CN111819173B

CN111819173B - Cd73抑制剂

Info

Publication number: CN111819173B
Application number: CN201980016287.8A
Authority: CN
Inventors: R·D·达利; M·C·加西亚帕雷德斯; L·J·海茵茨二世; J·M·豪厄尔; F·G·约罗格; Y·王; G·赵
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-03-01
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: HRP20220459T1; WO2019168744A1; MX2020009115A; CO2020010191A2; UA123890C2; ECSP20052897A; RS63073B1; TWI702954B; CL2020002158A1; CA3092661C; CA3092661A1; PT3759096T; ES2909701T3; DOP2020000148A; TW201945002A; PE20210177A1; MY200200A; PL3759096T3; AU2019228473A1; AU2019228473B2

Abstract

本发明提供5‑[5]‑[2‑环烷基]‑6‑哒嗪‑3‑基]‑1H‑嘧啶‑2,4‑二酮化合物或其可药用盐，其抑制CD73活性并可用于治疗癌症（式(I)）

Description

CD73抑制剂

本发明涉及5-[5]-[2-环烷基]-6-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮化合物或其可药用盐，和包含所述化合物的药物组合物，其抑制CD73的活性并可用于治疗癌症。

CD73，也称为5’-核苷酸酶或胞外-5’核苷酸酶(EC 3.1.3.5)是将5’单核苷酸转化成核苷的酶。CD73在许多组织中表达，并在癌组织中上调，且CD73通路通过经由腺苷受体信号传导限制抗肿瘤T细胞免疫而促进肿瘤生长(Zhang B,CancerResearch 2010；70:6407-6411；AntonioliL等人,DrugDiscoveryToday2017；22:1686-1696)。

CD73缺失小鼠具有提高的抗肿瘤免疫，并耐受实验性转移(Stagg J等人,CancerResearch 2011；71:2892-2900)。由肿瘤CD73生成的细胞外腺苷积聚在肿瘤微环境中，损害抗肿瘤T细胞免疫(ZhangB,CancerResearch 2010；70:6407-6411；AntonioliL等人,DrugDiscovery Today 2017；22:1686-1696)，并与肿瘤免疫逃逸、肿瘤细胞的增殖、迁移、血管新生、转移和化疗耐药性有关(InoueY等人,Oncotarget2017；8:8738-8751)。

提高的CD73表达也已被报道与提高的免疫抑制相关联(JinD等人,CancerRes.70:2245–2255(2010)；Beavis PA等人,Trends Immunol 33:231-7(2012)；Beavis,PA等人,CancerImmunol Res.3:506-17(2015)；Loi S等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:11091–11096(2013))。

因此，CD73通路发挥免疫抑制作用，并且已经表明阻断CD73通路有助于治疗癌症(AntonioliL等人,Oncoimmunol.2016；5:e1216292,doi:10.1080/2162402X.2016.1216292；Antonioli L等人,Trends in Cancer 2016；2:95-109；Allard D等人,Immunotherapy 2016；8:145-163)。CD73抑制剂在临床试验中用于治疗癌症(Hay CM等人,Oncoimmunol.2016；5(8):e1208875；AllardD等人,Immunotherapy2016；8:145-163)。

仍然需要提供替代性的CD73抑制剂，更特别是用于治疗癌症。特别地，仍然需要可口服的小分子CD73抑制剂，并且在肿瘤微环境中表现出更完全的靶抑制。

因此，本发明提供可用于治疗癌症的CD73抑制剂化合物。本发明提供式I的化合物或其可药用盐：

其中n为0-3；

其中R¹是–H、–F、–偕-二氟、–偕-二甲基、–C_1-4烷基、–CHF₂、–CHF₂CH₃或–CH₂CH₂F；

且

R²选自–H、–CH₃、–F、–Cl、–CN或–OCH₃。

在另一实施方案中，本发明提供式I的化合物或其可药用盐，其中n是0，R¹是–C_1-4烷基，且R²是–CH₃。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在另一实施方案中，该化合物是

或其可药用盐。

在一个实施方案中，式I的化合物为式：

其中R¹是-CH₂CH₃或-CH(CH₃)₂，或其可药用盐。在另一实施方案中，R¹是-CH₂CH₃，或其可药用盐。在另一实施方案中，R¹是-CH(CH₃)₂，或其可药用盐。

在另一实施方案中，式I的化合物为式：

其中R¹是CH₂CH₃或CH(CH₃)₂，或其可药用盐。

在另一实施方案中，式I的化合物为式：

其中R¹是-CH₂CH₃或-CH(CH₃)₂，或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供化合物：

或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供化合物：

或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供化合物：

或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供化合物：

或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供一种化合物，其是5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮，或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供一种化合物，其是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮，或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

在另一实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含给予需要其的患者有效量的5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含给予需要其的患者有效量的5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供用于疗法的5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供用于疗法的5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐。

在一个实施方案中，本发明提供5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐在用于治疗癌症的药物制备中的用途。

在另一实施方案中，本发明提供5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮或其可药用盐在用于治疗癌症的药物制备中的用途。

在一个实施方案中，本发明提供4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪的制备和用途，其可在结构上表示为：

其可用于制备用于治疗癌症的化合物或药物。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪。

在一个实施方案中，本发明提供4,4,5,5-四甲基-2-(2-取代环丙基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷的制备和用途，其可在结构上表示为：

其中R¹＝CH₂CH₃或CH(CH₃)₂，其可用于制备用于治疗癌症的药物。在一个实施方案中，R＝CH₂CH₃。在另一实施方案中，R＝CH(CH₃)₂。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的4,4,5,5-四甲基-2-(2-取代环丙基)-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷。

在一个实施方案中，本发明提供2-[(1S,2S)-2-乙基-环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷的制备和用途，其可在结构上表示为：

其可用于制备用于治疗癌症的化合物或药物。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的2-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷。

在一个实施方案中，本发明提供2-[(1S,2S)-2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷的制备和用途，其可在结构上表示为：

其可用于制备用于治疗癌症的化合物或药物。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的2-[(1S,2S)-2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷。

在一个实施方案中，本发明提供使用(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯手性合成2-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷，所述(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯可在结构上表示为：

其中R¹＝CH₂CH₃或CH(CH₃)₂，其可用于制备用于治疗癌症的化合物或药物。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯。

在一个实施方案中，本发明提供使用(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯手性合成2-[(1S,2S)-2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷，所述(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯可在结构上表示为：

其可用于制备用于治疗癌症的化合物或药物。在另一实施方案中，本发明提供用于制备化合物或药物的(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯。

CD73蛋白质在许多组织中表达，包括大脑、甲状腺、肾上腺、骨髓、淋巴结、扁桃体、脾、心肌、平滑肌、肺、鼻咽、肝、胆囊、胰腺、唾液腺、口腔粘膜、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肾、膀胱、睾丸、前列腺、输卵管、阴道、乳腺、子宫颈、子宫、子宫内膜、卵巢、软组织和皮肤(proteinatlas.org/ENSG00000135318-NT5E/tissue)。CD73在多种类型的肿瘤中过度表达(Antonioli L等人,Nat.Rev.Cancer 13,842–857(2013)；Antonioli L等人,TrendsCancer 2:95–109(2016))。CD73也在正常和病理性人肝胆胰组织中表达，包括肝细胞、胰腺导管腺癌和肝外胆管细胞癌(Sciarra,A.等人,Cancer ImmunolImmunother2019；doi.org/10.1007/s00262-018-2290-1)。

提高的CD73表达和活性与肿瘤浸润和转移和更短的患者存活时间相关联(Jin D等人,Cancer Research 2010；70:2245-2255)。提高的CD73表达与不良预后相关联(InoueK等人,Oncotarget 8:8738–8751(2017)；Turcotte K等人,Cancer Res.5:4494–4503(2015)；Lu YT等人,WorldJ.Gastroenterol.19:1912–1918(2013)；Wu XR等人,J.Surg.Oncol.106:130–137(2012)；Buisseret S等人,Ann.Oncol.29:1056–1062(2017)；Leclerc R等人,Clin.CancerRes.22:158-66(2016))。

三阴性乳腺癌中的CD73表达与更差的临床结果和提高的对蒽环类化疗的耐药性相关联(Allard B等人,Expert Opin.Ther.Targets 2014；18:863-881)。CD73与头颈鳞状细胞癌中的不良预后相关联(Ren Z-H等人,Oncotargets 2016；7:61690-61702)。CD73表达也与肾细胞癌的进展相关联(YuY等人,Oncol.Lett.2015；9:2485-2494)。

CD73在子宫内膜肿瘤(Aliagas E等人,Mediators of Inflammation 2014；doi:10.1155/2014/509027)、前列腺肿瘤组织(Leclerc BG等人,Clin.Cancer Res.2016；22:158-166)、非小细胞肺癌组织(Inoue Y等人,Oncotarget 2017；8:8738-8751)中过度表达。CD73已被报道在肿瘤，包括乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌和胆囊癌中过度表达(Gao Z-W和Zhang H-Z,BiomedRes.Int.2014；doi:10.1155/2014/460654)。CD73已被报道在癌细胞系，包括胶质母细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤和膀胱癌细胞系中过度表达(Gao Z-W和Zhang H-Z,BiomedRes.Int.2014；doi:10.1155/2014/460654)。

CD73-腺苷已被报道降低卵巢癌患者的免疫应答和存活率(Gaudreau P-O等人,Oncoimmunology 2016；5(5):e1127496)。

用选择性CD73抑制剂α,β–亚甲基腺苷5’-二磷酸盐体内阻断CD73已被报道在皮下注射EG7(淋巴瘤)、MC38(结肠)、AT-3(乳腺)和B16F10(黑素瘤)肿瘤细胞的同系小鼠中减轻肿瘤生长(Stagg J等人,Cancer Research 2011；71:2892-2900；Forte G等人,J.Immunol.2012；189:2226-2233)。抗-CD73抗体疗法已被报道抑制了乳腺肿瘤生长和转移(Stagg J等人,PNAS2010；107:1547-1552；Terp MG,J.Immunol.2013；191:4165-4173)。

此外，已报道在癌症患者中腺苷和CD73酶活性提高(Huang N等人,CancerRes.75:1538(2015)，并且对免疫检查点抑制剂没有响应的患者已被报道具有比有响应的患者高的腺苷水平(Giannakis HX等人,J.Clin.Oncol.35:15Suppl.3036-3036(2017))。

致癌基因活化和雌激素受体损失已被报道与提高的CD73表达相关联(ReinhardtJ等人,Cancer Res.77:4697–4709(2017)；Spychala J等人,Clin.CancerRes.10:708-17(2004)；Ascierto和McArthur J.,Transl.Med.15:173(2017)；Young A等人,CancerRes.77:4684-4696(2017))。

