CN111781291A - 一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法 - Google Patents
一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于抗生素检测领域，公开了一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法。本发明所述方法为：量取水样，用氨水调节pH=7~10，加入Na2EDTA、异丙醇，混匀，C18固相萃取膜依次用甲醇、水预处理，水样以45‑55 mL/min流速过膜，水淋洗固相萃取膜，去除残留水分，甲醇洗脱，洗脱液吹干，加入甲醇，旋涡混合溶解残渣，经滤膜过滤后，用液相色谱‑四极杆‑静电轨道阱高分辨质谱进行测定。该方法无需建立谱库，按照设定条件一次进样获得定性与定量结果，此外，采用固相萃取膜进行样品富集，缩短了样品处理时间，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素检测领域，具体是涉及一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法。
背景技术
大环内酯类抗生素是结构中含有内酯环及脱氧糖的一类弱碱性抗生素，常用的包括有14环的红霉素（ERY）、罗红霉素（ROM）、地红霉素（DRM）、氟红霉素（FRM）、克拉霉素（CLM）、竹桃霉素（OLM），15元环的阿奇霉素（AZM），16元环的泰乐霉素（TLS）、螺旋霉素（SPM）、吉他霉素（KTM）、米卡霉素(MDM)、替米考星（TMC）、交沙霉素（JSM）等。大环内酯类抗生素除用于治疗人类细菌感染，在畜禽水产养殖中也被广泛用于疾病治疗、提高饲料利用率和促进动物生长。这些抗生素并不能被动物体完全吸收，很大一部分最终以原形或者代谢物的形式排入环境中。环境中痕量的抗生素残留就能诱导细菌产生抗性基因，获得耐药性，并藉由横向传递作用转移到病原菌中或通过食物链转移到人或其他动物体内。
目前，致病菌耐药性的增加和扩散已经成为全球公共安全问题。但是水体环境中抗生素含量为痕量级别，需要富集后才能进入仪器检测。当前环境中抗生素检测主要使用固相萃取柱富集，这种方法的流速对回收率影响较大，且富集500mL样品需要1小时以上，难以应对大量样品检测。
发明内容
本发明为了克服上述背景技术的不足，提供了一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法。本发明提供的方法是一种基于固相萃取膜技术，建立的液相色谱-四极杆/静电场离子轨道阱质谱检测海水中大环内酯类抗生素的方法，对了解水体环境中抗生素残留重要参考意义。
其中，固相萃取膜由于比表面积大，500mL样品10min内可以完成富集，极大提高了样品处理效率。四极杆/静电场离子轨道阱质谱具有获取一、二级碎片离子精确质量数的功能，对一级全扫描谱图提取精确质量数可获得提取离子流图，从而实现高通量的目标物定量及非目标物的筛查，在一级全扫描的同时可以获得二级碎片离子质谱图，得到高可靠性的确证结果。
为达到本发明的目的，本发明水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法为：量取水样，用氨水调节pH=7~10，加入Na2EDTA、异丙醇，混匀，C18固相萃取膜依次用甲醇、水预处理，水样以45-55 mL/min流速过膜，水淋洗固相萃取膜，去除残留水分，甲醇洗脱，洗脱液吹干，加入甲醇，旋涡混合溶解残渣，经滤膜过滤后，用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行测定；其中，所述13种大环内酯类抗生素为红霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉、克拉霉素、竹桃霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、泰乐霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素、替米考星。
优选地，本发明水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法为：量取500mL水样，用氨水调节pH=7~10，加入0.2g Na2EDTA，5 mL异丙醇，混匀，C18固相萃取膜依次用5 mL甲醇、5 mL水预处理，水样以50 mL/min流速过膜，10mL水淋洗固相萃取膜，减压抽干去除残留水分，10 mL甲醇洗脱，洗脱液在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 20 %甲醇，旋涡混合溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行测定。
进一步优选地，所述水样用氨水调节pH=9.5~10.5。
更优选地，所述水样用氨水调节pH=10。
进一步地，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：C18（1.9μm，2.1mm×100mm）
流动相：A—乙腈；B—0.005 mol/L乙酸铵（含0.1 %甲酸）
流动相梯度洗脱程序如下
| 时间，min | A，% | B，% | 流速，mL/min |
| 0.0 | 10 | 90 | 0.2 |
| 5.0 | 10 | 90 | 0.2 |
| 6.0 | 50 | 50 | 0.2 |
| 11.0 | 50 | 50 | 0.2 |
| 11.1 | 10 | 90 | 0.2 |
| 13.0 | 10 | 90 | 0.2 |
柱温：35℃
进样量：20μL。
进一步地，所述质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源
喷雾电压：3200V
鞘气：40Arb
辅助气：10Arb
离子传输管温度：320℃
扫描模式：一级全扫描+数据依赖二级扫描（FullMS+ddms2）
一级扫描：扫描范围m/z 150~1500，分辨率70000，AGC target为3e6，驻留时间200ms
二级扫描：分辨率17500，AGC target为2e5，驻留时间50ms，归一化碰撞能量35eV。
进一步地，所述测定中针对13种大环内酯类抗生素的质谱参数如下：
| 化合物 | 分子式 | 加合物 | 母离子精确质量数 | 二级碎片离子精确质量数 |
| 红霉素 | C<sub>37</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 734.46852 | 158.11756,576.37422 |
