[go: up one dir, main page]

CN111801111A - 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法 - Google Patents

梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111801111A
CN111801111A CN201980014819.4A CN201980014819A CN111801111A CN 111801111 A CN111801111 A CN 111801111A CN 201980014819 A CN201980014819 A CN 201980014819A CN 111801111 A CN111801111 A CN 111801111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
group
amino acid
sequence selected
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201980014819.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111801111B (zh
Inventor
大卫·B·韦纳
伊丽莎白·迪佩雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wistar Institute of Anatomy and Biology
Original Assignee
Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wistar Institute of Anatomy and Biology filed Critical Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority to CN202510692710.3A priority Critical patent/CN120514835A/zh
Publication of CN111801111A publication Critical patent/CN111801111A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111801111B publication Critical patent/CN111801111B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

包含一种或多种核苷酸序列的核酸分子和组合物，所述核苷酸序列编码共有梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原。公开了免疫调节方法和诱导对MCV的免疫应答的方法。公开了治疗MCV感染的方法以及治疗或预防MCV相关的梅克尔细胞癌的方法。公开了修饰的共有MCV T抗原。

Description

梅克尔多元癌细胞病毒的大和小T抗原、核酸构建体和由此制 造的疫苗及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月19日提交的美国临时申请序列号62/619,161的优先权，通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及用于诱导免疫应答和治疗MCV感染个体和/或治疗或预防梅克尔细胞癌(MCC)的疫苗。本发明涉及共有MCV大T抗原(LTAg)和小t抗原(STAg)癌蛋白以及编码它们的核酸分子。
背景技术
梅克尔多元癌细胞病毒(Merkel Cell Polyomavirus，MCV)由于其与侵袭性人皮肤癌梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma，MCC)有关而最近受到关注。在美国，每年大约诊断出1,500例新发MCC病例，并且MCC受试者的死亡率仍保持在46％。与皮肤T细胞淋巴瘤和慢性粒细胞白血病相比，MCC杀死的患者更多。大多数(约75％)MCC包含克隆整合的病毒DNA，并表达病毒T抗原转录本和蛋白。
目前，尚无针对MCC的疫苗正在进行临床试验。因此，本领域需要针对MCV和MCC的治疗性疫苗。本发明满足了这种未满足的需求。
发明内容
在一个实施例中，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含编码至少一种修饰的梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原的核酸分子，其中，所述T抗原包含至少一种突变，所述突变破坏天然MCV T抗原的至少一种致癌特征。在一个实施例中，所述至少一种致癌特征是CR1结合、DnaJ结合、结合磷酸酶pp2A的结合、Rb结合、ATP酶活性、解旋酶活性、伴侣蛋白结合、hVam6p结合、Fbxw7结合、起点结合和转化中的至少一种。
在一个实施例中，所述至少一种突变是氨基酸突变，所述氨基酸位于D44、W209、E216、L142、L91、K92、D93、Y94或M95中的至少一处。在一个实施例中，至少一种突变是D44N突变、W209A、E216K突变、L142A突变、L91A突变、K92A突变、D93A突变、Y94A突变或M95A突变中的至少一种。在一个实施例中，所述修饰的MCV T抗原包含D44N突变、W209A或E216K突变中的至少一种。在一个实施例中，所述修饰的MCV T包含D44N突变、W209A和E216K突变。
在一个实施例中，至少一种MCV T抗原是大T抗原(LTAg)或小t抗原(STAg)。在一个实施例中，至少一种MCV T抗原是LTAg和STAg的组合。
在一个实施例中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含以下氨基酸序列：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子是DNA分子或RNA分子。
在一个实施例中，所述核酸分子包含以下至少一种核苷酸序列：a)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与至少60％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列具有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或者d)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的免疫原性片段。
在一个实施例中，编码肽的核苷酸序列与至少一种调控序列可操作地连接。在一个实施例中，所述调控序列是起始密码子、IgE前导序列或终止密码子中的至少一个。
在一个实施例中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含以下至少一个氨基酸序列：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
在一个实施例中，所述核酸分子包含以下至少一种核苷酸序列：a)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与至少60％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列具有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或者d)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的免疫原性片段，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
在一个实施例中，所述核酸分子包含表达载体。
在一个实施例中，所述核酸分子被掺入病毒颗粒。
在一个实施例中，所述免疫原性组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
在一个实施例中，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。
在一个实施例中，本发明涉及一种核酸分子，所述核酸分子编码包含以下至少一种氨基酸序列的肽：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述核酸分子是DNA分子或RNA分子。
在一个实施例中，所述核酸分子包含以下至少一种核苷酸序列：a)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与至少60％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列具有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或者d)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的免疫原性片段。
在一个实施例中，编码肽的核苷酸序列与至少一种调控序列可操作地连接。在一个实施例中，所述调控序列是起始密码子、IgE前导序列或终止密码子中的至少一个。
在一个实施例中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含以下至少一个氨基酸序列：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
在一个实施例中，所述核酸分子包含以下至少一种核苷酸序列：a)核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与至少60％的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5中的至少一个的核苷酸序列具有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:1、SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或者d)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列的免疫原性片段，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
在一个实施例中，所述核酸分子包含表达载体。
在一个实施例中，所述核酸分子被掺入病毒颗粒。
在一个实施例中，本发明涉及一种包含肽的免疫原性组合物，其中，所述肽包含以下至少一种氨基酸序列：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明涉及一种肽，其中，所述肽包含以下至少一种氨基酸序列：a)氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，b)免疫原性片段，其包含与至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的至少一个的氨基酸序列有至少约90％同一性，c)SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或者d)免疫原性片段，其包含至少60％的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明涉及一种诱导有需要的受试者对MCV T抗原产生免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含编码修饰的梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原的核酸分子，其中，所述T抗原包含至少一种突变，所述突变破坏天然MCV T抗原的至少一种致癌特征。
在一个实施例中，施用的方法包括电穿孔或注射中的至少一种。
在一个实施例中，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者的MCV相关病理的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含编码修饰的梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原的核酸分子，其中，所述T抗原包含至少一种突变，所述突变破坏天然MCV T抗原的至少一种致癌特征。
在一个实施例中，施用的方法包括电穿孔或注射中的至少一种。
在一个实施例中，所述MCV相关病理是MCV感染或梅克尔细胞癌中的至少一种。
附图说明
图1包含图1A至图1B，提供了LTAg和STAg的示意图。图1A示出了LTAg和STAg的致癌特征。图1B示出了核酸疫苗的LTAg和STAg掺入几种突变以破坏致癌特征的设计。*D44N-阻断与伴侣蛋白的结合；*W209A-阻断与hVam6p的结合；*E216K-阻断与Rb的结合并防止转化；*L142A-阻断与PP2A的结合；*91-95LKDYM->AAAAA-阻断与Fbxw7的结合并防止转化。
图2包含图2A至图2B，提供了共有LTAg和STAg的示意图。图2A示出了从所有可用的NCBI LTAg序列设计的LTAg共有序列图。图2B示出了从所有可用的NCBI STAg序列设计的STAg的共有序列的图。合成这些抗原序列并将其克隆至哺乳动物表达质粒中，产生用于在体内表达合成共有抗原的质粒DNA构建体。
图3示出了表明共有MCC LTAg在体外表达的示例性实验数据。由于缺少靶向STAg的有效抗体，未检测到共有MCC STAg的表达。
图4包括图4A至图4B，提供了表明单独或联合接种LTAg和STAg疫苗后诱导免疫应答的示例性实验数据。图4A示出了实验设计。在第0天、第14天和第28天，小鼠接受质粒DNA，然后进行肌内电穿孔。一周后，收集脾细胞进行分析。四组小鼠接种：第1组-pVax-空载体对照；第2组-LTAg疫苗；第3组-STAg疫苗；第4组-在同一部位接种LTAg和STAg疫苗。图4B示出了显示在单独或联合接种LTAg和STAg后诱导免疫应答，而在接种空对照载体(pVax)后未诱导免疫应答的实验数据。对于这些实验，肽与相应的序列匹配而无失活突变。
图5包括图5A至图5B，提供了表征LTAg和STAg的免疫显性表位的示例性实验数据。图5A示出了LTAg接种的免疫显性表位。图5B示出了STAg接种的免疫显性表位。
图6示出了对人梅克尔细胞癌样品中MCC大T截短程度的分析结果。数据由GenBank中的42个大T序列编辑而成。
图7包括图7A至图7F，提供了表明在LTAg肽接种和刺激5小时后对细胞因子产生CD4+和CD8+T细胞应答的水平的示例性实验数据。图7A示出了对IFNγ产生CD8+T细胞应答的水平。图7B示出了对TNFα产生CD8+T细胞应答的水平。图7C示出了对IL-2产生CD8+T细胞应答的水平。图7D示出了对IFNγ产生CD4+T细胞应答的水平。图7E示出了对TNFα产生CD4+T细胞应答的水平。图7F示出了对IL-2产生CD4+T细胞应答的水平。
图8示出了表明LTAg接种诱导稳健的多功能CD8 T细胞的示例性实验数据。
图9示出了表明LTAg接种诱导稳健的多功能CD4 T细胞的示例性实验数据。
图10示出了表明LTAg接种诱导具有共同表达CD107a、IFNγ和T-bet的细胞毒性潜力的CD8 T细胞的示例性实验数据。
图11示出了表明使用小鼠血清作为一抗证明大T和小T抗原疫苗产生体液应答的示例性实验数据。
图12示出了表明LTAg疫苗诱导遗传多样性CD-1远交系小鼠产生稳健的免疫应答的示例性实验数据。
图13示出了表明STAg疫苗诱导遗传多样性CD-1远交系小鼠产生免疫应答的示例性实验数据。
图14包括图14A至图14F，提供了表明在CD-1远交系小鼠接种LTAg肽和刺激5小时后对细胞因子产生CD4+和CD8+T细胞应答的水平的示例性实验数据。图14A示出了对IFNγ产生CD8+T细胞应答的水平。图14B示出了对TNFα产生CD8+T细胞应答的水平。图14C示出了对IL-2产生CD8+T细胞应答的水平。图14D示出了对IFNγ产生CD4+T细胞应答的水平。图14E示出了对TNFα产生CD4+T细胞应答的水平。图14F示出了对IL-2产生CD4+T细胞应答的水平。
图15包括图15A至图15F，提供了表明在CD-1远交系小鼠接种STAg肽和刺激5小时后对细胞因子产生CD4+和CD8+T细胞应答的水平的示例性实验数据。图15A示出了对IFNγ产生CD8+T细胞应答的水平。图15B示出了对TNFα产生CD8+T细胞应答的水平。图15C示出了对IL-2产生CD8+T细胞应答的水平。图15D示出了对IFNγ产生CD4+T细胞应答的水平。图15E示出了对TNFα产生CD4+T细胞应答的水平。图15F示出了对IL-2产生CD4+T细胞应答的水平。
具体实施方式
梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)感染与梅克尔细胞癌(MCC)有关，目前其死亡率为46％。
在一个实施例中，本发明包括一种针对MCV和MCC的核酸疫苗。在一个实施例中，所述疫苗包含编码共有MCV T抗原的质粒。在一个实施例中，所述共有MCV T抗原是大T抗原(LTAg)。在一个实施例中，所述共有MCV T抗原是小t抗原(STAg)。在一个实施例中，所述共有MCV T抗原进一步包含破坏天然T抗原的致癌特征的突变。作为候选疫苗，基于增强DNA(DNA)的平台在遗传优化和递送技术方面具有许多优势。这样，可以对每种MCV T抗原进行遗传优化，将其亚克隆至修饰的哺乳动物表达载体中，然后使用体内电穿孔(EP)进行递送。
临床前啮齿动物研究中的疫苗接种非常有效，因为接种合成共有MCV T抗原构建体可产生稳健的免疫应答。
在一些实施例中，该策略采用合成共有MCV T抗原的编码序列。提供了LTAg和STAg的编码序列。在一些实施例中，该策略采用单一合成共有MCV T抗原的编码序列。在一些实施例中，该策略采用多种合成共有MCV T抗原的编码序列。
作为候选疫苗，DNA疫苗表现出多种优势，包括快速且低成本的大规模生产、室温下具有稳定性以及易于运输，所有这些从经济和地理角度使该平台进一步提升。由于质粒的合成性质，抗原序列可以经快速且容易地修饰以对新出现的菌株产生应答和/或扩展为包括其他疫苗组分。
质粒DNA载体及其编码的抗原基因的优化导致体内免疫原性增加。当高浓度的质粒疫苗制剂与体内电穿孔一起施用时，细胞摄取和随后的抗原表达将大大增强，该技术在疫苗接种部位内利用短方波电脉冲驱动质粒进入瞬时透化的细胞中。理论上，可以组装DNA质粒混合物以指导对任何数量的可变抗原产生高特异性免疫应答。可以通过与编码种属特异性细胞因子基因的质粒分子佐剂共递送以及抗原氨基酸序列的“共有工程化”来进一步指导免疫，以助于偏向于特定菌株产生疫苗诱导的免疫力。
定义.