可获益于CD73抑制剂治疗的对象包括具有抗-PD1/PDL-1抑制剂耐药或难治的肿瘤，如非小细胞肺癌、膀胱癌和黑素瘤的对象；具有EGFR/BRAF/Kras突变癌，如非小细胞肺癌、膀胱癌、黑素瘤、结肠癌和胰腺癌的对象；具有雌激素受体(-)癌，如三阴性乳腺癌的对象；具有高CD73表达水平，如胰腺癌和结肠直肠癌的对象。如果需要，可基于如通过IHC测定法测得的其肿瘤中的高CD73表达水平的存在；或基于如通过RT-PCR测定法检测到的其肿瘤中的EGFR和BRAF突变的存在；或基于如通过IHC或RT-PCR测定法检测到的其肿瘤中的雌激素受体损失；或基于通过LC-MS测定法检测到的其肿瘤或血浆中的高水平腺苷和AMP的存在选择这些对象以用本文中公开的化合物或其可药用盐治疗。对于药效学评估，可使用本文所述的基于LC-MS的离体(ex vivo)测定法测量CD73抑制剂对血液中的AMP转化成腺苷的作用。

本发明还提供一种治疗患者的癌症的方法，其包含给予需要其的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐。

本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包含给予需要其的对象有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、结肠直肠癌、结肠癌、胃癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或肾癌。在一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。

在一个实施方案中，该患者是已测定了血清CD73活性的患者。在一个优选实施方案中，“测定CD73活性”是指测定是否存在CD73活性。测定CD73表达或CD73活性水平的方法是本领域普通技术人员已知的，例如参见S Morello等人,J.Trans.Med.2017；15:244。在另一优选实施方案中，“测定CD73活性”是指量化通过CD73将AMP转化成腺苷的水平，并在本文中提供基于LC-MS的测定法，其有利于量化CD73活性的水平。

在另一实施方案中，患者是已测定了组织中的CD73表达的患者。在另一实施方案中，该组织是肿瘤组织。测定组织中的CD73表达水平的方法是本领域普通技术人员已知的，例如使用蛋白质印迹法或免疫组织化学(X-R Wu等人,J.Surg.Oncol.2012；106:130-137)。

本发明还提供一种方法，其包含测定已给予了根据本发明的化合物或其可药用盐的患者的组织CD73表达。在一个优选实施方案中，该组织是肿瘤组织。

本发明还提供一种方法，其包含测定已给予了本文中的式I的化合物或其可药用盐的患者的血清CD73活性。这种方法是灵敏的，不涉及肿瘤活检，不涉及抗体或免疫组织化学，有利于量化CD73活性(例如通过促进EC₅₀的计算)。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。在另一优选实施方案中，该方法进一步包含使用放射性标记的一磷酸腺苷(AMP)检测CD73活性和使用质谱法测定放射性标记的AMP浓度。在另一优选实施方案中，放射性标记的AMP是13C5_15N5-AMP。

在另一优选实施方案中，该方法包含(a)在多个容器(例如微量滴定板)的每一个中提供来自患者的血清，所述容器配置为含有各种浓度的给药于患者的化合物，(b)在多个容器中的每个容器中提供13C10_15N5_AMP，(c)在促进混合的条件下(例如摇动)培养所述多个容器，(d)离心所述多个容器，(e)将来自各容器的上清液转移到新的各自的容器中，(f)在各个新的各自的容器中提供含内标的提取溶液，(g)离心新的各自的容器，(h)将来自各个新的各自的容器的上清液转移到各自的分析容器中，(i)通过如本文所述的LC/MS(“用于腺苷和腺苷纯化的质谱法”)测定各个各自的分析容器中的上清液的13C10_15N5_腺苷、13C10_15N4_肌苷和15N4次黄嘌呤和(j)计算EC₅₀。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。在一个优选实施方案中，内标是13C5-AMP、13C5-腺苷、15N4-肌苷和13C5-次黄嘌呤。

本发明还提供本文中的式I的化合物或其可药用盐在疗法中的用途。在一个实施方案中，该疗法是癌症的治疗。在另一实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、结肠直肠癌、结肠癌、胃癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或肾癌。在一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。

本发明还提供本文中的式I的化合物或其可药用盐用于制备癌症治疗药物的用途。在一个实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、结肠直肠癌、结肠癌、胃癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或肾癌。在一个实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含与一种或多种抗肿瘤剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。抗肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、吉西他滨、培美曲塞、galunisertib、阿贝西利(abemaciclib)、吉非替尼、维罗非尼(vemurafenib)、达拉菲尼、曲美替尼、顺铂、卡铂、达卡巴嗪、脂质体阿霉素、多西他赛、环磷酰胺和阿霉素、长春瑞滨、艾日布林、紫杉醇、用于注射混悬液的紫杉醇蛋白结合粒子、伊沙匹隆、卡培他滨、FOLFOX(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)、西妥昔单抗、EGFR抑制剂、Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、ERK抑制剂、CDK4/6抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、TGFβ抑制剂和TGFβ受体抑制剂。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含与一种或多种免疫肿瘤剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，免疫肿瘤剂是抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-CD137激动剂抗体或抗-CTLA4抗体。免疫肿瘤剂的非限制性实例包括纳武单抗、伊匹单抗(ipilimumab)、pidilizumab、派姆单抗(pembrolizumab)、替西木单抗(tremelimumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和抗-PD-L1抗体LY3300054(其重链和轻链序列分别作为SEQ ID NOS:10和11列在WO 2017/034916和US 2017/0058033中)。在一个优选实施方案中，免疫肿瘤剂是抗-PD-1抗体。在另一优选实施方案中，免疫肿瘤剂是抗-PD-L1抗体。在另一优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮且免疫肿瘤剂是LY3300054。

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包含与另一药剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，另一药剂是奥希替尼(osimertinib)、西妥昔单抗或阿贝西利。在另一优选实施方案中，另一药剂是奥希替尼(osimertinib)。在另一优选实施方案中，另一药剂是西妥昔单抗。在另一优选实施方案中，另一药剂是阿贝西利。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗黑素瘤的方法，其包含与另一药剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，另一药剂是BRAF抑制剂、抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体。在另一优选实施方案中，另一药剂是BRAF抑制剂。在另一优选实施方案中，另一药剂是抗-PD-1抗体。在另一优选实施方案中，另一药剂是抗-PD-L1抗体。在另一优选实施方案中，抗-PD-L1抗体是LY3300054。在另一优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮且另一药剂是抗-PD-L1抗体LY3300054。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗结肠直肠癌的方法，其包含与另一药剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，另一药剂是阿贝西利。在另一优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮，且另一药剂是阿贝西利。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗胰腺癌的方法，其包含与另一药剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，另一药剂是阿贝西利。在另一优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮，且另一药剂是阿贝西利。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗三阴性乳腺癌的方法，其包含与另一药剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。在一个优选实施方案中，该化合物是5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮。

本发明还提供一种抑制患者的CD73酶活性的方法，其包含给予需要其的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐。本发明还提供一种抑制患者的AMP转化成腺苷的方法，其包含给予需要其的患者有效量的式I的化合物或其可药用盐。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含与一种或多种腺苷调节剂同时、分开或相继组合给予有效量的本文中的式I的化合物或其可药用盐。腺苷调节剂的非限制性实例包括抗-CD73抗体和腺苷受体拮抗剂。

本发明还提供一种药物组合物，其包含式I的化合物或其可药用盐以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。本发明进一步提供一种制备药物组合物的方法，其包含将式I的化合物或其可药用盐与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。本发明还包含用于合成式I的化合物的新型中间体和方法。

如上文所用并且在本发明的说明书各处，除非另行指明，下列术语应被理解为具有下列含义：

“可药用载体、稀释剂或赋形剂”是本领域中公认用于向哺乳动物，例如人类递送生物活性剂的介质。

术语“治疗”等意在包括减慢或逆转障碍的进展。这些术语还包括缓解、改善、减弱、消除或减轻障碍或状况的一种或多种症状，即使没有实际消除该障碍或状况并且即使该障碍或状况的进程本身没有减慢或逆转。

“有效量”是指引发临床医生想要的患者的生物或医疗响应或对患者的所需疗效的本发明的化合物或其可药用盐或含有本发明的化合物或其可药用盐的药物组合物的量。在一个实施方案中，该化合物或其可药用盐在体外或离体CD73酶测定法中抑制AMP转化成腺苷。在另一实施方案中，该化合物或其可药用盐在来自用不同剂量的该化合物治疗的动物的小鼠全血中抑制AMP转化成腺苷。

“偕-二氟”是指键合到相同碳上的两个氟原子。

“偕-二甲基”是指键合到相同碳上的两个甲基。

本文所用的术语“患者”是指人类。

主治诊断医师作为本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对患者而言有效的量时，主治诊断医师考虑许多因素，包括但不限于：患者的种族；体型、年龄和一般健康状况；涉及的特定疾病或障碍；疾病或障碍的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用率特征；所选给药方案；伴随用药；和其它相关情况。

本发明的化合物可在宽剂量范围内使用。例如，每日剂量通常在大约0.01至大约50mg/kg体重的范围内。

本发明的化合物优选配制成通过使该化合物可生物利用的任何途径，包括口服、静脉和经皮途径给药的药物组合物。此类组合物最优选用于口服给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域中公知的(参见例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,D.B.Troy编辑，第21版，Lippincott,Williams&Wilkins,2006)。

技术人员会理解，本发明的化合物能够形成盐。本发明的化合物含有碱性杂环并相应地与许多无机和有机酸反应以形成可药用酸加成盐。这样的可药用酸加成盐和它们的常用制备方法是本领域中公知的。参见例如P.Stahl等人,HANDBOOK OF PHARMACEUTICALSALTS:PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2008)。

“可药用盐”是指本发明的化合物的相对无毒、无机和有机的盐(S.M.Berge等人,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol 66,No.1,1977年1月)。

化合物名中的“异构体1”的名称代表本发明的相应中间体或化合物是在下述“制备和实施例”中描述的条件下通过手性色谱法分离一对对映体的混合物时的两种洗脱对映体的第一种。化合物名中的“异构体2”的名称代表本发明的相应中间体或化合物是在下述“制备和实施例”中描述的条件下通过手性色谱法分离一对对映体的混合物时的两种洗脱对映体的第二种。

本发明的化合物可根据本领域中公知和了解的合成方法制备。用于这些反应的步骤的合适反应条件是本领域中公知的并且溶剂和共试剂的适当取代在本领域技术范围内。同样地，本领域技术人员会认识到，可以按需要或预期通过各种公知方法分离和/或提纯合成中间体，并且通常可以在几乎或完全不提纯的情况下在后续合成步骤中直接使用各种中间体。此外，技术人员会认识到，在一些情况中，结构部分(moieties)的引入顺序不重要。如熟练化学家充分了解，制备本发明的化合物所需的步骤的特定顺序取决于合成的特定化合物、起始化合物和被取代的部分的相对可能性(liability)。除非另行指明，所有取代基如上定义，且所有试剂是本领域中公知的和了解的。

