为了分析效应物p-HBA对HosA-CBD和dsDNAHosA复合物的解离作用，向HosA-CBD:dsDNAHosA＝5:1的反应体系中加入不同浓度(0、0.18、1.8、18、180、1800μM)的p-HBA通过EMSA检测dsDNAHosA的解离。结果如图2E所示，随着p-HBA浓度的增加，游离的dsDNAHosA不断增加。
1.3对p-HBA的检测
取2mg微晶纤维素(上海生工；货号9004-34-6)用Tris-HCl缓冲液洗涤两次，与融合蛋白HosA-CBD(200nM)混合于NEB
Figure BDA0002023167970000181
缓冲液，室温混合孵育10分钟。室温、7000rpm离心后弃上清，使用NEB
Figure BDA0002023167970000182
缓冲液洗涤3次除去未结合的蛋白，使用Bradford分析试剂盒(天根生化科技公司)对固定化的蛋白质进行定量；加入100nM dsDNAHosA，室温反应10分钟，室温、7000rpm离心弃上清，洗涤3次除去未结合的dsDNAHosA；在所得到的dsDNA-蛋白-纤维素复合物中各加入1.8mM p-HBA及其类似物(对羟苯基乙醇、对氨基苯甲酸(p-ABA)、对羟基苯甲酸甲酯(p-MHB)、对羟基苯甲醇(p-HBnOH)，室温反应15min，室温、7000rpm离心取上清。将上清液(其中可能包含游离形式的dsDNAHosA，以1.8mM游离形式的dsDNAHosA作为阳性对照)加入Cas12a、gRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)以及经FAM/BHQ的ssDNA(序列如SEQ ID NO:9所示)的混合物(50nM Cas12a、50nM gRNA以及250nM ssDNA，处于20μL NEB
Figure BDA0002023167970000183
缓冲液中)，混合后立即置于BMG CLARIOstar酶标仪(BMG Labtech，英国)中37℃反应，在480nm激发光和520nm发射光下测定并记录反应体系的荧光强度。结果如图3E所示，阳性对照(即游离形式的dsDNAHosA)和p-HBA组获得了最强的荧光强度，而p-HBA类似物(对羟苯基乙醇、p-ABA、p-MHB、p-HBnOH)组的荧光强度小于阳性对照组的5％。并且该结果与EMSA的结果(图3D)类似，说明本发明的p-HBA生物传感器能够准确地对小分子进行识别并且进行检测。
1.4p-HBA的线性检测范围
为了探究不同浓度的p-HBA对荧光强度变化的影响，取不同浓度(1.8、9、18、90、180、900、1800nM)的p-HBA进行检测，测定并记录反应体系荧光强度，结果如图4C(左栏)所示，随着p-HBA浓度的增加，游离的dsDNAHosA含量随之增多，荧光强度的变化也随之提高。为分析p-HBA浓度与反应体系荧光强度变化之间的线性关系，取荧光值线性增加区间的斜率，以p-HBA浓度为横坐标，对应的斜率为纵坐标作图4C(右栏)，可知dsDNA的线性检测范围9-180nM，回归方程分别为：y＝6.3x+656.6，R2＝0.992。因此，根据本发明的PHBA传感器性能也具有出色的检测极限(可低至1.8nM)。
因此，本发明的传感器和方法具有普适性，可借助多种别构转录因子对特定小分子化合物进行高灵敏度、高速、高通量的检测，不仅操作简单，而且成本低廉，在实验室以及工业应用中均具有广阔的应用前景。
序列表
<110> 华东理工大学;中国科学院微生物研究所
<120> 基于CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、试剂盒及其在小分子检测中的用途
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Ala Arg Met Asp Asn Asp Thr Ala Ala Leu Leu Glu Arg Ile
1 5 10 15
Arg Ser Asp Trp Ala Arg Leu Asn His Gly Gln Gly Pro Asp Ser Asp
20 25 30
Gly Leu Thr Pro Ser Ala Gly Pro Met Leu Thr Leu Leu Leu Leu Glu
35 40 45
Arg Leu His Ala Ala Leu Gly Arg Glu Ile Glu Arg Thr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Gly Leu Asn Ala Ala Gly Trp Asp Leu Leu Leu Thr Leu Tyr Arg
65 70 75 80
Ser Ala Pro Pro Glu Gly Leu Arg Pro Thr Glu Leu Ser Ala Leu Ala
85 90 95
Ala Ile Ser Gly Pro Ser Thr Ser Asn Arg Ile Val Arg Leu Leu Glu
100 105 110
Lys Gly Leu Ile Glu Arg Arg Glu Asp Glu Arg Asp Arg Arg Ser Ala
115 120 125
Ser Ile Arg Leu Thr Pro Gln Gly Arg Ala Leu Val Thr His Leu Leu
130 135 140
Pro Ala His Leu Ala Thr Thr Gln Arg Val Leu Ala Pro Leu Ser Ala
145 150 155 160
Gln Glu Gln Arg Thr Leu Glu Glu Leu Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly
165 170 175
Leu Glu Gln Gly Val
180
<210> 2
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ile Ala Ala Asp Ser Leu Pro Gly Val Tyr Met Ala Leu Arg Asn
1 5 10 15
Lys Ala Phe His Gln Leu Arg Gln Leu Phe Gln Gln His Thr Ala Arg
20 25 30
Trp Gln His Glu Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Gln Tyr Ala Val Met
35 40 45
Arg Ala Ile Ala Asp Lys Pro Gly Ile Glu Gln Val Ala Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Ala Val Ser Thr Lys Ala Thr Leu Ala Glu Met Leu Ala Arg Met
65 70 75 80
Glu Asn Arg Gly Leu Val Arg Arg Glu His Asp Ala Ala Asp Lys Arg
85 90 95
Arg Arg Phe Val Trp Leu Thr Ala Glu Gly Glu Lys Val Leu Ala Ala
100 105 110
Ala Ile Pro Ile Gly Asp Ser Val Asp Ala Glu Phe Leu Gly Arg Leu
115 120 125
Ser Gly Glu Glu Gln Glu Leu Phe Met Gln Leu Val Arg Lys Met Met
130 135 140
Ser Lys
145
<210> 3
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
195 200 205
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ser Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Lys Ser Ala Gln Thr Asn Ser
1 5 10 15
Ile Thr Pro Ile Ile Lys Ile Thr Asn Thr Ser Asp Ser Asp Leu Asn
20 25 30
Leu Asn Asp Val Lys Val Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ser Asp Gly Thr Gln
35 40 45
Gly Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser
50 55 60
Tyr Val Asp Asn Thr Ser Lys Val Thr Ala Asn Phe Val Lys Glu Thr
65 70 75 80
Ala Ser Pro Thr Ser Thr Tyr Asp Thr Tyr Val Glu Phe Gly Phe Ala
85 90 95
Ser Gly Ala Ala Thr Leu Lys Lys Gly Gln Phe Ile Thr Ile Gln Gly
100 105 110
Arg Ile Thr Lys Ser Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Thr Asn Asp Tyr
115 120 125
Ser Phe Asp Ala Ser Ser Ser Thr Pro Val Val Asn Pro Lys Val Thr
130 135 140
Gly Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Val Leu Gly Thr Ala Pro
145 150 155
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tactgagcca tgtatccagg tcattgtact tagatgtcta cctaagctct gacagttcca 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tactgagcca tgtatccagg tcattgcgtt cgtatacgaa cagtagctct gacagttcca 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tactgagcca tgtatccagg tcattgcgtt cgtatacgaa cagtagctct gacagttcca 60
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gattagcgta cgcacgttac 20
<210> 9
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaauuucuac uguuguagau uacuuagaug ucuaccua 38
<210> 10
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaauuucuac uguuguagau cguucguaua cgaacagu 38
<210> 11
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaauuucuac uguuguagau ucccuaucag ugauagag 38
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtggtggtgg tggtgctcga gtggtgctgt accaagaact t 41
<210> 14
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtgaaagtg ggtctctcga gtctggcggc ggcggctctg gcggcggcgg ctctggcggc 60
ggcggcatgt cagttgaatt ttaca 85
<210> 15
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcgaacagg gtgttctcga gtctggcggc ggcggctctg gcggcggcgg ctctggcggc 60
ggcggcatgt cagttgaatt ttacaa 86
<210> 16
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtgaaagtg ggtctctcga gtctggcggc ggcggctctg gcggcggcgg ctctggcggc 60
ggcggcatgt cagttgaatt ttaca 85
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaattaata cgactcacta taggg 25
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tggaactgtc agagcttagg tagacatcta agtacaatga cctggataca tggctcagta 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggaactgtc agagctactg ttcgtatacg aacgcaatga cctggataca tggctcagta 60
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggaactgtc agagcttctc tatcactgat agggacaaat gacctggata catggctca 59
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gttgtaaaac gacggccagt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acacaggaaa cagctatgac 20
<210> 23
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taggtagaca tctaagtaat ctacaacagt agaaattccc tatagtgagt cgtattaatt 60
tc 62
<210> 24
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
actgttcgta tacgaacgat ctacaacagt agaaattccc tatagtgagt cgtattaatt 60
tc 62
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctctatcact gatagggaat ctacaacagt agaaattccc tatagtgagt cgtattaat 59

Claims (6)

1.一种用于检测小分子的组合物，所述组合物包含识别试剂和换能试剂，其中，
所述识别试剂包含别构转录因子(aTF)和双链DNA(dsDNA)，所述dsDNA包含所述aTF的结合位点、CRISPR/Cas12a系统的识别位点PAM以及与向导RNA至少部分互补的序列；以及所述换能试剂包含所述CRISPR/Cas12a系统，
其中，所述组合物还含有发光/生色基团。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物处于生物传感器的形式。
3.一种用于检测小分子的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的组合物。
4.一种对待测样品中的小分子进行检测的方法，所述方法包括用权利要求1或2所述的组合物或如权利要求3所述的试剂盒对所述待测样品中的小分子进行检测。
5.权利要求1或2所述的组合物在制备检测小分子的试剂盒中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述试剂盒用于环境污染监控、食品和化妆品质量控制和疾病诊断。
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