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。以下描述了优选的方法和材料，尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以也用于本发明的实践或试验中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而并非用于限制。
本文所用的术语“包含(comprise(s))”、“包括(include(s))”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“包含(contain(s))”及其变体旨在是不排除其他表现方式或结构可能性的开放式过渡短语、术语或用语。除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数形式。本公开还预期了其他实施例“包括”、“由……组成”和“基本上由……组成”，本文所示的实施例或要素，无论是否明确提出。
如本文所用，“佐剂”可以指添加到核酸疫苗中以增强疫苗抗原性的任何分子。
“抗体”可以表示IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体，或片段，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，其对预期表位或由其衍生的序列具有足够的结合特异性。
本文可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”是指完整抗体的一部分，其包含抗原结合位点或可变区。该部分不包含完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、包含一个轻链可变结构域的单链多肽、包含轻链可变结合域的三个CDR的单链多肽、仅包含一个重链可变区的单链多肽和包含重链可变区的三个CDR的单链多肽。
“抗原”是指具有在宿主中产生免疫应答的能力的蛋白。抗原可以被抗体识别并结合。抗原可能起源于体内或外部环境。
如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”可以是指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导被施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可以任选地进一步包含编码N端甲硫氨酸或信号肽(诸如IgE或IgG信号肽)的起始密码子。
如本文所用，“互补”或“互补的”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
如本文所用，“共有”或“共有序列”可以意指基于对多个序列(例如，特定病毒抗原的多个序列)的比对分析而构建的合成核苷酸序列或相应的多肽序列。
如本文所用，“恒定电流”用于定义在递送至相同组织的电脉冲的持续时间内，组织或限定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲从本文所述的电穿孔装置传递。因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选具有瞬时反馈，所以该电流在电脉冲的整个过程中在所述组织中保持恒定安培数。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的电阻，并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，从而使同一组织中的电流在整个电脉冲中以及脉冲之间保持恒定(以微秒级)。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。
如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用，并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流并相应地改变由EP装置输送的能量输出，以保持电流恒定。该恒定水平由使用者在脉冲序列或电治疗开始之前预设。该反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔组件(例如，控制器)来实现，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并将所监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并持续进行能量输出调整，以将监控电流保持在预设水平。反馈环路可能是瞬时的，因其是模拟闭环反馈。
如本文所用，“分散电流”可以表示从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列输送的电流的模式，其中该模式最小化或优选地消除了在组织的任何区域上发生的与电穿孔相关的电穿孔发生。
本文可互换使用的“电化”、“电透化”或“电动增强”(“EP”)可以指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔)；它们的存在使生物分子(诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧穿过至另一侧。
如本文所用，“内源性抗体”可以指在被施用有效剂量的抗原以诱导体液免疫应答的受试者中产生的抗体。
如本文所用，“反馈机制”可以指由软件或硬件(或固件)执行的过程，该过程接收并比较预期组织(在能量脉冲输送之前、期间和/或之后)的阻抗与当前值(优选为电流)进行比较，并调整所输送的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可以由模拟闭环回路执行。
“片段”可以意指占全长多肽序列或核苷酸序列的百分比。片段可以包含亲本核苷酸序列或氨基酸序列或其变体的全长的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多的百分比。
如本文所用，“基因构建体”是指包含编码蛋白(诸如抗体)的核苷酸序列的DNA或RNA分子。遗传构建体还可以指转录RNA的DNA分子。编码序列包括与调控元件可操作地连接的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导被施用核酸分子的个体的细胞中表达的启动子和聚腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指含有必要调控元件的基因构建体，所述必要调控元件与编码蛋白的编码序列可操作地连接，使得当存在于个体细胞中时，所述编码序列将被表达。
如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所用的“同一的”或“同一性”可以意指该序列具有指定百分比的在指定区内相同的残基。可以通过最佳比对两个序列，在指定区上比较两个序列，确定两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区中位置的总数，然后将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。如果两个序列的长度不同，或者比对产生一个或多个交错的末端，并且指定的比较区仅包含单一序列，则单一序列的残基包含在分母中，但不包括计算的分子。比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以认为是等效的。同一性可以手动进行，也可以使用计算机序列算法(诸如BLAST或BLAST 2.0)进行。
在讨论反馈机制时，可以使用此处使用的“阻抗”，并且可以根据欧姆定律将其转换为电流值，从而可以与预设电流进行比较。
如本文所用，“免疫应答”可以意指对通过提供的疫苗引入一种或多种共有抗原产生应答而活化宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)。免疫应答可以是细胞应答或体液应答或者两者的形式。
如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描述也定义了互补链的序列。因此，核酸也涵盖所述单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与既定核酸相同的目的。因此，核酸也涵盖基本上具有同一性的核酸及其互补体。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或者可以包含双链和单链序列的一部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。
如本文所用，“可操作地连接”可以意指基因表达受与其在空间上连接的启动子的控制。启动子可以位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与该启动子与其在衍生该启动子的基因中控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知，可以适应该距离的变化而不缺失启动子功能。
如本文所用，“肽”、“蛋白”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的共有或者天然的和合成的修饰或组合。
如本文所用，“启动子”可以意指能够在细胞中赋予、活化或增强核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包含一种或多种特定的转录调控序列，以进一步增强表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位置。启动子可以来自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官，或相对于发生表达的发育阶段,或对外部刺激(诸如生理压力、病原体、金属离子或诱导剂)产生应答而组成性或差异性地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用，并且是指可以在本文所述的蛋白的氨基末端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从其产生的细胞中分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌后从蛋白的其余部分(通常称为成熟蛋白)切割。信号肽/前导序列在蛋白的N末端连接。
如本文所用，“严格杂交条件”可以意指第一核酸分子(例如，探针)将与第二核酸分子(例如，靶标)杂交的条件，诸如在核酸的复杂混合物中。严格条件具有序列依赖性，并且在不同情况下会有所不同。严格条件可以选择为比特定序列在定义的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是在该温度下，与靶标互补的50％的探针与靶标序列平衡杂交(由于靶序列过量存在，在Tm时，50％的探针处于平衡状态)的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是其中盐浓度小于约1.0M钠离子的条件，诸如在pH 7.0至8.3下，对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)在至少约30℃下，和对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)在至少60℃下，为约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)。通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)也可以达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5x SSC，1％SDS，在65℃下孵育，并在0.2x SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。
如本文所用，“受试者”和“患者”可互换地是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠和小鼠、非人类灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施例中，受试者可以是人或非人。
如本文所用，“基本上互补”可以意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或这两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用，“基本上同一”可以意指第一序列与第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸或氨基酸的区具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病来保护受试者免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向受试者施用本发明的疫苗。抑制疾病包括在诱导疾病之后但在其临床出现之前向受试者施用本发明的疫苗。压制疾病包括在疾病的临床出现后向受试者施用本发明的疫苗。
如本文所用，关于核酸的“变体”可以意指(i)参比核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参比核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参比核酸或其互补序列基本相同的核酸；(iv)在严格条件下与参比核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。
“变体”涉及通过氨基酸的插入、缺失或保守置换而使氨基酸序列有差异肽或多肽，但保留至少一种生物学活性。变体还可以意指具有与保留至少一种生物学活性的氨基酸序列的参比蛋白基本相同的氨基酸序列的蛋白。氨基酸的保守置换，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸取代氨基酸，在本领域通常被认为涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴别。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考量。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被置换并仍保留蛋白功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被置换。氨基酸的亲水性和可用于显示将导致蛋白保留生物学功能的置换。考虑肽背景中氨基酸的亲水性，可以计算出该肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的方法，据报道与抗原性和免疫原性密切相关。美国专利号4,554,101，其通过引用完全并入本文。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的置换可以导致肽保留生物学活性，例如，免疫原性。可以用亲水性值彼此在±2之内的氨基酸进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸置换应理解为取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性所示。
变体可以是与完整基因序列或其片段的全长基本上具有同一性的核苷酸序列。核苷酸序列可以与基因序列或其片段的全长具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。变体可以是与氨基酸序列或其片段的全长基本上具有同一性的氨基酸序列。氨基酸序列可以与氨基酸序列或其片段的全长具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
如本文所用，“载体”可以意指含有复制起点的核酸分子。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因组的载体。
为了在此列举数值范围，明确考虑了它们之间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外，数字7和8也可考虑；对于6.0-7.0的范围，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0可明确考虑。
描述
本发明提供了编码MCV T抗原的优化的共有序列。在一个实施例中，由优化的共有序列编码的MCV T抗原能够引发哺乳动物产生免疫应答。在一个实施例中，由优化的共有序列编码的MCV T抗原可以包含一个或多个表位，使其特别有效地作为可诱导对其产生免疫应答的免疫原。
优化的共有序列可以是源自两个或更多个MCV T抗原的共有序列。优化的共有序列可以包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。修饰可以包括密码子优化、RNA优化、添加kozak序列以增强翻译起始、和/或添加免疫球蛋白前导序列以提高免疫原性。由优化的共有序列编码的MCV T抗原可以包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施例中，由优化的共有序列编码的抗原可以包含血凝素(HA)标签。可以设计由优化的共有序列编码的抗原，以引起比相应的非优化的抗原更强的细胞和/或体液免疫应答。
本文提供了MCV T抗原，其可用于诱导患有MCV感染的遗传多样的受试者对MCV产生免疫。在一个实施例中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含一种或多种能够在哺乳动物中产生对MCV T抗原的免疫应答的核酸分子。本发明还提供了能够在哺乳动物中产生对MCV T抗原的免疫应答的分离的核酸分子。在一个实施例中，所述核酸分子包含编码共有MCV T抗原的优化的核苷酸序列。
在一个实施例中，MCV T抗原经修饰以减少或破坏天然MCV T抗原的至少一种致癌特征。在多个实施例中，MCV T抗原经修饰以减少或破坏CR1结合、DnaJ结合、结合磷酸酶pp2A的结合、Rb结合、ATP酶活性、解旋酶活性、伴侣蛋白结合、hVam6p结合、Fbxw7结合、起点结合和转化中的至少一种。在一个实施例中，MCV T抗原相对于天然T抗原序列在D44、W209、E216、L142、L91、K92、D93、Y94或M95处包含至少一种突变。在一个实施例中，MCV T抗原包含D44N突变、W209A、E216K突变、L142A突变、L91A突变、K92A突变、D93A突变、Y94A突变和M95A突变中的至少一种。在一个实施例中，MCV LTAg包含D44N突变、W209A和E216K突变中的至少一种。在一个实施例中，MCV LTAg包含D44N突变、W209A和E216K突变。在一个实施例中，MCVSTAg包含D44N突变、L142A突变、L91A突变、K92A突变、D93A突变、Y94A突变和M95A突变中的至少一种。在一个实施例中，MCV STAg包含D44N突变、L142A突变、L91A突变、K92A突变、D93A突变、Y94A突变和M95A突变。
MCV T抗原的共有氨基酸序列包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及其变体以及SEQID NO:2、SEQ ID NO:4的片段及其变体。修饰的合成共有MCV LTAg的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:2所提供。修饰的合成共有MCV STAg的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:2所提供。
在一个实施例中，本发明提供了包含核酸分子的组合物，所述核酸分子包含编码修饰的合成共有MCV T抗原的核苷酸序列。在一个实施例中，编码修饰的合成共有MCV LTAg的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所提供，其编码SEQ ID NO:2。在一个实施例中，编码修饰的合成共有MCV STAg的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所提供，其编码SEQ ID NO:4。
在多个实施例中，本发明提供了包含修饰的LTAg和修饰的STAg或一种或多种编码它们的核酸分子的组合的组合物。所述组合物可以包含单一核酸分子的多个拷贝，诸如单一质粒，或两个或更多不同核酸分子的两个拷贝，诸如两个或更多不同质粒。
组合物可以包含单一核酸分子，诸如质粒，其包含多个共有MCV T抗原的编码序列。在一个实施例中，组合物可以包含单一核酸分子，其包含编码MCV LTAg和MCV STAg的核苷酸序列。在一个实施例中，每个共有MCV T抗原的每个编码序列在单独的质粒上。
因此，包含一个或多个编码多个共有MCV T抗原的核苷酸序列的组合物可以在单一质粒上。在一个实施例中，组合物包含在单一启动子下编码MCV LTAg和MCV STAg的单一质粒。在这样的实施例中，编码MCV LTAg的序列和编码MCV STAg的序列可以通过融合肽序列(例如，furin切割序列)连接。包含通过furin切割位点连接的修饰的合成共有MCV LTAg和MCV STAg的单一构建体的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO:6所提供。在一个实施例中，编码通过furin切割序列连接的修饰的合成共有MCV LTAg和MCV STAg的单核苷酸序列如SEQID NO:5所提供，其编码SEQ ID NO:6。
在一个实施例中，将优化的共有序列编码的MCV T抗原与一个或多个调控元件可操作地连接。在一个实施例中，调控元件是前导序列。在一个实施例中，前导序列是IgE前导序列。在一个实施例中，IgE前导序列具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。因此，在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。在一个实施例中，本发明涉及编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
在一个实施例中，调控元件是起始密码子。因此，在一个实施例中，本发明涉及SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其片段或同系物，其与5'端包含起始密码子的核苷酸序列可操作地连接。在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2、SEQID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其片段或同系物，其与由N端的起始密码子(例如，蛋氨酸)编码的氨基酸可操作地连接。
在一个实施例中，调控元件是至少一个终止密码子。因此，在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其片段或同系物，其与3'端包含至少一个终止密码子的核苷酸序列可操作地连接。在一个实施例中，核苷酸序列与两个终止密码子可操作地连接以增加翻译终止的效率。
