CN111781376A - 一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法；由于痴呆病理学的异质性和阿尔茨海默病发病机理的复杂性，同时检测阿尔茨海默病多种生物标志物对于早期准确诊断阿尔茨海默病是非常必要的；因此该检测方法以双抗夹心式模式为基础，采用基于表面增强拉曼散射的侧向流试纸条技术，能同时对多种阿尔茨海默病生物标志物进行快速检测；与现有技术相比，具有特异性强、灵敏度高、成本低、可多重检测和快速检测的特点，在阿尔茨海默病的早期诊断和监测上具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，特别是涉及一种基于表面增强拉曼散射的侧向流试纸条的检测方法。属于即时检测领域。
背景技术
阿尔茨海默病（AD）是继心血管病、脑血管病和癌症之后，成了老人健康的“第四大杀手”。通常认为，阿尔茨海默病的病情改善治疗在疾病的早期和症状轻微阶段最为有效。根据最近的报道，早期诊断可以将罹患AD的风险降低三分之一，而高灵敏度的检测阿尔茨海默症的生物标志物有望早期诊断AD。
目前，已经证实了可能的AD生物标志物有β-淀粉样蛋白（Aβ）、tau蛋白和神经丝轻链蛋白。由于痴呆病理学的异质性和AD发病机理的复杂性，单一的生物标志物无法准确的诊断AD，特别是对于AD的早期诊断，而同时检测AD多种生物标志物，比如通过综合分析t-tau /Aβ42、Aβ42/Aβ40和p-tau181/Aβ42能够极大的提高诊断的准确率，并且可以提前15年检测出AD，而单一的检测Aβ，不仅准确率不高，而且仅可提前几年才能检测出AD。因此，同时检测AD多种生物标志物，对于AD的早期诊断是非常必要的。
目前临床上对AD生物标志物的检测方法有正电子发射断层扫描。但其需要价值数千万的设备并对受检者注射一定剂量的放射性药物，不适合对于没有症状的人群进行大规模早期筛查。其它针对AD生物标志物的检测方法主要有酶联免疫吸附分析、电化学生物传感器和基于表面等离子体激元共振的高灵敏度光学分析平台。由于AD生物标志物的含量极低，酶联免疫吸附分析和电化学生物传感器两种检测方法的检测灵敏度不够并且检测的成本高。而基于表面等离子体激元共振的高灵敏度光学分析平台目前只能检测单个AD生物标志物，无法准确诊断和预测AD。因此，需要发明一种成本低，高灵敏度、高特异性，能进行多重检测的检测方法。
表面增强拉曼散射（SERS）测量的是靠近或吸附在贵金属纳米粒子或纳米结构表面分子的放大的拉曼散射信号。SERS具有超高灵敏度、可多靶标检测和操作灵活等诸多优点。将其与侧向流试纸技术进行结合，可以提高检测灵敏度并实现高特异性的多靶标检测。
因此，本发明公开了一种基于表面增强拉曼散射的侧向流试纸条，来对AD生物标志物进行高灵敏度、高特异性的多重检测和快速检测，从而对AD进行早期诊断。
发明内容
本发明旨在提供一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，该检测方法基于表面增强拉曼散射的侧向流试纸条技术，具有特异性强、灵敏度高、成本低、可多重检测和快速检测的特点。
该检测方法包括以下步骤：
（1）制备用于检测阿尔茨海默病生物标志物的侧向流试纸条；
（2）将待检测的样品溶液滴加到试纸条的样品垫上；
（3）一段时间后（10分钟到30分钟），用拉曼光谱仪对试纸条上的质控线进行拉曼光谱分析：
若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则表明试纸条检测结果有效，否则需要换一张新的试纸条或重新制备试纸条再次进行检测；
若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则再用拉曼光谱仪对试纸条上的检测线进行拉曼光谱分析，即可得到相应的阿尔茨海默病生物标志物的浓度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测AD生物标志物的侧向流试纸条，侧向流试纸条由五部分组成：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸收垫和背衬。NC膜固定在背衬的中间位置，吸收垫固定在背衬的尾端，样品垫和金标垫固定在背衬的头端。制备时，依次将NC膜、金标垫、样品垫、吸收垫固定到背衬上，每个部分的末端相互交叠，确保当样品滴加到样品垫之后，能够通过毛细作用沿着每部分连续的流动。
所述AD生物标志物为β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白。
所述样品垫用含有表面活性剂的缓冲盐溶液进行饱和。
所述NC膜上横向设有检测线和质控线，其中，质控线平行排布于检测线的右侧。