| 罗红霉素 | C<sub>41</sub>H<sub>76</sub>N<sub>2</sub>O<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 837.53185 | 158.11756,679.43755 |
| 地红霉素 | C<sub>42</sub>H<sub>78</sub>N<sub>2</sub>O<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 835.55258 | 158.11756,677.45829 |
| 氟红霉素 | C<sub>37</sub>H<sub>66</sub>FNO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 752.45910 | 158.11756,594.3648 |
| 克拉霉素 | C<sub>38</sub>H<sub>69</sub>NO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 748.48417 | 158.11756,590.38987 |
| 阿奇霉素 | C<sub>38</sub>H<sub>72</sub>N<sub>2</sub>O<sub>12</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 749.51580 | 158.11756,591.42151 |
| 竹桃霉素 | C<sub>35</sub>H<sub>61</sub>NO<sub>12</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 688.42665 | 158.11756,544.34801 |
| 螺旋霉素 | C<sub>43</sub>H<sub>74</sub>N<sub>2</sub>O<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 843.52128 | 174.11247,540.31671 |
| 泰乐霉素 | C<sub>46</sub>H<sub>77</sub>NO<sub>17</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 916.52643 | 174.11247,772.44778 |
| 吉他霉素 | C<sub>40</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 786.46343 | 109.06479,174.11247 |
| 米卡霉素 | C<sub>41</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 814.45835 | 109.06479,174.11247 |
| 替米考星 | C<sub>46</sub>H<sub>80</sub>N<sub>2</sub>O<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 869.57332 | 696.46812,174.11247 |
| 交沙霉素 | C<sub>42</sub>H<sub>69</sub>NO<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 828.47400 | 109.06479,174.11247 |
与现有技术相比，本发明的优点如下：
（1）本发明的方法采用固相萃取膜进行样品富集，缩短了样品处理时间，提高了检测效率；
（2）本发明的方法无需建立谱库，按照设定条件一次进样获得定性与定量结果，采用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行一级离子精确质量数全扫描，当检测到目标物时自动触发二级离子扫描，用一级离子精确质量数进行定量分析，二级离子精确质量数及保留时间进行定性分析。
附图说明
图1是本发明13种大环内酯类抗生素提取离子流图（浓度100ng/L）；
图2是本发明实施例3按本发明所述方法选择不同pH条件下13种抗生素的回收率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。
此外，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
1.1主要仪器
U3000液相色谱（美国赛默飞世尔公司），Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔公司），HM100均质器（北京格瑞德曼公司），Centrifuge 5804R离心机（德国艾本德公司），旋涡混合器（美国talboys公司），Synergy纯水仪（美国密理博公司），固相膜萃取装置（上海安谱公司）。
1.2 试剂
甲醇、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；甲酸、乙酸铵、乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；Empore C18固相萃取膜（美国3M公司）。
1.3标准品
红霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、克拉霉素、竹桃霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、泰乐霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素、替米考星，购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均≥95%。
本发明以母离子精确质量数、保留时间及二级碎片离子精确质量数作为定性依据。在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5%以内，且检测到母离子与二级碎片离子的精确质量数与理论值相对偏差小于0.0005%。
本发明在测定中先定仪器条件，待仪器稳定后将标准溶液和样品制备液等体积进样测定，提取一级全扫描质谱图中各化合物母离子精确质量数得到选择离子流图，外标法定量。
实施例1
量取500 mL水样，用氨水调节pH=10，加入0.2g Na2EDTA，5 mL异丙醇，混匀。C18固相萃取膜依次用5 mL甲醇、5 mL水预处理，水样以50 mL/min流速过膜，10mL水淋洗固相萃取膜，减压抽干去除残留水分，10 mL甲醇洗脱。洗脱液在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 20 %甲醇，旋涡混合溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行测定。