在一个实施例中，核酸分子可以编码具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6所示氨基酸序列的肽。在一个实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。在一些实施例中，所述序列可以是与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的全长具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在其他实施例中，序列可以是编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的全长具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，所述核酸分子包含RNA序列，所述RNA序列是DNA序列的转录本，所述DNA序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的全长具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施例中，所述核酸分子包含编码氨基酸序列的RNA序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的全长具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，所述核酸分子可以包含编码全长共有MCV T抗原的核苷酸序列。所述核酸分子可以包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的序列。所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。所述核酸分子可任选地包含编码信号肽(诸如，例如，IgE或IgG信号肽)的编码序列。
共有MCV T抗原可以是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的肽。在一些实施例中，所述抗原可以具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的全长具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
可以提供SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的免疫原性片段。免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施例中，免疫原性片段包括前导序列，诸如，例如，免疫球蛋白前导，诸如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。
可以提供具有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白的免疫原性片段。此类免疫原性片段可以包含与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6具有95％同源性的蛋白的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施例涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施例涉及与本文共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施例中，免疫原性片段包括前导序列，诸如，例如，免疫球蛋白前导，诸如IgE前导。在一些实施例中，免疫原性片段不含前导序列。
在一个实施例中，核酸分子的免疫原性片段编码全长优化的共有MCV T抗原的至少一个免疫显性或亚免疫缺陷表位。
一些实施例涉及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的免疫原性片段，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可以与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的片段具有至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。在一些实施例中，免疫原性片段包括编码前导序列的序列，诸如，例如，免疫球蛋白前导，诸如IgE前导。在一些实施例中，片段不含编码前导序列的编码序列。
在一个实施例中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有至少90％同源性的序列。
在一个实施例中，所述核酸分子包含编码本文所述的共有MCV T抗原序列的RNA序列。例如，核酸可以包含编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的一个或多个，其变体，其片段或其任何组合的RNA序列。
在一些实施例中，所述核酸分子包括编码MCV T抗原的序列，减去编码序列N端上的IgE前导序列。在一些实施例中，DNA核酸分子进一步包含附着在编码序列的N末端并与启动子可操作地连接的IgE前导序列。
核酸分子可以进一步包括附着在编码序列的C末端的聚腺苷酸化序列。在一个实施例中，核酸分子经密码子优化。
疫苗和免疫原性组合物
提供了免疫原性组合物(诸如疫苗)，包含优化的共有序列、优化的共有编码的抗原、其片段、其变体或其组合。所述免疫原性组合物可以显著诱导施用该免疫原性组合物的受试者对MCV T抗原产生免疫应答。疫苗可包含多个核酸分子或其组合。可以提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫应答。
免疫原性组合物可以是DNA疫苗、RNA疫苗、肽疫苗或组合疫苗。疫苗可以包含编码抗原的优化的共有核苷酸序列。核苷酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核苷酸序列还可以包括编码通过肽键与抗原连接的接头、前导序列或标签序列的其他序列。肽疫苗可以包括抗原、其变体、其片段或其组合。DNA和肽疫苗的组合可以包括上述优化的共有核苷酸序列和编码的抗原。
疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗在美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594中公开，通过引用以其全文并入本文。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。
疫苗可以是一种或多种MCV T抗原的RNA。RNA疫苗可以被引入细胞中。
所述疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529，其各自通过引用并入本文。
本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，诸如安全，从而疫苗本身不会引起疾病或死亡；预防疾病；诱导保护性T细胞应答；并提供易于施用、几乎没有副作用、生物学稳定性和每剂量低成本的特点。
本文提供了能够在哺乳动物中产生对MCV的免疫应答的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可以包含如上所述的每种质粒。所述免疫原性组合物可以包含多种质粒，或其组合。可以提供免疫原性组合物以诱导治疗性或预防性免疫应答。
免疫原性组合物可以用于递送编码一种或多种共有MCV T抗原的核酸分子。免疫原性组合物优选是包含质粒的组合物。
免疫原性组合物可以进一步包含药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料可以是功能性分子，如溶媒、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的辅料可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，更优选地，聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于免疫原性组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡(诸如鲨烯和角鲨烯)、透明质酸，还可以与基因构建体联合施用。在一些实施例中，免疫原性组合物还可以包含转染促进剂，诸如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，如DNA脂质体混合物(参见，例如，W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。免疫原性组合物中转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml，小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的辅料可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是从相同或可选的质粒表达的其他基因，或者是与免疫原性组合物中的上述质粒组合作为蛋白递送的其他基因。一种或多种佐剂可以是蛋白和/或编码选自由以下组成的组的蛋白的核酸分子：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15(包括具有信号序列或编码缺失的信号序列的编码序列的IL-15，和任选地包括差异信号肽(诸如来自IgE)或编码差异信号肽(诸如来自IgE)的编码序列的IL-15)、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-lα、MIP-1β、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段，或其组合。
在一些实施例中，佐剂可以是一种或多种蛋白和/或编码选自由以下组成的组的蛋白的核酸分子：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例在PCT申请号PCT/US1997/019502和相应的美国申请序列号08/956,865，以及于2011年12月12日提交的美国临时申请序列号61/569600中公开，其各自通过引用并入本文。IL-15构建体和序列的实例在PCT申请号号PCT/US04/18962和相应的美国申请序列号10/560,650，以及PCT申请号PCT/US07/00886和相应的美国申请序列号12/160,766，以及PCT申请号PCT/US10/048827中公开，其各自通过引用并入本文。IL-28构建体和序列的实例在PCT申请号PCT/US09/039648和相应的美国申请序列号12/936,192中公开，其各自通过引用并入本文。RANTES以及其他构建体和序列的实例在PCT申请号PCT/US1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452中公开，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例在PCT申请号PCT/US11/024098中公开，其通过引用并入本文。RANTES以及其他构建体和序列的实例在PCT申请号PCT/US1999/004332和相应的美国申请序列号09/622452中公开，其各自通过引用并入本文。RANTES构建体和序列的其他实例在PCT申请号PCT/US11/024098中公开，其通过引用并入本文。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体以及序列的实例在PCT申请号PCT/US2005/042231和相应的美国申请序列号11/719,646中公开，其各自通过引用并入本文。OX40和其他免疫调节剂的实例在美国申请序列号10/560,653中公开，其通过引用并入本文。DR5和其他免疫调节剂的实例在美国申请序列号09/622452中公开，其通过引用并入本文。
免疫原性组合物可以进一步包含基因疫苗促进剂，如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述，通过引用以其全文并入本文。
所述免疫原性组合物可以包含约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克的量的共有抗原和质粒。在一些优选的实施例中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施例中，所述药物组合物包含约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施例中，所述药物组合物包含约0.1至约500微克的DNA。在一些优选的实施例中，所述药物组合物包含约1至约350微克的DNA。在一些优选的实施例中，所述药物组合物包含约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；约0.1微克至约10毫克；约1毫克至约2毫克，约5纳克至约1000微克，约10纳克至约800微克，约0.1至约500微克，约1至约350微克，约25至约250微克，约100至约200微克的共有抗原或其质粒。
在一些实施例中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的本发明的核酸分子。在一些实施例中，所述药物组合物可以包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的本发明的核酸分子。在一些实施例中，药物组合物可以包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的本发明的核酸分子。
在其他实施例中，药物组合物可以包含最多(含)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的本发明的核酸分子。在一些实施例中，所述药物组合物可以包含最多(含)1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的本发明的核酸分子。在一些实施例中，药物组合物可以包含最多(含)1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的本发明的核酸分子。
免疫原性组合物可以根据使用的施用方式进行配制。可注射的免疫原性组合物药物组合物可以是无菌的、不含热原的和不含颗粒的。可以使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。免疫原性组合物可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲液。免疫原性组合物可以进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定化可以使制剂在室温或环境温度下稳定延长的时间，诸如用于免疫原性组合物制剂的LGS或聚阳离子或聚阴离子。
所述免疫原性组合物在室温(25℃)下可以稳定超过1周，在一些实施例中超过2周，在一些实施例中超过3周，在一些实施例中超过4周，在一些实施例中超过5周，以及在一些实施例中超过6周。在一些实施例中，疫苗稳定超过一个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过7个月、超过8个月、超过9个月、超过10个月、超过11个月或超过12个月。在一些实施例中，疫苗稳定超过1年、超过2年、超过数年或超过5年。在一个实施例中，免疫原性组合物在冷藏(2-8℃)下稳定。因此，在一个实施例中，免疫原性组合物不需要冷冻的冷链。如果免疫原性组合物保持其生物学活性足够长的时间以允许其预期用途(例如，在受试者中产生免疫应答)，则该免疫原性组合物是稳定的。例如，对于将要储存、运输等的免疫原性组合物，可能希望免疫原性组合物保持稳定数月至数年。
免疫应答
免疫原性组合物可以诱导施用所述组合物的受试者产生免疫应答。诱导的免疫应答可以对MCV T抗原具有特异性。诱导的免疫应答可以与优化的共有编码抗原相关的MCV T抗原反应。在多个实施例中，相关抗原包括具有氨基酸序列的抗原，所述氨基酸序列与优化的共有编码抗原的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同源性。在多个实施例中，相关抗原包括由核苷酸序列编码的抗原，所述核苷酸序列与本文公开的优化的共有核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同源性。
免疫原性组合物可以诱导施用所述免疫原性组合物的受试者产生体液免疫应答。诱导的体液免疫应答可以对MCV T抗原具有特异性。诱导的体液免疫应答可以与优化的共有编码抗原有关的MCV T抗原反应。可以诱导施用免疫原性组合物的受试者产生约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍的体液免疫应答。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，可以诱导施用免疫原性组合物的受试者产生至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍的体液免疫应答。
与未施用免疫原性组合物的受试者相比，由免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可以包括与施用免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体水平的增加。这些IgG抗体可以对与优化的共有抗原遗传相关的MCV T抗原具有特异性。这些IgG抗体可以与优化的共有抗原遗传相关的MCV T抗原发生反应。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体的水平可以增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的IgG抗体的水平可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。
免疫原性组合物可以诱导施用所述免疫原性组合物的受试者产生细胞免疫应答。诱导的细胞免疫应答可以对与优化的共有编码抗原有关的MCV T抗原具有特异性。诱导的细胞免疫应答可以对与优化的共有编码抗原相关的MCV T抗原反应。诱导的细胞免疫应答可以包括引发CD8+T细胞应答。引发的CD8+T细胞应答可以与优化的共有抗原遗传相关的MCVT抗原发生反应。引发的CD8+T细胞应答可以是多功能的。诱导的细胞免疫应答可以包括引发CD8+T细胞应答，其中CD8+细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)或IFN-γ和TNF-α的组合。
与未施用免疫原性组合物的受试者相比，诱导的细胞免疫应答可以包括与施用免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞应答增加。与未施用免疫原性组合物的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞应答可以增加约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD8+T细胞应答可以增加至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。
诱导的细胞免疫应答可以包括对MCV T抗原具有反应性的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。
诱导的细胞免疫应答可以包括对MCV T抗原有反应性的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD107a/IFNγ双阳性CD8 T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。
免疫原性组合物诱导的细胞免疫应答可以包括引发CD4+T细胞应答。引发的CD4+细胞应答可以与优化的共有抗原遗传相关的MCV T抗原发生反应。引发的CD4+T细胞反应可以是多功能的。诱导的细胞免疫应答可以包括引发CD4+T细胞应答，其中CD4+T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ和TNF-α的组合。
诱导的细胞免疫应答可以包括产生IFN-γ的CD4+T细胞频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD4+IFN-γ+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。
诱导的细胞免疫应答可以包括产生TNF-α的CD4+T细胞频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD4+TNF-α+T细胞的频率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。
诱导的细胞免疫应答可以包括产生IFN-γ和TNF-α的CD4+T细胞频率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的MCV T抗原的受试者相比，施用免疫原性组合物的受试者相关的CD4+IFN-γ+TNF-α+频率可以增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。
当施用于不同组织(诸如肌肉或皮肤)时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。当通过电穿孔或注射，或皮下或肌肉内施用时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。
载体
可以将上述核苷酸构建体置于一种或多种载体中。一种或多种载体可以包含复制起点。一种或多种载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。一种或多种载体可以是自我复制的额外染色体载体，也可以是整合入宿主基因组的载体。
载体包括但不限于质粒、表达载体、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等。“载体”包含可以感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。将认识到，载体可以是裸核酸，或与蛋白或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白，和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括但不限于DNA片段可以连接并复制的复制子(例如RNA复制子、噬菌体)。因此，载体包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA(例如，质粒、病毒等，参见，例如，美国专利号5,217,879)，并且包括表达和非表达质粒。当重组微生物或细胞培养物被描述为是宿主“表达载体”时，它既包括染色体外的环状和线性DNA，也包括掺入宿主染色体的DNA。在宿主细胞维持载体的情况下，所述载体可以在有丝分裂期间作为自主结构被细胞稳定复制，或掺入宿主的基因组中。
一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因导入靶细胞的质粒。一旦表达载体进入细胞内部，基因编码的蛋白就由细胞转录和翻译机制的核糖体复合物产生。通常将质粒工程化以包含充当增强子和启动子区并导致表达载体上携带的基因的有效转录的调控序列。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，并因此表达蛋白。
载体可以具有表达信号(诸如强启动子、强终止密码子)，调节启动子与克隆的基因之间的距离以及转录终止序列和PTIS(简便翻译起始序列)的插入。
表达载体
一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的受试者细胞中表达。包含重组核酸构建体的一种或多种载体可以是嵌合的，表示其至少一种组分相对于其至少一种其他组分是异源的。
质粒
