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CN111819276B - 反应处理装置 - Google Patents

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CN111819276B
CN111819276B CN201980018161.4A CN201980018161A CN111819276B CN 111819276 B CN111819276 B CN 111819276B CN 201980018161 A CN201980018161 A CN 201980018161A CN 111819276 B CN111819276 B CN 111819276B
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Optoelectronics Group Japan Branch
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Abstract

反应处理装置(30)包括：反应处理容器(10)；对样本照射第1激发光并对样本产生的第1荧光进行检测的第1荧光检测装置(50)；以及对样本照射第2激发光并对样本产生的第2荧光进行检测的第2荧光检测装置(54)。第1荧光的波长范围和第2激发光的波长范围的至少一部分重叠。第1激发光及第2激发光以规定的占空比闪烁发光，在将第1激发光和第2激发光的闪烁的占空比设为d时，第1激发光和第2激发光的闪烁的相位差被设定在2π(pm‑Δpm)[rad]～2π(pm+Δpm)[rad]的范围内、或2π{(1‑pm)‑Δpm}[rad]～2π{(1‑pm)+Δpm}[rad]的范围内(其中pm＝d‑d2及Δpm＝0.01×pm)。

Description

反应处理装置
技术领域
本发明涉及用于聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)的反应处理装置。
背景技术
基因检查被广泛应用于各医学领域中的检查、农作物或病原性微生物的识别、食品的安全性评价、以及病原性病毒或各种感染症的检查中。为了高灵敏度地检测微小量的DNA，已知对将DNA的一部分进行扩增而得到的结果进行分析的方法。其中，使用了PCR的方法是对从活体等提取的极微量的DNA的某一部分选择性地进行扩增的受到瞩目的技术。
PCR是对将含有DNA的活体样本与由引物或酶等构成的PCR试剂混合而得到的样本施加规定的热循环，反复引起变性、退火及延伸反应，对DNA的特定部分选择性地进行扩增的技术。
在PCR中，一般是向PCR配管或形成有多个孔洞的微板(微孔)等反应处理容器中加入规定量的对象样本来进行的。但近年，使用具备在基板上形成有微细的流路的反应处理容器(也被称为芯片)来进行的技术已被实用化(例如专利文献1)。
[在先技术文献]
[专利文献]
专利文献1：日本特开2009-232700号公报
发明内容
[发明要解决的课题]
在使用具备上述那样的流路的反应处理容器的PCR中，有时因检测样本的定量的变化等目的而使用荧光检测装置。在样本中添加荧光色素，并在PCR的期间使用荧光检测装置向样本照射激发光，来检测样本发出的荧光。由于随着DNA的扩增的进展而从样本发出的荧光的强度增加，所以能够将该荧光的强度值作为PCR的进展或反应的终端的判定材料的指标。
在PCR中，根据扩增对象而使用混合有多种荧光色素的试剂的情况较多，在这种情况下需要设置多个荧光检测装置。特别是在一边使样本在形成于板状的反应处理容器内的流路中流动、一边检测来自样本的荧光那样的反应处理装置中，为了检测通过一条截面积例如为2mm2以下的流路的样本的荧光，需要沿流路的延伸方向排列多个荧光检测装置。
例如，在通过PCR使O-157扩增的情况下，需要同时测定VT1，VT2。例如东洋纺株式会社的检查套装(FIK-362)中，作为荧光色素使用ROX(为通过大致绿色光的照射被激发，并发出大致红色的荧光的荧光色素，以下将这样的荧光的特性称为“绿激发/红荧光”)、Cy5(红激发/红外荧光)。在这种情况下需要2个荧光检测装置。
另外，在检测诺如病毒的情况下需要同时测定G1，G2，例如宝生物株式会社的检查套装(RR255A)及东洋纺株式会社的检查套装(FIK-253)在荧光色素中都使用了FAM(蓝激发/绿荧光)、ROX(绿激发/红荧光)、Cy5(红激发/红外荧光)。这种情况需要3个荧光检测装置。
在像这样使用多个荧光检测装置对通过流路的样本进行荧光检测的情况下，有可能在荧光检测装置间产生干扰。以下举例来进行说明。
在同时向样本添加FAM和ROX作为荧光色素使用的情况下，为激发ROX而照射的激发光的与大致绿色相当的光的波长范围，和从FAM发出的荧光的与大致绿色相当的光的波长范围的一部分存在重叠。该情况下，为激发ROX而照射的激发光的一部分若进入用于检测从FAM发出的荧光的光电转换元件等光检测器中，则成为干扰，有可能无法进行高灵敏度的测定。通常，激发光的光量为数十μW，而检测对象的荧光的光量为数pW以下的量级。因荧光检测装置以能够检测这样的微弱光量的荧光的方式构成，所以即使仅有极少的一部分激发光到达该光检测器，也会呈现为较大的噪声。
另外，在同时向样本添加ROX和Cy5作为荧光色素使用的情况下，为激发Cy5而照射的激发光的大致红色的光的波长范围，和从ROX发出的荧光的与大致红色相当的光的波长范围的一部分存在重叠。这种情况下，为激发Cy5而照射的激发光的一部分若进入到用于检测从ROX发出的荧光的光检测器中，也会成为噪声，有可能无法进行高灵敏度的荧光测定。
本发明鉴于以上课题而完成，其目的在于提供一种在具备多个荧光检测装置的反应处理装置中，能够抑制荧光检测装置间的干扰的技术。
[用于解决技术课题的技术方案]
为解决上述课题，本发明的一个方案的反应处理装置包括：形成有供样本移动的流路的反应处理容器；使第1激发光照射流路中所设定的第1荧光检测区域中的样本，并对通过第1激发光的照射而从样本产生的第1荧光进行检测的第1荧光检测装置；以及使第2激发光照射流路中设定的第2荧光检测区域中的样本，并对通过第2激发光的照射而从样本产生的第2荧光进行检测的第2荧光检测装置。第1荧光的波长范围和第2激发光的波长范围的至少一部分重叠。第1激发光及第2激发光以规定的占空比闪烁发光。在将第1激发光和第2激发光的闪烁的占空比设为d时，第1激发光与第2激发光的闪烁的相位差被设定在2π(pm-Δpm)[rad]～2π(pm+Δpm)[rad]的范围内、或2π{(1-pm)-Δpm}[rad]～2π{(1-pm)+Δpm}[rad]的范围内(其中pm＝d-d2及Δpm＝0.01×pm)。
本发明的其他方案也是反应处理装置。该装置包括：形成有供样本移动的流路的反应处理容器；使第1激发光照射流路中设定的第1荧光检测区域中的样本，并对通过第1激发光的照射而从样本产生的第1荧光进行检测的第1荧光检测装置；以及使第2激发光照射流路中设定的第2荧光检测区域中的样本，并对通过第2激发光的照射而从样本产生的第2荧光进行检测的第2荧光检测装置。第1荧光的波长范围和第2激发光的波长范围的至少一部分重叠。第1激发光及第2激发光以规定的占空比闪烁发光。在将第1激发光和第2激发光的闪烁的占空比设为d时，第1激发光与第2激发光的闪烁的相位差被设定在2π(pm-Δpm)[rad]～2π(pm+Δpm)[rad]的范围内、或2π{(1-pm)-Δpm}[rad]～2π{(1-pm)+Δpm}[rad]的范围内(其中pm＝d-d2及Δpm＝(d-d2)/{k·(N0')/V1 0}，N0'是第1激发光和第2激发光的闪烁的相位差为0rad时的第1荧光检测装置的信号输出的噪声，V1 0是第2荧光检测装置未工作的情况下的第1荧光检测装置的信号输出，k＝20)。
在上述方案中，也可以是k＝100/3。另外，也可以是k＝100。