其中，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：C18（1.9μm，2.1mm×100mm）
流动相：A—乙腈；B—0.005 mol/L 乙酸铵（含0.1 %甲酸）
流动相梯度洗脱程序如下
| 时间，min | A，% | B，% | 流速，mL/min |
| 0.0 | 10 | 90 | 0.2 |
| 5.0 | 10 | 90 | 0.2 |
| 6.0 | 50 | 50 | 0.2 |
| 11.0 | 50 | 50 | 0.2 |
| 11.1 | 10 | 90 | 0.2 |
| 13.0 | 10 | 90 | 0.2 |
柱温：35℃
进样量：20μL。
所述质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源
喷雾电压：3200V
鞘气：40Arb
辅助气：10Arb
离子传输管温度：320℃
扫描模式：一级全扫描+数据依赖二级扫描（FullMS+ddms2）
一级扫描：扫描范围m/z 150~1500，分辨率70000，AGC target为3e6，驻留时间200ms
二级扫描：分辨率17500，AGC target为2e5，驻留时间50ms，归一化碰撞能量35eV。
所述测定中针对13种大环内酯类抗生素的质谱参数如下：
| 化合物 | 分子式 | 加合物 | 母离子精确质量数 | 二级碎片离子精确质量数 |
| 红霉素 | C<sub>37</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 734.46852 | 158.11756,576.37422 |
| 罗红霉素 | C<sub>41</sub>H<sub>76</sub>N<sub>2</sub>O<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 837.53185 | 158.11756,679.43755 |
| 地红霉素 | C<sub>42</sub>H<sub>78</sub>N<sub>2</sub>O<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 835.55258 | 158.11756,677.45829 |
| 氟红霉素 | C<sub>37</sub>H<sub>66</sub>FNO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 752.45910 | 158.11756,594.3648 |
| 克拉霉素 | C<sub>38</sub>H<sub>69</sub>NO<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 748.48417 | 158.11756,590.38987 |
| 阿奇霉素 | C<sub>38</sub>H<sub>72</sub>N<sub>2</sub>O<sub>12</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 749.51580 | 158.11756,591.42151 |
| 竹桃霉素 | C<sub>35</sub>H<sub>61</sub>NO<sub>12</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 688.42665 | 158.11756,544.34801 |
| 螺旋霉素 | C<sub>43</sub>H<sub>74</sub>N<sub>2</sub>O<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 843.52128 | 174.11247,540.31671 |
| 泰乐霉素 | C<sub>46</sub>H<sub>77</sub>NO<sub>17</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 916.52643 | 174.11247,772.44778 |
| 吉他霉素 | C<sub>40</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>14</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 786.46343 | 109.06479,174.11247 |
| 米卡霉素 | C<sub>41</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 814.45835 | 109.06479,174.11247 |
| 替米考星 | C<sub>46</sub>H<sub>80</sub>N<sub>2</sub>O<sub>13</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 869.57332 | 696.46812,174.11247 |
| 交沙霉素 | C<sub>42</sub>H<sub>69</sub>NO<sub>15</sub> | [M+H]<sup>+</sup> | 828.47400 | 109.06479,174.11247 |
实施例2：线性关系、检出限、定量限
用20 %甲醇稀释混合标准储备液，配成最终浓度为1~500μg/L的标准曲线，按照前述仪器条件和方法上机测定。以被测组分的峰面积响应值为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。在1~500μg/L线性范围内线性良好，相关系数r均大于0.99。按照准分子离子信噪比S/N=3和信噪比S/N=10确定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。标准曲线、相关系数、检出限、定量限见表1。
表1 13种大环内酯类抗生素的线性方程、相关系数、检出限（ng/L）、定量限（ng/L）
| 化合物 | 线性方程 | 相关系数 | 检出限 | 定量限 |
| 红霉素 | Y = 256985+23189500X | 0.9986 | 0.02 | 0.08 |
| 罗红霉素 | Y = 1256971+7452190X | 0.9987 | 0.04 | 0.14 |