一种或多种载体可以是质粒。质粒可以用于用重组核酸构建体转染细胞。质粒可以用于将重组核酸构建体引入受试者。质粒还可以包含调控序列，其可以非常适合在施用质粒的细胞中表达基因。
质粒还可以包含哺乳动物的复制起点，以在染色体外维持质粒并在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是Invitrogen(San Diego，CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，其可以包含Epstein Barr病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可以产生高拷贝的游离型复制而不整合。质粒的主链可以是pAV0242。质粒可以是复制缺陷型5型腺病毒(Ad5)质粒。
质粒可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。质粒可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可以用于在酿酒酵母酵母菌株中产生蛋白。质粒还可以是MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白。质粒还可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞中产生蛋白。
RNA
在一个实施例中，所述核酸是RNA分子。在一个实施例中，所述RNA分子从本文所述的DNA序列转录。例如，在一些实施例中，RNA分子由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5中的一个或其变体或其片段具有至少90％同源性的DNA序列编码。在另一个实施例中，所述核苷酸序列包含由DNA序列转录的RNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6中的一个或其变体或其片段具有至少90％同源性的多肽序列。因此，在一个实施例中，本发明提供了编码一种或多种MCV T抗原的RNA分子。所述RNA可以是正链的。因此，在一些实施例中，RNA分子可以被细胞翻译，而不需要任何中间的复制步骤，诸如反转录。可用于本发明的RNA分子可以具有5'帽(例如，7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。可用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，它可以通过5'至5'桥与7-甲基鸟苷连接。RNA分子可以具有3'poly-A尾巴。它还可以在其3'末端附近包含poly-A聚合酶识别序列(例如，AAUAAA)。可用于本发明的RNA分子可以是单链的。可用于本发明的RNA分子可以包含合成RNA。在一些实施例中，所述RNA分子是裸RNA分子。在一个实施例中，所述RNA分子包含在载体内。
在一个实施例中，所述RNA具有5'和3'UTR。在一个实施例中，5'UTR的长度在0至3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法来改变待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度，包括但不限于，设计用于退火至UTR的不同区的PCR的引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以在转录的RNA转染后修饰达到最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是目的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可选地，可以通过将UTR序列掺入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰以添加非目的基因内源的UTR序列。使用非目的基因内源的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件会降低RNA的稳定性。因此，基于本领域公知的UTR的特性，可以选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施例中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。可选地，当如上所述通过PCR添加对于目的基因不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列以重新设计共有的Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA转录本的翻译效率，但似乎并非所有RNA都能有效翻译。许多RNA对Kozak序列的需求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中稳定。在其他实施例中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR以阻止RNA的核酸外切酶降解。
在一个实施例中，RNA在5'末端和3'聚(A)尾部均具有帽，其确定核糖体结合、翻译的起始和RNA在细胞中的稳定性。
在一个实施例中，所述RNA是核苷修饰的RNA。核苷修饰的RNA与未修饰的RNA相比具有特别的优势，例如，稳定性更高、固有免疫原性低或不存在以及翻译增强。
环状和线性载体
一种或多种载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中以转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。
本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送至受试者并表达由重组核酸构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。LEC可以是没有任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可以不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸盐骨架。LEC可以不包含与预期基因表达无关的其他核苷酸序列。
LEC可以源自能够被线性化的任何质粒。质粒可能能够表达由重组核酸构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达由重组核酸构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其他表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
病毒载体
在一个实施例中，本文提供了能够将本发明的核酸递送至细胞的病毒载体。表达载体可以以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术是本领域公知的，并且，例如，如Sambrook等人(2001)，以及在Ausubel等人(1997)，以及其他病毒学和分子生物学手册所述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便限制性核酸内切酶位点以及一种或多种选择性标志物。(参见，例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒，痘病毒，单纯疱疹病毒I，腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
载体的制备方法
本文提供了一种制备其中已置入重组核酸构建体的一种或多种载体的方法。在最后的亚克隆步骤之后，可以使用本领域已知的方法将载体用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
在其他实施例中，在最后的亚克隆步骤之后，可以将载体与一个或多个电穿孔(EP)装置一起使用。以下更详细地描述了EP装置。
可以使用已知装置和技术的组合来配制或生产一种或多种载体，但是优选地，使用于2007年5月23日提交的许可的、共同未决的美国临时申请美国序列号60/939,792中描述的质粒生产技术进行生产。在一些实例中，本文所述的DNA质粒可以以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除了在美国序列号60/939792(包括在2007年7月3日公开的许可专利，美国专利号7,238,522中描述的那些)描述的那些以外，生产技术还包括或合并了本领域普通技术人员通常已知的各种装置和方案。以上引用的申请和专利，分别是美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522，以其全文并入本文。
多种载体
免疫原性组合物可以包含单一核酸分子的多个拷贝，诸如单一质粒，或两个或更多不同核酸分子的两个拷贝，诸如两个或更多不同质粒。例如，免疫原性组合物可以包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种不同的核酸分子。此类组合物可以包含多个两种、三种、四种、五种、六种或更多种不同的质粒。
免疫原性组合物可以包含核酸分子，诸如质粒，其共同包含MCV T抗原的编码序列。免疫原性组合物可以包含核酸分子，诸如质粒，其共同包含多种抗原的编码序列。在一个实施例中，抗原是MCV T抗原和一种或多种其他癌症抗原。免疫原性组合物可以包含核酸分子，诸如质粒，其共同包含一种或多种MCV T抗原以及一种或多种癌症抗原的编码序列。
癌症抗原
所述免疫原性组合物可以包含一种或多种癌症抗原，诸如WT1、MUC1、LMP2、HPV E6E7、EGFRvIII、HER-2/neu、个体基因型、MAGE A3、p53(非突变型)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体，蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(鱼精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原1用于治疗或预防肿瘤相关的病理。所述免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种癌症抗原WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、个体基因型、MAGE A3、p53(非突变型)、NY-ESO-1、PSMA、GD2,CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(鱼精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原以及优化的共有编码MCV T抗原用于治疗或预防肿瘤相关的病理。癌症抗原的其他组合也可以用于治疗或预防肿瘤相关的病理。
方法
本文提供了通过向受试者施用本文所述的一种或多种免疫原性组合物以治疗、防止和/或预防有需要的受试者的MCV相关疾病的方法。向受试者施用免疫原性组合物可以在受试者中诱导或引发免疫应答。诱导的免疫应答可以用于治疗、防止和/或预防疾病，例如，MCV感染或与MCV感染相关的MCC。
本文提供了用于递送免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物用于提供共有抗原的基因构建体和蛋白，其包含使它们特别有效地对MCV或MCC诱导免疫应答的表位。可以提供递送免疫原性组合物或接种疫苗的方法以诱导治疗性和预防性免疫应答。疫苗接种过程可能会在哺乳动物中产生对MCV或MCC的免疫应答。免疫原性组合物可以递送至个体，以调节哺乳动物免疫系统的活性并增强免疫应答。免疫原性组合物的递送可以是共有抗原作为核酸分子的转染，所述核酸分子在细胞中表达并递送至细胞表面，免疫系统在该表面上识别并诱导细胞、体液或细胞和体液应答。通过向哺乳动物施用如上所述的免疫原性组合物，可以将免疫原性组合物的递送用于在哺乳动物中诱导或引发对MCV或MCC的免疫应答。
在将免疫原性组合物和质粒递送至哺乳动物细胞中后，转染的细胞将表达和分泌针对从免疫原性组合物注射的每个质粒的共有抗原。这些蛋白将被免疫系统识别为外来物，并将针对它们产生抗体。这些抗体将由免疫系统维持，并能对随后的MCV感染产生有效应答。
可以向哺乳动物施用免疫原性组合物以引发哺乳动物的免疫应答。哺乳动物可以是人、灵长类、非人灵长类、奶牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。
诱导的免疫应答可以包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。可以诱导产生约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍的体液免疫应答。诱导的细胞免疫应答可以包括CD8+T细胞应答，其被诱导约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。
免疫原性组合物剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，并可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。免疫原性组合物可以以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。有效治疗的免疫原性组合物给药次数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
可以根据药学领域技术人员公知的标准技术配制免疫原性组合物。考虑到诸如年龄、性别、体重和特定受试者的病状以及施用途径之类的因素，可以以医学领域技术人员公知的剂量和技术施用此类组合物。
免疫原性组合物可以预防性或治疗性施用。在预防性施用中，免疫原性组合物可以以足以诱导免疫应答的量施用。在治疗性应用中，将免疫原性组合物以足以引起治疗效果的量施用于有需要的受试者。足以完成此过程的量定义为“治疗有效剂量”。对于该用途有效的量将取决于，例如，所施用的免疫原性组合物方案的特定组合物、施用方式、疾病的阶段和严重程度、受试者的总体健康状况以及开处方的医师的判断。
免疫原性组合物可以通过本领域公知的方法施用，如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(1996年12月3日公开的美国专利号5,580,859)；Felgner(1997年12月30日公开的美国专利5,703,055)；和Carson等人(1997年10月21日公开的美国专利号5,679,647)，其全部内容通过引用以其全文并入本文。可以将免疫原性组合物的DNA复合至颗粒或珠上，所述颗粒或珠可以例如使用疫苗枪施用于个体。本领域技术人员将知晓，包括生理上可接受的化合物在内的药学上可接受的载体的选择取决于例如表达载体的施用途径。
免疫原性组合物可以通过多种途径递送。典型的递送途径包括肠胃外给药，例如，皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服、鼻内和阴道内途径。特别是对于免疫原性组合物的DNA，可以将免疫原性组合物递送至个体组织的间隙中(Felgner等人，美国专利号5,580,859和5,703,055，其全部内容通过引用以其全文并入本文)。免疫原性组合物也可施用于肌肉，或可以通过皮内或皮下注射或经皮(诸如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用表皮施用免疫原性组合物。表皮施用可以涉及机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利号为5,679,647，其内容通过引用以其全文并入本文。
还可以将免疫原性组合物配制成经鼻道施用。其中载体是固体的适合于鼻腔施用的制剂可以包括具有例如鼻烟的方式施用的粒度，例如，在约10至约500微米的范围内，其以鼻烟的方式施用，即通过从保持靠近鼻子的粉末容器通过鼻道快速吸入。制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器气雾剂施用。制剂可以包括免疫原性组合物的水性或油性溶液。
免疫原性组合物可以是液体制剂，诸如混悬剂、糖浆剂或酏剂。免疫原性组合物也可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如，注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。
可以将免疫原性组合物掺入脂质体、微球或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,Vols.Ito III(2nd ed.1993)，其内容通过引用以其全文并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体，其相对容易制备和施用。
疫苗治疗癌症的方法
疫苗可用于在哺乳动物中产生或引发对哺乳动物或有需要的受试者的癌症或肿瘤(例如，MCC)具有反应性或针对性的免疫应答。引发的免疫应答可以预防癌症或肿瘤的生长。
引发的免疫应答可以预防和/或减少癌细胞或肿瘤细胞的转移。因此，疫苗可以用于治疗和/或预防施用疫苗的哺乳动物或受试者中的癌症或肿瘤的方法。
在一些实施例中，施用的疫苗可以通过诱导(1)由B细胞应答的体液免疫以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，从而延缓髓样来源的抑制细胞(MDSC)并抑制肿瘤的生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞，诸如CD8+(CTL)，以攻击和杀伤肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；(4)并通过IFN-γ和TFN-α或优选地所有前述增加炎症性应答。
在一些实施例中，免疫应答可以产生体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，其不会导致接种疫苗的受试者的各种组织或系统(例如，大脑或神经系统等)受损或发炎。
在一些实施例中，施用的疫苗可以在受试者中增加无肿瘤的生存率、减少肿瘤质量、增加肿瘤生存率或其组合。施用的疫苗可以使受试者的无肿瘤生存率提高20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％或更多。施用的疫苗可以使免疫后受试者的肿瘤质量减少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％或更多。施用的疫苗可以预防和阻止受试者中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的增加，MCP-1是由髓样来源的抑制细胞分泌的细胞因子。在一些实施例中，施用的疫苗可以预防和阻止受试者的癌组织或肿瘤组织中MCP-1的增加，从而减少受试者的癌组织或肿瘤组织的血管形成。
施用的疫苗可以使受试者的肿瘤肿瘤生存率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％或更多。在一些实施例中，可以将疫苗施用至外周(如下文更详细描述)以建立靶向癌细胞或肿瘤细胞或组织的抗原特异性免疫应答，以清除或消除表达一种或多种MCV T抗原的癌症或肿瘤而不会损害接种疫苗的受试者或引起其疾病或死亡。
施用的疫苗可以使受试者的细胞免疫应答增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，施用的疫苗可以使受试者的细胞免疫应答增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
施用的疫苗可以使受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平增加约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施例中，施用的疫苗可以使受试者中的IFN-γ水平增加约约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，并可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。疫苗可以以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。有效治疗的疫苗给药次数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
检查点抑制剂联合疗法
本发明还涉及使用如上所述的疫苗与一种或多种检查点抑制剂组合来提高哺乳动物的免疫应答的方法。在一个实施例中，如上所述的疫苗可以包含MCV T抗原和针对检查点蛋白的抗体。如本文所用，“检查点抑制剂”包括阻断免疫检查点的抑制剂或分子，如在癌症免疫疗法领域中通常所理解的。更通常地，检查点抑制剂是阻断免疫检查点蛋白的抗体。免疫检查点蛋白包括但不限于PD1、PDL1、PDL2、CTLA-4、LAG3、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1、CD80、CD86、OX40、CD27、GITR、DNAM-1、TIGIT、TMIGD2和DC-SIGN。已知检查点抑制剂的一些实例包括但不限于伊匹木单抗、帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、pidilizumab、阿维鲁单抗等。
组合可以是单一制剂，也可以是单独的并进行顺序施用(先是MCV T抗原，然后是检查点抑制剂，或者是先是检查点抑制剂，然后是MCV T抗原)。在一些实施例中，可以在向受试者施用检查点抑制剂前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周向受试者施用MCV T抗原。在其他实施例中，可以在向受试者使用MCV T抗原前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周向受试者施用检查点抑制剂。
MCV T抗原和检查点抑制剂的组合比单独包含MCV T抗原的疫苗更有效地诱导免疫系统。这种更有效的免疫应答在治疗和/或预防特定癌症中提供了增加的疗效。
在一些实施例中，免疫应答可以增加约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍、或约0.5倍至约8倍。可选地，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。
在其他可选的实施例中，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。在其他实施例中，施用疫苗的受试者的免疫应答可以增加至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，并可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。疫苗可以以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。有效治疗的疫苗给药次数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
梅克尔细胞癌
疫苗可用于在哺乳动物中产生或引发对哺乳动物或有需要的受试者的梅克尔细胞癌(MCC)具有反应性或针对性的免疫应答。引发的免疫应答可以阻止MCC生长。引发的免疫应答可以减少MCC的生长。引发的免疫应答可以预防和/或减少来自MCC的癌细胞或肿瘤细胞的转移。因此，疫苗可以用于治疗和/或预防施用疫苗的哺乳动物或受试者中的MCC的方法。