本文所用的下列术语具有所示含义：“ACN”是指乙腈；“DAST”是指二乙氨基三氟化硫，“DCM”是指二氯甲烷；“DMAP”是指4-二甲基氨基吡啶；“dmso”或“DMSO”是指二甲亚砜；“ee”是指对映体过量；“ES/MS”是指电喷雾质谱法；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Et₂O”是指二乙醚；“FBS”是指胎牛血清；“GC-MS”是指气相色谱法-质谱法联用；“HBSS”是指Hanks平衡盐溶液；“IC₅₀”是指半数最大抑制浓度；“LAH”是指氢化锂铝；“LC-ES/MS”是指液相色谱法-电喷雾质谱法；“MS”是指质谱法；“MeOH”是指甲醇；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“nBuLi”是指正丁基锂；“nm”是指纳米；“NMR”是指核磁共振；“OAc”是指乙酸酯；“psi”是指磅/平方英寸；“RT”是指室温或环境温度；“SCX”是指强阳离子交换(StrongCation Exchange)；“SFC”是指超临界流体色谱法；“S_NAr”是指亲核芳族取代；“TEA”是指三乙胺；“THF”是指四氢呋喃；“t_R”是指保留时间；且“w/w”是指溶液中的重量/重量比例。

本发明的化合物可如下列方案中所示合成。

方案1

方案1描绘了式Ia的化合物的制备。使用公知的Suzuki类型的条件，可将市售(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)硼酸(boronic acid)1偶联到4,6-二氯-3-甲基-哒嗪上。随后可实现3的氯部分与适当取代的反式硼酸环丙酯(trans-cyclopropylboronate)的Suzuki偶联以获得4。技术人员会认识到，可使用本领域中公知的手性分离技术分离化合物4的对映体。式Ia的化合物可通过在本领域中充分描述的一系列脱甲基条件下将4中的甲氧基脱保护制备。

方案2

方案2描绘了制备式II的化合物所需的必要的环丙基硼酸酯(boronic esters)。技术人员会认识到，可在一系列条件下，尤其是在过渡金属催化剂如Cu或Zr存在下进行适当取代的炔5的硼氢化，以获得烯基硼酸酯(alkenyl boronate)6。烯基硼酸酯(alkenylboronate)可在本领域中公知的稳定化类卡宾类型的条件下环丙烷化(cyclopropanated)，如Simmons-Smith环丙烷化、Corey–Chaykovsky反应和用重氮甲烷(或重氮化合物)借助(例如Cu、Pd或Ni)和不借助(例如热或光化学)过渡金属催化剂的环丙烷化方法，以获得适当取代的反式硼酸环丙酯(trans-cyclopropylboronate)7。技术人员会认识到，热力学上有利的环丙烷化产物是7中的反式对映体的混合物。

方案3

方案3描绘了式Ib的化合物的手性合成。适当取代的氨基酸8在改良Sandmeyer条件下(自由基S_NAr)重氮化以产生9是本领域中公知的。可使用本领域中公知的一系列还原剂，包括氢化铝和乙硼烷(diborane)作为还原剂实现后续还原成醇10。在本领域中充分描述了在碱性条件下环化成手性环氧化物11。可通过用合适的膦酸酯(例如2-二乙氧基磷酰基乙酸乙酯或膦酰基乙酸三乙酯)和合适的碱(例如烷基锂、金属醇盐或金属氢化物)处理手性环氧化物11而使用立体选择性Horner-Wadsworth-Emmons反应以获得反式-环丙烷衍生物12(参见例如L.Delhaye；A.Merschaert；P.Delbeke；W.Brione.Org.Proc.Res.&Dev.2007,11,689-692.)。可在本领域中充分描述的广泛的碱性条件下实现化合物12水解成相应的酸13。酸13与适当取代的N-羟基邻苯二甲酰亚胺的后续偶联充分描述在本领域中，其利用合适的酸活化剂，例如羰基二咪唑，在弱的非亲核碱存在下，以制备化合物14。N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯14的脱羧硼化可在本领域中已知的许多条件下实现，包括在过渡金属催化剂存在下(例如Suzuki-Miyaura反应)、在光解条件下或通过单电子转移反应，包括例如在用吡啶-硼自由基促进的自由基偶联中N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯与二硼(diboron)的络合，以获得反式环丙烷硼酸酯(trans-cyclopropane boronate)15。(参见例如W.-M.Cheng；S.Rui；B.Zhao；W.-L.Xing；Y.Fu.Org.Lett.2017,19,4291-4294.)。可类似于方案1中所述进行硼酸酯15与芳基氯4的偶联和后续脱甲基化以获得式Ib的类型的手性化合物。

方案4

方案4描绘了式Ic的化合物的合成。可在本领域中公知的自由基条件(例如Minisci反应)下进行二氯哒嗪17的亲核取代以获得取代哒嗪19。可类似于方案1中所述进行硼酸酯20与芳基氯19的偶联和后续脱甲基化以获得式Ic的类型的化合物。

方案5

方案5描绘了式Id的化合物的合成。可在本领域中公知的亲核条件下进行2-氯哒嗪21的置换以提供甲氧基哒嗪22。可类似于方案1中所述进行22的后续脱甲基化以获得式Id的类型的化合物。

方案6

方案6描绘了式Ie的化合物的合成。可在本领域中已知的各种条件(包括过渡金属(例如Pd、Cu、Rh)催化的反应)下实现式Ic的氰化以提供式Ie的化合物。

方案7

方案7描绘了式If的化合物的合成。烯基硼酸酯(alkenyl boronate)可类似于方案2中所述环丙烷化。可类似于方案1中所述进行硼酸酯25与芳基氯3的偶联以获得手性化合物26。可通过用适当的酸处理实现二乙缩醛26去遮蔽(Unmasking)为醛27。用各种氟化试剂(例如DAST、

Fluolead^TM或

)处理醛27可提供二氟甲基28。可类似于方案1中所述进行28的后续脱甲基化以获得式If的类型的化合物。

方案8

方案8描绘了式Ig的化合物的合成。可使用技术人员已知的取代技术用如氟化钾或氟化四丁基铵之类的试剂将甲磺酸酯29转化成氟化物30。可类似于方案1中所述进行后续脱甲基化以获得式Ig的手性化合物。

制备和实施例

下列“制备和实施例”进一步例示本发明并代表本发明的化合物的典型合成，但不应以任何方式解释为限制本发明的范围。试剂和原材料易得或是本领域普通技术人员容易合成的。应该理解的是，作为举例说明而非限制阐述“制备和实施例”且本领域普通技术人员可作出各种修改。

在Agilent HP1100液相色谱系统上进行LC-ES/MS。在与HP1100 HPLC相连的MassSelective Detector四极质谱仪上进行电喷雾质谱测量(以正和/或负模式获取)。LC-MS条件(低pH):柱:

NX C-182.1×50mm 3.0μm；梯度:在3min内5-100％B，然后100％B 0.75min，柱温:50℃+/-10℃；流速:1.2mL/min；溶剂A:含0.1％HCOOH的去离子水；溶剂B:含0.1％甲酸的ACN；波长214nm。替代性的LC-MS条件(高pH):柱:WATERS^TM

MS C-18柱2.1×50mm，3.5μm；梯度:5％的溶剂A 0.25min、在3min内从5％至100％溶剂B的梯度和100％的溶剂B 0.5min或在3min内10％至100％的溶剂B和在100％的溶剂B在0.75min；柱温:50℃+/-10℃；流速:1.2mL/min；溶剂A:10mM NH₄HCO₃ pH 9；溶剂B:ACN；波长:214nm。

在配有Mass Selective Detector质谱仪和Leap自动取样器/级分收集器的Agilent 1200LC-ES/MS上进行制备型反相色谱法。在具有10X20mm保护柱的75X30mm

-NX，5μm粒度柱上运行高pH法。流速85mL/min。洗脱剂是在ACN中的10mM碳酸氢铵(pH 10)。

在Bruker AVIII HD 400MHz NMR Spectrometer上获得NMR谱，作为以ppm报道的CDCl₃或(CD₃)₂SO溶液获得，使用残留溶剂[CDCl₃，7.26ppm；(CD₃)₂SO，2.50ppm]作为参考标准。当报道峰多重性时，可使用下列缩写：s(单重峰)、d(双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、br-s(宽单重峰)、dd(双重双峰)、dt(双重三峰)。当报道耦合常数(J)时，其以赫兹(Hz)为单位报道。

制备例1

外消旋-反式-2-(2-乙基环丙基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

向2-[(E)-丁-1-烯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(1.65g,9.06mmol)在Et₂O(45.30mL)中的溶液中加入Pd(OAc)₂(0.20g,0.90mmol)。声处理5分钟并冷却到-5℃。在250mL锥形烧瓶中，加入40％KOH水溶液(162mL)，接着Et₂O(245mL)。在冰/饱和NaCl水溶液浴中将该两相混合物冷却到-5℃。经10分钟逐份加入N-亚硝基-N-甲基脲(36.1g,350mmol)。搅拌15分钟并置于干冰/丙酮浴中。将醚层滗析到量筒中并在-5℃下将Et₂O混合物(71mL,～10当量的CH₂N₂)添加到上述溶液中。在2小时后，经硅藻土过滤反应内容物，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以获得标题化合物(1.08g,58％)。¹H NMR(d₆-DMSO)δ:-0.51(dt,J＝9.3,5.7Hz,1H),0.33-0.37(m,1H),0.50-0.54(m,1H),0.76-0.84(m,1H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H),1.14(s,12H),1.21-1.30(m,2H)。

用于制备例1的替代程序

在冷却为0℃的氮气下将三乙基硼氢化锂在THF中的1M溶液(41.3mL,41.3mmol)添加到二氯化双(五甲基环戊二烯基)锆(11.1g,25.5mmol)在THF(3.4L)中的溶液中。升温到RT并在用铝箔将烧瓶避光的同时搅拌1小时。

在氮气下在-78℃下冷却的不同烧瓶中，冷凝1-丁-1-炔(50.6g,936mmol)并加入频哪醇硼烷(55.0g,425mmol)。将所得混合物在-78℃下搅拌30分钟并经套管加入第一个烧瓶的内容物。加入TEA(5.93mL,42.6mmol)并在升温到RT的同时搅拌反应混合物20小时。通过经套管添加冰/水混合物(1.5L)猝灭该反应，加入EtOAc(300mL)并在RT下搅拌30分钟。分离所得层并用EtOAc(2x200mL)再萃取水相。合并有机萃取物，经Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩以提供黄色油形式的2-[(E)-丁-1-烯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(53g,65％)。GC-MS(m/z):182(M+)。

在-20℃下经10分钟将二乙基锌在甲苯中的溶液(15％w/w,550mL,611mmol)添加到氯碘甲烷(55mL,755mmol)中并搅拌35分钟。经20分钟逐滴加入2-[(E)-丁-1-烯基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(53g,277mmol)在甲苯(100mL)中的溶液，同时使该反应的内部温度保持在-20℃。在升温到0℃的同时将该混合物搅拌2小时。通过缓慢添加饱和NH₄Cl水溶液(750mL)猝灭该反应。分离有机层并用EtOAc(2x 250mL)再萃取水相。合并有机萃取物，经MgSO₄干燥，过滤，并蒸发以提供油形式的标题化合物(48g,84％)，其适合不经额外提纯使用。GC-MS(m/z):180(M-16)。

制备例2

4,4,5,5-四甲基-2-[(E)-3-甲基丁-1-烯基]-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