第1荧光检测装置也可以具备照射第1激发光并接收第1荧光的第1光学头。第2荧光检测装置也可以具备照射第2激发光并接收第2荧光的第2光学头。在第1光学头及第2光学头的数值孔径处于0.07～0.23的范围内的情况下，第1荧光检测区域的中心与第2荧光检测区域的中心之间的距离也可以被设定为4mm以上。
流路也可以具备：维持在第1温度的第1温度区域；维持在高于第1温度的第2温度的第2温度区域；以及连接第1温度区域和第2温度区域的连接区域。也可以基于由第1荧光检测装置检测到的荧光信号来控制流路内的样本的移动。第1荧光检测区域也可以设定于连接区域的大致中间点。
第1荧光检测装置也可以照射蓝色光作为第1激发光，并且检测绿色光作为第1荧光。第2荧光检测装置也可以照射绿色光作为第2激发光，并且检测红色光作为第2荧光。
也可以还包括使第3激发光照射设定于流路的第3荧光检测区域中的样本，并对通过第3激发光的照射而从样本产生的第3荧光进行检测的第3荧光检测装置。第3荧光检测装置也可以照射红色光作为第3激发光，并且检测红外光作为第3荧光。
第1荧光检测装置的第1光学头配置于中央，第2荧光检测装置的第2光学头及第3荧光检测装置的第3光学头也可以配置于第1光学头的两侧。
[发明效果]
根据本发明，可以提供一种在具备多个荧光检测装置的反应处理装置中，能够抑制荧光检测装置间的干扰的技术。
附图说明
图1的(a)及图1的(b)是用于说明在本发明的实施方式的反应处理装置中可使用的反应处理容器的图。
图2是用于说明本发明的实施方式的反应处理装置的示意图。
图3是用于说明荧光检测装置的构成的图。
图4是表示第1荧光检测装置的第1光学头和第2荧光检测装置的第2光学头所配置的状态的图。
图5是用于说明对来自荧光检测器的荧光信号进行处理的锁相放大器的电路构成的图。
图6是表示使第1调制信号和第2调制信号的相位差变化时的、第1荧光检测装置的第1信号输出的测量结果的图。
图7是表示基于来自FAM水溶液的荧光信号的信号输出与相位差的关系的图。
图8是表示第1调制信号和第2调制信号的占空比均为50％时的、噪声与相位差的关系的图。
图9是表示第1调制信号和第2调制信号的占空比均为30％时的、噪声与相位差的关系的图。
图10是表示第1调制信号和第2调制信号的占空比均为40％时的、噪声与相位差的关系的图。
图11的(a)～图11的(d)是用于说明使2个荧光检测装置中的一者停止时的锁相放大器的动作的图。
图12的(a)～图12的(f)是用于说明使2个荧光检测装置的二者都工作时的锁相放大器的动作的图。
图13是用于说明对与噪声的信号输出的最小值对应的相位差的容许幅度的决定方法的图。
图14是表示使第2荧光检测装置停止时的来自第1荧光检测装置的信号输出与时刻的关系的图。
图15是表示使第2荧光检测装置动作时的来自第1荧光检测装置的信号输出与时刻的关系的图。
图16是用于说明本发明的实施例的图。
图17是表示在实施例1中，将荧光点间距离设为4mm时的第1荧光检测装置输出的荧光信号的图。
图18是表示实施例1的PCR的扩增结果的图。
图19是表示比较例中第1荧光检测装置输出的荧光信号的图。
图20是表示比较例的PCR的扩增结果的图。
图21是用于说明本发明的其他实施方式的反应处理装置的图。
具体实施方式
以下，说明本发明的实施方式的反应处理装置。对各附图中表示的相同或同等的构成要素、构件、处理标注相同的附图标记，并适当省略重叠的说明。另外，实施方式并非限定发明而是示例，并非实施方式所述的所有特征或其组合都一定是发明的本质内容。
图1的(a)及图1的(b)是用于说明在本发明的实施方式的反应处理装置中可使用的反应处理容器10的图。图1的(a)是反应处理容器10的俯视图，图1的(b)是反应处理容器10的主视图。
如图1的(a)及图1的(b)所示，反应处理容器10由基板14和流路密封薄膜16组成。
基板14优选由针对温度变化较稳定，且不易被所使用的样本溶液侵入的材质形成。进而，基板14优选由成形性好、透明性和屏障性良好、并且具有较低的自身荧光性的材质形成。作为这样的材质，有玻璃、硅(Si)等无机材料，以及丙烯酸、聚酯、硅酮等树脂，其中环烯烃聚合物树脂为优选。基板14的尺寸的一个示例为长边75mm，短边25mm，厚度4mm。
基板14的下表面14a上形成有槽状的流路12，该流路12被流路密封薄膜16密封。形成于基板14的下主表面14a的流路12的尺寸的一个示例为宽度0.7mm，深度0.7mm。在基板14的流路12的一端的位置上形成有与外部联通的第1连通口17。在基板14的流路12的另一端的位置上形成有第2连通口18。形成于流路12的两端的一对第1连通口17和第2连通口18被以在基板14的上表面14b上露出的方式形成。这样的基板能够通过注射成型或由NC加工机等进行的切削加工来制作。
如图1的(b)所示，基板14的下表面14a上粘贴有流路密封薄膜16。在实施方式的反应处理容器10中，流路12的大部分形成为在基板14的下表面14a上露出的槽状。这是为了能够通过使用金属模具等的注射成型而容易地成形。为了将该槽密封而作为流路使用，基板14的下表面14a上粘贴有流路密封薄膜16。
流路密封薄膜16可以是一个主表面具有粘合性或接合性，也可以在一个主表面形成有通过按压或紫外线等能量照射、加热等来发挥粘合性或接合性的功能层，具备能够容易地与基板14的下表面14a紧贴并一体化的功能。流路密封薄膜16优选由包括粘合剂在内都具有较低的自身荧光性的材质形成。在这点上，由环烯烃聚合物、聚酯、聚丙烯、聚乙烯或丙烯酸等树脂构成的透明薄膜适合，但并不限定于这些。另外，流路密封薄膜16也可以由板状的玻璃或树脂形成。在这种情况下，由于能够期待刚性，所以有助于防止反应处理容器10的翘曲或变形。
流路12包括能够通过后述的反应处理装置控制多个水准的温度的反应区域。通过使样本在被维持多个水准的温度的反应区域连续往复地移动，能够对样本施加热循环。
图1的(a)及图1的(b)所示的流路12的反应区域，包含组合了曲线部与直线部的连续折返的蜿蜒状的流路。在反应处理容器10被安装于后述的反应处理装置时，预定流路12的纸面右侧为较高温(约95℃)的区域(以下，称为“高温区域”)，流路12的左侧为比其低温(约60℃)的区域(以下，称为“低温区域”)。另外流路12的反应区域包含在高温区域和低温区域之间连接二者的连接区域。该连接区域可以为直线状的流路。
像本实施方式这样将高温区域及低温区域设为蜿蜒状的流路的情况下，能够有效地使用构成后述的温度控制装置的加热器等的有效面积，易于减少反应区域内的温度的偏差，并能够缩小反应处理容器的实体的大小，具有能够使反应处理装置缩小的优点。
供于热循环的样本被从第1连通口17及第2连通口18的任意一者导入流路12。导入的方法不限于此，例如也可以用移液管或滴定管、注射器等从该连通口直接导入适量的样本。或者，也可以是经由内置有由多孔的PTFE或聚乙烯构成的过滤器的圆锥形的针尖来防止污染的导入方法。这样的针尖一般有许多种类在销售且能够容易地获得，可安装在移液管或滴定管、注射器等的前端来使用。进而，也可以利用移液管或滴定管、注射器等进行样本的排出、导入后，通过进一步地加压推动而使样本移动到流路的规定的位置。
作为样本，例如可例举在包含一或二种以上的DNA的混合物中，添加荧光色素、耐热性酶及4种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)作为PCR试剂的样本。进而，混合与反应处理对象的DNA产生特异反应的引物，进而根据情况混合TaqMan等荧光探针(TaqMan/TaqMan是罗氏诊断产品的注册商标)。也可以使用市售的实时PCR用试剂套装等。
图2是用于说明本发明的实施方式的反应处理装置30的示意图。
本实施方式的反应处理装置30包括：载置有反应处理容器10的反应处理容器载置部(未图示)；温度控制系统32；CPU36。温度控制系统32如图2所示，针对载置于反应处理容器载置部的反应处理容器10，构成为能够高精度地将反应处理容器10的流路12的纸面右侧的区域维持、控制在约95℃(高温区域)，将纸面左侧的区域维持、控制在约60℃(低温区域)。