| 地红霉素 | Y = 515896+360019X | 0.9987 | 0.24 | 0.81 |
| 氟红霉素 | Y = -1693520+27851300X | 0.9974 | 0.05 | 0.17 |
| 克拉霉素 | Y = 396541+12365700X | 0.9982 | 0.02 | 0.08 |
| 阿奇霉素 | Y = 296549+50163200X | 0.9967 | 0.09 | 0.29 |
| 竹桃霉素 | Y = 4693725+3269410X | 0.9979 | 0.10 | 0.34 |
| 螺旋霉素 | Y = -362548+885623X | 0.9987 | 0.16 | 0.53 |
| 泰乐霉素 | Y = 2963451+5263810X | 0.9994 | 0.09 | 0.30 |
| 吉他霉素 | Y = -441262+1026354X | 0.9994 | 0.19 | 0.64 |
| 米卡霉素 | Y = 3211025+1362044X | 0.9991 | 0.12 | 0.41 |
| 替米考星 | Y = 2974810+3232526X | 0.9988 | 0.12 | 0.40 |
| 交沙霉素 | Y = 965163+12960300X | 0.9987 | 0.04 | 0.14 |
实施例3：回收率及精密度实验
选择未检出大环内酯类抗生素的水质样品作为空白基质样品，分别添加3个浓度水平的混合标准溶液，进行加标回收实验。每个浓度水平做6个平行样品，结果见表2。实验结果表明，在3个添加水平下，13种大环内酯类平均回收率在79.6 %~100.3 %之间，相对标准偏差小于8.34%。
表2 加标回收率及相对标准偏差（n=6）
实施例4
大环内酯类抗生素为弱碱性化合物，pKa值在7~9之间，在中性条件下部分离子化，与C18的硅羟基结合较强，难以洗脱，应在碱性条件下进行富集。但pH>11时大环内酯类抗生素内酯环容易破裂。因此，将样品pH调节为7~10，添加标准物质后按照前处理方法富集洗脱，结果表明pH=10.0时，13种抗生素的回收率都较高，在79.4~104.7%之间，结果最优。具体的，按本发明所述方法选择不同pH条件下13种抗生素的回收率如图2所示。
实施例5：液相色谱条件的优化
本发明考察了不同流动相对目标物的影响，甲醇-水体系中大环内酯类抗生素出峰较晚且峰形宽，在乙腈-水体系下分析时间较短且峰形好，尝试在水相中添加0.005mol/L乙酸铵和0.1%甲酸以提高离子化效率，大环内酯类药物峰形尖锐对称，灵敏度高，如附图1所示。
实施例6：质谱条件的优化
静电场轨道阱质谱具有精确分子量的功能，采用FullMS+ddms2进行检测，在一级全扫描数据中，提取准分子离子精确质量数，得到提取离子流图，采用峰面积进行定量。当目标物一级离子响应达到阈值时，仪器自动触发二级扫描，得到二级离子全扫描谱图，根据二级谱图中特征子离子精确质量数可完成化合物确证。大环内酯类抗生素含有胺基，容易质子化，在正离子模式下有明显的[M+H]+峰，因此在正离子模式下进行分析。
在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5%以内，且检测到母离子与二级碎片离子的精确质量数与理论值相对偏差小于5ppm可以确证该化合物。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述方法为：量取水样，用氨水调节pH=7~10，加入Na2EDTA、异丙醇，混匀，C18固相萃取膜依次用甲醇、水预处理，水样以45-55 mL/min流速过膜，水淋洗固相萃取膜，去除残留水分，甲醇洗脱，洗脱液吹干，加入甲醇，旋涡混合溶解残渣，经滤膜过滤后，用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行测定；其中，所述13种大环内酯类抗生素为红霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉、克拉霉素、竹桃霉素、阿奇霉素、螺旋霉素、泰乐霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素、替米考星。
2.根据权利要求1所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述方法为：量取500 mL水样，用氨水调节pH=7~10，加入0.2g Na2EDTA，5 mL异丙醇，混匀，C18固相萃取膜依次用5 mL甲醇、5 mL水预处理，水样以50 mL/min流速过膜，10mL水淋洗固相萃取膜，减压抽干去除残留水分，10 mL甲醇洗脱，洗脱液在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL 20 %甲醇，旋涡混合溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤后，用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱进行测定。
3.根据权利要求1或2所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述水样用氨水调节pH=9.5~10.5。
4.根据权利要求4所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述水样用氨水调节pH=10。
5.根据权利要求1所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：C18，规格为1.9μm，2.1mm×100mm
流动相：A—乙腈；B—0.005 mol/L含0.1 %甲酸的乙酸铵
流动相梯度洗脱程序如下
柱温：35℃
进样量：20μL。
6.根据权利要求1所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源
喷雾电压：3200V
鞘气：40Arb
辅助气：10Arb
离子传输管温度：320℃
扫描模式：一级全扫描+数据依赖二级扫描（FullMS+ddms2）
一级扫描：扫描范围m/z 150~1500，分辨率70000，AGC target为3e6，驻留时间200ms
二级扫描：分辨率17500，AGC target为2e5，驻留时间50ms，归一化碰撞能量35eV。
7.根据权利要求1所述的水中13种大环内酯类抗生素的高分辨质谱检测方法，其特征在于，所述测定中针对13种大环内酯类抗生素的质谱参数如下：
。
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