将频哪醇硼烷(9.5ml,64mmol)经5分钟逐滴添加到冰冷的3-甲基丁-1-炔(4.91g,72.0mmol)中。密封压力容器，升温到RT并搅拌18小时。加入氢氯双(环戊二烯基)锆(IV)(2.0g,7.4mmol)和TEA(1.1mL,7.9mmol)。密封压力容器，置于60℃油浴中并搅拌10分钟。将所得红色溶液冷却到RT2.5小时。用DCM(200mL)稀释反应混合物，用饱和NaHCO₃水溶液(100mL)、饱和NaCl水溶液(50mL)洗涤，经MgSO₄干燥，经硅胶垫(150mL)过滤，用DCM(700mL)冲洗硅胶，并在真空中浓缩以提供标题化合物(11.5g,82％)。ES/MS(m/z):196(M+H).¹HNMR(CDCl₃)δ:1.03(d,J＝6.7Hz,6H),1.29(s,12H),2.37(m,1H),5.40(dd,1H),6.64(dd,1H)。

制备例3

外消旋-反式-2-[2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

将N-亚硝基-N-甲基脲逐份添加到Et₂O(70mL)和KOH水溶液(30.5g,435mmol,70mLH₂O)的冰冷两相混合物中。搅拌直至固体溶解(<5分钟)。将所得重氮甲烷溶液吸移到Pd(OAc)₂(237mg,1.05mmol)和4,4,5,5-四甲基-2-[(E)-3-甲基丁-1-烯基]-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(4.00g,20.4mmol)在Et₂O(70mL)中的快速搅拌的冰冷悬浮液中。在完全添加后，将反应混合物升温到RT，经硅藻土过滤并在真空中浓缩滤液。将所得残留物溶解在DCM中，经硅胶垫(25g)过滤，并在真空中浓缩以获得标题化合物(4.32g,>99％)。ES/MS(m/z):210(M+H).¹H NMR(CDCl₃)δ:-0.35(m,1H),0.45(m,1H),0.65(m,1H),0.78(m,1H),0.98(m,7H),1.23(s,12H)。

制备例4

4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪

在压力管瓶中，将2,4-二甲氧基-5-嘧啶基硼酸(6.75g,36.7mmol)、4,6-二氯-3-甲基-哒嗪(5.98g,36.7mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(0.55g,0.73mmol)、Cs₂CO₃(29.9g,91.8mmol)合并在1,4-二氧杂环己烷/H₂O的4:1混合物(151mL)中。排空空气并用N₂回填。密封该容器并在70℃下加热3小时。残留物经硅藻土过滤并用EtOAc冲洗。用水，接着饱和NaCl水溶液洗涤该有机混合物，经MgSO₄干燥并蒸发至干。通过使用330g

柱经硅胶的色谱法在200毫升/分钟的流速下经15分钟用0-30％DCM/(33％MeOH在DCM中)的梯度提纯所得黑色残留物，以在色谱级分蒸发后提供标题化合物(6.2g,63％)。ES/MS(m/z)(³⁵Cl/³⁷Cl)267/269[M+1]⁺H NMR(d₆-DMSO)δ:2.74(s,3H),4.00(s,3H),4.03(s,3H),8.20(s,1H),8.87(s,1H)。

用于制备例4的替代程序

使氮气料流经过(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)硼酸(85g,439mmol)、4,6-二氯-3-甲基-哒嗪(75g,437mmol)和Cs₂CO₃(358g,1099mmol)在1,4-二氧杂环己烷(1175mL)和H₂O(340mL)中的混合物5分钟。加入[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(6.6g,8.7mmol)并将所得混合物在75℃下搅拌16小时。将该反应冷却到RT，经硅藻土过滤该混合物，并用EtOAc冲洗滤饼。分离所得层并用饱和NaCl水溶液洗涤有机相两次，经MgSO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩。将水(500mL)添加到所得残留物中，在RT下搅拌16小时并过滤所得固体。用H₂O洗涤收集的固体并在真空下干燥16小时以获得棕色固体形式的所需化合物(70g,54％)。ES/MS(m/z)(³⁵Cl/³⁷Cl)267/269[M+1]⁺。

下列实施例可基本如制备例4中所述制备。

制备例6

反式-5-[2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶

在20毫升压力管瓶中，加入4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪(0.6g,2.0mmol)、双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(II)(114mg,0.16mmol)、K₂CO₃(0.69g,4.9mmol)、H₂O(2.25mL)和外消旋的反式-2-[2-乙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(0.66g,3.37mmol)。抽空烧瓶并用N₂回填。密封该容器并在90℃下加热整夜。经硅藻土过滤反应混合物，用水，接着饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经MgSO₄干燥并在真空中浓缩。通过使用275g

Gold C18柱的反相色谱法提纯所得残留物，在150毫升/分钟的流速下经20分钟用30-50％10mM NH₄HCO₃/ACN的梯度洗脱，以在色谱级分蒸发后提供标题化合物，白色固体形式的异构体的基本外消旋混合物(475mg,70％)。

对所得异构体施以通过SFC的提纯(柱:

Cellulose-4,4.6x150mm；40％MeOH/CO₂等度；流速:5毫升/分钟,UV 250nm)以提供0.197克异构体1:t_R＝2.71分钟(UV)；和0.195克异构体2:t_R 3.55分钟(UV),都以>98％ee。ES/MS(m/z):301(M+H)。

制备例7

反式-5-[2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶

合并4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪(1.97g,7.39mmol)、外消旋-反式-2-[2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(3.32g,15.8mmol)、双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(II)(1.35g,1.85mmol)、1,4-二氧杂环己烷(37mL)和1M Na₂CO₃水溶液(18mL,18mmol)。用N₂吹扫反应容器并加热到90℃18小时。冷却到RT，用EtOAc(150mL)稀释并分离各层。用1M Na₂CO₃水溶液、饱和NaCl水溶液相继洗涤有机层，经MgSO₄干燥，过滤并在真空中浓缩滤液。通过在二氧化硅上的色谱法提纯所得残留物，用60-100％EtOAc/DCM梯度洗脱，以在色谱级分蒸发后作为异构体的基本外消旋混合物提供标题化合物(1.48g,64％)。

对异构体施以通过SFC的提纯(柱:

Cellulose-4,4.6x150mm；40％MeOH/CO₂等度；流速:5毫升/分钟,UV 250nm)以提供647mg异构体1:t_R＝2.56min和647mg异构体2:t_R＝3.75min.ES/MS(m/z):315(M+H)。

制备例8

(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸乙酯

经10分钟向在冰/水浴中冷却(内部温度:8℃)的2-二乙氧基磷酰基乙酸乙酯(62.2g,277mmol)在1,4-二氧杂环己烷(400mL)中的溶液中逐滴加入nBuLi在己烷中的2.5M溶液(110mL,280mmol)。移除冷却浴并在RT下搅拌30分钟。将该溶液经套管转移到1L压力容器中并加入(2R)-2-乙基环氧乙烷(20g,280mmol)。所得混合物在150℃(50psi压力)下搅拌17小时。将该反应冷却到RT并加入水(250mL)。分离有机相并用MTBE(2x200mL)再萃取水相。合并有机萃取物，用饱和NaCl水溶液(2x150mL)洗涤，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以产生黄色油形式的粗制标题化合物(49.1g,定量)，适合不经额外提纯使用。GC-MS(m/z):142(M+),97(M-45)。

制备例9

(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸

在100℃下搅拌(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸乙酯(39.44g,277.4mmol)、1,4-二氧杂环己烷(315mL)和25％氢氧化钠水溶液(315mL)的混合物16小时。将该混合物冷却到RT，用MTBE(2x300mL)萃取并弃置有机相。用37％HCl水溶液酸化水相直至pH～1-2，用MTBE(3x300ml)萃取，分离各层，用饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以产生琥珀色油形式的标题化合物(25.1g,75％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.79-0.85(m,1H),1.00(t,J＝7.5Hz,3H),1.22-1.26(m,1H),1.32-1.42(m,3H),1.43-1.48(m,1H),9.0-12.0(br-s,1H)。

制备例10

(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯

在0℃下搅拌(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(25.1g,209mmol)、2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(34.8g,209mmol)和DMAP(2.58g,20.9mmol)在DCM(360mL)中的悬浮液并逐滴加入N,N’-二异丙基碳二亚胺(29.3g,230mmol)。移除冷却浴并将该反应在RT下搅拌2小时。经硅胶塞过滤该悬浮液，用DCM洗脱。蒸发溶剂并通过经硅胶的色谱法提纯所得残留物，用15％己烷/丙酮洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后提供浅黄色固体形式的标题化合物(51.56g,84％)。ES/MS(m/z):260(M+1)。

制备例11

2-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

使N₂料流经过(1S,2S)-2-乙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯(51g,173.1mmol)和联硼酸频那醇酯(87.9g,346mmol)在EtOAc(1L)中的溶液5分钟。加入异烟酸乙酯(5.34g,35mmol)并将该混合物在85℃下搅拌24小时。冷却所得悬浮液，过滤并弃置固体，并在减压下浓缩棕色滤液。经硅胶塞过滤所得粗制残留物，用2％EtOAc/己烷洗脱。从滤液中除去溶剂并使用经硅胶的色谱法再提纯所得残留物，用3％EtOAc/己烷洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后获得无色油形式的标题化合物(17.1g,49％)。GC-MS(m/z):180(M-16)。

制备例12

(2S)-2-氯-3-甲基-丁酸

在0℃下冷却L-缬氨酸(286g,2.44mol)和5M HCl水溶液(3.25L,16.3mol)的溶液。经2小时逐滴加入4M NaNO₂水溶液(1L,4mol)，使内部温度保持在5℃以下。在升温到RT的同时搅拌该反应2小时，并在RT下搅拌另外16小时。经30分钟逐份加入Na₂CO₃(242g,2.28mol)。用MTBE(3x1000mL)萃取所得溶液，用饱和NaCl水溶液(500mL)洗涤合并的有机萃取物，经MgSO₄干燥有机萃取物，并在真空中浓缩。通过真空蒸馏(15毫巴/140℃)提纯所得残留物以提供油形式的标题化合物(248g,68％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:1.1(dt,J＝6.6,2.6Hz,6H),2.34-2.42(m,1H),4.19-4.23(m,1H),10.0-12.0(br-s,1H)。

制备例13

(2S)-2-氯-3-甲基-丁-1-醇

将(2S)-2-氯-3-甲基-丁酸(137g,1mol)在2-甲基四氢呋喃(500mL)中的溶液冷却到0℃。经2.5小时逐滴加入2.3M LAH在甲基四氢呋喃中的溶液(480mL,1.1mol)，使内部温度保持在10℃以下。升温到RT并将该混合物在RT下搅拌1小时和在50℃下搅拌1小时。将该反应冷却到0℃并相继和缓慢加入H₂O(1.48mL)、15％NaOH水溶液(1.48mL)和H₂O(4.46mL)。使该混合物升温到RT，经硅藻土床过滤，并在真空中蒸发溶剂以提供无色油形式的标题化合物(110g,81％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.97-1.1(m,6H),1.94-2.18(m,1H),2.60-3.09(br-s,1H),3.71-3.78(m,1H),3.80-3.85(m,1H),3.90-3.96(m,1H)。