在一些实施例中，施用的疫苗可以通过诱导(1)由B细胞应答的体液免疫以产生靶向由MCC细胞表达的MCV T抗原的抗体来介导清除或防止MCC的生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞，诸如CD8+(CTL)，以攻击和杀伤MCC细胞；(3)增加T辅助细胞应答；(4)通过IFN-γ和TFN-α或所有上述物质增加炎症性应答。
在一些实施例中，施用的疫苗可以在受试者中增加无MCC的生存率、减少MCC质量、增加MCC生存率或其组合。施用的疫苗可以使无MCC生存率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％或更高的水平。施用的疫苗可以使受试者接种疫苗后的MCC质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％或更高。施用的疫苗可以预防和阻止受试者中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的增加，MCP-1是由髓样来源的抑制细胞分泌的细胞因子。在一些实施例中，施用的疫苗可以预防和阻止受试者的MCC组织内MCP-1的增加，从而减少受试者的MCC组织的血管形成。施用的疫苗可以使受试者的MCC生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％或更高。
联合治疗
免疫原性组合物可以与以下联合施用：其他蛋白和/或编码CCL20的基因、α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15(包括信号序列缺失的IL-15，并可选地包括不同的信号肽，诸如IgE信号肽)、MHC、CD80、CD86、IL-28、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-lα、MIP-1β、IL-8、L-选择素、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段，或其组合。在一些实施例中，免疫原性组合物与以下一种或多种核酸分子和/或蛋白联合施用：核酸分子，其选自由包含编码CCL20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC和RANTES或其功能片段中的一种或多种的编码序列的核酸分子组成的组，以及选自由以下组成的组的蛋白：CCL02、IL-12蛋白、IL-15蛋白、IL-28蛋白、CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或RANTES蛋白或其功能片段。
免疫原性组合物可以通过不同途径施用，包括经口、肠胃外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、经胸膜内、静脉内、动脉内、腹腔内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，可以根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的制剂施用。兽医可以容易确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。免疫原性组合物可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其他物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体力学方法”或超声进行施用。
可以通过几种公知的技术将免疫原性组合物的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括在有或没有体内电穿孔的情况下进行DNA注射(也称为DNA疫苗接种)，脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体，诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组疫苗。共有抗原可以通过DNA注射和体内电穿孔一起递送。
电穿孔
可以使用电穿孔装置完成经由电穿孔的免疫原性组合物的施用，该电穿孔装置可以被配置为向哺乳动物的预期组织递送有效地引发在细胞膜中形成可逆孔的能量脉冲，并且优选地，能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔组件和电极部件或手柄部件。电穿孔组件可以包括并结合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储元件、电源和电源开关。可以使用体内电穿孔装置，例如，CELLECTRA EP系统(Inovio Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)或Elgen电穿孔器(InovioPharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)完成电穿孔，以促进质粒转染细胞。
电穿孔组件可以用作电穿孔装置的一个元件，而其他元件是与电穿孔组件连通的单独的元件(或组件)。电穿孔组件可以用作电穿孔装置的一个以上元件，其可以与电穿孔装置中与电穿孔组件分离的其他元件连通。作为一种机电或机械装置的一部分而存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为这些元件可以用作一个装置或用作彼此连通的独立元件。电穿孔组件可能能够输送能量脉冲，该能量脉冲在预期组织中产生恒定电流，并包括反馈机制。电极部件可以包括具有在空间布置中的多个电极的电极阵列，其中，电极部件接收来自电穿孔组件的能量脉冲，并通过电极将其输送至预期组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的输送期间是中性的，并且测量预期组织中的阻抗，并将阻抗传递至电穿孔组件。反馈机制可以接收所测量的阻抗，并且可以调节由电穿孔组件输送的能量的脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以以分散模式输送能量脉冲。多个电极可以在编程的序列下通过电极的控制以分散的模式输送能量脉冲，并且用户将编程的序列输入到电穿孔组件中。编程的序列可以包括顺序输送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲由至少两个有源电极与一个测量阻抗的中性电极一起输送，并且其中多个脉冲中的后续脉冲由至少两个有源电极中的另一个与具有测量阻抗的中性电极的一个来输送。
反馈机制可以通过硬件或软件来执行。反馈机制可以由模拟闭环回路执行。反馈每隔50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选地，实时反馈或瞬时反馈(即，由用于确定响应时间的可用技术确定的基本上瞬时)。中性电极可测量预期组织中的阻抗并将阻抗传递至反馈机构，并且反馈机制响应该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在类似于预设电流的值。反馈机制可以在能量脉冲的输送期间连续且瞬时地保持恒定电流。
可以促进本发明免疫原性组合物递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括如Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963，由Smith等人提交的美国专利公开号2005/0052630所述，其内容通过引用以其全文并入本文。可用于促进免疫原性组合物递送的其他电穿孔装置和电穿孔方法包括如2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中所提供的，根据35USC 119(e)，其要求于2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149以及于2007年10月10日提交的60/978,982的权益，其全部以其全文并入本文。
Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统及其在促进将生物分子引入体内或植物中所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针状电极；皮下注射针头；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针状电极的导电连接；和电源。操作人员可以抓住安装在支撑结构上的多个针状电极，并将其牢固地插入身体或植物中选定的组织中。然后通过皮下注射针将生物分子输送到选定的组织中。可编程恒流脉冲控制器被激活，并且恒流电脉冲被施加到多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲有助于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容通过引用并入本文。
Smith等人的美国专利公开2005/0052630描述了一种可用于有效地促进将生物分子引入人体或植物中选定组织的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作由软件或固件指定。EKD装置根据用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲模式，并允许存储和采集电流波形数据。该电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘，用于注射针的中央注射通道以及可移除的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。
在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可以适用于不仅深入渗透到诸如肌肉的组织中，而且渗透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，注射针头(用于输送选择的生物分子)也完全插入到目标器官中，并且在目标部位预先划定的区域内垂直于目标问题进行注射。在美国专利号7,245,963和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选为20mm长，规格为21。
另外，在结合电穿孔装置及其用途的某些实施例中，考虑到以下专利中描述的电穿孔装置：1993年12月28日公开的美国专利5,273,525、2000年8月29日公开的美国专利6,110,161、2001年7月17日公开的6,261,281和2005年10月25日公开的6,958,060，以及2005年9月6日公开的美国专利6,939,862。此外，本文考虑了涵盖2004年2月24日公开的美国专利6,697,669中提供的主题的专利，其涉及使用多种装置中的任何一种递送DNA，以及2008年2月5日公开的美国专利7,328,064。以上专利通过引用以其全文并入本文。
体外和离体抗原的产生
在一个实施例中，优化的共有MCV T抗原在体外或离体产生。例如，在一个实施例中，可以在体外或离体细胞中引入并表达编码优化的共有MCV T抗原的核酸。
将基因导入细胞并表达到细胞中的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒，痘病毒，单纯疱疹病毒I，腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。考虑将脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质相关的核酸封装在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层中，并通过与脂质体和寡核苷酸均缔合的连接分子与脂质体连接，并包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，作为脂质的悬浮液包含在脂质中，或与胶束复合，或与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
实例
以下实例进一步说明本发明。应当理解，这些实例虽然示出了本发明的优选实施例，但仅以说明的方式给出。根据以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文中示出和描述的那些之外，如前所述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
实例1：靶向梅克尔多元癌细胞病毒的核酸疫苗
已研发出针对梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原的核酸疫苗(图1和图2)。代表大T抗原(LTAg)和小T抗原(STAg)的优化的合成共有MCV T抗原序列被分别克隆至哺乳动物表达质粒DNA中(图3)，并通过肌内电穿孔递送至小鼠(图4A)。免疫后，DNA疫苗构建体产生了对MCV T抗原肽的稳健抗体和T细胞应答(图4B至图15)。
图4B、图7、图12和图14示出了LTAg疫苗在C57Bl/6和CD-1远交系小鼠中具有高度免疫原性。图8至图10表明，LTAg接种可以产生稳健的多功能CD4和CD8 T细胞以及细胞毒性CD8 T细胞。
图4B和图15示出了STAg疫苗在C57Bl/6和CD-1小鼠中具有免疫原性。图15示出了对于CD-1小鼠，检测出对IFNγ/TNFα的CD4和CD8应答。
图11示出了两种疫苗在C57Bl/6小鼠中产生体液应答。
实例2：序列
SEQ ID NO:1：编码修饰的合成共有MCV LTAg的核苷酸序列
ATGGACCTGGTGCTGAACAGGAAGGAGAGAGAGGCCCTGTGCAAGCTGCTGGAGATCGCCCCCAACTGTTACGGCAATATCCCTCTGATGAAGGCCGCCTTCAAGCGGAGCTGCCTGAAGCACCACCCCAACAAGGGCGGCAACCCTGTGATCATGATGGAGCTGAATACCCTGTGGTCCAAGTTTCAGCAGAATATCCACAAGCTGCGGTCCGATTTCTCTATGTTTGACGAGGTGGATGAGGCCCCTATCTACGGCACCACCAAGTTCAAGGAGTGGTGGCGCTCCGGCGGCTTCTCTTTTGGCAAGGCCTACGAGTACGGCCCTAACCCACACGGCACCAATAGCAGGTCCAGAAAGCCAAGCTCCAACGCCAGCAGGGGAGCACCATCCGGATCTAGCCCACCTCACAGCCAGTCCTCTAGCTCCGGCTACGGCTCTTTTAGCGCCTCCCAGGCCTCTGACAGCCAGTCCAGAGGCCCCGATATCCCACCCGAGCACCACGAGGAGCCTACCTCTAGCTCCGGCTCTAGCTCCCGGGAGGAGACAACCAACAGCGGCAGGGAGTCTAGCACCCCAAACGGCACCTCCGTGCCAAGGAATTCCTCTAGGACCGACGGAACCGCCGAGGACCTGTTCTGCGATAAGTCCCTGAGCTCCCCTGAGCCTCCATCTAGCTCCGAGGAGCCAGAGGAGCCCCCTTCTAGCAGGTCCTCTCCCAGACAGCCACCAAGCTCCTCTGCCGAGGAGGCAAGCTCCTCTCAGTTCACCGACGAGGAGTACAGGAGCTCCTCTTTTACCACCCCTAAGACCCCTCCACCCTTCTCCCGGAAGCGCAAGTTTGGAGGCTCTAGGAGCTCCGCCTCTAGCGCCTCCTCTGCCAGCTTCACCTCCACCCCTCCAAAGCCCAAGAAGAACAGAGAGACACCCGTGCCTACCGACTTTCCTATCGACCTGAGCGATTACCTGTCCCACGCCGTGTACTCTAATAAGACCGTGAGCTGTTTCGCCATCTACACCACCAGCGACAAGGCCATCGAGCTGTACGATAAGATCGAGAAGTTCAAGGTGGACTTCAAGTCCAGGCACGCATGCGAGCTGGGATGTATCCTGCTGTTCATCACCCTGTCCAAGCACCGCGTGTCTGCCATCAAGAACTTCTGCAGCACCTTTTGTACCATCTCCTTTCTGATCTGCAAGGGCGTGAATAAGATGCCTGAGATGTACAACAACCTGTGCAAGCCCCCTTACAAGCTGCTGCAGGAGAACAAGCCACTGCTGAATTACGAGTTCCAGGAGAAGGAGAAGGAGGCCAGCTGCAACTGGAATCTGGTGGCCGAGTTCGCCTGTGAGTACGAGCTGGACGATCACTTTATCATCCTGGCCCACTACCTGGACTTCGCCAAGCCATTTCCCTGCCAGAAGTGTGAGAACAGGTCTAGACTGAAGCCACACAAGGCCCACGAGGCCCACCACTCCAATGCCAAGCTGTTTTACGAGTCTAAGAGCCAGAAGACCATCTGCCAGCAGGCAGCAGACACCGTGCTGGCAAAGAGGAGACTGGAGATGCTGGAGATGACCAGGACCGAGATGCTGTGCAAGAAGTTCAAGAAGCACCTGGAGCGGCTGCGCGACCTGGATACCATCGATCTGCTGTACTACATGGGCGGCGTGGCCTGGTACTGCTGTCTGTTCGAGGAGTTTGAGAAGAAGCTGCAGAAGATCATCCAGCTGCTGACCGAGAACATCCCAAAGTACAGAAATATCTGGTTCAAGGGCCCCATCAACTCTGGCAAGACCAGCTTCGCCGCCGCCCTGATCGACCTGCTGGAGGGCAAGGCCCTGAACATCAATTGCCCTAGCGATAAGCTGCCATTCGAGCTGGGCTGTGCCCTGGACAAGTTCATGGTGGTGTTTGAGGATGTGAAGGGCCAGAACTCCCTGAATAAGGACCTGCAGCCCGGCCAGGGCATCAACAATCTGGATAACCTGCGGGACCACCTGGATGGAGCAGTGGCCGTGAGCCTGGAGAAGAAGCACGTGAACAAGAAGCACCAGATCTTCCCACCCTGCATCGTGACCGCCAATGACTACTTTATCCCAAAGACCCTGATCGCCCGCTTCTCTTACACCCTGCACTTTAGCCCCAAGGCCAACCTGAGGGACAGCCTGGATCAGAATATGGAGATCAGAAAGAGGCGCATCCTGCAGTCCGGAACCACCCTGCTGCTGTGCCTGATCTGGTGTCTGCCTGACACCACCTTCAAGCCATGCCTGCAGGAGGAGATCAAGAACTGGAAGCAGATCCTGCAGTCTGAGATCAGCTACGGCAAGTTTTGTCAGATGATCGAGAACGTGGAGGCCGGCCAGGACCCCCTGCTGAATATCCTGATCGAGGAGGAGGGCCCAGAGGAGACAGAGGAGACACAGGACTCCGGCACCTTCTCTCAG
SEQ ID NO:2：修饰的合成共有MCV LTAg的氨基酸序列
MDLVLNRKEREALCKLLEIAPNCYGNIPLMKAAFKRSCLKHHPNKGGNPVIMMELNTLWSKFQQNIHKLRSDFSMFDEVDEAPIYGTTKFKEWWRSGGFSFGKAYEYGPNPHGTNSRSRKPSSNASRGAPSGSSPPHSQSSSSGYGSFSASQASDSQSRGPDIPPEHHEEPTSSSGSSSREETTNSGRESSTPNGTSVPRNSSRTDGTAEDLFCDKSLSSPEPPSSSEEPEEPPSSRSSPRQPPSSSAEEASSSQFTDEEYRSSSFTTPKTPPPFSRKRKFGGSRSSASSASSASFTSTPPKPKKNRETPVPTDFPIDLSDYLSHAVYSNKTVSCFAIYTTSDKAIELYDKIEKFKVDFKSRHACELGCILLFITLSKHRVSAIKNFCSTFCTISFLICKGVNKMPEMYNNLCKPPYKLLQENKPLLNYEFQEKEKEASCNWNLVAEFACEYELDDHFIILAHYLDFAKPFPCQKCENRSRLKPHKAHEAHHSNAKLFYESKSQKTICQQAADTVLAKRRLEMLEMTRTEMLCKKFKKHLERLRDLDTIDLLYYMGGVAWYCCLFEEFEKKLQKIIQLLTENIPKYRNIWFKGPINSGKTSFAAALIDLLEGKALNINCPSDKLPFELGCALDKFMVVFEDVKGQNSLNKDLQPGQGINNLDNLRDHLDGAVAVSLEKKHVNKKHQIFPPCIVTANDYFIPKTLIARFSYTLHFSPKANLRDSLDQNMEIRKRRILQSGTTLLLCLIWCLPDTTFKPCLQEEIKNWKQILQSEISYGKFCQMIENVEAGQDPLLNILIEEEGPEETEETQDSGTFSQ
SEQ ID NO:3：编码修饰的合成共有MCV STAg的核苷酸序列
ATGGACCTGGTGCTGAACCGAAAGGAGAGGGAGGCCCTGTGCAAGCTGCTGGAGATCGCCCCTAACTGTTACGGCAATATCCCACTGATGAAGGCCGCCTTCAAGAGGTCTTGCCTGAAGCACCACCCAAACAAGGGCGGCAATCCCGTGATCATGATGGAGCTGAACACCCTGTGGAGCAAGTTTCAGCAGAATATCCACAAGCTGCGGAGCGACTTCTCCATGTTTGATGAGGTGAGCACCAAGTTCCCCTGGGAGGAGTACGGAACAGCAGCAGCAGCAGCACAGTCCGGCTATAACGCCAGGTTTTGCAGAGGCCCTGGCTGTATGCTGAAGCAGCTGCGGGACTCCAAGTGCGCCTGTATCTCTTGCAAGCTGAGCCGCCAGCACTGTTCTCTGAAGACCCTGAAGCAGAAGAATTGCGCCACATGGGGCGAGTGCTTCTGTTATCAGTGTTTTATCCTGTGGTTCGGCTTTCCCCCTACATGGGAGTCCTTCGATTGGTGGCAGAAAACCCTGGAAGAAACCGACTACTGTCTGCTGCATCTGCATCTGTTC
SEQ ID NO:4：修饰的合成共有MCV STAg的氨基酸序列
MDLVLNRKEREALCKLLEIAPNCYGNIPLMKAAFKRSCLKHHPNKGGNPVIMMELNTLWSKFQQNIHKLRSDFSMFDEVSTKFPWEEYGTAAAAAQSGYNARFCRGPGCMLKQLRDSKCACISCKLSRQHCSLKTLKQKNCATWGECFCYQCFILWFGFPPTWESFDWWQKTLEETDYCLLHLHLF
SEQ ID NO:5：编码修饰的与furin切割位点连接的合成共有LTAg和STAg的核苷酸序列