所述检测线为一条或者多条直线，直线上固定有一种或多种捕获抗体，捕获抗体为β-淀粉样蛋白、tau蛋白、神经丝轻链蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体或羊抗兔1gG抗体。
所述金标垫中含有一种或多种检测抗体连接的一种或多种SERS纳米标签，检测抗体通过吸附或者共价连接在SERS纳米标签上。
所述检测抗体为β-淀粉样蛋白、tau蛋白、神经丝轻链蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述SERS纳米标签是指用拉曼标签编码的金属纳米粒子。
所述拉曼标签为耐尔兰A、结晶紫、罗丹明6G、亚甲基蓝、对氨基苯硫酚、水溶性3H-吲哚菁型生物荧光标示染料、甲基蓝、4,4'-联吡啶、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-硫基吡啶、对氟苯硫酚、对硫基苯胺、对氨基苯硫酚、对硫基苯硫酚、对疏基苯甲酸或甲苯胺蓝中的任意一种。
所述金属纳米粒子为单一结构的纳米粒子或核壳结构的纳米粒子，单一结构的纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或铂纳米粒子；核壳结构的纳米粒子为金核银壳纳米粒子、金核金壳纳米粒子、银核金壳纳米粒子、银核银壳纳米粒子、二氧化硅核金壳纳米粒子、金核二氧化硅壳纳米粒子、二氧化硅核银壳纳米粒子或银核二氧化硅壳纳米粒子。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、灵敏度高：本发明将SERS纳米标签与侧向流试纸技术进行结合，通过拉曼光谱仪对检测线上的拉曼标签进行检测，检测限可达到fg/mL级别，灵敏度高；
2、特异性强：本发明的试纸条以双抗夹心式模式为基础制备而成，NC膜上既有检测线，也有质控线，通过质控线可判断试纸条是否正常工作，结果准确，特异性强；
3、多重检测：本发明的试纸条可以设置多条检测线，每条检测线上也可固定多种捕获抗体，因此可以检测多种AD生物标志物，有效的降低成本；
4、快速检测：整个检测流程可以在半个小时内完成；
5、成本低：侧向流试纸条的制作成本低。
附图说明
图1为检测单一AD生物标志物的侧向流试纸条的示意图；
图2为多条检测线同时检测多种AD生物标志物的侧向流试纸条的示意图；
图3为一条检测线同时检测多种AD生物标志物的侧向流试纸条的示意图；
图中：1、样品垫，2、硝酸纤维素膜，3、金标垫，4、SERS纳米标签，5、检测线，6、捕获抗体，7、质控线，8、质控抗体，9、吸收垫，10、背衬。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明。
实施例1：β-淀粉样蛋白的检测
如图1所示，构建了一种快速检测AD生物标志物的侧向流试纸条。侧向流试纸条由五部分组成：样品垫1、金标垫3、硝酸纤维素膜2、吸收垫9和背衬10。硝酸纤维素膜2固定在背衬10的中间位置，吸收垫9固定在背衬10的尾端，样品垫1和金标垫3固定在背衬10的头端。制备时，依次将硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫1、吸收垫9固定到背衬10上，每个部分的末端相互交叠，确保当样品滴加到样品垫1之后，能够通过毛细作用沿着每部分连续的流动。样品垫1用含有表面活性剂的缓冲盐溶液进行饱和，金标垫3中含有β-淀粉样蛋白单克隆抗体连接的包裹有耐尔兰A的银核金壳SERS纳米标签4（AgNBA@Au SERS纳米标签4），β-淀粉样蛋白单克隆抗体固定到硝酸纤维素膜2上形成检测线5；羊抗鼠IgG抗体固定到硝酸纤维素膜2上形成质控线7。
将样品溶液滴加到样品垫1上时，样品溶液会通过毛细作用向前流动。当样品溶液流过金标垫3时，样品溶液中的β-淀粉样蛋白会与AgNBA@Au SERS纳米标签4表面的检测抗体β-淀粉样蛋白检测抗体反应，形成抗原-抗体杂交复合物。该复合物会跟随液体一起向前流动。当免疫复合物到达检测线5时，该复合物就会被固定在检测线5上的β-淀粉样蛋白捕获抗体6捕获。因此，三明治式的杂交复合物在检测线5上形成。剩余的样品溶液与β-淀粉样蛋白检测抗体连接的AgNBA@Au SERS纳米标签4继续向前流动，并被质控线7上的羊抗鼠IgG抗体捕获。
用拉曼光谱仪对质控线7和检测线5进行拉曼光谱分析。质控线7上的拉曼光谱中出现耐尔兰A的特征峰则表明侧向流试纸条的检测结果有效，β-淀粉样蛋白的定量检测可以通过测定检测线5上AgNBA@Au SERS纳米标签4的SERS信号的强度来实现。
实施例2：三条检测线5同时检测β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白
如图2所示，构建了一种快速检测AD生物标志物的侧向流试纸条。侧向流试纸条由五部分组成：样品垫1、金标垫3、硝酸纤维素膜2、吸收垫9和背衬10。硝酸纤维素膜2固定在背衬10的中间位置，吸收垫9固定在背衬10的尾端，样品垫1和金标垫3固定在背衬10的头端。制备时，依次将硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫1、吸收垫9固定到背衬10上，每个部分的末端相互交叠，确保当样品滴加到样品垫1之后，能够通过毛细作用沿着每部分连续的流动。样品垫1用含有表面活性剂的缓冲盐溶液进行饱和，金标垫3中含有β-淀粉样蛋白单克隆抗体连接的包裹有耐尔兰A的银核金壳SERS纳米标签4（AgNBA@Au SERS纳米标签4）、tau蛋白单克隆抗体连接的AgNBA@Au SERS纳米标签4和神经丝轻链蛋白单克隆抗体连接的AgNBA@Au SERS纳米标签4。硝酸纤维素膜2上有三条检测线5和一条质控线7，三条检测线5上分别固定上β-淀粉样蛋白单克隆抗体、tau蛋白单克隆抗体和神经丝轻链蛋白单克隆抗体，质控线7上固定羊抗鼠IgG抗体。
将样品溶液滴加到样品垫1上时，样品溶液会通过毛细作用向前流动。当样品溶液流过金标垫3时，相应的目标抗原（β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白）会与连接到AgNBA@Au SERS纳米标签4表面上的相应的检测抗体(β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白检测抗体)反应，形成三种不同类型的抗原-抗体杂交复合物。该复合物会跟随液体一起向前流动，当免疫复合物到达第一条检测线5时，β-淀粉样蛋白和β-淀粉样蛋白检测抗体连接的AgNBA@Au SERS纳米标签4形成的复合物会被固定在检测线5上的β-淀粉样蛋白捕获抗体6捕获。因此，三明治式β-淀粉样蛋白抗原-抗体杂交复合物在第一条检测线5上形成。
剩余的溶液继续向前流动，同理，三明治式tau蛋白抗原-抗体杂交复合物在第二条检测线5上形成，三明治式神经丝轻链蛋白抗原-抗体杂交复合物在第三条检测线5上形成。最后，剩余的样品溶液与三种检测抗体连接的AgNBA@Au SERS纳米标签4继续向前流动，并被质控线7上的羊抗鼠IgG抗体捕获。
用拉曼光谱仪对质控线7和检测线5进行拉曼光谱分析。质控线7上的拉曼光谱中出现耐尔兰A的特征峰则表明侧向流试纸条的检测结果有效，β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白的定量检测可以通过测定检测线5上AgNBA@Au SERS纳米标签4的SERS信号的强度来实现。
实施例3：一条检测线5同时检测β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白
如图3所示，构建了一种快速检测AD生物标志物的侧向流试纸条。侧向流试纸条由五部分组成：样品垫1、金标垫3、硝酸纤维素膜2、吸收垫9和背衬10。硝酸纤维素膜2固定在背衬10的中间位置，吸收垫9固定在背衬10的尾端，样品垫1和金标垫3固定在背衬10的头端。制备时，依次将硝酸纤维素膜2、金标垫3、样品垫1、吸收垫9固定到背衬10上，每个部分的末端相互交叠，确保当样品滴加到样品垫1之后，能够通过毛细作用沿着每部分连续的流动。样品垫1用含有表面活性剂的缓冲盐溶液进行饱和，金标垫3中含有β-淀粉样蛋白单克隆抗体连接的包裹有耐尔兰A的银核金壳SERS纳米标签4（AgNBA@Au SERS纳米标签4）、tau蛋白单克隆抗体连接的包裹有亚甲基蓝的银核金壳SERS纳米标签4（AgMB@Au SERS纳米标签4）和神经丝轻链蛋白单克隆抗体连接的包裹有罗丹明6G的银核金壳SERS纳米标签4（AgR6G@Au SERS纳米标签4）。硝酸纤维素膜2上有一条检测线5和一条质控线7，检测线5上固定有β-淀粉样蛋白单克隆抗体、tau蛋白单克隆抗体和神经丝轻链蛋白单克隆抗体，质控线7上固定有羊抗鼠IgG抗体。
将样品溶液滴加到样品垫1上时，样品溶液会通过毛细作用向前流动。当样品溶液流过金标垫3时，相应的目标抗原（β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白）与固定到SRES纳米标签上的相应检测抗体(β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白检测抗体)反应，形成三种免疫复合物，并继续沿试纸条向前流动。当这些免疫复合物到达检测线5时，三种复合物分别被预先固定在检测线5上的三种捕获抗体6(β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白捕获抗体)捕获，从而在检测线5上形成三种双抗夹心式的免疫复合物。剩余的溶液继续向前流动，并被质控线7上的羊抗鼠IgG抗体捕获。
用拉曼光谱仪对质控线7和检测线5进行拉曼光谱分析。质控线7上的拉曼光谱中的出现耐尔兰A、亚甲基蓝和罗丹明6G的特征峰则表明侧向流试纸条的检测结果有效，β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白的定量检测可以通过测定检测线5上AgNBA@Au、AgMB@Au和AgR6G@Au SERS纳米标签4的SERS信号的强度来实现。
以上所述实例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
（1）制备用于检测阿尔茨海默病生物标志物的侧向流试纸条；
（2）将待检测的样品溶液滴加到试纸条的样品垫上；
（3）静置10-30分钟后，用拉曼光谱仪对试纸条上的质控线进行拉曼光谱分析：
若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则表明试纸条检测结果有效，否则需要更换新的试纸条再次进行检测；
若所得到的质控线的拉曼光谱中出现所使用的所有拉曼标签的特征峰，则再用拉曼光谱仪对试纸条上的检测线进行拉曼光谱分析，即可得到相应的阿尔茨海默病生物标志物的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述侧向流试纸条的底部为背衬，背衬上从左向右依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫；硝酸纤维素膜上设有平行设置的检测线和质控线，质控线设置于检测线的右侧。
3.根据权利要求2所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于，对样品垫进行预处理，步骤如下：将样品垫放置于含有表面活性剂的缓冲盐溶液进行浸泡。
4.根据权利要求2所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述检测线为一条或者多条直线，直线上固定有一种或多种捕获抗体。
5.根据权利要求4所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述捕获抗体为β-淀粉样蛋白、tau蛋白、神经丝轻链蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求2所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述质控线上固定有羊抗鼠IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体或羊抗兔1gG抗体。
7.根据权利要求2所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述金标垫中含有一种或多种检测抗体连接的一种或多种SERS纳米标签，检测抗体通过吸附或者共价连接在SERS纳米标签上。
8.根据权利要求7所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述检测抗体为β-淀粉样蛋白、tau蛋白、神经丝轻链蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
9.根据权利要求7所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述SERS纳米标签为用拉曼标签编码的金属纳米粒子；
所述拉曼标签为耐尔兰A、结晶紫、罗丹明6G、亚甲基蓝、对氨基苯硫酚、水溶性3H-吲哚菁型生物荧光标示染料、甲基蓝、4,4'-联吡啶、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-硫基吡啶、对氟苯硫酚、对硫基苯胺、对氨基苯硫酚、对硫基苯硫酚、对疏基苯甲酸或甲苯胺蓝中的任意一种；
所述金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、金核银壳纳米粒子、金核金壳纳米粒子、银核金壳纳米粒子、银核银壳纳米粒子、二氧化硅核金壳纳米粒子、金核二氧化硅壳纳米粒子、二氧化硅核银壳纳米粒子或银核二氧化硅壳纳米粒子中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的一种阿尔茨海默病生物标志物的快速检测方法，其特征在于：所述阿尔茨海默病生物标志物为β-淀粉样蛋白、tau蛋白和神经丝轻链蛋白。
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