制备例14

(2R)-2-异丙基环氧乙烷

将KOH(195g,3.48mol)在H₂O(195mL)中的溶液冷却到0℃并经20分钟加入纯(2S)-2-氯-3-甲基-丁-1-醇(110g,801mmol)，同时使内部温度保持在5℃以下。使反应混合物升温到RT。通过在100毫巴下真空蒸馏提纯反应混合物，从23℃升温到50℃，以提供无色油形式的标题化合物(47g,64％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.98(d,J＝6.9Hz,3H),1.05(d,J＝6.9Hz,3H),1.51(o,J＝6.9Hz,1H),2.52-2.54(m,1H),2.70-2.75(m,2H)。

制备例15

(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸乙酯

将nBuLi在己烷中的2.5M溶液(310mL,780mmol)经25分钟逐滴添加到在冰/水浴中冷却(内部温度:8℃)的2-二乙氧基磷酰基乙酸乙酯(153mL,772mmol)在1,4-二氧杂环己烷(870mL)中的溶液中。升温到RT并搅拌40分钟。将该溶液经套管转移到3L压力容器中并加入在1,4-二氧杂环己烷(180mL)中的(2R)-2-异丙基环氧乙烷(70g,772mmol)。将反应混合物在150℃下在50psi压力下搅拌14小时。将反应混合物冷却到RT并加入H₂O(700mL)。分离各层并用MTBE(2x 500mL)再萃取水相。合并有机相，用饱和NaCl水溶液(2x350mL)洗涤，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩以获得黄色油形式的粗制标题化合物(107.7g,>99％)，适合不经进一步提纯而后续使用。GC-MS(m/z):156(M+)。

制备例16

(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸

将含有25％NaOH水溶液(800mL)的(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸乙酯(107.7g,482.6mmol)在1,4-二氧杂环己烷(800mL)中的混合物在100℃下搅拌7小时。将该混合物冷却到RT，加入水(300mL)，用MTBE(2x500mL)萃取并弃置有机相。用37％HCl水溶液(大约500mL)酸化水相直至pH～1-2。

用MTBE(2x600mL)萃取酸化的水性混合物，用饱和NaCl水溶液洗涤有机层，经MgSO₄干燥，并在真空中浓缩，以产生琥珀色油形式的标题化合物(54.2g,75％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:0.81-0.86(m,1H),1.01(dd,J＝5.9,3.7Hz,6H),1.04-1.13(m,1H),1.20-1.24(m,1H),1.28-1.37(m,1H),1.39-1.44(m,1H)。

制备例17

(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯

在0℃下搅拌(1S,2R)-2-异丙基环丙烷甲酸(54.2g,359mmol)、2-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(59.8g,359mmol)和DMAP(4.44g,35.9mmol)在DCM(690mL)中的悬浮液。逐滴加入N,N’-二异丙基碳二亚胺(50.4g,395mmol)，升温到RT并将所得反应混合物在RT下搅拌2小时。加入H₂O(600mL)并分离相。用DCM(2x300mL)萃取水相，合并有机相，经MgSO₄干燥，过滤并蒸发。通过在二氧化硅上的色谱法提纯所得固体残留物，用100％DCM洗脱，以在色谱级分蒸发后提供浅黄色固体形式的标题化合物(96g,88％)。ES/MS(m/z):274(M+1)。

制备例18

2-[(1S,2S)-2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

使氮气料流经过(1S,2S)-2-异丙基环丙烷甲酸(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)酯(96g,316mmol)和联硼酸频那醇酯(160g,630mmol)在EtOAc(480mL)中的溶液15分钟。在85℃下搅拌该混合物并经10分钟逐滴加入异烟酸乙酯(24.38g,157mmol)。将所得混合物在85℃下搅拌16小时。冷却所得悬浮液，过滤并弃置固体，并在减压下蒸发棕色滤液。经硅胶塞过滤粗制残留物，用2％EtOAc/己烷洗脱。从滤液中除去溶剂并使用经硅胶的色谱法再提纯所得残留物，用3％EtOAc/己烷洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后获得无色油形式的标题化合物(25.3g,38％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):-0.33^--0.38(m,1H),0.42-0.47(m,1H),0.63-0.67(m,1H),0.75-0.82(m,1H),0.89-1.02(m,1H),0.98(m,6H),1.24(s,12H)。

制备例19

4,4,5,5-四甲基-2-[(E)-4-甲基戊-1-烯基]-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷

将[(E)-4-甲基戊-1-烯基]硼酸(0.975g,7.62mmol)和频哪醇(1.11g,9.14mmol)溶解在无水DCM(9.7mL)中。加入MgSO₄(0.7313g,6.05mmol)并在室温下搅拌3天。过滤不溶性固体并在减压下除去溶剂以提供清澈油形式的标题化合物(1.6g,100％)。1H NMR(400.13MHz,DMSO):0.86(d,J＝6.6Hz,6H),1.08(s,6H),1.19(s,12H),1.62-1.72(m,1H),2.01(td,J＝6.9,1.4Hz,2H),3.92(s,1H),5.31(dt,J＝17.9,1.3Hz,1H),6.47(dt,J＝17.9,6.9Hz,1H)。

制备例20

叔丁基-[[(2S)-环氧乙烷-2-基]甲氧基]-二苯基-硅烷

向[(2R)-环氧乙烷-2-基]甲醇(15.0g,202.6mmol)在DMF(135mL)中的冰冷溶液中加入咪唑(33.34g,489.8mmol)并搅拌15分钟。经30分钟逐滴加入叔丁基-氯-二苯基-硅烷(77mL,302.5mmol)并搅拌整夜到室温。用己烷(1L)、醚(500ml)和水(1L)稀释。分离各层并用醚(2x1L)萃取水层。合并有机物并用水(3x750mL)、NaHCO₃ sat、饱和NaCl水溶液洗涤，并经MgSO₄干燥。在减压下蒸发溶剂。通过硅胶色谱法提纯:洗脱剂0-10％EtOAc/己烷以在从色谱级分中除去溶剂后提供油形式的标题化合物(11.77g,18％)。1H NMR(400.13MHz,CDCl₃):1.08(s,9H),2.64(dd,J＝2.6,5.1Hz,1H),2.77(t,J＝4.6Hz,1H),3.15(quintet,J＝3.5Hz,1H),3.73(dd,J＝4.7,11.8Hz,1H),3.88(dd,J＝3.2,11.9Hz,1H),7.40-7.48(m,6H),7.71(m,4H)。

制备例21

(1S,2S)-2-(羟甲基)环丙烷甲酸乙酯

在室温下将膦酰基乙酸三乙酯(7.5mL,38mmol)缓慢添加到叔丁醇钠(3.67g,37.82mmol)在1,4-二氧杂环己烷(40mL)中的悬浮液中。在1小时后加入叔丁基-[[(2S)-环氧乙烷-2-基]甲氧基]-二苯基-硅烷(11.77g,33.76mmol)并在密封的压力容器中在140℃下加热整夜。追加膦酰基乙酸三乙酯(2mL)并在160℃下加热1小时。允许该混合物冷却并用DCM(300ml)和水(150mL)稀释。分离各层，用DCM(3x150mL)萃取水层。合并有机物并用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤，并经MgSO₄干燥。经硅藻土过滤并在减压下蒸发溶剂以提供油形式的(1S,2S)-2-[[叔丁基(二苯基)甲硅烷基]氧基甲基]环丙烷甲酸乙酯(18.45g)。溶解在THF(75mL)中并在室温下加入氟化四丁基铵(1M THF,67mL,67mmol,1.0M)。搅拌48小时并在130毫巴和30℃下除去溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂:0-50％EtOAc/己烷，以在从色谱级分中除去溶剂后分离出油形式的标题化合物(3.35g,62％)。ES/MS(m/z):142(M+1).1H NMR(400.13MHz,CDCl₃):0.90-0.86(m,1H),1.23(dd,J＝4.5,8.9Hz,1H),1.28(t,J＝7.2Hz,4H),1.56-1.60(m,1H),1.69-1.77(m,2H),2.06(s,2H),3.50(dd,J＝6.9,11.5Hz,1H),3.64(dd,J＝6.0,11.4Hz,1H),4.14(qd,J＝7.1,2.9Hz,3H)。

制备例22

(1S,2S)-2-甲酰基环丙烷甲酸乙酯

向(1S,2S)-2-(羟甲基)环丙烷甲酸乙酯(12.25g,84.9mmol)在DCM(425mL)中的冰冷却溶液中一次性加入氯铬酸吡啶鎓(26.09g,118.6mmol)。在30分钟后移除冰浴并在室温下搅拌4小时。加入水(200mL)并经硅藻土过滤。用另外的水(100mL)和DCM(800mL)冲洗。将硅藻土饼悬浮在DCM中并过滤。重复这一操作两次。合并有机物，分离水层，并经二氧化硅垫过滤有机物。用另外的DCM冲洗并在减压下蒸发溶剂以提供油形式的标题化合物(11.0g,91％)。1H NMR(400.13MHz,CDCl₃):1.30(t,J＝7.3Hz,3H),1.57-1.50(m,1H),1.60-1.65(m,2H),2.26-2.30(m,1H),2.45(td,J＝9.0,4.2Hz,1H),4.13-4.22(m,3H),9.32(d,J＝4.2Hz,1H)。

制备例23

(1S,2S)-2-(二氟甲基)环丙烷甲酸乙酯

将二乙氨基三氟化硫(24mL,172.3mmol)经3分钟添加到(1S,2S)-2-甲酰基环丙烷甲酸乙酯(11.00g,77.38mmol)在DCM(220mL)中的冰冷溶液中。在1小时后从冰浴中取出并在室温下搅拌2小时。加入二乙氨基三氟化硫(3.5mL)并搅拌另外1小时。在冰浴中冷却该混合物并小心地倒入饱和NaHCO₃水溶液中。分离各层并用DCM(2x50mL)萃取水层。

合并有机物并经MgSO₄干燥。经小二氧化硅垫过滤样品并在减压(250毫巴和30℃)下蒸发溶剂以提供油形式的标题化合物(11.10g,87％)。1H NMR(400.13MHz,CDCl₃):1.14-1.19(m,1H),1.29(m,1H),1.30(t,J＝7.2Hz,3H),1.97-1.89(m,2H),4.22(q,J＝7.2Hz,3H),5.79(td,JH-F＝56.8Hz,J＝3.6Hz,1H)。

制备例24

(1S,2S)-2-(二氟甲基)环丙烷甲酸

将1N NaOH(75mL)添加到(1S,2S)-2-(二氟甲基)环丙烷甲酸乙酯(11.10g,67.62mmol)在MeOH(75mL)中的溶液中并在RT下搅拌整夜。加入DCM(70mL)并分离各层。用DCM(70mL)萃取水层。在冰浴中冷却水层并通过添加35％HCl将pH调节到1。加入DCM(50mL)并分离这两个层。用DCM萃取水层。合并有机物，经MgSO₄干燥并在减压(200毫巴,30℃)下蒸发溶剂以提供油形式的标题化合物(6.25g,68％)。1H NMR(400.13MHz,CDCl₃):1.26(dt,J＝8.4,5.9Hz,1H),1.34-1.39(m,1H),1.92-1.96(m,1H),2.01-2.07(m,1H),5.82(td,JH-F＝59Hz,J＝3.2Hz,1H)。