ATGGACCTGGTGCTGAACAGGAAGGAGAGAGAGGCCCTGTGCAAGCTGCTGGAGATCGCCCCCAACTGTTACGGCAATATCCCTCTGATGAAGGCCGCCTTCAAGCGGAGCTGCCTGAAGCACCACCCCAACAAGGGCGGCAACCCTGTGATCATGATGGAGCTGAATACCCTGTGGTCCAAGTTTCAGCAGAATATCCACAAGCTGCGGTCCGATTTCTCTATGTTTGACGAGGTGGATGAGGCCCCTATCTACGGCACCACCAAGTTCAAGGAGTGGTGGCGCTCCGGCGGCTTCTCTTTTGGCAAGGCCTACGAGTACGGCCCTAACCCACACGGCACCAATAGCAGGTCCAGAAAGCCAAGCTCCAACGCCAGCAGGGGAGCACCATCCGGATCTAGCCCACCTCACAGCCAGTCCTCTAGCTCCGGCTACGGCTCTTTTAGCGCCTCCCAGGCCTCTGACAGCCAGTCCAGAGGCCCCGATATCCCACCCGAGCACCACGAGGAGCCTACCTCTAGCTCCGGCTCTAGCTCCCGGGAGGAGACAACCAACAGCGGCAGGGAGTCTAGCACCCCAAACGGCACCTCCGTGCCAAGGAATTCCTCTAGGACCGACGGAACCGCCGAGGACCTGTTCTGCGATAAGTCCCTGAGCTCCCCTGAGCCTCCATCTAGCTCCGAGGAGCCAGAGGAGCCCCCTTCTAGCAGGTCCTCTCCCAGACAGCCACCAAGCTCCTCTGCCGAGGAGGCAAGCTCCTCTCAGTTCACCGACGAGGAGTACAGGAGCTCCTCTTTTACCACCCCTAAGACCCCTCCACCCTTCTCCCGGAAGCGCAAGTTTGGAGGCTCTAGGAGCTCCGCCTCTAGCGCCTCCTCTGCCAGCTTCACCTCCACCCCTCCAAAGCCCAAGAAGAACAGAGAGACACCCGTGCCTACCGACTTTCCTATCGACCTGAGCGATTACCTGTCCCACGCCGTGTACTCTAATAAGACCGTGAGCTGTTTCGCCATCTACACCACCAGCGACAAGGCCATCGAGCTGTACGATAAGATCGAGAAGTTCAAGGTGGACTTCAAGTCCAGGCACGCATGCGAGCTGGGATGTATCCTGCTGTTCATCACCCTGTCCAAGCACCGCGTGTCTGCCATCAAGAACTTCTGCAGCACCTTTTGTACCATCTCCTTTCTGATCTGCAAGGGCGTGAATAAGATGCCTGAGATGTACAACAACCTGTGCAAGCCCCCTTACAAGCTGCTGCAGGAGAACAAGCCACTGCTGAATTACGAGTTCCAGGAGAAGGAGAAGGAGGCCAGCTGCAACTGGAATCTGGTGGCCGAGTTCGCCTGTGAGTACGAGCTGGACGATCACTTTATCATCCTGGCCCACTACCTGGACTTCGCCAAGCCATTTCCCTGCCAGAAGTGTGAGAACAGGTCTAGACTGAAGCCACACAAGGCCCACGAGGCCCACCACTCCAATGCCAAGCTGTTTTACGAGTCTAAGAGCCAGAAGACCATCTGCCAGCAGGCAGCAGACACCGTGCTGGCAAAGAGGAGACTGGAGATGCTGGAGATGACCAGGACCGAGATGCTGTGCAAGAAGTTCAAGAAGCACCTGGAGCGGCTGCGCGACCTGGATACCATCGATCTGCTGTACTACATGGGCGGCGTGGCCTGGTACTGCTGTCTGTTCGAGGAGTTTGAGAAGAAGCTGCAGAAGATCATCCAGCTGCTGACCGAGAACATCCCAAAGTACAGAAATATCTGGTTCAAGGGCCCCATCAACTCTGGCAAGACCAGCTTCGCCGCCGCCCTGATCGACCTGCTGGAGGGCAAGGCCCTGAACATCAATTGCCCTAGCGATAAGCTGCCATTCGAGCTGGGCTGTGCCCTGGACAAGTTCATGGTGGTGTTTGAGGATGTGAAGGGCCAGAACTCCCTGAATAAGGACCTGCAGCCCGGCCAGGGCATCAACAATCTGGATAACCTGCGGGACCACCTGGATGGAGCAGTGGCCGTGAGCCTGGAGAAGAAGCACGTGAACAAGAAGCACCAGATCTTCCCACCCTGCATCGTGACCGCCAATGACTACTTTATCCCAAAGACCCTGATCGCCCGCTTCTCTTACACCCTGCACTTTAGCCCCAAGGCCAACCTGAGGGACAGCCTGGATCAGAATATGGAGATCAGAAAGAGGCGCATCCTGCAGTCCGGAACCACCCTGCTGCTGTGCCTGATCTGGTGTCTGCCTGACACCACCTTCAAGCCATGCCTGCAGGAGGAGATCAAGAACTGGAAGCAGATCCTGCAGTCTGAGATCAGCTACGGCAAGTTTTGTCAGATGATCGAGAACGTGGAGGCCGGCCAGGACCCCCTGCTGAATATCCTGATCGAGGAGGAGGGCCCAGAGGAGACAGAGGAGACACAGGACTCCGGCACCTTCTCTCAGAGAGGCCGCAAAAGGAGGTCTGATCTGGTGCTGAATCGGAAAGAGAGAGAAGCCCTGTGCAAACTGCTGGAAATCGCCCCAAACTGTTACGGCAACATCCCCCTGATGAAGGCCGCCTTCAAGAGGTCTTGCCTGAAGCACCACCCAAACAAGGGCGGCAATCCCGTGATCATGATGGAGCTGAACACCCTGTGGAGCAAGTTTCAGCAGAATATCCACAAGCTGCGGAGCGACTTCTCCATGTTTGATGAGGTGAGCACCAAGTTCCCTTGGGAGGAGTACGGAACAGCAGCAGCAGCAGCACAGTCCGGCTATAACGCCAGGTTTTGCAGAGGCCCAGGCTGTATGCTGAAGCAGCTGCGGGACTCCAAGTGCGCCTGTATCTCTTGCAAGCTGAGCCGCCAGCACTGTTCTCTGAAGACCCTGAAGCAGAAGAATTGCGCCACATGGGGCGAGTGCTTCTGTTATCAGTGTTTTATCCTGTGGTTCGGCTTTCCCCCTACATGGGAGTCCTTCGATTGGTGGCAGAAAACCCTGGAGGAAACTGATTACTGTCTGCTGCACCTGCACCTGTTC
SEQ ID NO:6：修饰的与furin切割位点连接的合成共有LTAg和STAg的氨基酸序列。
MDLVLNRKEREALCKLLEIAPNCYGNIPLMKAAFKRSCLKHHPNKGGNPVIMMELNTLWSKFQQNIHKLRSDFSMFDEVDEAPIYGTTKFKEWWRSGGFSFGKAYEYGPNPHGTNSRSRKPSSNASRGAPSGSSPPHSQSSSSGYGSFSASQASDSQSRGPDIPPEHHEEPTSSSGSSSREETTNSGRESSTPNGTSVPRNSSRTDGTAEDLFCDKSLSSPEPPSSSEEPEEPPSSRSSPRQPPSSSAEEASSSQFTDEEYRSSSFTTPKTPPPFSRKRKFGGSRSSASSASSASFTSTPPKPKKNRETPVPTDFPIDLSDYLSHAVYSNKTVSCFAIYTTSDKAIELYDKIEKFKVDFKSRHACELGCILLFITLSKHRVSAIKNFCSTFCTISFLICKGVNKMPEMYNNLCKPPYKLLQENKPLLNYEFQEKEKEASCNWNLVAEFACEYELDDHFIILAHYLDFAKPFPCQKCENRSRLKPHKAHEAHHSNAKLFYESKSQKTICQQAADTVLAKRRLEMLEMTRTEMLCKKFKKHLERLRDLDTIDLLYYMGGVAWYCCLFEEFEKKLQKIIQLLTENIPKYRNIWFKGPINSGKTSFAAALIDLLEGKALNINCPSDKLPFELGCALDKFMVVFEDVKGQNSLNKDLQPGQGINNLDNLRDHLDGAVAVSLEKKHVNKKHQIFPPCIVTANDYFIPKTLIARFSYTLHFSPKANLRDSLDQNMEIRKRRILQSGTTLLLCLIWCLPDTTFKPCLQEEIKNWKQILQSEISYGKFCQMIENVEAGQDPLLNILIEEEGPEETEETQDSGTFSQRGRKRRSDLVLNRKEREALCKLLEIAPNCYGNIPLMKAAFKRSCLKHHPNKGGNPVIMMELNTLWSKFQQNIHKLRSDFSMFDEVSTKFPWEEYGTAAAAAQSGYNARFCRGPGCMLKQLRDSKCACISCKLSRQHCSLKTLKQKNCATWGECFCYQCFILWFGFPPTWESFDWWQKTLEETDYCLLHLHLF
SEQ ID NO:7：IgE前导序列的氨基酸序列
MDWTWILFLVAAATRVHS
应当理解的是，前述和所附实例仅是示例性的，并且不应被视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书及其等同物来限定。
对于所公开的实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。可以在不背离本发明精神和范围的情况下进行的改变和修改包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关的改变和修改。
序列表
<110> 威斯塔解剖学和生物学研究所
大卫·B·韦纳
伊丽莎白·迪佩雷
<120> 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小T抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法
<130> 206194-0021-00-WO.608420
<150> 62619161
<151> 2018-01-19
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2451
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码修饰的合成共有MCV LTAg的核苷酸序列
<400> 1
atggacctgg tgctgaacag gaaggagaga gaggccctgt gcaagctgct ggagatcgcc 60
cccaactgtt acggcaatat ccctctgatg aaggccgcct tcaagcggag ctgcctgaag 120
caccacccca acaagggcgg caaccctgtg atcatgatgg agctgaatac cctgtggtcc 180
aagtttcagc agaatatcca caagctgcgg tccgatttct ctatgtttga cgaggtggat 240
gaggccccta tctacggcac caccaagttc aaggagtggt ggcgctccgg cggcttctct 300
tttggcaagg cctacgagta cggccctaac ccacacggca ccaatagcag gtccagaaag 360
ccaagctcca acgccagcag gggagcacca tccggatcta gcccacctca cagccagtcc 420
tctagctccg gctacggctc ttttagcgcc tcccaggcct ctgacagcca gtccagaggc 480
cccgatatcc cacccgagca ccacgaggag cctacctcta gctccggctc tagctcccgg 540
gaggagacaa ccaacagcgg cagggagtct agcaccccaa acggcacctc cgtgccaagg 600
aattcctcta ggaccgacgg aaccgccgag gacctgttct gcgataagtc cctgagctcc 660
cctgagcctc catctagctc cgaggagcca gaggagcccc cttctagcag gtcctctccc 720
agacagccac caagctcctc tgccgaggag gcaagctcct ctcagttcac cgacgaggag 780
tacaggagct cctcttttac cacccctaag acccctccac ccttctcccg gaagcgcaag 840
tttggaggct ctaggagctc cgcctctagc gcctcctctg ccagcttcac ctccacccct 900
ccaaagccca agaagaacag agagacaccc gtgcctaccg actttcctat cgacctgagc 960
gattacctgt cccacgccgt gtactctaat aagaccgtga gctgtttcgc catctacacc 1020
accagcgaca aggccatcga gctgtacgat aagatcgaga agttcaaggt ggacttcaag 1080
tccaggcacg catgcgagct gggatgtatc ctgctgttca tcaccctgtc caagcaccgc 1140
gtgtctgcca tcaagaactt ctgcagcacc ttttgtacca tctcctttct gatctgcaag 1200
ggcgtgaata agatgcctga gatgtacaac aacctgtgca agccccctta caagctgctg 1260
caggagaaca agccactgct gaattacgag ttccaggaga aggagaagga ggccagctgc 1320
aactggaatc tggtggccga gttcgcctgt gagtacgagc tggacgatca ctttatcatc 1380
ctggcccact acctggactt cgccaagcca tttccctgcc agaagtgtga gaacaggtct 1440
agactgaagc cacacaaggc ccacgaggcc caccactcca atgccaagct gttttacgag 1500
tctaagagcc agaagaccat ctgccagcag gcagcagaca ccgtgctggc aaagaggaga 1560
ctggagatgc tggagatgac caggaccgag atgctgtgca agaagttcaa gaagcacctg 1620
gagcggctgc gcgacctgga taccatcgat ctgctgtact acatgggcgg cgtggcctgg 1680
tactgctgtc tgttcgagga gtttgagaag aagctgcaga agatcatcca gctgctgacc 1740
gagaacatcc caaagtacag aaatatctgg ttcaagggcc ccatcaactc tggcaagacc 1800
agcttcgccg ccgccctgat cgacctgctg gagggcaagg ccctgaacat caattgccct 1860
agcgataagc tgccattcga gctgggctgt gccctggaca agttcatggt ggtgtttgag 1920
gatgtgaagg gccagaactc cctgaataag gacctgcagc ccggccaggg catcaacaat 1980
ctggataacc tgcgggacca cctggatgga gcagtggccg tgagcctgga gaagaagcac 2040
gtgaacaaga agcaccagat cttcccaccc tgcatcgtga ccgccaatga ctactttatc 2100
ccaaagaccc tgatcgcccg cttctcttac accctgcact ttagccccaa ggccaacctg 2160
agggacagcc tggatcagaa tatggagatc agaaagaggc gcatcctgca gtccggaacc 2220
accctgctgc tgtgcctgat ctggtgtctg cctgacacca ccttcaagcc atgcctgcag 2280
gaggagatca agaactggaa gcagatcctg cagtctgaga tcagctacgg caagttttgt 2340
cagatgatcg agaacgtgga ggccggccag gaccccctgc tgaatatcct gatcgaggag 2400
gagggcccag aggagacaga ggagacacag gactccggca ccttctctca g 2451
<210> 2
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的合成共有MCV LTAg的氨基酸序列
<400> 2
Met Asp Leu Val Leu Asn Arg Lys Glu Arg Glu Ala Leu Cys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ile Ala Pro Asn Cys Tyr Gly Asn Ile Pro Leu Met Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Lys Arg Ser Cys Leu Lys His His Pro Asn Lys Gly Gly Asn
35 40 45
Pro Val Ile Met Met Glu Leu Asn Thr Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln
50 55 60
Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Met Phe Asp Glu Val Asp
65 70 75 80
Glu Ala Pro Ile Tyr Gly Thr Thr Lys Phe Lys Glu Trp Trp Arg Ser
85 90 95
Gly Gly Phe Ser Phe Gly Lys Ala Tyr Glu Tyr Gly Pro Asn Pro His
100 105 110
Gly Thr Asn Ser Arg Ser Arg Lys Pro Ser Ser Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ala Pro Ser Gly Ser Ser Pro Pro His Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly
130 135 140
Tyr Gly Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Ser Asp Ser Gln Ser Arg Gly
145 150 155 160
Pro Asp Ile Pro Pro Glu His His Glu Glu Pro Thr Ser Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Ser Ser Arg Glu Glu Thr Thr Asn Ser Gly Arg Glu Ser Ser Thr
180 185 190
Pro Asn Gly Thr Ser Val Pro Arg Asn Ser Ser Arg Thr Asp Gly Thr
195 200 205
Ala Glu Asp Leu Phe Cys Asp Lys Ser Leu Ser Ser Pro Glu Pro Pro
210 215 220
Ser Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Ser Ser Arg Ser Ser Pro
225 230 235 240
Arg Gln Pro Pro Ser Ser Ser Ala Glu Glu Ala Ser Ser Ser Gln Phe
245 250 255
Thr Asp Glu Glu Tyr Arg Ser Ser Ser Phe Thr Thr Pro Lys Thr Pro
260 265 270
Pro Pro Phe Ser Arg Lys Arg Lys Phe Gly Gly Ser Arg Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ser Phe Thr Ser Thr Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Lys Asn Arg Glu Thr Pro Val Pro Thr Asp Phe Pro Ile Asp Leu Ser
305 310 315 320
Asp Tyr Leu Ser His Ala Val Tyr Ser Asn Lys Thr Val Ser Cys Phe
325 330 335
Ala Ile Tyr Thr Thr Ser Asp Lys Ala Ile Glu Leu Tyr Asp Lys Ile
340 345 350
Glu Lys Phe Lys Val Asp Phe Lys Ser Arg His Ala Cys Glu Leu Gly
355 360 365
Cys Ile Leu Leu Phe Ile Thr Leu Ser Lys His Arg Val Ser Ala Ile
370 375 380
Lys Asn Phe Cys Ser Thr Phe Cys Thr Ile Ser Phe Leu Ile Cys Lys
385 390 395 400
Gly Val Asn Lys Met Pro Glu Met Tyr Asn Asn Leu Cys Lys Pro Pro
405 410 415
Tyr Lys Leu Leu Gln Glu Asn Lys Pro Leu Leu Asn Tyr Glu Phe Gln
420 425 430
Glu Lys Glu Lys Glu Ala Ser Cys Asn Trp Asn Leu Val Ala Glu Phe
435 440 445
Ala Cys Glu Tyr Glu Leu Asp Asp His Phe Ile Ile Leu Ala His Tyr
450 455 460
Leu Asp Phe Ala Lys Pro Phe Pro Cys Gln Lys Cys Glu Asn Arg Ser
465 470 475 480
Arg Leu Lys Pro His Lys Ala His Glu Ala His His Ser Asn Ala Lys
485 490 495
Leu Phe Tyr Glu Ser Lys Ser Gln Lys Thr Ile Cys Gln Gln Ala Ala
500 505 510
Asp Thr Val Leu Ala Lys Arg Arg Leu Glu Met Leu Glu Met Thr Arg
515 520 525
Thr Glu Met Leu Cys Lys Lys Phe Lys Lys His Leu Glu Arg Leu Arg
530 535 540
Asp Leu Asp Thr Ile Asp Leu Leu Tyr Tyr Met Gly Gly Val Ala Trp
545 550 555 560
Tyr Cys Cys Leu Phe Glu Glu Phe Glu Lys Lys Leu Gln Lys Ile Ile
565 570 575
Gln Leu Leu Thr Glu Asn Ile Pro Lys Tyr Arg Asn Ile Trp Phe Lys
580 585 590
Gly Pro Ile Asn Ser Gly Lys Thr Ser Phe Ala Ala Ala Leu Ile Asp
595 600 605
Leu Leu Glu Gly Lys Ala Leu Asn Ile Asn Cys Pro Ser Asp Lys Leu
610 615 620