温度控制系统32是维持反应区域的各温度区域的温度的装置，具体地说，包括：用于加热流路12的高温区域的高温用加热器60；用于加热流路12的低温区域的低温用加热器62；用于测量各温度区域的实际温度的例如热电偶等温度传感器(未图示)；控制高温用加热器60的温度的高温用加热器驱动器33；控制低温用加热器62的温度的低温用加热器驱动器35。通过温度传感器测量到的实际温度信息被发送到CPU36。CPU36基于各温度区域的实际温度信息，控制各加热器驱动器以使各加热器的温度达到规定的温度。各加热器例如可以是电阻加热元件或帕尔贴元件等。温度控制系统32进而也可以还包括用于使各温度区域的温度控制性提高的其他要素部件。
本实施方式的反应处理装置30还包括用于使导入到反应处理容器10的流路12内的样本20在流路12内移动的送液系统37。送液系统37包括：第1泵39；第2泵40；用于驱动第1泵39的第1泵驱动器41；用于驱动第2泵40的第2泵驱动器42；第1配管43；第2配管44。
反应处理容器10的第1连通口17连接有第1配管43的一端。优选在第1连通口17和第1配管43的一端的连接部上配置用于确保气密性的密封件45或密封圈。第1配管43的另一端与第1泵39的输出连接。同样，反应处理容器10的第2连通口18连接有第2配管44的一端。优选在第2连通口18和第2配管44的一端的连接部上配置用于确保气密性的密封件46或密封圈。第2配管44的另一端与第2泵40的输出连接。
第1泵39、第2泵40例如可以是由隔膜泵构成的微型增压泵。作为第1泵39、第2泵40，例如可以使用株式会社村田制作所制造的微型增压泵(型号MZB1001T02)等。该微型增压泵在动作时能够使次级侧的压力比初级侧提高，但在停止的瞬间或停止时初级侧和次级侧的压力变得相等。
CPU36经由第1泵驱动器41、第2泵驱动器42控制来自第1泵39、第2泵40的送风或加压。来自第1泵39、第2泵40的送风或加压通过第1连通口17、第2连通口18作用于流路内的样本20，成为推进力使样本20移动。更详细地说，通过使第1泵39、第2泵40交替动作，因施加到样本20的某一端面的压力比施加到另一端的压力大，所以能得到涉及样本20的移动的推进力。通过使第1泵39、第2泵40交替动作，能够使样本20在流路内往复式地移动，并通过反应处理容器10的流路12的各温度区域，其结果，能够对样本20施加热循环。更具体地说，通过反复施加在高温区域变性、在低温区域退火/延伸的各工序，使样本20中的目标DNA选择性地扩增。换言之，可以将高温区域看作变性温度域，将低温区域看作退火/延伸温度域。另外在各温度区域滞留的时间，可以通过改变样本20在各温度区域的规定的位置停止的时间来适当设定。
本实施方式的反应处理装置30进而包括第1荧光检测装置50及第2荧光检测装置54。如上所述，样本20中添加有规定的荧光色素。由于随着DNA的扩增的进展，从样本20发出的荧光信号的强度增加，所以能够将该荧光信号的强度值作为PCR的进度或反应的终端的判定材料的指标。
作为第1荧光检测器50及第2荧光检测器54，可以使用日本板硝子株式会社制造的光纤型荧光检测器FLE-510，其是非常紧凑的光学系统，能够迅速地进行测定，并且不论在明亮的场所或黑暗的场所都能检测荧光。该光纤型荧光检测器能够将其激发光/荧光的波长特性预先调谐为适合样本20所发出的荧光特性，能够对具有各种特性的样本提供最适合的光学检测系统，进而由于光纤型荧光检测器带来的光线直径的细小度，适合用于检测来自存在于流路等较小或较细的区域中的样本的荧光。
第1荧光检测装置50包括：第1光学头51；第1荧光检测用激发光源/检测器模块52；连接第1光学头51和第1荧光检测用激发光源/检测器模块52的光纤F12。同样，第2荧光检测装置54包括：第2光学头55；第2荧光检测用激发光源/检测器模块56；连接第2光学头55和第2荧光检测用激发光源/检测器模块56的光纤F22。
第1荧光检测用激发光源/检测器模块52、第2荧光检测用激发光源/检测器模块56中分别包含：激发光用光源；波分复用器；荧光检测器；用于控制它们的驱动器等。第1光学头51、第2光学头55分别由透镜等光学系统构成，承担激发光对样本的指向性照射和样本发出的荧光的聚光的功能。被由第1光学头51、第2光学头55聚光的荧光分别通过光纤F12、F22而被第1荧光检测用激发光源/检测器模块52、第2荧光检测用激发光源/检测器模块56内的波分复用器与激发光分开，由荧光检测器转换为电信号。关于荧光检测装置的构成的详细，将在后文叙述。
在本实施方式的反应处理装置30中，第1光学头51被以能够从通过连接高温区域与低温区域的连接区域内的一部分区域12a(称为“第1荧光检测区域12a”)的样本20检测荧光的方式配置。另外，第2光学头55被以能够从通过连接区域内的另一部分区域12b(称为“第2荧光检测区域12b”)的样本20检测荧光的方式配置。由于通过使样本20在流路内反复地往复移动从而反应进展，样本20所包含的规定的DNA扩增，所以通过监控检测到的荧光的量的变动，能够实时地了解DNA扩增的进度。
图3是用于说明荧光检测装置的构成的图。在图3中说明第1荧光检测装置50的构成，但第2荧光检测装置54除了带通滤波器的中心波长不同这点之外也是相同构成。
如图3所示，第1荧光检测装置50包括：第1光学头51；第1荧光检测用激发光源/检测器模块52；连接第1光学头51和第1荧光检测用激发光源/检测器模块52的光纤F12。第1荧光检测用激发光源/检测器模块52包括：第1激发光源64；第1波分复用器65；第1荧光检测器66，这些功能性要素被由光纤连接，激发光及荧光在光纤内传播。
在第1激发光源64的附近，带通滤波器A1以透射第1激发光源64射出的激发光的方式配置。第1波分复用器65具有带通滤波器B1。在第1荧光检测器66的附近，带通滤波器C1以透射入射到第1荧光检测器66的荧光的方式配置。这些带通滤波器的波长特性例如根据FAM等荧光色素的激发/荧光相关的波长特性而设计。各带通滤波器具有使特定的波长范围的光高效地透射(例如透射率75％以上)，并使其之外的波长的光高效地反射(例如反射率75％以上；优选85％以上)的分光功能。
在本实施方式中，第1荧光检测装置50被构成为能够检测来自含有FAM作为荧光色素的样本的荧光。
第1激发光源64只要是之后能够对目标波长的光进行分光的光源即可，不特别限定，例如可以使用LD或LED、白色光源等。从第1激发光源64射出的激发光被带通滤波器A1分光，仅使中心波长为约470nm的规定范围的波长的光(以下称为“激发光OE1”)在光纤F11内传播。
激发光OE1入射到第1波分复用器65，被由透镜L1校准后到达带通滤波器B1。由于带通滤波器B1以反射激发光OE1的方式设计，激发光OE1被透镜L1再次聚光，并入射到光纤F12。激发光OE1在光纤F12内传播，到达第1光学头51。第1光学头51内具备物镜OB1，使激发光OE1以规定的工作距离作为激发光照射样本20。
若激发光OE1照射到样本20，则样本20内的荧光色素被激发，从样本20出射荧光OF1。荧光OF1被由第1光学头51的物镜OB1聚光并入射到光纤F12，在光纤F12内传播。荧光OF1入射到第1波分复用器65，被由透镜L1校准后到达带通滤波器B1。
一般地，通过激发光的照射而产生的荧光的波长比激发光的波长更长。即，若将激发光的中心波长设为λe，将荧光的中心波长设为λf，则λe<λf。因此，为仅将荧光OF1引导至第1荧光检测器66，使用具有使波长λe的光反射、使波长λf的光透射的光谱特性的设备作为带通滤波器B1。带通滤波器B1以透射荧光OF1中与激发光OE1的波长不重叠的范围的波长的光的方式设计。通过带通滤波器B1后的荧光OF1被透镜L2聚光并入射到光纤F13。另外，由于带通滤波器B1具有使激发光反射并使荧光透射的功能，所以可以使用与其中心波长相对应、能够使包含λe的波长范围的光反射并使包含λf的波长范围的光透射的边缘滤波器(edge filter)来代替带通滤波器。