制备例25

反式-苄基-2-乙酰基环丙烷甲酸酯

将K₂CO₃(36.2g,261.93mmol)添加到溴乙酸苄酯(40g,174.618mmol)、甲基乙烯基酮(43mL,523.85mmol)、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(2.3g,20.9mmol)在乙腈(400mL)中的混合物中。在N₂下在80℃下搅拌整夜。允许冷却，过滤并在减压下蒸发溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂0-50％EtOAc/己烷以在从色谱级分中除去溶剂后提供标题化合物(13.4g,35％)。1H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO):1.33-1.39(m,2H),2.08-2.13(m,1H),2.24(s,3H),2.54-2.59(m,2H),5.13(s,2H),7.39-7.37(m,6H)。

制备例26

反式-苄基-2-(1,1-二氟乙基)环丙烷甲酸酯

在0℃下将EtOH(0.05eq)添加到反式-苄基-2-乙酰基环丙烷甲酸酯(2.76g,12.6mmol)和双(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(23.2mL,126mmol)的混合物中。允许升温到室温并在50℃下加热40小时。用DCM稀释并在冰浴中冷却该混合物以缓慢加入饱和NaHCO₃水溶液。分离各层并用DCM(2x100mL)萃取水层。合并有机物并经无水Na₂SO₄干燥。在减压下蒸发溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂:10％MTBE/己烷以在从色谱级分中除去溶剂后提供无色油形式的标题化合物(2.30g,76％)。1H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO):1.19(t,J＝7.5Hz,2H),1.67(t,J H-F＝16Hz,3H),1.93-1.98(m,1H),2.00-2.08(m,1H),5.13(s,2H),7.38-7.40(m,5H)。

制备例27

反式-2-(1,1-二氟乙基)环丙烷甲酸

将10％Pd/C(1.53g,14.4mmol)添加到反式-苄基-2-(1,1-二氟乙基)环丙烷甲酸酯(6.56g,27.3mmol)在EtOAc(136mL,0.2M)中的溶液中。使用气球在H₂下在RT下搅拌3小时。经硅藻土过滤并用EtOAc冲洗。在减压下蒸发溶剂以提供无色油形式的标题化合物(4.03g,98％)。1H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO):1.10(t,J＝7.4Hz,2H),1.66(t,J H-F＝18.4Hz,3H),1.72-1.77(m,1H),1.96-1.99(m,1H),12.49(s,1H)。

制备例28

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶

通过将N₂鼓过该混合物10分钟，将4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪(16g,54.0mmol)、2-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(17g,83.22mmol)、2M Na₂CO₃水溶液(70mL,140mmol)和1,4-二氧杂环己烷(290mL)的混合物脱气。加入双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(II)(2.0g,2.74mmol)并将所得混合物在90℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却到RT，用H₂O稀释并用EtOAc萃取。分离所得相，经无水MgSO₄干燥有机相，并在真空中浓缩。通过经二氧化硅的色谱法提纯所得残留物，用60-100％己烷/EtOAc梯度洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后获得琥珀色油形式的标题化合物(12.95g,77％)。该油在RT下静置时固化成灰白色固体。ES/MS(m/z):301(M+1)。

制备例29

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶

混合4-氯-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪(19.1g,70.6mmol)、K₃PO₄(45.9g,212mmol)、1,4-二氧杂环己烷(300mL)和H₂O(75mL)并用N₂将该混合物脱气10分钟。加入[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(7.98g 10.6mmol)。用氮气鼓泡另外2分钟并一次性加入2-[(1S,2S)-2-异丙基环丙基]-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(22.2g,106mmol)。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将该反应冷却到RT，加入H₂O，并用EtOAc萃取。分离有机层，经无水MgSO₄干燥并在减压下浓缩。通过经二氧化硅的色谱法提纯所得残留物，用85％己烷/EtOAc洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后分离出琥珀色油形式的标题化合物(21.5g,92％)。该油在RT下静置时固化成灰白色固体。ES/MS(m/z):315(M+1)。

制备例30

4-[(1S,2S)-2-(二氟甲基)环丙基]-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪

将二甲基锌(2M在甲苯中，1.5mL,3.0mmol)添加到3-氯-4-[(1S,2S)-2-(二氟甲基)环丙基]-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)哒嗪(502mg,1.46mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁-二氯化钯(II)(53mg,0.07mmol)在THF(6mL)中的脱气悬浮液中。在密封管瓶中在60℃下加热2小时。允许冷却到室温。加入饱和NH₄Cl水溶液并用DCM萃取(3x)。合并有机物，经无水MgSO₄干燥并在减压下除去溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂:EtOAc，以在从色谱级分中除去溶剂后作为黄色残渣提供标题化合物(433mg,91.8％)。ES/MS(m/z):323(M+1)。

制备例31

3,6-二氯-4-环丙基-哒嗪

向3,6-二氯哒嗪(10.00g,67.12mmol)在水(300mL)中的悬浮液中加入10mL浓H₂SO₄和环丙烷甲酸(5.85mL,73.7mmol)，在70℃下加热并用N₂脱气。经30秒加入AgNO₃(2.28g,13.4mmol)在10mL H₂O中的溶液，接着经30分钟逐滴加入(NH₄)₂S₂O₈(46g,201.577mmol)在150mL H₂O中的溶液。在1小时后允许混合物冷却到RT并倒在冰上，通过添加浓NH₄OH将pH调节到9。用EtOAc稀释并分离有机层。用另外的EtOAc萃取水层。合并有机物，经无水Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发溶剂。通过反相色谱法提纯(C18Gold 415g,梯度25-100％ACN在10mM碳酸氢铵中；150mL/min,30min)以在从色谱级分中除去溶剂后分离出白色固体形式的标题化合物(6.83g,54％)。ES/MS(m/z):(³⁵Cl/³⁷Cl)189/191。

下列实施例可基本如制备例22中所述制备。

制备例43

3-氯-4-环丙基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)哒嗪

混合(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)硼酸(4.60g,25.0mmol)、3,6-二氯-4-环丙基-哒嗪(5.2g,28mmol)和K₂CO₃(4.4g,32mmol)、1,4-二氧杂环己烷(125mL)和H₂O(42mL)并将该混合物用N₂脱气10分钟。加入[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(1.5g,1.8mmol)并进一步用N₂脱气。所得混合物在60℃下搅拌1小时。将该反应冷却到RT，加入H₂O，并用EtOAc萃取。分离有机层。用另外的EtOAc萃取水层。合并有机物，经无水Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发溶剂。通过经二氧化硅的色谱法提纯所得残留物，用70％己烷/(3:2丙酮:DCM)洗脱，以在从色谱级分中除去溶剂后分离出浅黄色固体形式的标题化合物(2.4g,33％)。ES/MS(m/z):(³⁵Cl/³⁷Cl)293/295[M+1]⁺。

下列实施例可基本如制备例6中所述制备。

制备例52

4-环丁基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲氧基-哒嗪

根据制备例21和33由环丁基甲酸获得3-氯-4-环丁基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)哒嗪。

将3-氯-4-环丁基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)哒嗪(0.42g,1.4mmol)添加到通过将Na(0.16g,6.8mmol)溶解在MeOH(12mL)中制成的NaOMe溶液中。该混合物在加盖管瓶中在60℃下加热整夜。允许混合物冷却到RT，加入50％饱和NaCl水溶液并用DCM(3x)萃取。合并有机物并经无水MgSO₄干燥。在减压下除去溶剂以提供白色固体形式的标题化合物(0.38g,93％)。ES/MS(m/z):303(M+1)。

下列实施例可基本如制备例52中所述制备。

制备例59

反式-叔丁基-二甲基-[2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-基)环丙基]乙氧基]硅烷

可由市售叔丁基-二甲基-[(E)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)丁-3-烯氧基]硅烷基本如制备例3中所述制备。1H NMR(400.13MHz,CDCl3):3.70-3.66(m,2H),1.51-1.38(m,2H),1.23(s,12H),1.04-0.96(m,1H),0.91(s,9H),0.71-0.67(m,1H),0.46-0.41(m,1H),0.07(s,6H),-0.38(dt,J＝9.3,5.8Hz,1H)。

制备例60

反式-叔丁基-二甲基-[2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙氧基]硅烷

可基本如制备例4中所述制备。ES/MS(m/z):417(M+1)。

制备例61

反式-2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙醇

将氟化四丁基铵(5mL,5mmol,1M在THF中)和反式-叔丁基-二甲基-[2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙氧基]硅烷(1.15g,8.9mmol)添加在DCM(3mL)中并在60℃下搅拌1小时。冷却到室温。用DCM(80mL)稀释并用饱和NH₄Cl(3x30mL)洗涤。合并有机物，经无水Na₂SO₄干燥并在减压下除去溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂0-30％MeOH/EtOAc以在从色谱级分中除去溶剂后提供白色固体形式的标题化合物(0.53g,53％)。ES/MS(m/z):317(M+1).1H NMR(399.80MHz,CDCl3):8.92(s,1H),7.29(m,1H),4.03(s,3H),4.02(s,3H),3.81(t,J＝6.2Hz,2H),2.76(s,3H),1.73-(m,3H),1.26(m,2H),1.03(m,2H)。

制备例62

甲磺酸反式-2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙基酯

在0℃下在N₂下将甲磺酰氯(0.2mL,3mmol)添加到反式-2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙醇(0.390g,1.22mmol)和N,N-二异丙基乙基胺(0.4mL,2mmol)在DCM(8mL)中的溶液中。在0℃下搅拌40分钟。用50mL DCM稀释并用5％NaHCO₃(2x30mL)和水(30mL)洗涤。合并有机物，经无水Na₂SO₄干燥并在减压下蒸发溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂:0-20％MeOH/EtOAc，以在从色谱级分中除去溶剂后提供棕色固体形式的标题化合物(0.280g,58％)。ES/MS(m/z):395(M+1).1H 1H NMR(399.80MHz,CDCl3):8.98(s,1H),7.38(s,1H),4.37(t,J＝6.2Hz,2H),4.07(s,3H),4.05(s,3H),3.01(s,3H),2.81(s,3H),2.04(m,1H),1.90-1.78(m,2H),1.27(m,1H),1.06(t,J＝7.1Hz,2H)。

制备例63

反式-2,4-二甲氧基-5-[6-甲基-5-[2-(2-氟乙基)环丙基]哒嗪-3-基]嘧啶

将水合氟化四丁基铵(3mL,3mmol,1M在THF中)添加到甲磺酸反式-2-[2-[6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲基-哒嗪-4-基]环丙基]乙基酯(0.280g,0.71mmol)在THF(3mL)中的溶液中。在70℃下加热2小时。冷却到RT。用EtOAc稀释，用饱和NaCl水溶液洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，并在减压下除去溶剂。通过硅胶色谱法提纯，洗脱剂:0-20％MeOH/EtOAc，以在从色谱级分中除去溶剂后提供浅黄色油形式的标题化合物(0.170g,71％)。ES/MS(m/z):319(M+1).1H NMR(399.80MHz,CDCl3):9.01(m,1H),7.39(s,1H),4.67-4.52(dt,J H-F48Hz,J＝6.7Hz,2H),4.08(s,3H),4.07(s,3H),2.83(s,3H),2.00-1.94(m,3H),1.27(m,1H),1.06(m,2H)。

手性分离:柱Lux Cellulose-4,250x21mm,流速70g/min，洗脱剂:40％MeOH/CO₂。

对映体1>99％ee,rt 2.59min(Lux Cellulose-4,4.6x150mm,40％MeOH/CO₂,5mL/min,225nm).对映体2>99％ee.rt 3.34min(Lux Cellulose-4,4.6x150mm,40％MeOH/CO₂,5mL/min,225nm)。

实施例1

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮

将5-[5-[(-2-乙基环丙基)-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶异构体1(197mg,0.66mmol)溶解在1M HCl水溶液(4mL)中并将所得混合物加热到70℃整夜。将反应混合物冷却到RT，在丙酮/干冰浴中在-78℃下冷冻，并通过冻干除去溶剂以提供浅黄色固体形式的标题化合物(0.176g,97％)。ES/MS(m/z):273(M+H).