Pro Phe Glu Leu Gly Cys Ala Leu Asp Lys Phe Met Val Val Phe Glu
625 630 635 640
Asp Val Lys Gly Gln Asn Ser Leu Asn Lys Asp Leu Gln Pro Gly Gln
645 650 655
Gly Ile Asn Asn Leu Asp Asn Leu Arg Asp His Leu Asp Gly Ala Val
660 665 670
Ala Val Ser Leu Glu Lys Lys His Val Asn Lys Lys His Gln Ile Phe
675 680 685
Pro Pro Cys Ile Val Thr Ala Asn Asp Tyr Phe Ile Pro Lys Thr Leu
690 695 700
Ile Ala Arg Phe Ser Tyr Thr Leu His Phe Ser Pro Lys Ala Asn Leu
705 710 715 720
Arg Asp Ser Leu Asp Gln Asn Met Glu Ile Arg Lys Arg Arg Ile Leu
725 730 735
Gln Ser Gly Thr Thr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Trp Cys Leu Pro Asp
740 745 750
Thr Thr Phe Lys Pro Cys Leu Gln Glu Glu Ile Lys Asn Trp Lys Gln
755 760 765
Ile Leu Gln Ser Glu Ile Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Gln Met Ile Glu
770 775 780
Asn Val Glu Ala Gly Gln Asp Pro Leu Leu Asn Ile Leu Ile Glu Glu
785 790 795 800
Glu Gly Pro Glu Glu Thr Glu Glu Thr Gln Asp Ser Gly Thr Phe Ser
805 810 815
Gln
<210> 3
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码修饰的合成共有MCV STAg的核苷酸序列
<400> 3
atggacctgg tgctgaaccg aaaggagagg gaggccctgt gcaagctgct ggagatcgcc 60
cctaactgtt acggcaatat cccactgatg aaggccgcct tcaagaggtc ttgcctgaag 120
caccacccaa acaagggcgg caatcccgtg atcatgatgg agctgaacac cctgtggagc 180
aagtttcagc agaatatcca caagctgcgg agcgacttct ccatgtttga tgaggtgagc 240
accaagttcc cctgggagga gtacggaaca gcagcagcag cagcacagtc cggctataac 300
gccaggtttt gcagaggccc tggctgtatg ctgaagcagc tgcgggactc caagtgcgcc 360
tgtatctctt gcaagctgag ccgccagcac tgttctctga agaccctgaa gcagaagaat 420
tgcgccacat ggggcgagtg cttctgttat cagtgtttta tcctgtggtt cggctttccc 480
cctacatggg agtccttcga ttggtggcag aaaaccctgg aagaaaccga ctactgtctg 540
ctgcatctgc atctgttc 558
<210> 4
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的合成共有MCV STAg的氨基酸序列
<400> 4
Met Asp Leu Val Leu Asn Arg Lys Glu Arg Glu Ala Leu Cys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ile Ala Pro Asn Cys Tyr Gly Asn Ile Pro Leu Met Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Lys Arg Ser Cys Leu Lys His His Pro Asn Lys Gly Gly Asn
35 40 45
Pro Val Ile Met Met Glu Leu Asn Thr Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln
50 55 60
Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Met Phe Asp Glu Val Ser
65 70 75 80
Thr Lys Phe Pro Trp Glu Glu Tyr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln
85 90 95
Ser Gly Tyr Asn Ala Arg Phe Cys Arg Gly Pro Gly Cys Met Leu Lys
100 105 110
Gln Leu Arg Asp Ser Lys Cys Ala Cys Ile Ser Cys Lys Leu Ser Arg
115 120 125
Gln His Cys Ser Leu Lys Thr Leu Lys Gln Lys Asn Cys Ala Thr Trp
130 135 140
Gly Glu Cys Phe Cys Tyr Gln Cys Phe Ile Leu Trp Phe Gly Phe Pro
145 150 155 160
Pro Thr Trp Glu Ser Phe Asp Trp Trp Gln Lys Thr Leu Glu Glu Thr
165 170 175
Asp Tyr Cys Leu Leu His Leu His Leu Phe
180 185
<210> 5
<211> 3027
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码修饰的与furin切割位点连接的合成共有LTAg和STAg核苷酸序列
<400> 5
atggacctgg tgctgaacag gaaggagaga gaggccctgt gcaagctgct ggagatcgcc 60
cccaactgtt acggcaatat ccctctgatg aaggccgcct tcaagcggag ctgcctgaag 120
caccacccca acaagggcgg caaccctgtg atcatgatgg agctgaatac cctgtggtcc 180
aagtttcagc agaatatcca caagctgcgg tccgatttct ctatgtttga cgaggtggat 240
gaggccccta tctacggcac caccaagttc aaggagtggt ggcgctccgg cggcttctct 300
tttggcaagg cctacgagta cggccctaac ccacacggca ccaatagcag gtccagaaag 360
ccaagctcca acgccagcag gggagcacca tccggatcta gcccacctca cagccagtcc 420
tctagctccg gctacggctc ttttagcgcc tcccaggcct ctgacagcca gtccagaggc 480
cccgatatcc cacccgagca ccacgaggag cctacctcta gctccggctc tagctcccgg 540
gaggagacaa ccaacagcgg cagggagtct agcaccccaa acggcacctc cgtgccaagg 600
aattcctcta ggaccgacgg aaccgccgag gacctgttct gcgataagtc cctgagctcc 660
cctgagcctc catctagctc cgaggagcca gaggagcccc cttctagcag gtcctctccc 720
agacagccac caagctcctc tgccgaggag gcaagctcct ctcagttcac cgacgaggag 780
tacaggagct cctcttttac cacccctaag acccctccac ccttctcccg gaagcgcaag 840
tttggaggct ctaggagctc cgcctctagc gcctcctctg ccagcttcac ctccacccct 900
ccaaagccca agaagaacag agagacaccc gtgcctaccg actttcctat cgacctgagc 960
gattacctgt cccacgccgt gtactctaat aagaccgtga gctgtttcgc catctacacc 1020
accagcgaca aggccatcga gctgtacgat aagatcgaga agttcaaggt ggacttcaag 1080
tccaggcacg catgcgagct gggatgtatc ctgctgttca tcaccctgtc caagcaccgc 1140
gtgtctgcca tcaagaactt ctgcagcacc ttttgtacca tctcctttct gatctgcaag 1200
ggcgtgaata agatgcctga gatgtacaac aacctgtgca agccccctta caagctgctg 1260
caggagaaca agccactgct gaattacgag ttccaggaga aggagaagga ggccagctgc 1320
aactggaatc tggtggccga gttcgcctgt gagtacgagc tggacgatca ctttatcatc 1380
ctggcccact acctggactt cgccaagcca tttccctgcc agaagtgtga gaacaggtct 1440
agactgaagc cacacaaggc ccacgaggcc caccactcca atgccaagct gttttacgag 1500
tctaagagcc agaagaccat ctgccagcag gcagcagaca ccgtgctggc aaagaggaga 1560
ctggagatgc tggagatgac caggaccgag atgctgtgca agaagttcaa gaagcacctg 1620
gagcggctgc gcgacctgga taccatcgat ctgctgtact acatgggcgg cgtggcctgg 1680
tactgctgtc tgttcgagga gtttgagaag aagctgcaga agatcatcca gctgctgacc 1740
gagaacatcc caaagtacag aaatatctgg ttcaagggcc ccatcaactc tggcaagacc 1800
agcttcgccg ccgccctgat cgacctgctg gagggcaagg ccctgaacat caattgccct 1860
agcgataagc tgccattcga gctgggctgt gccctggaca agttcatggt ggtgtttgag 1920
gatgtgaagg gccagaactc cctgaataag gacctgcagc ccggccaggg catcaacaat 1980
ctggataacc tgcgggacca cctggatgga gcagtggccg tgagcctgga gaagaagcac 2040
gtgaacaaga agcaccagat cttcccaccc tgcatcgtga ccgccaatga ctactttatc 2100
ccaaagaccc tgatcgcccg cttctcttac accctgcact ttagccccaa ggccaacctg 2160
agggacagcc tggatcagaa tatggagatc agaaagaggc gcatcctgca gtccggaacc 2220
accctgctgc tgtgcctgat ctggtgtctg cctgacacca ccttcaagcc atgcctgcag 2280
gaggagatca agaactggaa gcagatcctg cagtctgaga tcagctacgg caagttttgt 2340
cagatgatcg agaacgtgga ggccggccag gaccccctgc tgaatatcct gatcgaggag 2400
gagggcccag aggagacaga ggagacacag gactccggca ccttctctca gagaggccgc 2460
aaaaggaggt ctgatctggt gctgaatcgg aaagagagag aagccctgtg caaactgctg 2520
gaaatcgccc caaactgtta cggcaacatc cccctgatga aggccgcctt caagaggtct 2580
tgcctgaagc accacccaaa caagggcggc aatcccgtga tcatgatgga gctgaacacc 2640
ctgtggagca agtttcagca gaatatccac aagctgcgga gcgacttctc catgtttgat 2700
gaggtgagca ccaagttccc ttgggaggag tacggaacag cagcagcagc agcacagtcc 2760
ggctataacg ccaggttttg cagaggccca ggctgtatgc tgaagcagct gcgggactcc 2820
aagtgcgcct gtatctcttg caagctgagc cgccagcact gttctctgaa gaccctgaag 2880
cagaagaatt gcgccacatg gggcgagtgc ttctgttatc agtgttttat cctgtggttc 2940
ggctttcccc ctacatggga gtccttcgat tggtggcaga aaaccctgga ggaaactgat 3000
tactgtctgc tgcacctgca cctgttc 3027
<210> 6
<211> 1009
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的与furin切割位点连接的合成共有LTAg和STAg氨基酸序列
<400> 6
Met Asp Leu Val Leu Asn Arg Lys Glu Arg Glu Ala Leu Cys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ile Ala Pro Asn Cys Tyr Gly Asn Ile Pro Leu Met Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Lys Arg Ser Cys Leu Lys His His Pro Asn Lys Gly Gly Asn
35 40 45
Pro Val Ile Met Met Glu Leu Asn Thr Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln
50 55 60
Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe Ser Met Phe Asp Glu Val Asp
65 70 75 80
Glu Ala Pro Ile Tyr Gly Thr Thr Lys Phe Lys Glu Trp Trp Arg Ser
85 90 95
Gly Gly Phe Ser Phe Gly Lys Ala Tyr Glu Tyr Gly Pro Asn Pro His
100 105 110
Gly Thr Asn Ser Arg Ser Arg Lys Pro Ser Ser Asn Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Ala Pro Ser Gly Ser Ser Pro Pro His Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly
130 135 140
Tyr Gly Ser Phe Ser Ala Ser Gln Ala Ser Asp Ser Gln Ser Arg Gly
145 150 155 160
Pro Asp Ile Pro Pro Glu His His Glu Glu Pro Thr Ser Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Ser Ser Arg Glu Glu Thr Thr Asn Ser Gly Arg Glu Ser Ser Thr
180 185 190
Pro Asn Gly Thr Ser Val Pro Arg Asn Ser Ser Arg Thr Asp Gly Thr
195 200 205
Ala Glu Asp Leu Phe Cys Asp Lys Ser Leu Ser Ser Pro Glu Pro Pro
210 215 220
Ser Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Ser Ser Arg Ser Ser Pro
225 230 235 240
Arg Gln Pro Pro Ser Ser Ser Ala Glu Glu Ala Ser Ser Ser Gln Phe
245 250 255
Thr Asp Glu Glu Tyr Arg Ser Ser Ser Phe Thr Thr Pro Lys Thr Pro
260 265 270
Pro Pro Phe Ser Arg Lys Arg Lys Phe Gly Gly Ser Arg Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Ser Ala Ser Ser Ala Ser Phe Thr Ser Thr Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Lys Asn Arg Glu Thr Pro Val Pro Thr Asp Phe Pro Ile Asp Leu Ser
305 310 315 320
Asp Tyr Leu Ser His Ala Val Tyr Ser Asn Lys Thr Val Ser Cys Phe
325 330 335
Ala Ile Tyr Thr Thr Ser Asp Lys Ala Ile Glu Leu Tyr Asp Lys Ile
340 345 350
Glu Lys Phe Lys Val Asp Phe Lys Ser Arg His Ala Cys Glu Leu Gly
355 360 365
Cys Ile Leu Leu Phe Ile Thr Leu Ser Lys His Arg Val Ser Ala Ile
370 375 380
Lys Asn Phe Cys Ser Thr Phe Cys Thr Ile Ser Phe Leu Ile Cys Lys
385 390 395 400
Gly Val Asn Lys Met Pro Glu Met Tyr Asn Asn Leu Cys Lys Pro Pro
405 410 415
Tyr Lys Leu Leu Gln Glu Asn Lys Pro Leu Leu Asn Tyr Glu Phe Gln
420 425 430
Glu Lys Glu Lys Glu Ala Ser Cys Asn Trp Asn Leu Val Ala Glu Phe
435 440 445
Ala Cys Glu Tyr Glu Leu Asp Asp His Phe Ile Ile Leu Ala His Tyr
450 455 460
Leu Asp Phe Ala Lys Pro Phe Pro Cys Gln Lys Cys Glu Asn Arg Ser
465 470 475 480
Arg Leu Lys Pro His Lys Ala His Glu Ala His His Ser Asn Ala Lys
485 490 495
Leu Phe Tyr Glu Ser Lys Ser Gln Lys Thr Ile Cys Gln Gln Ala Ala
500 505 510
Asp Thr Val Leu Ala Lys Arg Arg Leu Glu Met Leu Glu Met Thr Arg
515 520 525
Thr Glu Met Leu Cys Lys Lys Phe Lys Lys His Leu Glu Arg Leu Arg
530 535 540
Asp Leu Asp Thr Ile Asp Leu Leu Tyr Tyr Met Gly Gly Val Ala Trp
545 550 555 560
Tyr Cys Cys Leu Phe Glu Glu Phe Glu Lys Lys Leu Gln Lys Ile Ile
565 570 575
Gln Leu Leu Thr Glu Asn Ile Pro Lys Tyr Arg Asn Ile Trp Phe Lys
580 585 590
Gly Pro Ile Asn Ser Gly Lys Thr Ser Phe Ala Ala Ala Leu Ile Asp
595 600 605
Leu Leu Glu Gly Lys Ala Leu Asn Ile Asn Cys Pro Ser Asp Lys Leu
610 615 620
Pro Phe Glu Leu Gly Cys Ala Leu Asp Lys Phe Met Val Val Phe Glu
625 630 635 640
Asp Val Lys Gly Gln Asn Ser Leu Asn Lys Asp Leu Gln Pro Gly Gln
645 650 655
Gly Ile Asn Asn Leu Asp Asn Leu Arg Asp His Leu Asp Gly Ala Val
660 665 670
Ala Val Ser Leu Glu Lys Lys His Val Asn Lys Lys His Gln Ile Phe
675 680 685
Pro Pro Cys Ile Val Thr Ala Asn Asp Tyr Phe Ile Pro Lys Thr Leu
690 695 700
Ile Ala Arg Phe Ser Tyr Thr Leu His Phe Ser Pro Lys Ala Asn Leu
705 710 715 720
Arg Asp Ser Leu Asp Gln Asn Met Glu Ile Arg Lys Arg Arg Ile Leu
725 730 735
Gln Ser Gly Thr Thr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Trp Cys Leu Pro Asp
740 745 750
Thr Thr Phe Lys Pro Cys Leu Gln Glu Glu Ile Lys Asn Trp Lys Gln
755 760 765