在光纤F13内传播的荧光OF1到达第1荧光检测器66。为严密地调整波长域，荧光OF1也可以在入射到第1荧光检测器66前通过带通滤波器C1。第1荧光检测器66中仅入射通过了带通滤波器B1和C1的、中心波长为约530nm的规定范围的波长的光。第1荧光检测器66例如为PD或APD、光电倍增管(photomultiplier)等光电转换元件。被由第1荧光检测器66转换为电信号的信号，进行后述的信号处理。
在图3所示的第1荧光检测装置50中，各要素也可以包含用于使光高效地传送或耦合、使带通滤波器的利用效率提高的透镜。作为透镜可以使用折射率分布型透镜、球透镜或非球面透镜等。另外，在图3所示的第1荧光检测装置50中，光纤F11、F12及F13可以使用单模光纤或多模光纤等。
如上述那样构成的第1荧光检测装置50将中心波长为470nm且波长范围为约450～490nm的光作为第1激发光OE1照射到样本，并检测样本发出的、中心波长为530nm且波长范围为约510～550nm的第1荧光OF1。本领域技术人员应能够理解，波长相关的特性如上述那样根据各带通滤波器的透射或反射特性的组合而决定，它们可以变更或定制。
另一方面，在本实施方式中，第2荧光检测装置54被构成为能够检测来自含有ROX作为荧光色素的样本的荧光。第2荧光检测装置54使中心波长为530nm且波长范围为约510～550nm的光作为第2激发光OE2照射到样本，并检测中心波长为610nm且波长范围为约580～640nm的第2荧光OF2。
图4表示第1荧光检测装置50的第1光学头51和第2荧光检测装置54的第2光学头55所配置的状态。第1光学头51以能够从通过流路12的第1荧光检测区域12a的样本20检测荧光的方式配置。第2光学头55以能够从通过流路12的第2荧光检测区域12b的样本20检测荧光的方式配置。另外，第1荧光检测装置50的第1光学头51和第2荧光检测装置54的第2光学头55中的任意一个也可以配置于连接区域的中间或低温区域与高温区域的中间附近。
如图4所示，第1光学头51使在光纤F12内传播的第1激发光OE1由物镜OB1聚光并照射到通过第1荧光检测区域12a的样本20，使从样本20发出的第1荧光OF1由物镜OB1聚光并入射到光纤F12。同样，第2光学头55使在光纤F22内传播的第2激发光OE2由物镜OB2聚光并照射到通过第2荧光检测区域12b的样本20，使从样本20发出的第2荧光OF2由物镜OB2聚光并入射到光纤F22。
第1光学头51、第2光学头55的直径例如为1～4mm，第1光学头51和第2光学头55以直径以上的任意间隔配置。在此，将从第1光学头51照射第1激励光OE1的第1荧光检测区域12a的中心与从第2光学头55照射第2激励光OE2的第2荧光检测区域12b的中心之间的距离称为“荧光点间距离tp”。
作为物镜OB1、OB2，可以使用光焦度(power)为正的透镜或透镜组，例如为折射率分布型透镜的SELFOC(注册商标)微透镜。物镜OB1、OB2例如可以使用直径为1.8mm、数值孔径(NA)为0.23、WD为1mm～3mm的物镜。
在本实施方式中，第1荧光检测装置50的第1激发光源被第1调制信号调制并闪烁发光。同样，第2荧光检测装置54的第2激发光源被第2调制信号调制并闪烁发光。
图5是用于说明对来自荧光检测器的荧光信号进行处理的锁相放大器的电路构成的图。
在本实施方式中，来自第1荧光检测装置50的第1荧光检测器66的第1荧光信号被由第1锁相放大器68处理。第1锁相放大器68具备：IV放大器70；高通滤波器80；反相/非反相放大器81；低通滤波器82。第1荧光检测器66输出的第1荧光信号被IV放大器70适当放大后，被高通滤波器(HPF)80除去DC成分。该信号进而通过反相/非反相放大器81与第1调制信号同步检波而被直流化。被直流化的信号接着通过低通滤波器(LPF)82除去噪声，最终得到第1荧光检测装置50的第1信号输出。
来自第2荧光检测装置54的第2荧光检测器67的第2荧光信号被由第2锁相放大器69处理。第2锁相放大器69的构成与第1锁相放大器68相同，通过由第2锁相放大器69处理来自第2荧光检测器67的第2荧光信号，最终得到第2荧光检测装置54的第2信号输出。
在本实施方式中，为检测通过一条流路12的样本20，第1光学头51及第2光学头55并列配置。如上述那样，第1荧光检测装置50照射中心波长为470nm且波长范围为约450～490nm的第1激发光OE1，并检测中心波长为530nm且波长范围为约510～550nm的第1荧光OF1。另外，第2荧光检测装置54照射中心波长为530nm且波长范围为约510～550nm的第2激发光OE2，并检测中心波长为610nm且波长范围为约580～640nm的第2荧光OF2。因此，第2激发光OE2的波长范围(约510～550nm)和第1荧光OF1的波长范围(约510～550nm)重叠。在这种情况下，若第2光学头55照射的第2激发光OE2的一部分被第1光学头51检测到，则该第2激发光OE2有可能不被第1光学头51的后级的带通滤波器B1、C1除去，而到达第1荧光检测器66。该第2激发光OE2在第1荧光检测器66中为噪声，有可能不能检测到本来应检测的第1荧光OF1。
只要将第1光学头51和第2光学头55充分分离地配置就不会产生这样的问题，但在这种情况下反应处理装置30的尺寸会大型化。本发明人为解决这样矛盾的课题，对在将2个光学头并列地配置的情况下对荧光的检测产生怎样的影响进行了深入研究和调查。
本发明者实际调查了第1荧光检测装置50的第1调制信号(第1激发光源的调制信号)与第2荧光检测装置54的第2调制信号(第2激发光源的调制信号)的相位差，换言之，实际调查了第1激发光和第2激发光的闪烁的相位差对来自沿样本的荧光的检测造成怎样的影响。实验的条件如下所示。
(1)第1光学头51及第2光学头55如图4所示，以能够对来自流路12中的样本20的荧光进行聚光的方式并列配置。第1荧光检测区域12a的中心与第2荧光检测区域12b的中心之间的距离即荧光点间距离tp为4.5mm。
(2)由脉冲发生器等产生第1调制频率(110Hz)的第1调制信号，并使用该第1调制信号对来自第1激发光源的第1激发光进行调制。同样，产生第2调制频率(110Hz)的第2调制信号，并使用该第2调制信号对来自第2激发光源的第2激发光进行调制。第1调制信号和第2调制信号的占空比均为50％。
(3)使基于第1调制信号的调制和基于第2调制信号的调制的相位差变化，测量第1荧光检测装置50的第1信号输出。
此外，在本实施例中，由于对荧光信号仅检测相位差的依赖性，所以不进行热循环。
图6表示使第1调制信号和第2调制信号的相位差变化时的、第1荧光检测装置50的第1信号输出的测量结果。在图6中，黑圆点的标记表示使用FAM水溶液作为样本的情况的测量结果(表示为“FAM水溶液”)。在反应处理容器10的流路12中配置FAM水溶液(浓度30nM)，使第1调制信号和第2调制信号的相位差从0°变化至360°，并测量第1荧光检测装置50的第1信号输出。另外，在图6中，白圆点的标绘表示在反应处理容器10的流路12中什么都没有装入的状态(即空白状态)下对第1信号输出进行测量的结果(表示为“空白”)。
由图6可知，在“FAM水溶液”和“空白”的情况下，第1信号均根据相位差的变化而变化，在相位差为0°及360°(即没有相位差)时第1信号为最大，在相位差为180°时第1信号为最小。
基于从作为样本的FAM水溶液射出的荧光信号的信号输出，是从图6所示的“FAM水溶液”时的第1信号输出的值，减去“空白”时的第1信号输出的值而得到的。通过该运算，能够求出基于来自净(正味)FAM水溶液的荧光信号的信号输出。该信号输出与相位差的关系在图7中以黑四边形的标记(FAM水溶液(除空白之外))表示。
由图7可知，根据第1激发光源的第1调制信号和第2激发光源的第2调制信号的相位差的值，基于来自净FAM水溶液的荧光信号的信号强度发生变动。这意味着第2激发光对第1荧光检测装置50的荧光检测造成影响，进而意味着其影响度根据相位差而不同。
接下来，在使第2激发光源停止的情况下，针对“空白”和“FAM水溶液”，测量第1信号输出的强度并取二者的差，求出基于来自净FAM水溶液的荧光信号的信号强度。在这种情况下由于停止第2激发光源，所以没有相位差的观念，第1信号输出为恒定(4.0)。该值基于来自除空白之外的FAM水溶液的荧光信号，且是不受其他激发光/荧光检测系统影响的值。该值在图7中以实线表示(表示为“净信号s”)。
在此，从“FAM水溶液(除空白之外)”的值减去“净信号s”的绝对值相当于噪声。该噪声(N')与相位差的关系在图8中表示。由图8可知，在第2荧光检测装置54的第2激发光存在下，相位差为90°及270°时，从第1荧光检测装置50的第1荧光检测器66通过第1锁相放大器68而得到的荧光信号的噪声也为最小。
图9表示第1调制信号和第2调制信号的占空比均为30％时的、噪声与相位差的关系。图10表示第1调制信号和第2调制信号的占空比均为40％时的、噪声与相位差的关系。在图9和图10的任意一者中，将荧光点间距离tp设为4.5mm。如图9所示，占空比为30％时的噪声N'成为最小的相位差为约76°及约284°。另外如图10所示，占空比为40％时的噪声N'成为最小的相位差为约86°及约274°。
由以上的实验结果可知，根据第1调制信号和第2调制信号的占空比的不同，噪声N'成为最小的最佳相位差改变。该情况如从以下考察导出的那样，可以使用数学式来表示。
图11的(a)～图11的(d)是用于说明使2个荧光检测装置中的一者停止时的锁相放大器的动作的图。在此，考虑使第1荧光检测装置50和第2荧光检测装置54中的第2荧光检测装置54停止(不使第2激发光源闪烁发光)，将第1荧光检测装置50的第1荧光检测器66所接收到的信号通过第1锁相放大器68进行处理的情况。由于使第2荧光检测装置54停止，所以应该由第1荧光检测装置50检测的第1荧光信号不受第2荧光检测装置54的第2激发光的影响。
在图5所示的第1锁相放大器68中，将通过IV放大器70后的输出设为V1 1，将通过高通滤波器80后的输出设为V1 2，将通过反相/非反相放大器81后的输出设为V1 4a，将通过低通滤波器82后的输出设为V1 4。此外，包括此后的说明在内，锁相放大器的说明中的、包含V的输出的记号为以电压(Volt)为准的任意单位。
图11的(a)表示通过IV放大器后的输出V1 1。图11的(b)表示通过高通滤波器后的输出V1 2。图11的(c)表示通过反相/非反相放大器后的输出V1 4a。图11的(d)表示通过低通滤波器后的输出V1 4。在图11的(a)～图11的(d)中，横轴表示相位，纵轴表示信号输出。所谓的1周期为360°或2πrad。任意的相位为的关系。在此，考虑计算的容易度而主要以rad(弧度)表示相位。
在此，为了简单，考虑通过IV放大器后的输出V1 1为图11的(a)所示的矩形信号的情况。V1 1是在恒定的频率下，在1周期中，在与区间α对应的相位的区域中输出值为1、在与区间β对应的相位的区域中输出值为0的矩形信号。该矩形信号的占空比以d＝α/(α+β)(0<d<1)或d＝α/2π表示。此外，在此对通过IV放大器后的输出V1 1的占空比进行说明，但该占空比与在同一频率下从接通/断开的第1激发光源64射出的第1激发光的占空比相同。
由于图11的(a)所示的矩形信号通过高通滤波器80时直流成分被去除，所以得到如图11的(b)所示的输出信号。由于图11的(b)所示的信号通过反相/非反相放大器81时属于与上述区间β对应的相位的区域的输出信号的符号被反转，所以得到如图11的(c)所示的输出信号。进而，由于图11的(c)所示的信号通过低通滤波器82时直流成分被去除，所以得到如图11的(d)所示的输出信号。通过低通滤波器后的输出值V1 4能够使用占空比d如以下的数学式(1)那样表示。
V1 4＝2·d·(1-d)…(1)
图12的(a)～图12的(f)是用于说明使2个荧光检测装置这二者都工作时的锁相放大器的动作的图。在此，考虑使第1荧光检测装置50和第2荧光检测装置54工作，将第1荧光检测装置50的第1荧光检测器66所接收到的信号通过第1锁相放大器68进行处理的情况。由于使第2荧光检测装置54工作，所以应该由第1荧光检测装置50检测的第1荧光信号受到第2荧光检测装置54的第2激发光的影响。
图12的(a)表示没有第2荧光检测装置54的第2激发光的影响的情况下的、通过第1锁相放大器68的IV放大器70后的输出V1 1。在此，也与图11的(a)同样，为在恒定的频率下，在1周期中，在与区间α对应的相位的区域中输出值为1、在与区间β对应的相位的区域中输出值为0的矩形信号，考虑具有与图11的(a)相同占空比d的矩形信号。
图12的(b)表示来自第2荧光检测装置54的第2激发光的光被第1荧光检测器66接收，并通过第1锁相放大器68的IV放大器70后的信号。该信号为在与V1 1相同的频率下，在1周期中，在与区间α对应的相位的区域中输出值为a(0<a<1)、在与区间β对应的相位的区域中输出值为0的矩形信号。该信号具有与V1 1相同的占空比d。但是，来自第2激发光的信号为比图12的(a)所示的输出信号V1 1延迟2πp[rad](p是参数，为0<p<1)的信号。在上述以表示的相位差与以2πp[rad]表示的相位差之间，存在的关系。
图12的(c)表示实际从IV放大器70输出的输出V1 1。这是图12的(a)所示的输出信号与图12的(b)所示的输出信号的和。
图12的(d)表示通过高通滤波器80后的输出V1 2。将伴随于从高通滤波器80的通过引起的直流成分的除去所带来的偏置假设为(-x)。
由输出与相位包围的区域的面积中，以0为界、正侧的区域与负侧的区域的面积相等，所以以下数学式(2)成立。
根据(1-x)·p+(1+a-x)·(d-p)+(a-x)·p+(-x)·{1-(d+p)}＝0，
x＝(1+a)·d…(2)
图12的(e)表示通过反相/非反相放大器81后的输出V1 4a。图12的(f)表示通过低通滤波器82后的输出V1 4。由于图12的(d)所示的信号通过反相/非反相放大器81时，属于与第1荧光检测装置的区间β对应的相位的区域的输出信号的符号被反转，所以得到如图12的(e)所示的输出信号。进而，由于图12的(e)所示的信号通过低通滤波器82时交流成分被去除，所以得到如图12的(f)所示的输出信号。
考虑数学式(2)的关系，表示通过低通滤波器82后的输出(即第1信号输出)V1 4时，如以下数学式(3)所示。
V1 4＝-2·(1+a)·d2+2·(1+a)·d-2·a·p…(3)
根据以上考察，由于在第1信号输出中，从数学式(3)减去数学式(1)后的值(的绝对值)作为噪声与第1信号输出重叠，所以噪声成分V1 N的值如以下数学式(4)所示。
V1 N＝|-2·a·(d2-d+p)|…(4)
由于在数学式(4)中，d2-d+p＝0时，V1 N为最小(0)，所以这时的参数p的值pm由以下数学式(5)表示。
pm＝d-d2…(5)
根据该数学式(5)，能够计算出占空比为0.5(50％)、0.4(40％)及0.3(30％)时的pm的值分别为0.25、0.24及0.21。进而，能够求出使这些pm所对应的噪声成分V1 N为最小的最佳的相位差为0.5πrad、0.48πrad及0.42πrad。另外，在以度(°)为单位的表述中，能够求出及与上述实验结果大致一致，确认了实验结果的妥当性。另外，对照上述实验结果，则能够理解在相位差为2π(1-pm)[rad]及时，噪声成分V1 N也为最小。
像这样，在本实施方式的反应处理装置30中，通过使用数学式(5)所设定的pm将第1光学头51照射的第1激发光、第2光学头55照射的第2激发光的闪烁的相位差设为2πpm[rad]或2π(1-pm)[rad](在以度(°)为单位的表述中为360pm[°]或360(1-pm)[°])，由此能够抑制第1荧光检测装置50和第2荧光检测装置54之间的干扰。
图13是将上述噪声的表述V1 N设为N'，用于说明对与噪声N'的信号输出的最小值对应的pm中的容许幅度Δpm的决定方法的图。图13表示噪声N'的信号输出与相位差2πp[rad]的关系。
在将相位差2πp为0rad时的噪声N'设为N0'，将噪声N'的容许值设为Nm'，将第2荧光检测装置54未工作的情况下的第1荧光检测装置50的第1信号输出设为V1 0时，参数p的pm中的容许幅度Δpm考虑上述的数学式(5)，由以下数学式(6)表示。
Δpm＝(Nm')·(d-d2)/(N0')＝(Nm'/V1 0)·(d-d2)/{(N0')/V1 0}…(6)
由于求出相对于第2荧光检测装置54未工作的情况下的第1荧光检测装置50的第1信号输出V1 0的Nm'的比为0.05(5％)，所以容许幅度Δpm被设定为通过以下数学式(7)而求出的值。
Δpm＝(d-d2)/{20·(N0')/V1 0}…(7)
例如，在求出V1 0＝4、N0'＝50程度时，荧光检测装置的占空比为0.4时，pm＝0.24、相位差2πpm＝0.48πrad(86.4°)。根据数学式(7)求出Δpm＝0.00096，相位差的容许幅度为0.00192πrad(0.35°)，所以能够将适当的相位差的范围决定为0.48π±0.00192π[rad](86.4±0.35[°])，进而能够决定为1.52π±0.00192π[rad](273.6±0.35[°])。
另外，由于更优选相对于第1信号输出V1 0的Nm'的比为0.03(3％)，所以容许幅度Δpm被设定为通过以下数学式(8)而求出的值。同样，V1 0＝4、N0'＝50及d＝0.4时，求出Δpm＝0.00058、相位差的容许幅度为0.00116πrad(0.21°)，所以能够将适当的相位差的范围决定为0.48π±0.00116π[rad](86.4±0.21[°])，进而能够决定为1.52π±0.00116π[rad](273.6±0.21[°])。
Δpm＝3·(d-d2)/{100·(N0')/V1 0}…(8)
除此之外，由于进而优选相对于第1信号输出V1 0的Nm'的比为0.01(1％)，所以容许幅度Δpm被设定为通过以下数学式(9)而求出的值。同样，V1 0＝4、N0'＝50及d＝0.4时，求出Δpm＝0.00019、相位差的容许幅度为0.00038πrad(0.07°)，所以能够将适当的相位差的范围决定为0.48π±0.00038π[rad](86.4±0.07[°])，进而能够决定为1.52π±0.00038π[rad](273.6±0.07[°])。
Δpm＝(d-d2)/{100·(N0')/V1 0}…(9)
根据以上研究结果，优选的相位差的范围在以rad(弧度)为单位的表述中一般能够记载为2π(pm-Δpm)[rad]～2π(pm+Δpm)[rad]或2π{(1-pm)-Δpm}[rad]～2π{(1-pm)+Δpm}[rad]，在以度(°)为单位的表述中一般能够记载为360(pm-Δpm)[°]～360(pm+Δpm)[°]或360{(1-pm)-Δpm}[°]～360{(1-pm)+Δpm}[°]。其中，d作为占空比，pm＝d-d2、Δpm＝(d-d2)/{20·(N0')/V1 0}，更优选为Δpm＝3·(d-d2)/{100·(N0')/V1 0}，进而优选为Δpm＝(d-d2)/{100·(N0')/V1 0}。
另一方面，Δpm根据与pm的关系，也可以为Δpm＝0.01×pm。也可以像这样将Δpm唯一地设定为pm的1％。
根据以下实验及考察可知，即使以噪声成为最小的方式设定第1荧光检测装置50的第1激发光及第2荧光检测装置54的第2激发光的闪烁的相位差，在通过锁相放大器对样本通过荧光检测区域时由荧光检测器检测到的荧光信号进行处理后的信号中也会产生噪声。
图14及图15表示在图2所示的反应处理装置30中，使样本在流路12内移动，并通过规定的荧光检测区域时的来自第1荧光检测装置50的信号输出和时刻的关系。图14表示使第2荧光检测装置54停止(即，不使第2激发光源闪烁)，并使样本在流路12内移动时的来自第1荧光检测装置50的荧光信号输出。另一方面，图15表示使第2荧光检测装置54工作(即，使第2激发光源闪烁)，并使样本在流路12内移动时的来自第1荧光检测装置50的荧光信号输出。
使第1激发光及第2激发光均以相同频率(110Hz)且以相同占空比0.5(50％)闪烁，使其相位差为0.5πrad(90.0°)。进而各激发光和荧光检测器以来自流路12中的样本的荧光强度成为最大的方式而独立地相对于流路确定配置。
首先，参照图14对样本通过荧光检测区域时的荧光信号的变化进行说明。图14所示的荧光信号的强度与时刻一起在基线上推移，在某一一定的时刻(11×1/10秒)上升。可以认为在该时刻样本侵入到第1荧光检测区域12a。进而荧光信号与时刻一起推移大致一定值(任意强度为大致14)。这可以认为在流路12内具有一定的长度的样本与通过第1荧光检测区域12a的时间对应。之后，在某一时刻荧光信号再次下降到基线。可以认为在该时刻(18×1/10秒)样本从第1荧光检测区域12a脱离。之后，荧光信号在基线上推移。
以上说明是样本仅通过一次第1荧光检测区域12a时的荧光信号的变化。在PCR的情况下，样本反复在流路12往复移动，通过反复暴露于预先设定的不同水准的温度区域(即，热循环)，样本中包含的特定的DNA等被扩增。
在包含荧光色素的样本的情况下，规定的DNA等扩增，并且样本所发出的荧光强度也增加。然后通过监测该增加的荧光强度、样本通过荧光检测区域时得到的荧光信号的最大值，能够实现伴随规定的DNA的扩增的实时PCR。
接下来，参照图15对样本通过荧光检测区域时的荧光信号的变化进行说明。图15所示的荧光信号的变化，与图14所示的荧光信号的变化不同。图15所示的荧光信号在上升的部分中大幅过冲，与之后的时间中的大致一定的荧光强度相比成为较高的荧光强度。因为像这样在荧光信号中产生较大的过冲时，荧光信号产生偏差，所以难以监测正确的荧光信号的强度，有可能对实时PCR造成障碍。
根据以上情况，暗示了在多个激发光/荧光的组合中，在属于任意一个组合的激发光所对应的波长范围和属于其之外的组合的荧光所对应的波长范围重叠的情况下，即使使锁相的相位差最佳化，在荧光信号的检测中也会产生影响。即使使第1荧光检测装置50及第2荧光检测装置54的激发光的闪烁相位差为最佳，也可能存在图15所示的荧光信号的变化。
因此，本发明人为了减少这样的荧光信号的过冲而进行了深入研究、实验，结果得知在荧光点间距离tp上存在过冲的原因。具体地说，在针对光学头的光学系统的样本的NA处于规定的范围内的情况下，发现在荧光点间距离为4mm以上时，噪声值(Nv)成为优选的0.2以下。
图16是用于说明本发明的实施例的图。与以上实施方式同样，以能够检测来自配置于反应处理容器10的流路12中的样本20的荧光的方式，并列配置第1光学头51及第2光学头55。第1光学头51具备物镜OB1，第2光学头55具备物镜OB2。在流路12中设定有第1荧光检测区域12a及第2荧光检测区域12b。第1光学头51对位置于第1荧光检测区域12a的样本20照射激发光，并接收荧光。第2光学头55对位置于第2荧光检测区域12b的样本20照射激发光，并接收荧光。第1光学头51及第2光学头55照射的激发光的频率均为110Hz，占空比均为0.5而闪烁。由第1光学头51及第2光学头55接收的荧光在后级的锁相放大器(参照图5)中进行锁相处理而输出荧光信号。进而，第1光学头51及第2光学头55照射的激发光的闪烁以其相位差成为0.5πrad(90.0°)的方式调整各自的相位。如图16所示，第1荧光检测区域12a的中心与第2荧光检测区域12b的中心之间的距离为荧光点间距离tp。
(实施例1)
在实施例1中，使用数值孔径(NA)为0.23的物镜作为第1光学头51的物镜OB1及第2光学头55的物镜OB2。第1荧光检测装置以蓝激发/绿荧光的组合与FAM对应，第2荧光检测装置以绿激发/红萤光的组合与ROX对应。
图17表示在实施例1中将荧光点间距离设为tp＝4mm时的第1荧光检测装置50输出的荧光信号。样本使用FAM水溶液。在图17中，横轴表示时刻[×1/10秒]，纵轴表示荧光强度[任意单位]。在图17所示的荧光信号中，峰值以2个为一组每隔大致一定时间出现。样本在流路12中反复往复移动(其中，以样本通过第1荧光检测区域12a的通过时间为约0.5秒的方式调整了移动速度)。因此，如图17的荧光信号所示，去路和回路中的荧光强度的值作为一组出现。
(实施例2)
在实施例2中，使用数值孔径(NA)为0.18的物镜作为第1光学头51的物镜OB1及第2光学头55的物镜OB2。
(实施例3)
在实施例3中，使用数值孔径(NA)为0.12的物镜作为第1光学头51的物镜OB1及第2光学头55的物镜OB2。
(实施例4)
在实施例4中，使用数值孔径(NA)为0.07的物镜作为第1光学头51的物镜OB1及第2光学头55的物镜OB2。
在实施例1～4中，使荧光点间距离tp变化为2.5mm、2.75mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm，针对各荧光点间距离tp得到了第1荧光检测装置50输出的荧光信号。为了评价根据样本的往复移动而得到的荧光强度的偏差，将通过50次的样本的往复移动而得到的各峰的荧光强度的最大值的标准偏差作为噪声值Nv进行计算并作为指标。
以下表格汇总了关于实施例1～4得到的、荧光点间距离tp[mm]与噪声值Nv的关系。
[表1]
关于数值孔径(NA)为0.23的实施例1，在荧光点间距离tp为4mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.2，得到了良好的结果。关于数值孔径(NA)为0.18的实施例2，在荧光点间距离tp为4mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.2，得到了良好的结果。关于数值孔径(NA)为0.12的实施例3，在荧光点间距离tp为3.5mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.3，得到了良好的结果，在荧光点间距离tp为4mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.2，进一步得到了良好的结果。关于数值孔径(NA)为0.07的实施例4，在荧光点间距离tp为2.5mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.3，得到了良好的结果，在荧光点间距离tp为2.75mm～5mm的情况下噪声值Nv不足0.2，进一步得到了良好的结果。根据这些实验结果，本发明人发现，在光学头的数值孔径NA处于0.07～0.23的范围内的情况下，在荧光点间距离tp为4mm以上时，噪声值Nv成为优选的0.2以下。
为确认本实施例的效果，使用图2所示的反应处理装置30，对以下表格所示的样本实际进行PCR，以实时测量荧光信号。试图检测Vero毒素VT1，使用KAPA Biosystems公司的作为PCR酶的KAPA3G Plant PCR套装，按以下表格所示的要领调整PCR用样本。
[表2]
在此，针对物镜的数值孔径NA设为0.23的实施例1进行了PCR。图18表示实施例1的PCR的扩增结果。在图18中，横轴为循环数，纵轴为荧光强度[任意单位]。使用以上反应处理装置30，测量相对于循环数的由第1荧光检测装置50检测到的荧光信号的强度。若样本中的检体扩增，则荧光强度增加。如图18所示，从30循环附近起荧光强度急剧上升。这样的荧光强度的急剧的上升，表示样本中的检体进行扩增，可知在使用实施例1的情况下能够进行良好的PCR。
接下来，表示比较例。在比较例中，将荧光点间距离tp设为3mm，其他条件与实施例1(参照图17)相同。
图19表示在比较例中第1荧光检测装置50输出的荧光信号。将图19所示的荧光信号与图17所示的实施例1的情况进行比较时，可知在图19所示的比较例中产生了非常大的过冲。
图20表示比较例的PCR的扩增结果。将图20所示的PCR的扩增结果与图18所示的实施例1的情况进行比较时，可知在图20所示的比较例中荧光强度的偏差非常大。由于在像这样荧光强度的偏差大的情况下，难以检测荧光强度的上升，所以实时PCR的精度有可能降低。根据与该比较例的比较，证实了本实施例的优越性。
图21是用于说明本发明的其他实施方式的反应处理装置130的图。图21所示的反应处理装置130在包括3个荧光检测装置(第1荧光检测装置131、第2荧光检测装置132以及第3荧光检测装置133)这点与图2所示的反应处理装置30不同。在图21中，仅图示3个荧光检测装置及反应处理容器10的局部，省略其他构成的图示。
第1荧光检测装置131被构成为能够检测来自含有FAM作为荧光色素的样本的荧光。第1荧光检测装置131具备第1光学头134，使中心波长为约470nm且波长范围为约450～490nm的第1激发光(蓝色光)照射到流路12的第1荧光检测区域12a，并检测中心波长为约530nm且波长范围为约510～550nm的第1荧光(绿色光)。
第2荧光检测装置132被构成为能够检测来自含有ROX作为荧光色素的样本的荧光。第2荧光检测装置132具备第2光学头135，使中心波长为约530nm且波长范围为约510～550nm的第2激发光(绿色光)照射到流路12的第2荧光检测区域12b，并检测中心波长为约610nm且波长范围为约580～640nm的第2荧光(红色光)。
第3荧光检测装置133被构成为能够检测来自含有Cy5作为荧光色素的样本的荧光。第3荧光检测装置133具备第3光学头136，使中心波长为约630nm且波长范围为约610～650nm的第3激发光(红色光)照射到流路12的第3荧光检测区域12c，并检测中心波长为约690nm且波长范围为约660～720nm的第3荧光(红外光)。
本实施方式的反应处理装置130的特征在于3个荧光检测装置的光学头的排列顺序。具体地说，从低温区域侧起，按第2荧光检测装置132的第2光学头135、第1荧光检测装置131的第1光学头134、第3荧光检测装置133的第3光学头136的顺序排列。换言之，在中央配置第1光学头134，在第1光学头134的低温区域侧配置第2光学头135，在第1光学头134的高温区域侧配置第3光学头136。第2荧光检测装置132和第3荧光检测装置133的位置也可以相反。即，也可以在第1光学头134的低温区域侧配置第3光学头136，在第1光学头134的高温区域侧配置第2光学头135。
如上所述，荧光检测装置间的干扰由于激发光的波长范围与荧光的波长范围重叠而产生。因此，在并列配置多个光学头的情况下，避免激发光的波长范围与荧光的波长范围重叠的光学头彼此相邻配置。例如，假设在将第2光学头135配置于中央，在其两侧配置第1光学头134和第3光学头136的情况下，第2光学头135的第2激发光的波长范围(约510～550nm)与第1光学头134的第1荧光的波长范围(约510～550nm)重叠。另外，第2光学头135的第2荧光的波长范围(约580～640nm)与第3光学头136的第3荧光的波长范围(约610～650nm)部分重叠。在这种情况下，在第1荧光检测装置131与第2荧光检测装置132之间、第2荧光检测装置132与第3荧光检测装置133之间容易产生干扰。
另一方面，如本实施方式所示，在将第1光学头134配置于中央，在其两侧配置第2光学头135和第3光学头136的情况下，由于第2光学头135和第3光学头136被隔离，所以能够使第2荧光检测装置132与第3荧光检测装置133之间的干扰难以产生。
另外，也可以将第3光学头136配置于中央，在其两侧配置第1光学头134和第2光学头135。在这种情况下由于第1光学头134和第2光学头135被隔离，所以能够使第1荧光检测装置131与第2荧光检测装置132之间的干扰难以产生。
在反应处理装置中，有时将基于多个荧光检测装置中的某一个荧光检测装置的荧光强度的变动，作为用于控制在流路中反复往返移动的样本的动作(样本的移动和停止)的参数。承担这样的目的的荧光检测装置的光学头，优选配置于流路中的高温区域与低温区域之间的连接区域的大致中间点。假设在用于样本的移动控制的光学头偏向流路的连接区域中的高温或低温区域的任意一侧地配置的情况下，送液或其停止的控制有可能变得繁琐。通过在流路的连接区域的大致中间配置用于样本的移动控制的光学头，样本的送液或停止的控制变得容易。另外，控制的容易性也与精度的提高相关。
另一方面，在供于PCR等反应处理的样本中，添加以FAM为代表的以波长约为470nm为中心的激发光来激发样本的荧光色素的情况较多。通过由波长约470nm附近的光进行激发，与其对应的荧光必然包含波长约500～560nm附近的波长的光。这是相当于第1荧光检测装置131的规格，结果在反应处理装置中大多使用具有这样的激发光/荧光的波长特性的荧光检测装置。
根据以上情况可知，3个光学头中的配置于中央的第1光学头134配置于流路12的连接区域的大致中间点C是适当的。上述情况在仅包括2个荧光检测装置的上述反应处理装置30中也相同。即，在图2所示的反应处理装置30中，第1光学头51也可以配置于流路12的连接区域的大致中间点C。
以上，基于实施方式说明了本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施方式仅为示例，其各构成要素、各处理流程的组合可以有各种变形例，并且这样的变形例也在本发明的范围内。
[工业可利用性]
本发明能够利用于聚合酶链式反应(PCR)。
[附图标记说明]
10 反应处理容器，12 流路，14 基板，16 流路密封薄膜，17 第1连通口，18 第2连通口，20 样本，30、130 反应处理装置，32 温度控制系统，33 高温用加热器驱动器，35 低温用加热器驱动器，36 CPU，37 送液系统，39 第1泵，40 第2泵，41 第1泵驱动器，42 第2泵驱动器，43 第1配管，44 第2配管，45、46 密封件，50、131 第1荧光检测装置，51、134 第1光学头，52 第1荧光检测用激发光源/检测器模块，54、132 第2荧光检测装置，55、135 第2光学头，56 第2荧光检测用激发光源/检测器模块，60 高温用加热器，62 低温用加热器，64第1激发光源，65 第1波分复用器，66 第1荧光检测器，67 第2荧光检测器，68 第1锁相放大器，69 第2锁相放大器，70 IV放大器，80 高通滤波器，81 反相/非反相放大器，82 低通滤波器，133 第3荧光检测装置，136 第3光学头。
[序列表自由内容]
序列号1：正向PCR引物
序列号2：反向PCR引物
序列号3：探针
序列表
<110> 日本板硝子株式会社(NIPPON SHEET GLASS COMPANY, LIMITED)
<120> 反应处理装置(REACTION TREATMENT DEVICE)
<130> P0013542WO01
<150> JP 2018-056767
<151> 2018-03-23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向PCR引物(Forward PCR Primer)
<400> 1
ggataatttg tttgcagttg atgtc 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向PCR引物(Reverse PCR Primer)
<400> 2
caaatcctgt cacatataaa ttatttcgt 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 探针(Probe)
<400> 3
ccgtagatta ttaaaccgcc cttcctctgg a 31

Claims (6)

1.一种反应处理装置，其特征在于，包括：
反应处理容器，其形成有供样本移动的流路，
第1荧光检测装置，其使第1激发光照射所述流路中设定的第1荧光检测区域中的样本，并对通过所述第1激发光的照射而从样本产生的第1荧光进行检测，以及
第2荧光检测装置，其使第2激发光照射所述流路中设定的第2荧光检测区域中的样本，并对通过所述第2激发光的照射而从样本产生的第2荧光进行检测；
所述第1荧光的波长范围和所述第2激发光的波长范围的至少一部分重叠，
所述第1激发光及所述第2激发光以规定的占空比闪烁发光，
在将所述第1激发光和所述第2激发光的闪烁的占空比设为d时，所述第1激发光与所述第2激发光的闪烁的相位差被设定在2π（pm-Δpm）[rad]~2π（pm+Δpm）[rad]的范围内、或2π{（1-pm）-Δpm}[rad]~2π{（1-pm）+Δpm}[rad]的范围内，其中pm=d-d2及Δpm=0.01×pm，
所述流路具备：维持在第1温度的第1温度区域；维持在高于所述第1温度的第2温度的第2温度区域；以及连接所述第1温度区域和所述第2温度区域的连接流路，
所述第1荧光检测装置具备照射所述第1激发光并接收所述第1荧光的第1光学头，
所述第2荧光检测装置具备照射所述第2激发光并接收所述第2荧光的第2光学头，
所述第1光学头及所述第2光学头以检测来自所述连接流路内的样本的荧光的方式配置，
在所述第1光学头及所述第2光学头的数值孔径处于0.07~0.23的范围内的情况下，所述第1荧光检测区域的中心与所述第2荧光检测区域的中心之间的距离被设定为4mm以上。
2.一种反应处理装置，其特征在于，包括：
反应处理容器，其形成有供样本移动的流路，
第1荧光检测装置，其使第1激发光照射所述流路中设定的第1荧光检测区域中的样本，并对通过所述第1激发光的照射而从样本产生的第1荧光进行检测，以及
第2荧光检测装置，其使第2激发光照射所述流路中设定的第2荧光检测区域中的样本，并对通过所述第2激发光的照射而从样本产生的第2荧光进行检测；
所述第1荧光的波长范围和所述第2激发光的波长范围的至少一部分重叠，
所述第1激发光及所述第2激发光以规定的占空比闪烁发光，
在将所述第1激发光和所述第2激发光的闪烁的占空比设为d时，所述第1激发光与所述第2激发光的闪烁的相位差被设定在2π（pm-Δpm）[rad]~2π（pm+Δpm）[rad]的范围内、或2π{（1-pm）-Δpm}[rad]~2π{（1-pm）+Δpm}[rad]的范围内，其中pm=d-d2及Δpm=（d-d2）/{k･（N0'）/V1 0}，N0'是所述第1激发光和所述第2激发光的闪烁的相位差为0rad时的所述第1荧光检测装置的信号输出的噪声，V1 0是所述第2荧光检测装置未工作的情况下的所述第1荧光检测装置的信号输出，k=20或者k=100/3或者k=100，
所述流路具备：维持在第1温度的第1温度区域；维持在高于所述第1温度的第2温度的第2温度区域；以及连接所述第1温度区域和所述第2温度区域的连接流路，
所述第1荧光检测装置具备照射所述第1激发光并接收所述第1荧光的第1光学头，
所述第2荧光检测装置具备照射所述第2激发光并接收所述第2荧光的第2光学头，
所述第1光学头及所述第2光学头以检测来自所述连接流路内的样本的荧光的方式配置，
在所述第1光学头及所述第2光学头的数值孔径处于0.07~0.23的范围内的情况下，所述第1荧光检测区域的中心与所述第2荧光检测区域的中心之间的距离被设定为4mm以上。
3.如权利要求1或2所述的反应处理装置，其特征在于，
基于由所述第1荧光检测装置检测到的荧光信号控制所述流路内的样本的移动；
所述第1荧光检测区域被设定于所述连接流路的大致中间点。
4.如权利要求1或2所述的反应处理装置，其特征在于，
所述第1荧光检测装置照射蓝色光作为所述第1激发光，并且检测绿色光作为所述第1荧光；
所述第2荧光检测装置照射绿色光作为所述第2激发光，并且检测红色光作为所述第2荧光。
5.如权利要求4所述的反应处理装置，其特征在于，
还包括第3荧光检测装置，其使第3激发光照射所述流路中设定的第3荧光检测区域中的样本，并对通过所述第3激发光的照射而从样本产生的第3荧光进行检测；
所述第3荧光检测装置照射红色光作为所述第3激发光，并且检测红外光作为所述第3荧光。
6.如权利要求5所述的反应处理装置，其特征在于，
所述第1荧光检测装置的第1光学头配置于中央，所述第2荧光检测装置的第2光学头及所述第3荧光检测装置的第3光学头配置于所述第1光学头的两侧。
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