¹H NMR(d₆-DMSO)δ:1.00(t,J＝7.3Hz,3H),1.11-1.16(m,1H),1.27-1.33(m,2H),1.47-1.52(m,2H),1.92-1.96(m,1H),2.80(s,3H),8.00(s,1H),8.41(d,J＝5.5Hz,1H),11.73(s,1H),11.99-11.91(m,1H)。

用于实施例1-5的替代程序

将5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶(16.2g,51.5mmol)和1M HCl水溶液(135mL,135mmol)的悬浮液在45℃下搅拌16小时。冷却到RT，加入2M K₂HPO₄水溶液至pH～6(大约150mL)，并在RT下搅拌16小时。过滤并收集所得固体，用水洗涤并在真空炉中在45℃下干燥16小时以产生白色固体形式的标题化合物(13.8g,93％)。ES/MS(m/z):273(M+1)。

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的结晶将5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮溶解在甲醇中，在50℃下搅拌1小时并允许冷却到环境温度，在此其从溶液中结晶。通过真空过滤分离固体并在真空下在70℃下短暂干燥。

实施例2

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮

将反式-5-[5-[2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶异构体1(628mg,2.00mmol)溶解在MeOH(3mL)中。加入1M HCl水溶液(5mL)并加热到70℃3小时。冷却到RT，将反应混合物加载在MeOH洗过的SCX柱(20g,Silicycle SILIABOND TosicAcid)上，用MeOH(140mL)洗涤SCX柱并用2M NH₃/MeOH(140ml)洗脱所需产物。浓缩NH₃/MeOH级分以获得乳白色固体形式的标题化合物(546mg,95％)。ES/MS(m/z):287(M+H).¹H NMR(d₆-DMSO)δ:0.99(m,9H),1.24(m,1H),1.81(m,1H),2.72(s,3H),7.67(s,1H),8.23(s,1H),11.43(bs,2H)。

用于实施例1-5的替代程序

将5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-2,4-二甲氧基-嘧啶(21.5g,65.6mmol)和1M HCl水溶液(165mL,135mmol)的悬浮液在45℃下搅拌16小时。冷却到RT并用MTBE萃取。弃置有机相并向水相中加入2M K₂HPO₄水溶液直至pH～6(大约150mL)。所得混合物在RT下搅拌16小时。过滤并收集所得固体，用水洗涤并在真空炉中在45℃下干燥16小时以产生白色固体形式的标题化合物(14.3g,76％)。ES/MS(m/z):287(M+1)。

实施例3

5-[5-[2-(二氟甲基)环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮

5-[5-[2-(二氟甲基)环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮可基本如实施例1中所述制备。

下列实施例可基本如实施例1中所述制备。

实施例7

5-(6-氯-5-环丙基-哒嗪-3-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮

将1M HCl(14mL,14mmol)添加到3-氯-4-环丙基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)哒嗪(1.0g,3.4mmol)在MeOH(17mL)中的溶液中并在50℃下搅拌整夜。在减压下除去溶剂以提供白色固体形式的标题化合物(0.9g,100％)。ES/MS(m/z):(³⁵Cl/³⁷Cl)265/267。

下列实施例可基本如实施例7中所述制备。

实施例16

4-环丙基-6-(2,4-二氧代-1H-嘧啶-5-基)哒嗪-3-甲腈

用N₂将5-(6-氯-5-环丙基-哒嗪-3-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(A,57mg,0.22mmol,100质量％)在DMF(1mL,12.9mmol)中的溶液脱气。加入Zn(CN)₂(20mg,0.22mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(5mg,0.0054mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁(6mg,0.011mmol)并进一步用N₂脱气。盖紧盖子并在120℃下加热整夜。冷却到RT并经硅藻土过滤。通过反相色谱法提纯(C18 Gold 15.5g,梯度5-20％ACN在10mM碳酸氢铵中；20CV)以分离出浅黄色固体形式的标题化合物(0.032g,58％)。ES/MS(m/z):256(M+1)。

下列实施例可基本如实施例16中所述制备。

实施例23

5-(5-环丁基-6-甲氧基-哒嗪-3-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮

将1M HCl(5.2mL,5.2mmol)添加到4-环丁基-6-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-3-甲氧基-哒嗪(0.39g,1.3mmol)中并在50℃下搅拌6小时，然后在RT下搅拌整夜。在减压下除去溶剂。经SCX筒提纯(10g,洗脱剂60mL DCM,60mL 50％MeOH/DCM和120mL 50％(7M NH₃/MeOH)/DCM)以提供白色固体形式的标题化合物(0.337g,96％)。ES/MS(m/z):275(M+1)。

下列实施例可基本如实施例23中所述制备。

实施例30

5-[5-[(1S,2R)-2-(2-氟乙基)环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮

将HCl(1M在H₂O中,2mL,2mmol)添加到反式2,4-二甲氧基-5-[6-甲基-5-[2-(2-氟乙基)环丙基]哒嗪-3-基]嘧啶的对映体1(0.043g,0.14mmol)中并在50℃下加热整夜。在减压下除去溶剂。经SCX筒提纯(12g,洗脱剂70mL MeOH,70mL 2M NH₃/MeOH)以提供白色固体形式的标题化合物(0.037g,89％)。ES/MS(m/z):291(M+1)。

生物检测

下列检测法证实所例举的本发明的化合物是CD73活性的抑制剂，并可用于治疗癌症。

CD73蛋白质表达和纯化

通过用CD73基因瞬时转染细胞，在HEK293F哺乳动物细胞中表达C端6-HIS-标记人类CD73(氨基酸1-547)并使用Ni²⁺亲和力和Superdex 200尺寸排阻色谱法纯化。如上所述表达和纯化C端6-HIS-标记小鼠CD73(氨基酸1-549)。如上所述表达和纯化C端6-HIS-标记大鼠CD73(氨基酸1-549)。

用于腺苷和腺苷纯化的质谱法

使用Agilent 300RapidFire自动化萃取系统(Agilent,Santa Clara,CA)，具有三个HPLC四元泵，耦合到具有电喷雾电离(ESI)接口源的Sciex 6500三重四极杆质谱仪(ABSciex,Framingham,MA)。向RapidFire质谱系统加载可重复使用的RapidFire HILIC(H1)固相萃取(SPE)筒(G9203-80109)。

用于样品加载和洗涤的溶剂A是50mM甲酸铵，pH 4.0，含有5％(v/v)ACN。用于样品洗脱的溶剂B是0.3％甲酸+2％氢氧化铵在70％ACN/30％MeOH中。通过在真空下直接从多孔板将10μL抽吸到收集回路上，相继分析样品。将10μL样品加载到HILIC筒上并借助四元泵1使用溶剂A在1.25毫升/分钟的流速下洗涤3000ms。保留的被分析物借助四元泵3使用溶剂B在1.25毫升/分钟的流速下洗脱到质谱仪3000ms。该系统借助四元泵1使用溶剂A在1.25毫升/分钟的流速下重新平衡3000ms。

为三重四极杆质谱仪配备电喷雾电离(ESI)源并使用选择反应监测(SRM)以正模式(M+H)+监测被分析物。在m/z 268.05/136.0下监测腺苷并在m/z 348.1/136.0下监测一磷酸腺苷。分别使用13C5腺苷和15N5 AMP作为内标计算腺苷和一磷酸腺苷的面积比值。

人类CD73生化检测

这一检测的目的是鉴定和表征CD73酶活性的抑制剂。将含有2μM一磷酸腺苷(Sigma#01930)、10mM Tris pH 7.5、100mM NaCl、0.01％BSA、0.2mM辛基葡糖苷和50pMCD73蛋白质的反应混合物(20μL)添加到384孔板(Nunc#264573)中。在室温下培养30分钟后，通过加入20μL含有2％甲酸和10μM ¹³C5-腺苷(用¹³C5标记的核糖)(Cambridge IsotopeLaboratories-#CLM-3678-0)的终止液，接着加入40μL dH₂O，终止该反应。使用如上所述的质谱法测定腺苷和腺苷核糖-¹³C5(内标)水平。使用信号比(腺苷峰值积分/腺苷内标峰值积分)量化各反应。使用方程{％抑制＝100x[1-(X-MIN)/(MAX-MIN)]}计算抑制百分比，其中X等于孔信号比(well signal ratio)，MAX等于DMSO对照物的中值信号比，且MIN等于>10XIC₅₀的已知竞争性抑制剂存在下的酶活性的信号比。为了筛选目的，在1％DMSO中50μM下测试各化合物。通过在从0.0025至50μM的10个浓度下(使用1:3稀释方案)测试各化合物，测定各化合物的IC₅₀。

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.028μM。

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.043μM。

本文中公开的实施例的所有化合物表现出小于0.062μM的IC₅₀。

人类CD73机制检测

这一检测的目的是测定相关化合物的作用机制。如上文对人类CD73生化检测所示进行该检测。使用1:3稀释方案在从0.023至50μM的8个不同浓度下测试各化合物，但使用3倍稀释方案在从0.023至50μM的8个不同的AMP浓度下。使用GraphPad Prism 7.00绘制在不同抑制剂和底物浓度下的面积比并使用专用混合模型抑制(dedicated mixed-modelinhibition)拟合以测定抑制的Vmax、Km、Ki和alpha值{(Vmax_app＝Vmax/(1+[I]/(Alpha*Ki))；Km_app＝Km*(1+[I]/Ki)/(1+[I]/(Alpha*Ki))；Y＝Vmax_app*X/(Km_app+X)，其中Alpha、Vmax、Km和Ki为各化合物共用。

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮和5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮各自是结合到酶-磷酸盐复合物上而非脱辅酶本身上的非竞争性抑制剂。

如表1中所示，提高AMP的底物浓度增强非竞争性抑制剂，例如5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的效力，因为其IC50值降低。

小鼠CD73机制检测

这一检测的目的是评估抑制剂对小鼠CD73酶活性的抑制。如上文对人类CD73生化检测所述进行这一检测，只是使用3μM AMP和50pM小鼠CD73酶。

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.175μM。

Calu6人类细胞检测

这一检测的目的是在基于细胞的检测法中针对CD73测试化合物。在含有100μL培养基(MEM(Gibco#11095-072)+1％丙酮酸钠(Gibco#11360-070)+1％NEAA(Gibco#11140-050)+10％FBS(Hyclone#SH30071))的96孔聚-D-赖氨酸涂布板(BD#356640)中培养Calu6细胞(1500个细胞/孔)。板在室温下培养30分钟，然后在37℃/5％CO₂下培养整夜。细胞用检测缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.2、10mM D-葡萄糖、1mM KCl、125mM NaCl、2mM MgCl₂)(90μL/孔)洗涤两次。然后，将90μL检测缓冲液添加到各孔中，然后加入每孔10μL的AMP和化合物预混物(50μM AMP，在1％DMSO中不同浓度的化合物)。板在室温下培养60分钟。然后，取出每孔10μL上清液并添加到新板中，接着加入20μL终止液(2％甲酸,1.2μM腺苷核糖-¹³C5(Cambridge Isotope Laboratories-#CLM-3678-0))和90μL ddH2O以供质谱分析。使用如上文对人类CD73生化检测所述的质谱法(Agilent RapidFire)测定腺苷-和腺苷核糖-¹³C5(内标)水平。也如上所述计算抑制百分比。

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.0073uM(实施例2的化合物)。

5-[5-[(1S,2S)-2-乙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.028uM。

离体靶抑制检测

这一检测的目的是在离体基检测中针对小鼠血液中的鼠CD73测试化合物。在肿瘤达到大约400mm³后，口服给予动物(6个/组)配制在20％HPBCD(2-羟丙基-β-环糊精)，pH 2中的各化合物。在治疗后，将血液收集到肝素管中并用于离体分析¹³C10-¹⁵N5-AMP转化成标记的腺苷、肌苷和次黄嘌呤——如对使用收集自经口服给药接受化合物治疗的动物的全血的离体检测所描述。

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮如表2中所示在来自用不同剂量的化合物治疗的动物的小鼠全血中抑制AMP转化成腺苷、肌苷和次黄嘌呤。

*:统计显著性。

5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮的IC₅₀为0.0073uM。

人类CD73检测的Calu6肿瘤基体内靶抑制

这一检测的目的是在体内靶抑制检测中在源自人类癌Calu6细胞的异种移植肿瘤中针对人类CD73测试化合物。Calu6细胞(ATCC)在补充了10％胎牛血清的HBSS培养基中生长。用胰蛋白酶收取近汇合(sub-confluent)细胞并用无血清的生长培养基冲洗两次。通过在裸小鼠(The Harlon Laboratory)的后侧腹注射在1:1HBSS和

混合物(BDBiosciences,Franklin Lakes,NJ)中的5x10⁶，引发皮下肿瘤的生长。当平均肿瘤体积达到大约400-500mm³时，通过肿瘤尺寸和体重随机分配动物并如所示分到它们各自的治疗组中。在治疗后，收集肿瘤样品(各50-80mg)并在含有如下所述的内标的1mL冰冷提取缓冲液中加工。

将箔条和液氮添加到研钵中以预冷。将肿瘤组织放到箔条上，并加入液氮。将另一箔条放置在肿瘤组织上并用研杵锤击直至肿瘤充分磨碎。将50至100mg的肿瘤组织放入管(Fishers Scientific,cat#02-681-302)中并置于干冰上。将一个金属珠(QiagenCat.No.69989)和1ml含有¹³C₅-腺苷、¹³C₅-AMP、¹⁵N₅-GTP、¹⁵N₄-肌苷5’-一磷酸盐和¹³C-¹⁵N-次黄嘌呤的内标的80％甲醇(Cambridge Isotope Lab and Cayman Chemical)添加到管中，并将样品储存在-80℃下直至用于LC/MS分析。

也将血液收集到肝素管中并用于离体分析¹³C₅-¹⁵N5-AMP转化成标记的腺苷、肌苷和次黄嘌呤——如对使用收集自经口服给药接受化合物治疗的动物的全血的离体检测所描述。

如表3中所示，5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮在用不同剂量的化合物治疗的Calu6肿瘤中抑制AMP转化成腺苷。

*:统计显著性。

T细胞抑制检测

使用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester)(CFSE)作为标记剂Human PBMC或用含有5％HI FBS(Gibco#10082)的标记缓冲液(RPMI 1640w/L-谷氨酰胺,GIBCO cat#11875)洗涤分离的CD4细胞(0.5x10⁶–1x10⁸个细胞)，并悬浮在1毫升标记缓冲液中。将细胞与含50μM CFSE(Biolegend cat#423801)的110μl PBS混合，并在室温下培养5分钟。标记的细胞用含5％HI FBS(Gibco#10082)的PBS洗涤一次并用含1x青霉素/链霉素的T细胞正常生长培养基(X-Vivo 15,Lonza,cat#04-744Q)洗涤一次，并悬浮在用于PMBCs和CD4细胞的生长培养基中。

T细胞活化和处理

将CFSE标记的人PBMC(600,000个细胞/毫升)或CD4细胞(500,000个细胞/毫升)与

Human T-Activator CD3/CD28(Gibco,cat#11131D)(在1:1细胞/珠比率下)和人IL-2(60IU/ml,Roche,cat#:11011456001)混合。将细胞置于37℃水浴中10分钟以预活化T细胞。将PBMC(125μl/孔)或CD4细胞(100μl/孔)转移到96孔板(Costar 3799,CorningInc.)。为使用PBMC测试化合物，在含有400-600μM AMP的细胞正常生长培养基(125μL)中制备各种浓度的受试化合物。为使用CD4细胞测试化合物，在含有200-250μM AMP的细胞正常生长培养基(100μL)中制备各种浓度的受试化合物。处理过的细胞在37℃,5％CO₂下培养68-70hr。

将含有处理过的PBMC的培养基(160μl)转移到板并将用于细胞因子检测的剩余培养基转移到AcroPrep 96板(AcroPrep 96滤板,Omega 3K NTRL 350ul孔,Pall LifeScience Cat#8033)以制备用于代谢物的LC-MS分析的样品。

将含有CD4细胞的培养基(100μl)转移到AcroPrep板并通过在1500g下离心2小时而经AcroPrep板过滤到另一个板。将过滤的介质(50μl/孔)与相同体积的80％甲醇、1％NH₄OH和内标(250ng/mL ¹³C5-AMP和250ng/mL ¹³C5-腺苷)混合以用于代谢物的LC-MS分析。

收集处理过的PBMC或CD4细胞并为流式细胞术染色以量化T细胞增殖。

流式细胞术

PBMC或CD4细胞用1:200稀释在DPBS中的Zombie Aqua(Biolegend,cat#423102,Lot#B195875)染色15分钟，随后在冰上在流式染色缓冲液(DPBS-2％HIFBS-0.5％BSA)中用人Fc受体结合抑制剂(eBioscience Cat#No.14-9161-73)在1:5稀释下阻断15分钟。PBMC用APC/Cy7抗人CD3(Biolegend cat#300426,1:20稀释)、APC抗人CD4(Biolegend,Cat#317416,1:20稀释)和Pacific Blue抗人CD8a(Biolegend,Cat#300927,1:20稀释)的混合物染色，且CD4细胞在冰上在流式染色缓冲液中用APC抗人CD4(Biolegend,Cat#317416,1:20稀释)染色30分钟。

通过BD FACS Verse获取流动数据。适当补偿各荧光通道。在FloJo ver.7.6.5上用下列设门策略处理数据：在FSC vs SSC点状图上设门的淋巴细胞；在SSC vs ZombieAqua点状图上设门的淋巴细胞的活细胞；在APC-Cy7 vs Zombie Aqua点状图上设门的活淋巴细胞的CD3细胞；在APC vs Pacific Blue点状图上设门的CD3细胞的CD4细胞和CD8细胞；进一步在APC vs CFSE(FITC)和Pacific Blue vs CFSE(FITC)点状图上设门的CD4和CD8细胞。通过增殖工具分析CD4和CD8细胞的增殖。增殖指数(PI)被定义为总细胞数/起始细胞数，且化合物挽救％被计算为(PI_{w/o AMP w/o cpd}–PI_样品)/(PI_{w/oAMP w/o cpd}–PI_{w AMP w/o cpd})*100。

如表4中所示，通过5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮抑制CD73挽救了腺苷介导的T细胞增殖抑制，这与生长培养基中的腺苷水平的剂量依赖性降低相关联。

细胞因子分析

来自处理过的PBMC的培养基用来自细胞因子ELISA试剂盒的1x ELISA/ELISPOTDiluent以1:7.5、1:2.5和1:50稀释并使用Human TNF alpha ELISA Ready-SET-GO！Kit(eBioscience cat#88-7346-22)分析TNFα、使用Human IL-1βELISA ready-SET-GO！Kit(第2代)(eBioscience,cat#88-7261-22)分析IL-1β和使用Human IFN gamma ELISAready-SET-GO！Kit(eBioscience,cat#88-7316-22)分析IFNγ，基于制备商手册。

如表5中所示，通过5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮抑制CD73提高CD4⁺T细胞中的TNF-α水平。

如表6中所示，通过5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮抑制CD73提高CD4⁺T细胞中的TNF-α水平。

体内模型

如果需要，可以例如根据现有技术中，例如在Rongvaux A等人,AnnualRev.Immunology 2013；31:635-74和其中引用的文献；Sanmamed MF等人,Annals ofOncology 2016；27:1190-1198和其中引用的文献中阐述的方法进行本发明的化合物或其可药用盐的CD73抑制作用的临床前建模。

用于测量人血清中的CD73活性的基于LC/MS的检测法

新鲜的正常人血在室温下在1,500g下离心15分钟，并收集含血清的上部。将收集的血清(25ul/孔)转移到含有各种浓度的实施例2的化合物和固定浓度的左旋咪唑(1,500uM)的96深孔板(DWP,Analytical Sales&Services Inc.Cat#968820)中。在冰上培养60分钟后，将¹³C5-¹⁵N5-AMP(50uM)添加到板中的各孔中，并将该板在室温下培养15分钟。然后将板置于干冰上，添加200uL/孔的17.3TCA，接着用摇板机(Qiagen)在26fps下摇动3分钟。然后将板在4℃下在2940g下离心20分钟。在离心后，将来自各孔的100ul/孔的上清液转移到新的96深孔板并在冰上与18.4ul/孔的2.5M Na₂CO₃混合，随后加入200ul含内标的提取溶液(IS:¹³C5-AMP,¹³C5-腺苷,¹³C5-次黄嘌呤和¹⁵N4-肌苷)。在4℃下在2940g下进一步离心20分钟后，200ul/孔的上清液用于通过如上所述的LC/MS分析¹³C10-¹⁵N5-腺苷、¹³C10-¹⁵N5-肌苷和¹⁵N5-次黄嘌呤。对于EC50计算，用源自in-silico模型或经实验得出的未结合分数(％)校正血清中的CD73抑制剂的浓度。

表7含有通过5-[5-[(1S,2R)-2-异丙基环丙基]-6-甲基-哒嗪-3-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(实施例2的化合物)抑制人血清中的CD73活性的数据。

表8含有通过本文中公开的某些化合物抑制人血清中的CD73活性的数据。