Ile Leu Gln Ser Glu Ile Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Gln Met Ile Glu
770 775 780
Asn Val Glu Ala Gly Gln Asp Pro Leu Leu Asn Ile Leu Ile Glu Glu
785 790 795 800
Glu Gly Pro Glu Glu Thr Glu Glu Thr Gln Asp Ser Gly Thr Phe Ser
805 810 815
Gln Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Asp Leu Val Leu Asn Arg Lys Glu
820 825 830
Arg Glu Ala Leu Cys Lys Leu Leu Glu Ile Ala Pro Asn Cys Tyr Gly
835 840 845
Asn Ile Pro Leu Met Lys Ala Ala Phe Lys Arg Ser Cys Leu Lys His
850 855 860
His Pro Asn Lys Gly Gly Asn Pro Val Ile Met Met Glu Leu Asn Thr
865 870 875 880
Leu Trp Ser Lys Phe Gln Gln Asn Ile His Lys Leu Arg Ser Asp Phe
885 890 895
Ser Met Phe Asp Glu Val Ser Thr Lys Phe Pro Trp Glu Glu Tyr Gly
900 905 910
Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ser Gly Tyr Asn Ala Arg Phe Cys Arg
915 920 925
Gly Pro Gly Cys Met Leu Lys Gln Leu Arg Asp Ser Lys Cys Ala Cys
930 935 940
Ile Ser Cys Lys Leu Ser Arg Gln His Cys Ser Leu Lys Thr Leu Lys
945 950 955 960
Gln Lys Asn Cys Ala Thr Trp Gly Glu Cys Phe Cys Tyr Gln Cys Phe
965 970 975
Ile Leu Trp Phe Gly Phe Pro Pro Thr Trp Glu Ser Phe Asp Trp Trp
980 985 990
Gln Lys Thr Leu Glu Glu Thr Asp Tyr Cys Leu Leu His Leu His Leu
995 1000 1005
Phe
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgE前导序列的氨基酸序列
<400> 7
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser

Claims (30)

1.一种免疫原性组合物，其包含编码至少一种修饰的梅克尔多元癌细胞病毒(MCV)T抗原的核酸分子，其中，所述T抗原包含至少一种突变，所述突变破坏天然MCV T抗原的至少一种致癌特征。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述至少一种致癌特征选自由以下组成的组：CR1结合、DnaJ结合、结合磷酸酶pp2A的结合、Rb结合、ATP酶活性、解旋酶活性、伴侣蛋白结合、hVam6p结合、Fbxw7结合、起点结合和转化。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述至少一种突变是选自由D44、W209、E216、L142、L91、K92、D93、Y94和M95组成的组的氨基酸处的突变。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，至少一种突变选自由以下组成的组：D44N突变、W209A、E216K突变、L142A突变、L91A突变、K92A突变、D93A突变、Y94A突变和M95A突变。
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述MCV T抗原选自由大T抗原(LTAg)、小t抗原(STAg)及其组合组成的组。
6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％。
7.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)核苷酸序列，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％同一性，
c)核苷酸序列，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，以及
d)核苷酸序列的免疫原性片段，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组。
9.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，编码肽的核苷酸序列与至少一种调控序列可操作地连接，所述调控序列选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％，
与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)核苷酸序列，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％同一性，
c)核苷酸序列，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，以及
d)核苷酸序列的免疫原性片段，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，
与编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列可操作地连接。
12.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子包含表达载体。
13.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述核酸分子被掺入病毒颗粒。
14.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的辅料。
15.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
16.一种核酸分子，所述核酸分子编码肽，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。
18.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)核苷酸序列，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％同一性，
c)核苷酸序列，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，以及
d)核苷酸序列的免疫原性片段，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组。
19.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，编码的肽与至少一种调控序列可操作地连接，所述调控序列选自由起始密码子、IgE前导序列和终止密码子组成的组。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其中，所述核酸分子编码肽，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％，
与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列可操作地连接。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)核苷酸序列，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)核苷酸序列的免疫原性片段，其与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％具有至少约90％同一性，
c)核苷酸序列，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，以及
d)核苷酸序列的免疫原性片段，其选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5组成的组，
与编码SEQ ID NO:7的核苷酸序列可操作地连接。
22.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含表达载体。
23.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含病毒颗粒。
24.一种包含肽的免疫原性组合物，其中，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％。
25.一种肽，所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
a)氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的全长具有至少约90％同一性，
b)免疫原性片段，其包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列至少60％的至少约90％同一性，
c)氨基酸序列，其选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组，以及
d)免疫原性片段，其包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％。
26.一种诱导对其有需要的受试者对MCV T抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1所述的免疫原性组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，施用包括电穿孔和注射中的至少一种。
28.一种治疗或预防对其有需要的受试者的MCV相关病理的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1所述的免疫原性组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，施用包括电穿孔和注射中的至少一种。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述MCV相关病理是MCV感染和梅克尔细胞癌中的至少一种。
CN201980014819.4A 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法 Active CN111801111B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510692710.3A CN120514835A (zh) 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862619161P 2018-01-19 2018-01-19
US62/619,161 2018-01-19
PCT/US2019/014171 WO2019143921A2 (en) 2018-01-19 2019-01-18 Large and small t antigens of merkel cell polyomavirus, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510692710.3A Division CN120514835A (zh) 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111801111A true CN111801111A (zh) 2020-10-20
CN111801111B CN111801111B (zh) 2025-06-10

Family

ID=67302504

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510692710.3A Pending CN120514835A (zh) 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法
CN201980014819.4A Active CN111801111B (zh) 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510692710.3A Pending CN120514835A (zh) 2018-01-19 2019-01-18 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11524065B2 (zh)
EP (1) EP3740226A4 (zh)
JP (2) JP7485604B2 (zh)
KR (1) KR20200110678A (zh)
CN (2) CN120514835A (zh)
AU (2) AU2019210063B2 (zh)
BR (1) BR112020014632A2 (zh)
CA (1) CA3088374A1 (zh)
EA (1) EA202091732A1 (zh)
MX (1) MX2020007676A (zh)
WO (1) WO2019143921A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020007676A (es) * 2018-01-19 2020-11-12 Wistar Inst Antígenos t grandes y pequeños del poliomavirus de células de merkel, construcciones de ácido nucleico y vacunas fabricadas con ellos, y métodos de usar los mismos.
WO2021247534A2 (en) * 2020-06-01 2021-12-09 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for treating merkel cell carcinoma (mcc) using hla class i specific epitopes

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020123099A1 (en) * 2000-10-04 2002-09-05 Weiner David B. Highly expressible genes
WO2016073595A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services T cells and dendritic cells for polyomavirus therapy
EP3101134A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-07 Apcure SAS Therapeutic vaccine for treating or preventing merkel cell polyoma virus-associated tumors
WO2017060283A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 Universität Basel Specific immunodominant peptide epitopes for polyomavirus vaccine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020007676A (es) * 2018-01-19 2020-11-12 Wistar Inst Antígenos t grandes y pequeños del poliomavirus de células de merkel, construcciones de ácido nucleico y vacunas fabricadas con ellos, y métodos de usar los mismos.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020123099A1 (en) * 2000-10-04 2002-09-05 Weiner David B. Highly expressible genes
WO2016073595A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services T cells and dendritic cells for polyomavirus therapy
EP3101134A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-07 Apcure SAS Therapeutic vaccine for treating or preventing merkel cell polyoma virus-associated tumors
WO2017060283A1 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 Universität Basel Specific immunodominant peptide epitopes for polyomavirus vaccine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYUN JIN KWUN 等: ""Restricted protein phosphatase 2A targeting by Merkel cell polyomavirus small T antigen"", J VIROL, vol. 89, no. 8, pages 4196 *
MASAHIRO SHUDA 等: ""Human Merkel cell polyomavirus small T antigen is an oncoprotein targeting the 4E-BP1 translation regulator"", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 121, no. 9, pages 3623 - 3634, XP055700171, DOI: 10.1172/JCI46323 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3740226A2 (en) 2020-11-25
US20230201328A1 (en) 2023-06-29
CA3088374A1 (en) 2019-07-25
KR20200110678A (ko) 2020-09-24
WO2019143921A3 (en) 2020-04-09
EP3740226A4 (en) 2021-10-13
JP2024096334A (ja) 2024-07-12
BR112020014632A2 (pt) 2021-01-05
AU2019210063A1 (en) 2020-08-20
AU2019210063B2 (en) 2025-03-06
AU2025204247A1 (en) 2025-06-26
WO2019143921A2 (en) 2019-07-25
JP7485604B2 (ja) 2024-05-16
EA202091732A1 (ru) 2020-09-10
CN111801111B (zh) 2025-06-10
US11524065B2 (en) 2022-12-13
US20200345830A1 (en) 2020-11-05
CN120514835A (zh) 2025-08-22
MX2020007676A (es) 2020-11-12
JP2021511320A (ja) 2021-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220354945A1 (en) Epstein-barr virus nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
JP2024150611A (ja) Ｗｔ１ワクチン
JP2024096334A (ja) メルケル細胞ポリオーマウイルスのラージおよびスモールｔ抗原、それから作製される核酸構築物およびワクチン、ならびにそれを使用する方法
US12296001B2 (en) DNA vaccine against crimean-congo hemorrhagic fever virus (CCHFV)
ES2938900T3 (es) Vacunas contra el cáncer dirigidas al PRAME y usos de las mismas
US12390521B2 (en) Canine distemper vaccines and methods of treatment using the same
US20250276051A1 (en) Powassan viral antigens and related compositions, and uses thereof to vaccinate and treat patients
US12194000B2 (en) Optimized synthetic consensus immunogenic compositions targeting chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4)
HK40038957A (zh) 梅克尔多元癌细胞病毒的大和小t抗原、核酸构建体和由此制造的疫苗及其使用方法
US20190290751A1 (en) Marburgvirus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
US20190192644A1 (en) Optimized Synthetic Consensus Immunogenic Compositions Targeting the Follicle Stimulating Hormone Receptor (FSHR)
CN112888457A (zh) 抗尼帕病毒的疫苗及其使用方法
EA045600B1 (ru) Конструкты нуклеиновых кислот и вакцины из больших и малых т-антигенов полиомавируса клеток меркеля и способы их применения
HK40053340A (zh) 抗尼帕病毒的疫苗及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40038957

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant