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CN111770757A - 诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法 - Google Patents

诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法 Download PDF

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CN111770757A
CN111770757A CN201880074378.2A CN201880074378A CN111770757A CN 111770757 A CN111770757 A CN 111770757A CN 201880074378 A CN201880074378 A CN 201880074378A CN 111770757 A CN111770757 A CN 111770757A
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polynucleic acid
cases
acid molecule
exon
acid conjugate
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CN201880074378.2A
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English (en)
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亚瑟·A·莱文
安德鲁·约翰·吉尔
迈克尔·卡拉米安·科克伦
黄汉华
文卡塔·拉马纳·多帕拉普迪
罗伯·伯克
比亚特丽丝·戴安娜·达里蒙特
石云雨
雷切尔·约翰斯
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Avidity Biosciences Inc
Original Assignee
Avidity Biosciences Inc
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Abstract

本文公开了在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的分子和药物组合物。本文描述的还包括治疗疾病或病症的方法，其包括在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的分子或药物组合物。

Description

诱导外显子跳读的核酸-多肽组合物和方法
交叉引用
本申请要求于2017年9月22日提交的第62/561,939号美国临时申请和2018年7月11日提交的第62/696,766号美国临时申请的权益，其中每一个通过引用整体并入本文。
背景技术
RNA功能的调节是不断发展中的具有治疗意义的领域。影响mRNA稳定性的药物，如反义寡核苷酸和短干扰RNA，是调节RNA功能的一种方式。另一组寡核苷酸可以通过改变前mRNA的加工来调节RNA功能，以在最终基因产物——编码的蛋白质中包括或从中排除前mRNA的特定区域。因此，寡核苷酸治疗剂代表调节疾病状态的蛋白质表达的手段，因此具有作为治疗剂的用途。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了用于调节RNA加工的分子和药物组合物。在一些实施方案中，本文还公开了用于治疗肌营养不良症的分子和药物组合物。
在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的受试者中由错误剪接的mRNA转录物引起的疾病或病症的方法，该方法包括：向该受试者施用多核酸分子缀合物；其中所述多核酸分子缀合物缀合至细胞靶向结合部分；其中多核苷酸任选地包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分；其中所述多核酸分子缀合物在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以在错误剪接的mRNA转录物中诱导外显子跳读(exon skipping)或外显子包含(exon inclusion)，从而生成完全加工的mRNA转录物；并且其中所述完全加工的mRNA转录物编码功能性蛋白质，从而治疗所述受试者的所述疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症的特征还在于所述mRNA中的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的外显子跳读。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子23的外显子跳读。在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(I)的缀合物：
A-X-B
式I
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；且
X为键或第一连接体。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(II)的缀合物：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(III)的缀合物：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)或肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在一些实施方案中，所述至少一个反向脱碱基部分是至少一个末端。在一些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约10个至约30个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少以下之一：约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约90％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约70％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约15％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含单链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含两条或更多条链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为RNA分子。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸为siRNA分子。在一些实施方案中，X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在一些实施方案中，X为键。在一些实施方案中，X为C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X为同双官能连接体或异双官能连接体，其任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或者骆驼科抗体或其结合片段。在一些实施方案中，C为聚乙二醇。在一些实施方案中，C具有约5000Da的分子量。在一些实施方案中，A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。在一些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。在一些实施方案中，A-X、Y-C或其组合缀合至核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，方法进一步包括D。在一些实施方案中，D缀合至C或A。在一些实施方案中，D根据式(IV)缀合至式(II)的分子缀合物：
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
式IV
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；
Y为键或第二连接体；
L为键或第三连接体；
D为内体溶解(endosomolytic)部分；且
c为0至1的整数；并且
其中所述多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或反向脱碱基部分；并且D缀合在A、B或C上的任何地方。
在一些实施方案中，D为INF7或蜂毒肽。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些实施方案中，L为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在一些实施方案中，所述至少第二结合部分A缀合至A、B或C。
在一些实施方案中，本文公开了在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以在错误剪接的mRNA转录物中诱导外显子跳读或外显子包含的方法，该方法包括：使靶细胞与多核酸分子缀合物接触，其中多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或至少一个反向脱碱基部分；使所述多核酸分子缀合物与靶细胞内错误剪接的mRNA转录物杂交，以在所述错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，从而诱导外显子跳读或外显子包含，其中所述错误剪接的mRNA转录物能够编码功能形式的蛋白质；并且从前一步的完全加工的mRNA转录物翻译所述功能形式的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶细胞是受试者的靶细胞。在一些实施方案中，所述错误剪接的mRNA转录物进一步诱导疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症的特征还在于所述mRNA中的一个或多个突变。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是杜氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的外显子跳读。在一些实施方案中，所述外显子跳读是DMD基因的外显子23的外显子跳读。在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(I)的缀合物：
A-X-B
式I
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；且
X为键或第一连接体。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(II)的缀合物：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在一些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(III)的缀合物：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含锁定核酸(LNA)、亚乙基核酸(ENA)、肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。在一些实施方案中，所述至少一个反向脱碱基部分是至少一个末端。在一些实施方案中，所述至少一个修饰的核苷酸间连接包括硫代磷酸酯连接或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约10个至约30个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少以下之一：约15至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23或约20至约22个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少约16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约90％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约70％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约15％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含单链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含两条或更多条链。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和与所述第一多核苷酸杂交以形成双链多核酸分子的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含至少一个修饰。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是RNA分子。在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是siRNA分子。在一些实施方案中，X和Y独立地为键、可降解连接体、不可降解连接体、可切割连接体或非聚合连接体基团。在一些实施方案中，X为键。在一些实施方案中，X为C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X为同双官能连接体或异双官能连接体，任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，Y为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，所述结合部分是抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或者骆驼科抗体或其结合片段。在一些实施方案中，C为聚乙二醇。在一些实施方案中，C具有约5000Da的分子量。在一些实施方案中，A-X缀合至B的5’端且Y-C缀合至B的3’端。在一些实施方案中，Y-C缀合至B的5’端且A-X缀合至B的3’端。在一些实施方案中，A-X、Y-C或其组合缀合至所述核苷酸间连接基团。在一些实施方案中，方法进一步包括D。在一些实施方案中，D缀合至C或A。在一些实施方案中，D根据式(IV)缀合至式(II)的分子缀合物：
(A-X-B-Y-Cc)-L-D
式IV
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；
Y为键或第二连接体；
L为键或第三连接体；
D为内体溶解部分；且
c为0至1的整数；并且
其中多核苷酸包含至少一个2’修饰的核苷酸、至少一个修饰的核苷酸间连接或反向脱碱基部分；并且D缀合在A、B或C上的任何地方。
在一些实施方案中，D为INF7或蜂毒肽。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些实施方案中，L为同双官能连接体或异双官能连接体。在一些实施方案中，方法进一步包括至少第二结合部分A。在一些实施方案中，所述至少第二结合部分A缀合至A、B或C。在一些实施方案中，所述方法是体内方法。在一些实施方案中，所述方法是体外方法。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了包含通过任一种本文公开的方法获得的分子和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为纳米颗粒制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外、口服、鼻内、颊部、直肠或透皮给药。
在某些实施方案中，本文公开了包含多核酸分子缀合物的组合物，其中所述多核酸分子缀合物包含含有与SEQ ID NO:45-963具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本文公开了包含多核酸分子缀合物的组合物，其中所述多核酸分子缀合物包含含有与SEQ ID NO:45-963具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(I)的缀合物：
A-X-B
式I
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；且
X为键或第一连接体。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(II)的缀合物：
A-X-B-Y-C
式II
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在某些实施方案中，所述多核酸分子缀合物是式(III)的缀合物：
A-X-C-Y-B
式III
其中，
A为结合部分；
B为多核苷酸；
C为聚合物；
X为键或第一连接体；且
Y为键或第二连接体。
在某些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包括吗啉代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个2’修饰的核苷酸包含吗啉代。
在某些实施方案中，本文公开了一种多核酸缀合物，其包含与至少一个多核苷酸分子结合的靶细胞结合部分，所述至少一个多核酸分子与DMD基因的前mRNA转录物的靶区域杂交，其中所述至少一个多核酸分子诱导从前mRNA转录物中剪接出外显子，以生成编码功能性肌养蛋白蛋白质的mRNA转录物。在一些实施方案中，所述功能性肌养蛋白蛋白质是肌养蛋白蛋白质的截短形式。在一些实施方案中，所述靶区域在外显子-内含子接界处，其中所述外显子是将被剪接出的外显子。在一些实施方案中，所述外显子是外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55。在一些实施方案中，所述外显子-内含子接界位于将被剪接出的外显子的5’侧。在一些实施方案中，所述靶区域是所述外显子-内含子接界上游的内含子区域。在一些实施方案中，所述靶区域位于所述外显子-内含子接界上游约500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸。在一些实施方案中，所述外显子-内含子接界位于将被剪接出的外显子的3’侧。在一些实施方案中，所述靶区域是所述外显子-内含子接界下游的内含子区域。在一些实施方案中，所述靶区域位于所述外显子-内含子接界下游约500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶细胞结合部分与两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者八个或更多个多核酸分子结合。在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核酸分子与选自SEQ ID NO:964-1285的序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:964-1285的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述多核酸分子进一步包含1、2、3或4个错配。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1094、1147-1162或1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1076的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1077-1094的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1147-1162的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些实施方案中，所述结合部分包含抗体。在一些实施方案中，所述抗体包括抗转铁蛋白抗体。在一些实施方案中，所述结合部分包含血浆蛋白质。在一些实施方案中，所述多核酸缀合物包含A-(X1-B)n：式(V)，其中，A包含所述结合部分；B由所述多核酸分子组成；X1由键或第一非聚合连接体组成；n为选自1-12的平均值。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含过客链和指导链。在一些实施方案中，所述指导链包含至少一个修饰的核苷酸间连接、至少一个反向脱碱基部分、至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸或其组合。在一些实施方案中，所述指导链包含约2、3、4、5、6、7、8或9个硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述指导链包含1个硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸位于所述多核苷酸的核苷酸间连接处。在一些实施方案中，所述至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸位于距所述指导链的5’末端约1、2、3、4或5个碱基处。在一些实施方案中，所述至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸在2’-位进一步被修饰。在一些实施方案中，所述2’-修饰选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述过客链包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述过客链包含100％的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述过客链的长度短于所述指导链，从而产生5’突出端、3’突出端或其组合。在一些实施方案中，所述过客链的长度与所述指导链的长度相等，从而在所述多核酸分子的每个末端产生平末端。在一些实施方案中，所述多核酸分子是二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物/RNA异源双链体。在一些实施方案中，所述过客链包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个肽核酸修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述过客链包含100％的肽核酸修饰的非天然核苷酸。在一些实施方案中，所述过客链的长度短于所述指导链，从而产生5’突出端、3’突出端或其组合。在一些实施方案中，所述过客链的长度与所述指导链的长度相等，从而在所述多核酸分子的每个末端产生平端。在一些实施方案中，所述多核酸分子是肽核酸/RNA异源双链体。在一些实施方案中，所述过客链缀合至A-X1。在一些实施方案中，A-X1缀合至所述过客链的5’端。在一些实施方案中，A-X1缀合至所述过客链的3’端。在一些实施方案中，X1为键。在一些实施方案中，X1为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X1为同双官能连接体或异双官能连接体，其任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，所述多核酸缀合物进一步包含C。在一些实施方案中，C为聚乙二醇。在一些实施方案中，C经由X2直接缀合至B。在一些实施方案中，X2由键或第二非聚合连接体组成。在一些实施方案中，X2为键。在一些实施方案中，X2为C1-C6烷基。在一些实施方案中，X2为同双官能连接体或异双官能连接体，其任选地缀合至C1-C6烷基。在一些实施方案中，所述过客链缀合至A-X1和X2-C。在一些实施方案中，A-X1缀合至所述过客链的5’端，并且X2-C缀合至所述过客链的3’端。在一些实施方案中，X2-C缀合至所述过客链的5’端，并且A-X1缀合至所述过客链的3’端。在一些实施方案中，所述多核酸缀合物包含：A-X1-(B-X2-C)n；式(VI)，其中，A包含所述结合部分；B由所述多核酸分子组成；C由聚合物组成；X1由键或第一非聚合连接体组成；X2由键或第二非聚合连接体组成；且n为选自1-12的平均值。在一些实施方案中，所述多核酸缀合物进一步包含D。在一些实施方案中，D为内体溶解部分。
在某些实施方案中，本文公开了一种多核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:1056-1058或1087-1089的碱基序列的至少23个连续碱基，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
在某些实施方案中，本文公开了一种包含SEQ ID NO:1056-1058的多核酸分子，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
在某些实施方案中，本文公开了一种包含SEQ ID NO:1087-1089的多核酸分子，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
在某些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含：本文所述的多核酸缀合物或本文所述的多核酸分子；和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于全身递送。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外给药。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗有需要的受试者中以缺陷mRNA为特征的疾病或病况，其包括：向所述受试者施用本文所述的多核酸缀合物或本文所述的多核酸分子，以诱导外显子的跳读，该外显子跳读导致所述缺陷mRNA产生编码功能性蛋白质的经加工的mRNA，从而治疗所述受试者的所述疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况是神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些实施方案中，所述神经肌肉疾病是肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括：向所述受试者施用本文所述的多核酸缀合物或本文所述的多核酸分子，从而治疗所述受试者的所述肌营养不良症。在一些实施方案中，所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的多核酸缀合物或本文所述的多核酸分子的试剂盒。
在某些实施方案中，本文公开了包含通过任一种本文公开的方法获得的分子的试剂盒。
附图说明
图1描绘了末端核苷酸扩展的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)序列。
图2A描绘了末端核苷酸扩展的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)序列。
图2B描绘了充分扩展的硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)序列。
图3描绘了使用Taqman qPCR对总RNA中跳读的DMD mRNA进行定量的方法。
图4描绘了用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的抗CD71 mAb-PMO反应混合物的色谱图。
图5A描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。
图5B描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的色谱图。
图5C描绘了使用大小排阻色谱(SEC)方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR>2的色谱图。
图6A描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的抗CD71 mAb的色谱图。
图6B描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMODAR 1,2缀合物的色谱图。
图6C描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMODAR>2缀合物的色谱图。
图7A描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)方法3对抗CD71 Fab-PMO进行快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化的色谱图。
图7B描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab的色谱图。
图7C描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR1缀合物的色谱图。
图7D描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。
图7E描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。
图7F描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab的色谱图。
图7G描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。
图7H描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。
图7I描绘了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。
图8A描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO反应混合物的色谱图。
图8B描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。
图8C描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。
图8D描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2缀合物的色谱图。
图8E描绘了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。
图8F描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。
图8G描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2缀合物的色谱图。
图8H描绘了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。
图9描绘了使用PMO和抗CD71 mAb-PMO缀合物检测分化C2C12细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图10描绘了使用PMO、抗CD71 mAb-PMO和抗CD71 Fab-PMO缀合物检测分化C2C12细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图11描绘了使用PMO、ASO、DAR1的缀合抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR1”)、DAR2的缀合抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR2”)和DAR3的缀合抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR3”)检测分化C2C12细胞中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图12A描绘了检测野生型小鼠腓肠肌中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶，该小鼠施用了抗CD71 mAb-PMO缀合物的单次静脉内注射。
图12B是来自腓肠肌的PCR产物的定量图。
图12C是使用Taqman qPCR对来自野生型小鼠腓肠肌的体内外显子跳读进行定量的图。
图13A描绘了在单次静脉内注射后检测野生型小鼠心肌中的外显子23跳读的巢式PCR的琼脂糖凝胶。
图13B是来自心肌的PCR产物的定量图。
图14描绘了来自跳读的和野生型PCR产物的DNA片段的测序数据。
图15示出了靶向人DMD前mRNA中外显子45的不同长度的外显子跳读PMO在转染的原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
图16示出了hTfR1.mAb-PMO缀合物在体外与人转铁蛋白受体的结合。
图17示出了hTfR1.mAb-PMO缀合物在原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
图18示出了hTfR1.mAb-PMO缀合物在原代和无限增殖化人骨骼肌细胞的肌管中的外显子跳读活性。
具体实施方式
核酸(例如，RNAi)疗法是具有高选择性和特异性的靶向疗法。然而，在一些情况下，核酸疗法也受到细胞内摄取不良、靶细胞中的细胞内浓度不足和低效力的阻碍。为了解决这些问题，探索了核酸组合物的各种修饰，例如，用于更好稳定和/或降低毒性的新型连接体，用于提高靶标特异性和/或靶标递送的结合部分的优化，以及用于提高稳定性和/或降低脱靶效应的核酸聚合物修饰。
在一些情况下，使用寡核苷酸的一个这样的领域是用于治疗肌营养不良症。肌营养不良症包括数种影响肌肉的疾病。杜氏肌营养不良症是一种严重的肌营养不良症形式，由DMD基因中的突变引起。在一些情况下，DMD基因中的突变破坏翻译阅读框并导致无功能的肌养蛋白(dystrophin)。
在某些实施方案中，本文描述了涉及核酸疗法以在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变以诱导外显子跳读或外显子包含的方法和组合物，其用来恢复翻译阅读框。在一些实施方案中，本文描述的还包括用于治疗以错误加工的mRNA转录物为特征的疾病或病症的方法和组合物，其中在除去外显子后，该mRNA能够编码功能性蛋白质，从而治疗该疾病或病症。在另外的实施方案中，本文描述的包括用于治疗该疾病或病症的药物组合物和试剂盒。
RNA加工
RNA在基因表达和细胞生理学的调节中具有重要作用。RNA的适当加工对于功能蛋白质的翻译是至关重要的。RNA加工的改变，如RNA的错误剪接的结果，可导致疾病。例如，剪接位点的突变导致过早终止密码子的暴露、外显子的丢失或内含子的包含。在一些情况下，RNA加工的改变导致插入、缺失或复制。在一些情况下，RNA加工的改变导致外显子的插入、缺失或复制。在一些情况下，RNA加工的改变导致内含子的插入、缺失或复制。
外显子跳读
外显子跳读是RNA剪接的一种形式。在一些情况下，当外显子被跳过或从加工的mRNA中剪接出来时发生外显子跳读。作为外显子跳读的结果，加工的mRNA不含有跳读的外显子。在一些情况下，外显子跳读导致表达改变的产物。
在一些情况下，使用反义寡核苷酸(AON)来诱导外显子跳读。在一些情况下，AON是与特定mRNA或前mRNA序列结合的短核酸序列。例如，AON结合剪接位点或外显子增强子。在一些情况下，AON与特定mRNA或前mRNA序列的结合生成双链区。在一些情况下，双链区的形成发生在剪接体或与剪接体缔合的蛋白质通常会结合的位点处，并导致外显子被跳过。在一些情况下，外显子的跳读导致转录物阅读框的恢复并允许产生部分功能性蛋白质。
外显子包含
在一些情况下，RNA中的突变导致外显子跳读。在一些情况下，突变是剪接位点处、剪接位点附近和距剪接位点一定距离中的至少一种。在一些情况下，突变导致剪接位点失活或弱化、破坏外显子剪接增强子或内含子剪接增强子以及产生外显子剪接沉默子或内含子剪接增强子中的至少一个。在一些情况下，突变改变RNA的二级结构。在一些情况下，突变改变RNA的二级结构导致破坏对外显子识别至关重要的信号的可及性。
在一些情况下，AON的使用会导致包含跳读的外显子。在一些情况下，AON与剪接位点、剪接位点附近的位点和远离剪接位点的位点中的至少一个结合。在一些情况下，AON在RNA中的位点处结合，以防止外显子剪接增强子或内含子剪接增强子的破坏。在一些情况下，AON在RNA中的位点处结合，以防止产生外显子剪接沉默子或内含子剪接沉默子。
适应症
一些实施方案中，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗以缺陷mRNA为特征的疾病或病症。在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于通过在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变来诱导外显子跳读或外显子包含而治疗疾病或病症。
大部分人类蛋白质编码基因被选择性地剪接。在一些情况下，突变导致不正确的剪接或部分剪接的mRNA。例如，突变位于蛋白质编码基因中的剪接位点、沉默子或增强子序列、外显子序列或内含子序列中的至少一个中。在一些情况下，突变导致基因功能障碍。在一些情况下，突变导致疾病或病症。
在一些情况下，由不正确剪接或部分剪接的mRNA引起的疾病或病症包括但不限于神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
在一些情况下，遗传性疾病或病症包括常染色体显性病症、常染色体隐性病症、X连锁显性病症、X连锁隐性病症、Y连锁病症、线粒体疾病或多因素或多基因病症。
在一些情况下，诸如高胆固醇血症的心血管疾病由不正确剪接或部分剪接的mRNA引起。在高胆固醇血症中，已经显示低密度脂蛋白受体(LDLR)的外显子12中的单核苷酸多态性促进外显子跳读。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致癌症。例如，不正确剪接或部分剪接的mRNA影响与癌症有关的细胞过程，包括但不限于增殖、运动性和药物反应。在一些情况下是实体癌症或血液学癌症。在一些情况下，该癌症是膀胱癌、肺癌、脑癌、黑素瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肝癌或子宫癌。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致神经肌肉疾病或病症。示例性的神经肌肉疾病包括肌营养不良症，如杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良。在一些情况下，肌营养不良症是遗传性的。在一些情况下，肌营养不良症是由自发突变引起的。贝克肌营养不良症和杜氏肌营养不良症已被证明与DMD基因的突变有关，该基因编码肌养蛋白。面肩肱型肌营养不良症已被证明与双同源框4(DUX4)基因的突变有关。
在一些情况下，不正确剪接或部分剪接的mRNA会导致杜氏肌营养不良症。杜氏肌营养不良症导致严重的肌无力，并且由DMD基因的突变引起，其阻止了功能性肌养蛋白的产生。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中的外显子突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中外显子1、2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是DMD基因中外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53和55中的至少一个的突变的结果。在一些情况下，多个外显子发生突变。例如，外显子48-50的突变在杜氏肌营养不良症患者中是常见的。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是外显子51突变的结果。在一些情况下，杜氏肌营养不良症是外显子23突变的结果。在一些情况下，突变涉及一个或多个外显子的缺失。在一些情况下，突变涉及一个或多个外显子的复制。在一些情况下，突变涉及外显子中的点突变。例如，已经显示一些患者在DMD基因的外显子51中具有无义点突变。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗肌营养不良症。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或药物组合物用于治疗杜氏肌营养不良症。
多核酸分子
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以诱导外显子跳读或外显子包含。在一些情况下，该多核酸分子恢复翻译阅读框。在一些情况下，该多核酸分子产生功能性和截短的蛋白质。
在一些情况下，多核酸分子靶向mRNA序列。在一些情况下，多核酸分子靶向剪接位点。在一些情况下，多核酸分子靶向顺式调节元件。在一些情况下，多核酸分子靶向反式调节元件。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子剪接增强子或内含子剪接增强子。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子剪接沉默子或内含子剪接沉默子。
在一些情况下，多核酸分子靶向在内含子或外显子中发现的序列。例如，多核酸分子靶向在外显子中发现的、介导所述外显子的剪接的序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子识别序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子上游的序列。在一些情况下，多核酸分子靶向外显子下游的序列。
如上所述，多核酸分子靶向错误加工的mRNA转录物，后者导致疾病或病症，不限于神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。在一些情况下，多核酸分子靶向导致神经肌肉疾病或病症的错误加工的mRNA转录物。在一些情况下，神经肌肉疾病或病症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良。在一些情况下，多核酸分子靶向导致杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良的错误加工的mRNA转录物。在一些情况下，多核酸分子靶向导致杜氏肌营养不良症的错误加工的mRNA转录物。
在一些情况下，多核酸分子靶向引起杜氏肌营养不良症的在DMD基因中突变的外显子。引起杜氏肌营养不良症的在DMD基因中突变的示例性外显子包括但不限于外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。在一些情况下，多核酸分子靶向与突变的外显子相邻的序列。例如，如果外显子50缺失，则多核酸分子靶向外显子51中的序列，从而跳过外显子51。在另一种情况下，如果在外显子23中存在突变，则多核酸分子靶向外显子22中的序列，从而跳过外显子23。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子8的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子23的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子35的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子43的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子44的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子45的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子48的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子49的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子50的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子51的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子52的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子53的外显子-内含子接界处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向位于DMD基因的外显子55的外显子-内含子接界处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个的5’内含子-外显子接界处或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的5’内含子-外显子接界处或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的5’内含子-外显子接界处或3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个的5’内含子-外显子接界(例如，外显子3的5’内含子-外显子接界是内含子2-外显子3接界)处的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的5’内含子-外显子接界(例如，外显子3的5’内含子-外显子接界是内含子2-外显子3接界)处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子23的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子35的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子43的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子44的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子45的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子50的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子51的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子52的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子53的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子55的5’内含子-外显子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个的3’外显子-内含子接界(例如，外显子3的3’外显子-内含子接界是外显子3-内含子3接界)处的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个的3’外显子-内含子接界(例如，外显子3的3’外显子-内含子接界是外显子3-内含子3接界)处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子8的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子23的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子35的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子43的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子44的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子45的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子50的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子51的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子52的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子53的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与位于DMD基因的外显子55的3’外显子-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53的剪接位点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55的剪接位点。如本文所用的，剪接位点包括规范剪接位点、隐蔽剪接位点或选择性剪接位点，其能够在错误剪接的mRNA转录物中诱导插入、缺失、复制或改变，以诱导外显子跳读或外显子包含。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向部分剪接的mRNA序列，该序列包含与杜氏肌营养不良症有关的其他外显子，如外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63。
在一些情况下，所述多核酸分子与外显子-内含子接界近侧的靶区域杂交。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78上游(或5’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63上游(或5’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55上游(或5’)至少1000nt、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55中的至少一个上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55下游(或3’)至少1000个核苷酸(nt)、500nt、400nt、300nt、200nt、100nt、80nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或5nt处的区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55中的至少一个下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子8内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子23内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子35内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子43内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子44内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子45内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子48内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子49内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子50内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子51内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子52内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子53内的内部区域。在一些情况下，本文所述的多核酸分子靶向DMD基因的外显子55内的内部区域。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78中的至少一个内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63中的至少一个内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55中的至少一个内的靶区域杂交。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向包含DMD基因的外显子44的部分剪接的mRNA序列。在一些情况下，该多核酸分子与外显子44上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子44上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子44下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子44下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子44内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于5’内含子-外显子44接界处或3’外显子44-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向包含DMD基因的外显子45的部分剪接的mRNA序列。在一些情况下，该多核酸分子与外显子45上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子45上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子45下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子45下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子45内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于5’内含子-外显子45接界处或3’外显子45-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向包含DMD基因的外显子51的部分剪接的mRNA序列。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子51下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子51内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于5’内含子-外显子51接界处或3’外显子51-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子靶向包含DMD基因的外显子53的部分剪接的mRNA序列。在一些情况下，该多核酸分子与外显子53上游(或5’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子53上游(或5’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子53下游(或3’)的靶区域杂交。在一些情况下，该多核酸分子与外显子53下游(或3’)约5、10、15、20、50、100、200、300、400或500bp处的靶区域杂交。
在一些情况下，所述多核酸分子与DMD基因的外显子53内的靶区域杂交。在一些情况下，所述多核酸分子与位于5’内含子-外显子53接界处或3’外显子53-内含子接界处的靶区域杂交。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由感兴趣的靶序列组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，第二多核苷酸包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述多核酸分子包含与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第一多核苷酸和与感兴趣的靶序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的第二多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQID NO:964-1285具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ ID NO:964-1285组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1094具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1056-1094组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1147-1162具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1147-1162组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1173-1211具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1173-1211组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1076具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1056-1076组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1077-1094具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1077-1094组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1056-1058具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1056-1058组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少50％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少60％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少70％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少75％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子包含与SEQ ID NO:1087-1089具有至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述多核酸分子由SEQ IDNO:1087-1089组成。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:964-1285的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1094、1147-1162或1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1076的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1077-1094的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1147-1162的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1058的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1087-1089的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。在一些情况下，该多核酸分子进一步包含1、2、3或4个错配。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含指导链和过客链。在一些情况下，该指导链包含与SEQ ID NO:964-1285具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，该指导链包含选自SEQ ID NO:964-1285的序列。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子包含RNA或DNA。在一些情况下，该多核酸分子包含RNA。在一些情况下，RNA包含短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)或核内不均一RNA(hnRNA)。在一些情况下，RNA包含shRNA。在一些情况下，RNA包含miRNA。在一些情况下，RNA包含dsRNA。在一些情况下，RNA包含tRNA。在一些情况下，RNA包含rRNA。在一些情况下，RNA包含hnRNA。在一些情况下，RNA包含siRNA。在一些情况下，该多核酸分子包含siRNA。在一些情况下，该多核酸分子是反义寡核苷酸(ASO)。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、约19至约30、约19至约25、约19至约24、约19至约23、约20至约30、约20至约25、约20至约24、约20至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约35个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约45个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约40个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约35个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个至约20个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约15个至约25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约15个至约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约12个至约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约19个至约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约20个至约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约19个至约25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约20个至约25个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少15个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少18个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少19个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少20个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少21个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少22个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少23个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少24个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为至少30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约35个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约29个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约28个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约27个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约26个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约24个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约23个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约22个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约21个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子的长度为约10个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含第二多核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸为有义链或过客链。在一些情况下，第二多核苷酸为反义链或指导链。
在一些实施方案中，所述多核酸分子为第一多核苷酸。在一些实施方案中，第一多核苷酸的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、约19至约30、约19至约25、约19至约24、约19至约23、约20至约30、约20至约25、约20至约24、约20至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约35个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约45个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约40个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约35个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约10个至约20个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15个至约25个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约15个至约30个核苷酸。在一些情况下，第一多核苷酸的长度为约12个至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子为第二多核苷酸。在一些实施方案中，第二多核苷酸的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10至约30、约15至约30、约18至约30、约18至约25、约18至约24、约19至约23、约19至约30、约19至约25、约19至约24、约19至约23、约20至约30、约20至约25、约20至约24、约20至约23或约20至约22个核苷酸。
在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约45个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约40个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约35个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约20个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约19个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约18个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约17个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约16个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约14个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约13个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约12个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约11个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约50个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约45个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约40个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约35个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约10个至约20个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15个至约25个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约15个至约30个核苷酸。在一些情况下，第二多核苷酸的长度为约12个至约30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含第一多核苷酸和第二多核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子进一步包含平端、突出端或其组合。在一些情况下，该平端为5’平端、3’平端或两者。在一些情况下，该突出端为5’突出端、3’突出端或两者。在一些情况下，该突出端包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1、2、3、4、5或6个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1、2、3或4个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含1个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含2个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含3个非碱基配对核苷酸。在一些情况下，该突出端包含4个非碱基配对核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少50％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少60％互补。在一些实施方案中，多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少70％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少80％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少90％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少95％互补。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列至少99％互补。在一些情况下，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列100％互补。
在一些实施方案中，所述多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有5个或更少的错配。在一些实施方案中，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有4个或更少的错配。在一些情况下，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有3个或更少的错配。在一些情况下，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有2个或更少的错配。在一些情况下，该多核酸分子的序列与本文所述的靶序列具有1个或更少的错配。
在一些实施方案中，与本文所述的靶序列杂交的多核酸分子的特异性是该多核酸分子与靶序列的95％、98％、99％、99.5％或100％序列互补性。在一些情况下，该杂交是高度严格的杂交条件。
在一些实施方案中，所述多核酸分子具有降低的脱靶效应。在一些情况下，“脱靶”或“脱靶效应”是指其中针对给定靶标的多核酸聚合物通过直接或间接地与另一mRNA序列、DNA序列或者细胞蛋白质或其他部分相互作用而引起非预期效应的任何情况。在一些情况下，当由于其他转录物与多核酸分子的有义链和/或反义链之间的部分同源性或互补性而导致其他转录物同时降解时，发生“脱靶效应”。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含天然或合成或人工核苷酸类似物或碱基。在一些情况下，该多核酸分子包含DNA、RNA和/或核苷酸类似物的组合。在一些情况下，该合成或人工核苷酸类似物或碱基在核糖部分、磷酸部分、核苷部分或其组合中的一种或多种处包含修饰。
在一些实施方案中，核苷酸类似物或人工核苷酸碱基包含在核糖部分的2’羟基处具有修饰的核酸。在一些情况下，该修饰包括H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为烷基部分。示例性的烷基部分包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯、仲或叔胺)、酰胺、醚、酯、醇和氧。在一些情况下，该烷基部分进一步包含修饰。在一些情况下，该修饰包括偶氮基团、酮基团、醛基团、羧基、硝基、亚硝基、腈基团、杂环(例如，咪唑、肼基或羟基氨基)基团、异氰酸酯或氰酸酯基团，或者含硫基团(例如，亚砜、砜、硫化物或二硫化物)。在一些情况下，该烷基部分进一步包含杂取代。在一些情况下，杂环基团的碳被氮、氧或硫替代。在一些情况下，杂环取代包括但不限于吗啉代、咪唑和吡咯烷子基(pyrrolidino)。
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-甲基修饰或2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰。在一些情况下，2’-O-甲基修饰向核糖部分的2’羟基添加甲基，而2’O-甲氧基乙基修饰向核糖部分的2’羟基添加甲氧基乙基。腺苷分子的2’-O-甲基修饰和尿苷的2’-O-甲氧基乙基修饰的示例性化学结构如下所示。
Figure BDA0002494424650000521
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-氨基丙基修饰，其中包含丙基连接体的延伸胺基团将胺基团与2’氧结合。在一些情况下，该修饰通过每个糖从胺基团引入一个正电荷来中和寡核苷酸分子的磷酸酯衍生的整体负电荷，从而由于其两性离子性质来改善细胞摄取性质。2’-O-氨基丙基核苷亚磷酰胺的示例性化学结构如下所示。
Figure BDA0002494424650000522
在一些情况下，2’羟基处的修饰是锁定或桥连的核糖修饰(例如，锁定核酸或LNA)，其中在2’碳处键合的氧分子通过亚甲基与4’碳连接，从而形成2′-C,4′-C-氧基-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。LNA的化学结构的示例性表示如下所示。左侧所示的表示突出了LNA单体的化学连接性。右侧所示的表示突出了LNA单体的呋喃糖环的锁定的3′-内(3E)构象。
Figure BDA0002494424650000531
在一些情况下，2’羟基处的修饰包括亚乙基核酸(ENA)，例如2’-4’-亚乙基桥连的核酸，其将糖构象锁定为C3’-内糖折叠(puckering)构象。ENA是桥连核酸类别的修饰核酸的一部分，该修饰核酸也包含LNA。ENA和桥连核酸的示例性化学结构如下所示。
Figure BDA0002494424650000532
在一些实施方案中，2’羟基处的其他修饰包括2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
在一些实施方案中，核苷酸类似物包含修饰的碱基，诸如但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和其他在5位置处具有修饰的核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基尿苷、7-甲基尿苷、2,2-二甲基尿苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其他硫代碱基如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-烷基化和N-烷基化嘌呤和嘧啶如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羟乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基如氨基酚或2,4,6-三甲氧基苯、充当G夹(clamp)核苷酸的修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。修饰的核苷酸还包括在糖部分被修饰的核苷酸，以及具有非核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，在一些情况下，糖部分是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4’-硫代核糖和其他糖、杂环或碳环。术语核苷酸还包含本领域已知的通用碱基。例如，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。
在一些实施方案中，核苷酸类似物进一步包含吗啉代、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺、1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)或其组合。吗啉代或二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸(PMO)包括其结构模拟天然核酸结构但偏离正常的糖和磷酸酯结构的合成分子。在一些情况下，五元核糖环被含有四个碳、一个氮和一个氧的六元吗啉代环取代。在一些情况下，核糖单体通过二氨基磷酸酯基团而不是磷酸酯基团连接。在这样的情况下，骨架改变去除所有正电荷和负电荷，使得吗啉代中性分子能够穿过细胞膜而无需借助细胞递送剂，诸如带电荷的寡核苷酸所使用的细胞递送剂。
Figure BDA0002494424650000541
在一些实施方案中，肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯连接，并且碱基通过寡聚甘氨酸样分子连接并适当间隔，因此消除了骨架电荷。
Figure BDA0002494424650000551
在一些实施方案中，一个或多个修饰任选地在核苷酸间连接处发生。在一些情况下，修饰的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、5’-甲基膦酸酯、3’-亚烷基膦酸酯、三氟化硼、3’-5’连接或2’-5’连接的硼烷磷酸酯和硒基磷酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯、氢膦酸酯键、烷基膦酸酯、烷基硫代磷酸酯、芳基硫代磷酸酯、硒化磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒化磷酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、3’-烷基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、哌嗪磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、酮、砜、磺胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、亚甲基肼(methylenehydrazo)、亚甲基二甲基亚肼(methylenedimethylhydrazo)、formacetal、硫代甲缩醛、肟、亚甲基亚胺、亚甲基甲基亚胺、硫代酰胺、具有核糖乙酰基的连接、氨乙基甘氨酸、甲硅烷基或硅氧烷连接、具有或不具有杂原子的烷基或环烷基连接，例如，1至10个饱和或不饱和的和/或取代的和/或含有杂原子的碳，具有吗啉代结构、酰胺或聚酰胺的连接，其中碱基直接或间接地连接到骨架的氮杂氮，及其组合。硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)是包含硫代磷酸酯连接的反义寡核苷酸。示例性的PS ASO如下所示。
Figure BDA0002494424650000561
在一些情况下，所述修饰是甲基或硫醇修饰，如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修饰。示例性的硫醇膦酸酯核苷酸(左)和甲基膦酸酯核苷酸(右)如下所示。
Figure BDA0002494424650000562
在一些情况下，修饰的核苷酸包括但不限于2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺，如下所示：
Figure BDA0002494424650000563
在一些情况下，修饰的核苷酸包括但不限于己糖醇核酸(或1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA))，如下所示：
Figure BDA0002494424650000571
在一些实施方案中，上述核苷酸类似物或人工核苷酸碱基包含在核糖部分的5’羟基处具有修饰的5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸核酸。在一些实施方案中，该5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸选自以下提供的核苷酸，其中X为O或S；且B为杂环碱基部分。
Figure BDA0002494424650000572
在一些情况下，2’羟基处的修饰是2’-O-氨基丙基修饰，其中包含丙基连接体的延伸的胺基团将胺基团与2’氧结合。在一些情况下，这种修饰通过每个糖从胺基团引入一个正电荷来中和寡核苷酸分子的磷酸衍生的总负电荷，并且由于其两性离子性质而改善了细胞摄取性质。
在一些情况下，5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸在锁定或桥接的核糖修饰(例如，锁定核酸或LNA)中的2’羟基处被进一步修饰，其中结合在2’碳上的氧分子通过亚甲基连接至4’碳，从而形成2’-C、4’-C-氧基-亚甲基连接的双环核糖核苷酸单体。5’-乙烯基膦酸酯修饰的LNA的化学结构的示例性表示如下所示，其中X为O或S；B为杂环碱基部分；并且J为连接至多核苷酸的相邻核苷酸的核苷酸间连接基团。
Figure BDA0002494424650000581
在一些实施方案中，2’羟基处的另外的修饰包括2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
在一些实施方案中，核苷酸类似物包含修饰的碱基，诸如但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和其他在5位置处具有修饰的核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基尿苷、7-甲基尿苷、2,2-二甲基尿苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸(如7-脱氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷或6-偶氮胸苷)、5-甲基-2-硫尿苷、其他硫代碱基(如2-硫代尿苷、4-硫代尿苷和2-硫代胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和取代的萘基、任何O-烷基化和N-烷基化嘌呤和嘧啶(如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羟乙酸、吡啶-4-酮或吡啶-2-酮)、苯基和修饰的苯基如氨基酚或2,4,6-三甲氧基苯、充当G夹(clamp)核苷酸的修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸还包括在糖部分被修饰的核苷酸，以及具有非核糖基的糖或其类似物的5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸。例如，在一些情况下，糖部分是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4’-硫代核糖和其他糖、杂环或碳环。术语核苷酸还包含本领域已知的通用碱基。例如，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。
在一些实施方案中，5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸类似物进一步包含吗啉代、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)。吗啉代或二氨基磷酸酯吗啉代寡核苷酸(PMO)包括其结构模拟天然核酸结构但偏离正常的糖和磷酸酯结构的合成分子。在一些情况下，五元核糖环被含有四个碳、一个氮和一个氧的六元吗啉代环取代。在一些情况下，核糖单体通过二氨基磷酸酯基团而不是磷酸酯基团连接。在这样的情况下，骨架改变去除所有正电荷和负电荷，使得吗啉代中性分子能够穿过细胞膜而无需借助细胞递送剂，诸如带电荷的寡核苷酸所使用的细胞递送剂。5’-乙烯基膦酸酯修饰的吗啉代寡核苷酸的非限制性实例如下所示，其中X为O或S；且B为杂环碱基部分。
Figure BDA0002494424650000591
在一些实施方案中，以上描述的5’-乙烯基膦酸酯修饰的吗啉代或PMO是包含正电荷或阳离子电荷的PMO。在一些情况下，该PMO是FMOplus(Sarepta)。FMOplus是指包含任何数目的(1-哌嗪子基)亚膦酰亚基氧基、(1-(4-(ω-胍基-链烷酰基))-哌嗪子基)亚膦酰亚基氧基连接的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(例如，如在PCT公开WO2008/036127中描述的那些)。在一些情况下，该PMO是美国专利7943762中描述的PMO。
在一些实施方案中，以上描述的吗啉代或PMO是PMO-X(Sarepta)。在一些情况下，PMO-X是指包含至少一个连接或至少一个所公开的末端修饰的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物，如PCT公开WO2011/150408和美国公开2012/0065169中描述的那些。
在一些实施方案中，以上描述的吗啉代或PMO是如美国公开2014/0296321的表5中描述的PMO。
5’-乙烯基膦酸酯修饰的核酸的化学结构的示例性表示如下所示，其中X为O或S；B为杂环碱基部分；且J为核苷酸间连接。
Figure BDA0002494424650000601
在一些实施方案中，肽核酸(PNA)不含糖环或磷酸酯连接，并且碱基通过寡聚甘氨酸样分子连接并适当间隔，因此消除了骨架电荷。
Figure BDA0002494424650000602
在一些实施方案中，5’-乙烯基膦酸酯修饰的寡核苷酸的一个或多个修饰任选地在核苷酸间连接处发生。在一些情况下，修饰的核苷酸间连接包括但不限于硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；甲基膦酸酯；5’-亚烷基膦酸酯；5’-甲基膦酸酯；3’-亚烷基膦酸酯；三氟化硼；3’-5’连接或2’-5’连接的硼烷磷酸酯和硒基磷酸酯；磷酸三酯；硫羰基烷基磷酸三酯；氢膦酸酯键；烷基膦酸酯；烷基硫代磷酸酯；芳基硫代磷酸酯；硒化磷酸酯(phosphoroselenoate)；二硒化磷酸酯；次膦酸酯；氨基磷酸酯；3’-烷基氨基磷酸酯；氨基烷基氨基磷酸酯；硫羰基氨基磷酸酯；哌嗪磷酸酯；苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)；苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)；酮；砜；磺胺；碳酸酯；氨基甲酸酯；亚甲基肼(methylenehydrazo)；亚甲基二甲基亚肼(methylenedimethylhydrazo)；formacetal；硫代甲缩醛；肟；亚甲基亚胺；亚甲基甲基亚胺；硫代酰胺；具有核糖乙酰基的连接；氨乙基甘氨酸；甲硅烷基或硅氧烷连接；具有或不具有杂原子的烷基或环烷基连接，例如，1至10个饱和或不饱和的和/或取代的和/或含有杂原子的碳；具有吗啉代结构、酰胺或聚酰胺的连接，其中碱基直接或间接地连接到骨架的氮杂氮；及其组合。
在一些情况下，所述修饰是甲基或硫醇修饰，如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修饰。示例性的硫醇膦酸酯核苷酸(左)、二硫代磷酸酯(中)和甲基膦酸酯核苷酸(右)如下所示。
Figure BDA0002494424650000611
在一些情况下，5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸包括但不限于如下所示的亚磷酰胺：
Figure BDA0002494424650000612
在一些情况下，修饰的核苷酸间连接是二氨基磷酸酯连接。与吗啉代体系的二氨基磷酸酯连接的非限制性实例如下所示。
Figure BDA0002494424650000613
在一些情况下，修饰的核苷酸间连接是甲基膦酸酯连接。甲基膦酸酯连接的非限制性实例如下所示。
Figure BDA0002494424650000621
在一些情况下，修饰的核苷酸间连接是酰胺连接。酰胺连接的非限制性实例如下所示。
Figure BDA0002494424650000622
在一些情况下，5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸包括但不限于以下所示的修饰的核酸。
在一些实施方案中，一个或多个修饰包括修饰的磷酸骨架，其中该修饰产生中性或不带电荷的骨架。在一些情况下，磷酸骨架通过烷基化来修饰，以产生不带电荷的或中性的磷酸骨架。如本文所用的，烷基化包括甲基化、乙基化和丙基化。在一些情况下，如本文在烷基化的上下文中所使用的，烷基是指含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基。在一些情况下，示例性烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基和2-乙基丁基。在一些情况下，修饰的磷酸酯是如美国专利9481905所述的磷酸基团。
在一些实施方案中，另外的修饰的磷酸骨架包含甲基膦酸酯、乙基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯或甲氧基膦酸酯。在一些情况下，修饰的磷酸酯是甲基膦酸酯。在一些情况下，修饰的磷酸酯是乙基膦酸酯。在一些情况下，修饰的磷酸酯是甲基硫代膦酸酯。在一些情况下，修饰的磷酸酯是甲氧基膦酸酯。
在一些实施方案中，一个或多个修饰进一步任选地包括核糖部分、磷酸骨架和核苷的修饰，或者3’或5’末端处的核苷酸类似物的修饰。例如，3’末端任选地包含3’阳离子基团，或用3’-3’连接在3’末端处反转核苷。在另一替代方案中，3’末端任选地与氨基烷基缀合，例如3’C5-氨基烷基dT。在另一替代方案中，3’末端任选地与脱碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。在一些情况下，5’末端与氨基烷基缀合，例如与5’-O-烷基氨基取代基缀合。在一些情况下，5’末端与脱碱基位点缀合，例如与脱嘌呤或脱嘧啶位点缀合。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含一个或多个本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，该多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，该人工核苷酸类似物包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。在一些情况下，该多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个人工核苷酸类似物，该人工核苷酸类似物选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。在一些情况下，该多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25个或更多个硫醇膦酸酯核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物或多个肽核酸修饰的非天然核苷酸，并且任选地包含至少一个反向脱碱基部分。在一些情况下，该多核酸分子包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20个或更多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含100％的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。
在一些情况下，该多核酸分子包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个肽核酸修饰的非天然核苷酸。在一些情况下，该多核酸分子包含100％的肽核酸修饰的非天然核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含一个或多个核苷酸类似物，其中每个核苷酸类似物为立体化学异构形式。在这样的情况下，该多核酸分子是手性分子。在一些情况下，该核苷酸类似物包含骨架立体化学。在另外的情况下，该核苷酸类似物包括美国专利9,982,257、9,695,211或9,605,019中描述的手性类似物。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约5％至约100％的修饰、约10％至约100％的修饰、约20％至约100％的修饰、约30％至约100％的修饰、约40％至约100％的修饰、约50％至约100％的修饰、约60％至约100％的修饰、约70％至约100％的修饰、约80％至约100％的修饰和约90％至约100％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约90％的修饰、约20％至约90％的修饰、约30％至约90％的修饰、约40％至约90％的修饰、约50％至约90％的修饰、约60％至约90％的修饰、约70％至约90％的修饰和约80％至约100％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约80％的修饰、约20％至约80％的修饰、约30％至约80％的修饰、约40％至约80％的修饰、约50％至约80％的修饰、约60％至约80％的修饰和约70％至约80％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约70％的修饰、约20％至约70％的修饰、约30％至约70％的修饰、约40％至约70％的修饰、约50％至约70％的修饰和约60％至约70％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约60％的修饰、约20％至约60％的修饰、约30％至约60％的修饰、约40％至约60％的修饰和约50％至约60％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约50％的修饰、约20％至约50％的修饰、约30％至约50％的修饰和约40％至约50％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约40％的修饰、约20％至约40％的修饰和约30％至约40％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少以下之一：约10％至约30％的修饰和约20％至约30％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含约10％至约20％的修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含约15％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的修饰。
在另外的情况下，所述多核酸分子包含至少约15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的修饰。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰。
在一些情况下，所述多核酸分子包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22个或更多个修饰的核苷酸.
在一些情况下，约5％至约100％的所述多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的所述多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约5％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约10％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约15％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约20％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约25％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约30％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约35％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约40％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约45％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约50％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约55％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约60％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约65％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约70％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约75％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约80％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约85％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约90％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约95％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约96％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约97％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约98％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约99％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些情况下，约100％的多核酸分子包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，该人工核苷酸类似物包括2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合。
在一些实施方案中，所述多核酸分子包含约1个至约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约1个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约2个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约3个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约4个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约5个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约6个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约7个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约8个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约9个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约10个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约11个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约12个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约13个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约14个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约15个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约16个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约17个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约18个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约19个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约20个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约21个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约22个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约23个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约24个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。在一些实施方案中，多核酸分子包含约25个修饰，其中该修饰包含本文所述的人工核苷酸类似物。
在一些实施方案中，多核酸分子由两个单独的多核苷酸装配而成，其中一个多核苷酸包含有义链，而第二个多核苷酸包含该多核酸分子的反义链。在其他实施方案中，有义链经由连接体分子与反义链连接，在一些情况下，该连接体分子是多核苷酸连接体或非核苷酸连接体。
一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中的嘧啶核苷酸包含2'-O-甲基嘧啶核苷酸，有义链中的嘌呤核苷酸包含2'-脱氧嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链中存在的嘧啶核苷酸包含2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且其中有义链中存在的嘌呤核苷酸包含2'-脱氧嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中嘧啶核苷酸当存在于所述反义链中时是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，并且其中嘌呤核苷酸当存在于所述反义链中时包含2'-脱氧-嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链在有义链的5’端、3’端或者5’和3’两端包括末端帽部分。在其他实施方案中，该末端帽部分是反向脱氧脱碱基部分。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链在反义链的3’端包含磷酸骨架修饰。在一些情况下，该磷酸骨架修饰是硫代磷酸酯。在一些情况下，过客链比指导链包含更多的硫代磷酸酯修饰。在其他情况下，指导链比过客链包含更多的硫代磷酸酯修饰。在另外的情况下，过客链包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯修饰。在另外的情况下，指导链包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链在反义链的3’端包含甘油基修饰。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，和可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约10个或更多个，特别是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2'-脱氧、2'-O-甲基、2'-脱氧-2'-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)通用碱基碱基修饰的核苷酸，和可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其他实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟代核苷酸进行化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中有义链包含约1个至约25个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其他实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟代核苷酸进行化学修饰，具有或不具有约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或约一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约10个或更多个，特别是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其他实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，具有或不具有一个或多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子包含有义链和反义链，其中反义链包含约1个至约25个或更多个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在有义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子；并且其中反义链包含约1个至约25个或更多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-脱氧-2′-氟代，和/或一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸，以及可选的在反义链的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。在其他实施方案中，有义链和/或反义链的一个或多个，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶核苷酸用2′-脱氧、2′-O-甲基和/或2′-脱氧-2′-氟核苷酸进行化学修饰，具有或不具有约1个至约5个，例如约1、2、3、4、5个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接和/或存在于相同或不同链中的、在3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽分子。
在一些实施方案中，多核酸分子是具有以下一种或多种性质的双链体多核酸分子：更高的肝细胞稳定性，降低的总电荷，减少的肝细胞摄取，或延长的药代动力学。在一些实施方案中，该双链体多核酸分子包含含有多个修饰的过客链(例如，有义链)和指导链(例如，反义链)。
在一些实施方案中，所述双链体多核酸分子包含具有一个或多个上述修饰的指导链(例如，反义链)和具有多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物或多个肽核酸修饰的非天然核苷酸的过客链(例如，有义链)。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子是化学修饰的短干扰核酸分子，其在该多核酸分子的每条链中具有约1个至约25个，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
在另一个实施方案中，本文所述的多核酸分子包含2’-5’核苷酸间连接。在一些情况下，该2’-5’核苷酸间连接位于一条或两条序列链的3’端、5’端或者3’和5’两端。在其他实例中，该2’-5’核苷酸间连接存在于一条或两条序列链内的各个其他位置，例如，多核酸分子的一条或两条链中的嘧啶核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，包括每个核苷酸间连接，包含2’-5’核苷酸间连接，或者多核酸分子的一条或两条链中的嘌呤核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个，包括每个核苷酸间连接，包含2’-5’核苷酸间连接。
在一些实施方案中，多核酸分子是单链多核酸分子，其在细胞或重建的体外系统中介导RNAi活性，其中该多核酸分子包含与靶核酸序列具有互补性的单链多核苷酸，并且其中一个或多个存在于该多核酸中的嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸(例如，其中所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸，或者多个嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟代嘧啶核苷酸)，并且其中该多核酸中存在的任何嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸(例如，其中所有嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸，或者多个嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸)，以及任选地存在于反义序列的3’端、5’端或者3’和5’两端的末端帽修饰，该多核酸分子任选地在多核酸分子的3’端还包含约1个至约4个(例如，约1、2、3或4个)末端2'-脱氧核苷酸，其中该末端核苷酸进一步包含一个或多个(例如，1、2、3或4个)硫代磷酸酯核苷酸间连接，并且其中该多核酸分子任选地还包含末端磷酸基团，例如5’末端磷酸基团。
在一些情况下，与天然多核酸分子相比，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对核酸酶具有抗性，该核酸酶例如是核糖核酸酶如RNA酶H、脱氧核糖核酸酶如DNA酶或者外切核酸酶如5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶。在一些情况下，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺或其组合的人工核苷酸类似物对核酸酶具有抗性，该核酸酶例如是核糖核酸酶如RNA酶H、脱氧核糖核酸酶如DNA酶或者外切核酸酶如5’-3’外切核酸酶和3’-5’外切核酸酶。在一些情况下，2’-O-甲基修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-脱氧修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-脱氧-2’-氟代修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，LNA修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，ENA修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，HNA修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，吗啉代是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，PNA修饰的多核酸分子对核酸酶具有抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，硫醇膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，包含2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子是核酸酶抗性的(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’外切核酸酶或3’-5’外切核酸酶抗性)。在一些情况下，本文所述的5’缀合物抑制5’-3’核酸外切切割。在一些情况下，本文所述的3’缀合物抑制3’-5’核酸外切切割。
在一些实施方案中，相对于等同的天然多核酸分子，本文所述的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。相对于等同的天然多核酸分子，包含2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰、LNA、ENA、PNA、HNA、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸或2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的一种或多种人工核苷酸类似物对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-甲基修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-氨基丙基修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-脱氧修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，T-脱氧-2’-氟代修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，LNA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，ENA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，PNA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，HNA修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，吗啉代修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，甲基膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，硫醇膦酸酯核苷酸修饰的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，相对于等同的天然多核酸分子，包含2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺的多核酸分子对其mRNA靶标具有增加的结合亲和力。在一些情况下，增加的亲和力用较低的Kd、较高的解链温度(Tm)或其组合说明。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子是手性纯的(或立体纯的)多核酸分子，或是包含单一对映体的多核酸分子。在一些情况下，多核酸分子包含L-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子包含D-核苷酸。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的其镜像对映体。在一些情况下，多核酸分子组合物包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的外消旋混合物。在一些情况下，多核酸分子是在美国专利公开2014/194610和2015/211006以及PCT公开WO2015107425中描述的多核酸分子。
在一些实施方案中，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含适体缀合部分。在一些情况下，该适体缀合部分是DNA适体缀合部分。在一些情况下，该适体缀合部分是Alphamer(Centauri Therapeutics)，其包含识别特定细胞表面靶标的适体部分和呈现特定表位以供连接至循环抗体的部分。在一些情况下，进一步修饰本文所述的多核酸分子以包含如美国专利8,604,184、8,591,910和7,850,975中所述的适体缀合部分。
在另外的实施方案中，修饰本文所述的多核酸分子以增加其稳定性。在一些实施方案中，该多核酸分子为RNA(例如，siRNA)。在一些情况下，通过一个或多个上述修饰来修饰多核酸分子以增加其稳定性。在一些情况下，在2’羟基位置处修饰多核酸分子，诸如通过2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰，或者通过锁定或桥连核糖构象(例如，LNA或ENA)修饰多核酸分子。在一些情况下，多核酸分子被2’-O-甲基和/或2’-O-甲氧基乙基核糖修饰。在一些情况下，多核酸分子还包含吗啉代、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和/或2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺以增加其稳定性。在一些情况下，多核酸分子是手性纯的(或立体纯的)多核酸分子。在一些情况下，修饰手性纯的(或立体纯的)多核酸分子以增加其稳定性。为了增加递送稳定性而对RNA的合适的修饰对于技术人员将会是显而易见的。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子具有RNAi活性，其调节由与肌营养不良症有关的基因诸如但不限于DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA编码的RNA的表达。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该双链siRNA分子的一条链包含与DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的核苷酸序列或由DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个编码的RNA或其部分互补的核苷酸序列，并且其中该双链siRNA分子的第二条链包含与DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的核苷酸序列或由DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个编码的RNA或其部分基本相似的核苷酸序列。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约15至25、18至24或19至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约14、17或19个核苷酸。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD、DUX4、DYSF、EMD或LMNA中的至少一个的表达的双链siRNA分子，其中该siRNA分子的每条链包含约19个至约23个核苷酸，并且其中每条链包含与另一条链的核苷酸互补的至少约19个核苷酸。在一些情况下，该RNAi活性发生在细胞内。在其他情况下，该RNAi活性发生在重建的体外系统中。
在一些实施方案中，本文所述的多核酸分子具有调节由DMD基因编码的RNA的表达的RNAi活性。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链siRNA分子，其中该单链siRNA分子包含与DMD的核苷酸序列或由DMD编码的RNA或其部分互补的核苷酸序列。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链siRNA分子，其中该siRNA分子包含约15至25、18至24或19至约23个核苷酸。在一些情况下，本文所述的多核酸分子是下调DMD表达的单链siRNA分子，其中该siRNA分子包含约19个至约23个核苷酸。在一些情况下，该RNAi活性发生在细胞内。在其他情况下，该RNAi活性发生在重建的体外系统中。
在一些情况下，所述多核酸分子是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在一些情况下，所述多核酸分子由两个单独的多核苷酸装配而成，其中一条链是有义链，而另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(例如，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区域为约19、20、21、22、23个或更多个碱基对)；反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，所述多核酸分子由单个寡核苷酸装配而成，其中该多核酸分子的自身互补的有义和反义区通过基于核酸或非基于核酸的连接体连接。
在一些情况下，所述多核酸分子是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。在其他情况下，所述多核酸分子是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中反义区包含与靶核酸中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中该环状多核苷酸在体内或体外加工，以生成能够介导RNAi的活性多核酸分子。在另外的情况下，所述多核酸分子还包含单链多核苷酸，其具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列(例如，在这样的多核酸分子不需要在多核酸分子内存在对应于靶核酸序列的核苷酸序列或其部分时)，其中该单链多核苷酸进一步包含末端磷酸基团，如5’-磷酸(参见例如Martinez等人,2002,Cell.,110,563-574和Schwarz等人,2002,MolecularCell,10,537-568)或5′,3′-二磷酸。
在一些情况下，不对称是线性多核酸分子，其包含反义区、包含核苷酸或非核苷酸的环部分以及包含比反义区更少的核苷酸的有义区，使得有义区具有足够的互补核苷酸，以与反义区发生碱基配对并与环形成双链体。例如，不对称发夹多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19个至约22个核苷酸)和包含约4个至约8个核苷酸的环区域，以及具有约3个至约18个与反义区互补的核苷酸的有义区。在一些情况下，不对称发夹多核酸分子还包含化学修饰的5’末端磷酸基团。在另外的情况下，不对称发夹多核酸分子的环部分包含核苷酸、非核苷酸、连接体分子或缀合物分子。
在一些实施方案中，不对称双链体是具有包含有义区和反义区的两条单独的链的多核酸分子，其中有义区包含比反义区更少的核苷酸，使得有义区具有足够的互补核苷酸，以与反义区发生碱基配对并形成双链体。例如，不对称双链多核酸分子包含长度足以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区(例如约19个至约22个核苷酸)和具有约3个至约18个与反义区互补的核苷酸的有义区。
在一些情况下，通用碱基是指几乎没有区别地与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物。通用碱基的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、唑类羧酰胺和硝基唑衍生物，如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚，如本领域已知的(参见例如Loakes,2001,Nucleic Acids Research,29,2437-2447)。
多核酸分子合成
在一些实施方案中，使用本领域已知的程序，使用化学合成和/或酶促连接反应构建本文所述的多核酸分子。例如，使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸以化学方式合成多核酸分子，该修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或者增加多核酸分子与靶核酸之间形成的双链体的物理稳定性。示例性方法包括在美国专利5,142,047、5,185,444、5,889,136、6,008,400和6,111,086、PCT公开WO2009099942或欧洲公开1579015中描述的那些方法。另外的示例性方法包括在以下文献中描述的那些方法：Griffey等人,“2’-O-aminopropyl ribonucleotides:a zwitterionic modification that enhances theexonuclease resistance and biological activity of antisenseoligonucleotides,”J.Med.Chem.39(26):5100-5109(1997))；Obika等人"Synthesis of2′-O,4′-C-methyleneuridine and-cytidine.Novel bicyclic nucleosides having afixed C3,-endo sugar puckering".Tetrahedron Letters 38(50):8735(1997)；Koizumi,M."ENA oligonucleotides as therapeutics".Current opinion in moleculartherapeutics 8(2):144–149(2006)；和Abramova等人,“Novel oligonucleotideanalogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies:newchemical possibilities,”Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726(2009)。或者，使用表达载体以生物学方式产生多核酸分子，其中多核酸分子已经以反义方向(即，从插入的多核酸分子转录的RNA将会与感兴趣的靶多核酸分子呈反义方向)亚克隆到该表达载体中。
在一些实施方案中，通过串联合成方法合成多核酸分子，其中两条链被合成为由可切割连接体隔开的单个连续寡核苷酸片段或链，随后将其切割以提供单独的片段或链，它们杂交并允许纯化双链体。
在一些情况下，多核酸分子还由两个不同的核酸链或片段装配而成，其中一个片段包括有义区，而第二个片段包括该分子的反义区。
用于并入例如糖、碱基和磷酸修饰的其他修饰方法包括：Eckstein等人,国际公开PCT No.WO 92/07065；Perrault等人Nature,1990,344,565-568；Pieken等人Science,1991,253,314-317；Usman和Cedergren,Trends in Biochem.Sci.,1992,17,334-339；Usman等人,国际公开PCT No.WO 93/15187；Sproat,美国专利5,334,711和Beigelman等人,1995,J.Biol.Chem.,270,25702；Beigelman等人,国际PCT公开No.WO 97/26270；Beigelman等人,美国专利5,716,824；Usman等人,美国专利5,627,053；Woolf等人,国际PCT公开No.WO98/13526；Thompson等人,1998年4月20日提交的U.S.Ser.No.60/082,404；Karpeisky等人,1998,Tetrahedron Lett.,39,1131；Earnshaw和Gait,1998,Biopolymers(Nucleic AcidSciences),48,39-55；Verma和Eckstein,1998,Annu.Rev.Biochem.,67,99-134；和Burlina等人,1997,Bioorg.Med.Chem.,5,1999-2010。这些出版物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入核酸分子中的位置而无需调节催化的一般方法和策略。
在一些情况下，虽然采用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5’-甲基膦酸酯连接对多核酸分子核苷酸间连接的化学修饰改善了稳定性，但过度修饰有时会引起毒性或活性降低。因此，当设计核酸分子时，在一些情况下，这些核苷酸间连接的量被最小化。在这样的情况下，这些连接的浓度的降低导致这些分子的毒性降低、功效提高以及更高的特异性。
核酸-多肽缀合物
在一些实施方案中，多核酸分子进一步缀合至多肽A以供递送至目标部位。在一些情况下，多核酸分子缀合至多肽A和可选的聚合部分。
在一些情况下，至少一个多肽A缀合到至少一个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合到至少一个B以形成A-B缀合物。在一些实施方案中，至少一个A缀合至B的5’末端、B的3’末端、B上的内部位点或其任意组合。在一些情况下，至少一个多肽A缀合到至少两个B。在一些情况下，至少一个多肽A缀合到至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个B。
在一些实施方案中，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而至少一个C在所述至少一个B的相对末端缀合，以形成A-B-C缀合物。在一些情况下，至少一个多肽A在至少一个B的一个末端缀合，而至少一个C在所述至少一个B上的内部位点缀合。在一些情况下，至少一个多肽A直接缀合到至少一个C。在一些情况下，至少一个B通过至少一个C间接缀合到至少一个多肽A，以形成A-C-B缀合物。
在一些情况下，至少一个B和/或至少一个C以及可选的至少一个D缀合到至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个B在末端(例如，5’末端或3’末端)缀合到至少一个多肽A，或者通过内部位点缀合到至少一个多肽A。在一些情况下，至少一个C直接缀合到至少一个多肽A，或者通过至少一个B间接地缀合到至少一个多肽A。如果通过至少一个B间接缀合，则至少一个C与至少一个多肽A在相同的末端缀合在B上、与至少一个多肽A在相对的末端缀合，或者独立地在内部位点缀合。在一些情况下，至少一个另外的多肽A进一步缀合到至少一个多肽A、B或C。在另外的情况下，至少一个D任选地直接或间接地缀合到至少一个多肽A、至少一个B或至少一个C。如果直接缀合到至少一个多肽A，则至少一个D也任选地缀合到至少一个B，以形成A-D-B缀合物，或者任选地缀合到至少一个B和至少一个C，以形成A-D-B-C缀合物。在一些情况下，至少一个D直接缀合到至少一个多肽A，并间接缀合到至少一个B和至少一个C，以形成D-A-B-C缀合物。如果间接缀合到至少一个多肽A，则至少一个D还任选地缀合到至少一个B，以形成A-B-D缀合物，或者任选地缀合到至少一个B和至少一个C，以形成A-B-D-C缀合物。在一些情况下，至少一个另外的D进一步缀合到至少一个多肽A、B或C。
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000831
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000832
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000833
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000834
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000835
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000836
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000841
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000842
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000843
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000844
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000845
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000846
在一些实施方案中，多核酸分子缀合物包含如下所示的构建体：
Figure BDA0002494424650000851
如上所示的
Figure BDA0002494424650000852
仅用于表示目的，并且包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、单链可变片段(scFv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdAb)或者骆驼科抗体或其结合片段。
结合部分
在一些实施方案中，结合部分A是多肽。在一些情况下，该多肽是抗体或其片段。在一些情况下，该片段是结合片段。在一些情况下，该抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(dsFv)、单结构域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段，或者它们的化学修饰的衍生物。
在一些情况下，A为抗体或其结合片段。在一些情况下，A为人源化抗体或其结合片段、鼠抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价Fab’、二价Fab2、F(ab)'3片段、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(sdAb)、Ig NAR、骆驼科抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段，或者它们的化学修饰的衍生物。在一些情况下，A为人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，A为鼠抗体或其结合片段。在一些情况下，A为嵌合抗体或其结合片段。在一些情况下，A为单克隆抗体或其结合片段。在一些情况下，A为单价Fab’。在一些情况下，A为二价Fab2。在一些情况下，A为单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，结合部分A是双特异性抗体或其结合片段。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体或双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性抗体是三官能抗体。在一些情况下，该三官能抗体是全长单克隆抗体，其包含针对两种不同抗原的结合位点。
在一些情况下，所述双特异性抗体是双特异性微抗体。在一些情况下，该双特异性微抗体包括二价Fab2、F(ab)'3片段、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、三抗体、四抗体或双特异性T细胞接合物(BiTE)。在一些实施方案中，该双特异性T细胞接合物是包含两个单链可变片段(scFv)的融合蛋白，其中这两个scFv靶向两种不同抗原的表位。
在一些实施方案中，结合部分A是双特异性微抗体。在一些情况下，A为双特异性Fab2。在一些情况下，A为双特异性F(ab)'3片段。在一些情况下，A为双特异性双scFv。在一些情况下，A为双特异性(scFv)2。在一些实施方案中，A为双特异性双抗体。在一些实施方案中，A为双特异性微抗体。在一些实施方案中，A为双特异性三抗体。在其他实施方案中，A为双特异性四抗体。在其他实施方案中，A为双特异性T细胞接合物(BiTE)。
在一些实施方案中，结合部分A是三特异性抗体。在一些情况下，该三特异性抗体包括F(ab)'3片段或三抗体。在一些情况下，A为三特异性F(ab)'3片段。在一些情况下，A为三抗体。在一些实施方案中，A为三特异性抗体，如Dimas等人,“Development of atrispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target threedifferent antigens on tumor cells,”Mol.Pharmaceutics,12(9):3490-3501(2015)所述。
在一些实施方案中，结合部分A是识别细胞表面蛋白质的抗体或其结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别肌细胞上的细胞表面蛋白质的抗体或其结合片段。被抗体或其结合片段识别的示例性的细胞表面蛋白质包括但不限于Sca-1、CD34、Myo-D、肌细胞生成蛋白、MRF4、NCAM、CD43和CD95(Fas)。
在一些情况下，细胞表面蛋白质包括分化簇(CD)细胞表面标志物。示例性的CD细胞表面标志物包括但不限于CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L(L-选择蛋白)、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD79(例如，CD79a、CD79b)、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD125(IL5RA)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD221、CD274、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、CD326(EpCAM)等。
在一些情况下，结合部分A是识别CD细胞表面标志物的抗体或其结合片段。在一些情况下，结合部分A是识别CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L(L-选择蛋白)、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD79(例如，CD79a、CD79b)、CD90、CD95(Fas)、CD103、CD104、CD125(IL5RA)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD152(CTLA-4)、CD221、CD274、CD279(PD-1)、CD319(SLAMF7)、CD326(EpCAM)或其组合的抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，结合部分A是抗肌球蛋白抗体、抗转铁蛋白抗体和识别肌肉特异性激酶(MuSK)的抗体。
在一些情况下，结合部分A是抗肌球蛋白抗体。在一些情况下，该抗肌球蛋白抗体是人源化抗体。在其他情况下，该抗肌球蛋白抗体是嵌合抗体。在另外的情况下，该抗肌球蛋白抗体是单价、二价或多价抗体。
在一些情况下，结合部分A是抗转铁蛋白(抗CD71)抗体。在一些情况下，该抗转铁蛋白抗体是人源化抗体。在其他情况下，该抗转铁蛋白抗体是嵌合抗体。在另外的情况下，该抗转铁蛋白抗体是单价、二价或多价抗体。在一些实施方案中，示例性的抗转铁蛋白抗体包括来自R&D Systems的MAB5746、来自Bio-Rad Laboratories的AHP858、来自BethylLaboratories,Inc.的A80-128A和来自Millipore Sigma的T2027。
在一些情况下，结合部分A是识别MuSK的抗体。在一些情况下，该抗MuSK抗体是人源化抗体。在其他情况下，该抗MuSK抗体是嵌合抗体。在其他情况下，该抗MuSK抗体是单价、二价或多价抗体。
在一些实施方案中，结合部分A非特异性地缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由赖氨酸残基或半胱氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由赖氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A经由半胱氨酸残基以非位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。
在一些实施方案中，结合部分A以位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基、半胱氨酸残基、在5’末端、3’末端、非天然氨基酸或者酶修饰或酶催化的残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过赖氨酸残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过半胱氨酸残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在5’末端经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A在3’末端经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过非天然氨基酸经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。在一些情况下，结合部分A通过酶修饰或酶催化的残基经由位点特异性方式缀合至多核酸分子(B)。
在一些实施方案中，一个或多个多核酸分子(B)缀合至结合部分A。在一些情况下，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约1个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约2个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约3个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约4个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约5个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约6个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约7个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约8个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约9个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约10个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约11个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约12个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约13个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约14个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约15个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，约16个多核酸分子缀合至一个结合部分A。在一些情况下，所述一个或多个多核酸分子是相同的。在其他情况下，所述一个或多个多核酸分子是不同的。
在一些实施方案中，缀合至结合部分A的多核酸分子(B)的数目形成比值。在一些情况下，该比值被称为DAR(药物-抗体)比，其中如本文提及的药物为多核酸分子(B)。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约2或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约4或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约5或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约6或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约7或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约8或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约9或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约10或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约11或更大。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约12或更大。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约3。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约4。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约5。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约7。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约9。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约10。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约11。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约12。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约13。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约14。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约15。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为约16。
在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为1。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为2。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为4。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为6。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为8。在一些情况下，多核酸分子(B)与结合部分A的DAR比为12。
在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物具有改善的活性。在一些情况下，改善的活性导致增强的生物学相关功能，例如，改善的稳定性、亲和力、结合、功能活性和在治疗或预防疾病状态中的功效。在一些情况下，该疾病状态是基因的一个或多个突变外显子的结果。在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物导致一个或多个突变外显子的外显子跳读增加。在一些情况下，与包含不含结合部分A的多核酸分子(B)的缀合物相比，在包含多核酸分子(B)和结合部分A的缀合物中，外显子跳读增加至少或大约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％。
在一些实施方案中，使用本领域已知的常规技术进一步修饰抗体或其结合片段，例如，通过单独或组合地使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或通过重组和/或本领域已知的其他任何修饰(例如，翻译后和化学修饰，如糖基化和磷酸化)。在一些情况下，该修饰进一步包括用于调节与Fc受体的相互作用的修饰。在一些情况下，所述一个或多个修饰包括例如国际公开WO97/34631中描述的那些修饰，该文献公开了参与Fc域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基。在抗体或其结合片段的氨基酸序列的核酸序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员公知的。
在一些情况下，抗体结合片段进一步包括其衍生物，并且包括含有至少一个CDR的多肽序列。
在一些情况下，如本文所用的术语“单链”意指双特异性单链构建体的第一和第二结构域共价连接，优选地为单个核酸分子可编码的共线氨基酸序列的形式。
在一些情况下，双特异性单链抗体构建体涉及包含两个抗体衍生的结合域的构建体。在这样的实施方案中，双特异性单链抗体构建体是串联双scFv或双抗体。在一些情况下，scFv含有通过连接体肽连接的VH和VL域。在一些情况下，连接体的长度和序列足以确保第一和第二结构域中的每一个可以彼此独立地保留其差异结合特异性。
在一些实施方案中，与本文所用的结合或相互作用定义至少两个抗原相互作用位点彼此的结合/相互作用。在一些情况下，抗原相互作用位点定义多肽的基序，其显示出与特定抗原或特定抗原组的特异性相互作用的能力。在一些情况下，结合/相互作用也被理解为定义特异性识别。在这样的情况下，特异性识别是指抗体或其结合片段能够与每个靶分子的至少两个氨基酸特异性地相互作用和/或结合。例如，特异性识别涉及抗体分子的特异性，或其辨别靶分子的特定区域的能力。在另外的情况下，抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用导致信号起始，例如，由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等。在进一步的实施方案中，结合的实例是“匙-锁原理”的特异性。因此，在一些情况下，抗原相互作用位点和抗原的氨基酸序列中的特定基序由于其一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰而彼此结合。在这样的情况下，抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用也导致位点与抗原的简单结合。
在一些情况下，特异性相互作用进一步指抗体或其结合片段的交叉反应性降低或脱靶效应降低。例如，与感兴趣的多肽/蛋白质结合但不与或基本上不与其他任何多肽结合的抗体或其结合片段被认为对感兴趣的多肽/蛋白质具有特异性。抗原相互作用位点与特定抗原的特异性相互作用的实例包括配体对其受体的特异性，例如抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用。
另外的结合部分
在一些实施方案中，所述结合部分是血浆蛋白质。在一些情况下，该血浆蛋白质包括白蛋白。在一些情况下，结合部分A是白蛋白。在一些情况下，白蛋白通过本文所述的一种或多种缀合化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，白蛋白通过天然连接化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，白蛋白通过赖氨酸缀合而缀合至多核酸分子。
在一些情况下，所述结合部分是类固醇。示例性的类固醇包括胆固醇、磷脂、二酰基甘油和三酰基甘油、脂肪酸，饱和的、不饱和的、包含取代的烃，或其组合。在一些情况下，该类固醇是胆固醇。在一些情况下，该结合部分是胆固醇。在一些情况下，胆固醇通过本文所述的一种或多种缀合化学法缀合至多核酸分子。在一些情况下，胆固醇通过天然连接化学法缀合至多核酸分子上。在一些情况下，胆固醇通过赖氨酸缀合而缀合至多核酸分子。
在一些情况下，所述结合部分是聚合物，包括但不限于与细胞上的特定表面标志物结合的多核酸分子适体。在这种情况下，该结合部分是这样的多核酸，其不与靶基因或mRNA杂交，而是类似于与细胞表面标志物的其特定表位结合的抗体，能够选择性地与细胞表面标志物结合。
在一些情况下，所述结合部分是肽。在一些情况下，该肽具有约1至约3kDa。在一些情况下，该肽具有约1.2至约2.8kDa、约1.5至约2.5kDa或约1.5至约2kDa。在一些情况下，该肽是双环肽。在一些情况下，该双环肽是受约束的双环肽。在一些情况下，该结合部分是双环肽(例如，来自Bicycle Therapeutics的双环化合物)。
在另外的情况下，所述结合部分是小分子。在一些情况下，该小分子是募集抗体的小分子。在一些情况下，该募集抗体的小分子包含靶标结合末端和抗体结合末端，其中靶标结合末端能够识别细胞表面受体并与之相互作用。例如，在一些情况下，包含谷氨酸脲化合物的靶标结合末端使得能够与PSMA相互作用，从而增强与表达PSMA的细胞的抗体相互作用。在一些情况下，结合部分是Zhang等人,“A remote arene-binding site on prostatespecific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules,”JAm Chem Soc.132(36):12711-12716(2010)；或McEnaney等人,“Antibody-recruitingmolecules:an emerging paradigm for engaging immune function in treating humandisease,”ACS Chem Biol.7(7):1139-1151(2012)中描述的小分子。
缀合化学
在一些实施方案中，多核酸分子B缀合至结合部分。在一些情况下，该结合部分包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、抗原、毒素、激素、脂质、核苷酸、核苷、糖、碳水化合物、聚合物如聚乙二醇和聚丙二醇，以及所有这些物质类别的类似物或衍生物。结合部分的其他实例还包括类固醇如胆固醇、磷脂、二酰基甘油和三酰基甘油、脂肪酸、烃(例如，饱和的、不饱和的或含有取代)、酶底物、生物素、洋地黄毒苷和多糖。在一些情况下，该结合部分是抗体或其结合片段。在一些情况下，多核酸分子进一步缀合至聚合物和可选的内体溶解部分。
在一些实施方案中，多核酸分子通过化学连接过程缀合至结合部分。在一些情况下，多核酸分子通过天然连接缀合至结合部分。在一些情况下，缀合如下所述：Dawson等人.“Synthesis of proteins by native chemical ligation,”Science 1994,266,776–779；Dawson等人.“Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through theUse of Thiol Additives,”J.Am.Chem.Soc.1997,119,4325–4329；Hackeng等人.“Proteinsynthesis by native chemical ligation:Expanded scope by using straightforwardmethodology.,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,10068–10073；或Wu等人.“Buildingcomplex glycopeptides:Development of a cysteine-free native chemical ligationprotocol,”Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,4116–4125。在一些情况下，缀合如美国专利8,936,910所述。在一些实施方案中，多核酸分子经由天然连接化学法位点特异性或非特异性地缀合至结合部分。
在一些情况下，多核酸分子通过利用“无痕”偶联技术(Philochem)的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该“无痕”偶联技术利用结合部分上的N-末端1,2-氨基硫醇基团，其随后与含有醛基团的多核酸分子缀合(参见Casi等人,“Site-specific tracelesscoupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies forpharmacodelivery,”JACS134(13):5887-5892(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用并入结合部分中的非天然氨基酸的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该非天然氨基酸包括对乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe)。在一些情况下，pAcPhe的酮基团选择性地与衍生自烷氧基-胺的缀合部分偶联以形成肟键(参见Axup等人,“Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnaturalamino acids,”PNAS 109(40):16101-16106(2012))。
在一些情况下，多核酸分子通过利用酶催化过程的定点方法缀合至结合部分。在一些情况下，该定点方法利用SMARTagTM技术(Redwood)。在一些情况下，SMARTagTM技术包括通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)在醛标签的存在下通过氧化过程从半胱氨酸生成甲酰甘氨酸(FGly)残基，随后经由肼基-Pictet-Spengler(HIPS)连接将FGly缀合至烷基肼官能化多核酸分子(参见Wu等人,“Site-specific chemical modification of recombinantproteins produced in mammalian cells by using the genetically encodedaldehyde tag,”PNAS 106(9):3000-3005(2009)；Agarwal等人,“A Pictet-Spenglerligation for protein chemical modification,”PNAS 110(1):46-51(2013))。
在一些情况下，酶催化过程包含微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。在一些情况下，多核酸分子利用微生物转谷氨酰胺催化的过程缀合至结合部分。在一些情况下，mTG催化识别序列内谷氨酰胺的酰胺侧链与官能化多核酸分子的伯胺之间的共价键形成。在一些情况下，mTG由茂源链霉菌(Streptomyces mobarensis)产生(参见Strop等人,“Location matters:site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drugconjugates,”Chemistry and Biology 20(2)161-167(2013))。
在一些情况下，多核酸分子通过如PCT公开WO2014/140317中描述的方法缀合至结合部分，该方法利用序列特异性转肽酶。
在一些情况下，多核酸分子通过如美国专利公开2015/0105539和2015/0105540中描述的方法缀合至结合部分。
抗体或其结合片段的产生
在一些实施方案中，使用本领域已知可用于合成多肽(例如，抗体)的任何方法产生本文所述的多肽(例如，抗体及其结合片段)，特别是通过化学合成或通过重组表达，并且优选地通过重组表达技术产生。
在一些情况下，重组地表达抗体或其结合片段，并且由化学合成的寡核苷酸装配编码该抗体或其结合片段的核酸(例如，如Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242所述)，该方法包括合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，退火并连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增所连接的寡核苷酸。
或者，任选地通过使用可与序列的3’和5’端杂交的合成引物的PCR扩增，或者通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针的克隆，从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或由表达免疫球蛋白的任何组织或细胞生成的cDNA文库)生成编码抗体的核酸分子。
在一些情况下，任选地通过对动物如兔进行免疫来生成多克隆抗体，或者更优选地，通过生成单克隆抗体，来生成抗体或其结合片段，例如，如Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)所述，或者如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)所述。或者，任选地通过针对结合特定抗原的Fab片段的克隆筛查Fab表达文库(例如，如Huse等人,1989,Science 246:1275-1281所述)，或通过筛查抗体文库(参见，例如，Clackson等人,1991,Nature 352:624；Hane等人,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)，来获得至少编码抗体的Fab部分的克隆。
在一些实施方案中，使用被开发用于通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接而产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature312:604-608；Takeda等人,1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。
在一些实施方案中，针对产生单链抗体所描述的技术(美国专利4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于产生单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链多肽来形成单链抗体。还任选地使用在大肠杆菌(E.coli)中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。在具体实施方案中，抗体的表达受组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，利用多种宿主表达载体系统表达本文所述的抗体或其结合片段。此类宿主表达系统代表通过其产生抗体的编码序列并随后进行纯化的载体，而且也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包括但不限于用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(SaccharomycesPichia))；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期高产量生产，优选稳定表达。在一些情况下，任选地对稳定表达抗体的细胞系进行工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到其染色体中，并生长形成灶点(focus)，然后将该灶点克隆并扩充成细胞系。该方法可有利地用来对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程化。
在一些情况下，使用多种选择系统，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等人,1980,Cell 22:817)基因。此外，使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH 11(5):155-215)；以及hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。重组DNA技术领域中公知的可使用的方法描述于Ausubel等人(编著),1993,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,Gene Transferand Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；以及第12和13章,Dracopoli等人(编著),1994,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY.；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1。
在一些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press,NewYork,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域已知的用于纯化或分析抗体或抗体缀合物的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是针对蛋白A后的特定抗原的亲和色谱法，以及大小柱色谱法)、离心、差异溶解度，或通过用于纯化蛋白质的其他任何标准技术。示例性的色谱方法包括但不限于强阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、大小排阻色谱法和快速蛋白质液相色谱法。
聚合物缀合部分
在一些实施方案中，聚合物部分C进一步缀合至本文所述的多核酸分子、本文所述的结合部分或其组合。在一些情况下，聚合物部分C缀合至多核酸分子。在一些情况下，聚合物部分C缀合至结合部分。在其他情况下，聚合物部分C缀合至多核酸分子结合部分分子。在另外的情况下，聚合物部分C如上所示缀合。
在一些情况下，聚合物部分C是天然或合成聚合物，其由支链或非支链单体的长链和/或二维或三维的单体交联网络组成。在一些情况下，聚合物部分C包括多糖、木质素、橡胶或聚环氧烷(例如，聚乙二醇)。在一些情况下，至少一个聚合物部分C包括但不限于α-、ω-二羟基聚乙二醇、可生物降解的基于内酯的聚合物，例如聚丙烯酸、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烃、聚酰胺、聚氰基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二酯(PET、PETG)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETE)、聚丁二醇(PTG)或聚氨酯及其混合物。如本文所用的，混合物是指在同一化合物内以及在嵌段共聚物中使用不同聚合物。在一些情况下，嵌段共聚物是其中至少一部分聚合物由另一聚合物的单体构成的聚合物。在一些情况下，聚合物部分C包括聚环氧烷。在一些情况下，聚合物部分C包括PEG。在一些情况下，聚合物部分C包括聚乙烯酰亚胺(PEI)或羟乙基淀粉(HES)。
在一些情况下，C为PEG部分。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的5’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的3’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分在多核酸分子的3’末端缀合，而结合部分在多核酸分子的5’末端缀合。在一些情况下，该PEG部分缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该PEG部分、结合部分或其组合缀合至多核酸分子的内部位点。在一些情况下，该缀合是直接缀合。在一些情况下，该缀合经由天然连接进行。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如，PEG)是多分散或单分散化合物。在一些情况下，多分散材料包含不同分子量的材料的分散分布，其特征在于平均重量(重均)大小和分散性。在一些情况下，单分散PEG包含一种大小的分子。在一些实施方案中，C为多分散或单分散的聚环氧烷(例如，PEG)，并且指示的分子量表示聚环氧烷(例如，PEG)分子的分子量的平均值。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如，PEG)的分子量为约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da。
在一些实施方案中，C为聚环氧烷(例如，PEG)，并且具有约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da的分子量。在一些实施方案中，C为PEG，并且具有约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da的分子量。在一些情况下，C的分子量为约200Da。在一些情况下，C的分子量为约300Da。在一些情况下，C的分子量为约400Da。在一些情况下，C的分子量为约500Da。在一些情况下，C的分子量为约600Da。在一些情况下，C的分子量为约700Da。在一些情况下，C的分子量为约800Da。在一些情况下，C的分子量为约900Da。在一些情况下，C的分子量为约1000Da。在一些情况下，C的分子量为约1100Da。在一些情况下，C的分子量为约1200Da。在一些情况下，C的分子量为约1300Da。在一些情况下，C的分子量为约1400Da。在一些情况下，C的分子量为约1450Da。在一些情况下，C的分子量为约1500Da。在一些情况下，C的分子量为约1600Da。在一些情况下，C的分子量为约1700Da。在一些情况下，C的分子量为约1800Da。在一些情况下，C的分子量为约1900Da。在一些情况下，C的分子量为约2000Da。在一些情况下，C的分子量为约2100Da。在一些情况下，C的分子量为约2200Da。在一些情况下，C的分子量为约2300Da。在一些情况下，C的分子量为约2400Da。在一些情况下，C的分子量为约2500Da。在一些情况下，C的分子量为约2600Da。在一些情况下，C的分子量为约2700Da。在一些情况下，C的分子量为约2800Da。在一些情况下，C的分子量为约2900Da。在一些情况下，C的分子量为约3000Da。在一些情况下，C的分子量为约3250Da。在一些情况下，C的分子量为约3350Da。在一些情况下，C的分子量为约3500Da。在一些情况下，C的分子量为约3750Da。在一些情况下，C的分子量为约4000Da。在一些情况下，C的分子量为约4250Da。在一些情况下，C的分子量为约4500Da。在一些情况下，C的分子量为约4600Da。在一些情况下，C的分子量为约4750Da。在一些情况下，C的分子量为约5000Da。在一些情况下，C的分子量为约5500Da。在一些情况下，C的分子量为约6000Da。在一些情况下，C的分子量为约6500Da。在一些情况下，C的分子量为约7000Da。在一些情况下，C的分子量为约7500Da。在一些情况下，C的分子量为约8000Da。在一些情况下，C的分子量为约10,000Da。在一些情况下，C的分子量为约12,000Da。在一些情况下，C的分子量为约20,000Da。在一些情况下，C的分子量为约35,000Da。在一些情况下，C的分子量为约40,000Da。在一些情况下，C的分子量为约50,000Da。在一些情况下，C的分子量为约60,000Da。在一些情况下，C的分子量为约100,000Da。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如PEG)是离散的PEG，其中该离散的PEG是包含超过一个重复环氧乙烷单元的聚合PEG。在一些情况下，离散的PEG(dPEG)包含2至60、2至50或2至48个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约2个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约3个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约4个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约5个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约6个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约7个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约8个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约9个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约10个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约11个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约12个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约13个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约14个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约15个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约16个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约17个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约18个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约19个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约20个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约22个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约24个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约26个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约28个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约30个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约35个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约40个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约42个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约48个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含约50个或更多个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，以逐步的方式由纯的(例如，约95％、98％、99％或99.5％)起始材料将dPEG合成为单分子量化合物。在一些情况下，dPEG具有特定的分子量，而不是平均分子量。在一些情况下，本文所述的dPEG是来自Quanta Biodesign,LMD的dPEG。
在一些实施方案中，聚合物部分C包含基于阳离子粘酸的聚合物(cMAP)。在一些情况下，cMAP包含至少一个重复亚单位的一个或多个亚单位，并且该亚单位结构表示为式(V)：
Figure BDA0002494424650001031
其中m在每次出现时独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选4-6或5；并且n在每次出现时独立地为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m和n为例如约10。
在一些情况下，cMAP进一步缀合至PEG部分，生成cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约50,000Da。在一些情况下，PEG部分的范围为约500Da至约1000Da、大于1000Da至约5000Da、大于5000Da至约10,000Da、大于10,000至约25,000Da、大于25,000Da至约50,000Da，或这些范围中的两个或更多个的任意组合。
在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG共聚物。在其他情况下，聚合物部分C是mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物。在另外的情况下，聚合物部分C是cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。
在一些实施方案中，聚合物部分C如上所示缀合至多核酸分子、结合部分和可选的内体溶解部分。
内体溶解部分
在一些实施方案中，式(I)——A-X-B-Y-C——的分子进一步包含另外的缀合部分。在一些情况下，该另外的缀合部分是内体溶解部分。在一些情况下，该内体溶解部分是细胞区室释放组分，诸如能够从本领域已知的任何细胞区室释放的化合物，该细胞区室例如是内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体或细胞内的其他囊泡体。在一些情况下，该内体溶解部分包含内体溶解多肽、内体溶解聚合物、内体溶解脂质或内体溶解小分子。在一些情况下，该内体溶解部分包含内体溶解多肽。在其他情况下，该内体溶解部分包含内体溶解聚合物。
内体溶解多肽
在一些实施方案中，式(I)——A-X-B-Y-C——的分子进一步与内体溶解多肽缀合。在一些实施方案中，式(V)——A-(X1-B)n——或式(II)——A-X1-(B-X2-C)n——的分子进一步与内体溶解多肽缀合。在一些情况下，该内体溶解多肽是pH依赖性膜活性肽。在一些情况下，该内体溶解多肽是两亲性多肽。在另外的情况下，该内体溶解多肽是拟肽。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF、蜂毒肽、meucin或其各自的衍生物。在一些情况下，该内体溶解多肽包含INF或其衍生物。在其他情况下，该内体溶解多肽包含蜂毒肽或其衍生物。在另外的情况下，该内体溶解多肽包含meucin或其衍生物。
在一些情况下，INF7为24个残基的多肽，其序列包含CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA(SEQ ID NO:1)或GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(SEQ ID NO:2)。在一些情况下，INF7或其衍生物包含以下序列：GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG(SEQ ID NO:3)、GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG-(PEG)6-NH2(SEQ ID NO:4)或GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2(SEQ ID NO:5)。
在一些情况下，蜂毒肽是26个残基的多肽，其序列包含CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ(SEQ ID NO:6)或GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ IDNO:7)。在一些情况下，蜂毒肽包含如美国专利8,501,930中描述的多肽序列。
在一些情况下，meucin是来源于蝎子条斑钳蝎(Mesobuthus eupeus)的毒腺的抗微生物肽(AMP)。在一些情况下，meucin包括meucin-13和meucin-18，meucin-13的序列包含IFGAIAGLLKNIF-NH2(SEQ ID NO:8)，meucin-18的序列包含FFGHLFKLATKIIPSLFQ(SEQ IDNO:9)。
在一些情况下，内体溶解多肽包括其序列与INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包括INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或者meucin或其衍生物。
在一些情况下，内体溶解部分是INF7或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:1-5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQID NO:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:2-5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:2-5。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:1组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:2-5组成。
在一些情况下，内体溶解部分是蜂毒肽或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:6或7具有至少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:6具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ IDNO:7具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:7。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:6组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:7组成。
在一些情况下，内体溶解部分是meucin或其衍生物。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:8或9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含与SEQ IDNO:9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:8。在一些情况下，内体溶解部分包含SEQ ID NO:9。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:8组成。在一些情况下，内体溶解部分由SEQ ID NO:9组成。
在一些情况下，内体溶解部分包含如以下表1所示的序列。
Figure BDA0002494424650001071
Figure BDA0002494424650001081
在一些情况下，内体溶解部分包含Bak BH3多肽，后者通过拮抗抑制剂靶标如Bcl-2和/或Bcl-xL诱导凋亡。在一些情况下，内体溶解部分包含Albarran等人,“Efficientintracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsivecarrier,”Reactive&Functional Polymers 71:261-265(2011)描述的Bak BH3多肽。
在一些情况下，内体溶解部分包含PCT公开WO2013/166155或WO2015/069587中描述的多肽(例如，细胞穿透多肽)。
内体溶解聚合物
在一些实施方案中，式(V)——A-(X1-B)n——或式(VI)——A-X1-(B-X2-C)n——的分子进一步与内体溶解聚合物缀合。如本文所用的，内体溶解聚合物包括直链、支链的网络、星形、梳形或梯形聚合物。在一些情况下，内体溶解聚合物是包含两种或更多种不同类型的单体的均聚物或共聚物。在一些情况下，内体溶解聚合物是聚阳离子聚合物。在其他情况下，内体溶解聚合物是聚阴离子聚合物。
在一些情况下，聚阳离子聚合物包含带正电荷、为电荷中性或带负电荷的单体单元，并且净电荷为正。在其他情况下，聚阳离子聚合物包含含有两个或更多个正电荷的非聚合分子。示例性阳离子聚合物包括但不限于聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸](PAGA)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEMA)或甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEMA)。
在一些情况下，聚阴离子聚合物包含带正电荷、为电荷中性或带负电荷的单体单元，并且净电荷为负。在其他情况下，聚阴离子聚合物包含含有两个或更多个负电荷的非聚合分子。示例性的阴离子聚合物包括聚(丙烯酸烷基酯)(例如，聚(丙烯酸丙酯)(PPAA))或聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)。另外的实例包括PP75——在Khormaee等人,“Edosomolytic anionic polymer for the cytoplasmic delivery of siRNAs inlocalized in vivo applications,”Advanced Functional Materials 23:565-574(2013)中描述的L-苯丙氨酸-聚(L-赖氨酸异邻苯二甲酰胺)聚合物。
在一些实施方案中，本文所述的内体溶解聚合物是pH响应性内体溶解聚合物。pH响应性聚合物包括根据环境的pH而增大(溶胀)或塌缩的聚合物。聚丙烯酸和壳聚糖是pH响应性聚合物的实例。
在一些情况下，本文描述的内体溶解部分是膜破坏性聚合物。在一些情况下，该膜破坏性聚合物包括阳离子聚合物、中性或疏水性聚合物或阴离子聚合物。在一些情况下，该膜破坏性聚合物是亲水性聚合物。
在一些情况下，本文描述的内体溶解部分是pH响应性膜破坏性聚合物。示例性的pH响应性膜破坏性聚合物包括聚(烷基丙烯酸)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)共聚物、琥珀酰化聚(缩水甘油)和聚(β-苹果酸)聚合物。
在一些情况下，聚(烷基丙烯酸)包括聚(丙基丙烯酸)(polyPAA)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(乙基丙烯酸)(PEAA)和聚(丙基丙烯酸)(PPAA)。在一些情况下，聚(烷基丙烯酸)包括Jones等人,Biochemistry Journal 372:65-75(2003)中描述的聚(烷基丙烯酸)。
在一些实施方案中，pH响应性膜破坏性聚合物包括聚(丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)。(参见Bulmus等人,Journal of Controlled Release93:105-120(2003)；和Yessine等人,Biochimica et Biophysica Acta 1613:28-38(2003))。
在一些实施方案中，pH响应性膜破坏性聚合物包括聚(苯乙烯-马来酸酐)交替聚合物。(参见Henry等人,Biomacromolecules 7:2407-2414(2006))。
一些实施方案中，pH响应性膜破坏性聚合物包括吡啶基二硫化物丙烯酸酯(PDSA)聚合物，如聚(MAA-共-PDSA)、聚(EAA-共-PDSA)、聚(PAA-共-PDSA)、聚(MAA-共-BA-共-PDSA)、聚(EAA-共-BA-共-PDSA)或聚(PAA-共-BA-共-PDSA)聚合物。(参见El-Sayed等人,“Rational design of composition and activity correlations for pH-responsiveand glutathione-reactive polymer therapeutics,”Journal of Controlled Release104:417-427(2005)；或Flanary等人,“Antigen delivery with poly(propylacrylicacid)conjugation enhanced MHC-1 presentation and T-cell activation,”Bioconjugate Chem.20:241-248(2009))。
在一些实施方案中，pH响应性膜破坏性聚合物包括包含以下基本结构的溶解性聚合物：
Figure BDA0002494424650001101
在一些情况下，本文所述的内体溶解部分进一步缀合至另外的缀合物，例如聚合物(例如，PEG)或修饰的聚合物(例如，胆固醇修饰的聚合物)。
在一些情况下，所述另外的缀合物包括去污剂(例如，Triton X-100)。在一些情况下，本文所述的内体溶解部分包含与去污剂(例如，Triton X-100)缀合的聚合物(例如，聚(酰胺基胺))。在一些情况下，本文所述的内体溶解部分包含聚(酰胺基胺)-Triton X-100缀合物(Duncan等人,“A polymer-Triton X-100conjugate capable of pH-dependentred blood cell lysis:a model system illustrating the possibility of drugdelivery within acidic intracellular compartments,”Journal of Drug Targeting2:341-347(1994))。
内体溶解脂质
在一些实施方案中，所述内体溶解部分是脂质(例如，促融合脂质)。在一些实施方案中，式(V)——A-(X1-B)n或式(VI)——A-X1-(B-X2-C)n——的分子进一步与内体溶解脂质(例如，促融合脂质)缀合。示例性促融合脂质包括1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)和N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙胺(XTC)。
在一些情况下，内体溶解部分是PCT公开WO09/126,933中描述的脂质(例如，促融合脂质)。
内体溶解小分子
在一些实施方案中，所述内体溶解部分是小分子。在一些实施方案中，式(I)——A-(X1-B)n——或式(II)——A-X1-(B-X2-C)n——的分子进一步与内体溶解小分子缀合。适合作为内体溶解部分的示例性小分子包括但不限于奎宁、氯喹、羟基氯喹、氨酚喹(carnoquine)、阿莫吡喹、伯氨喹、甲氟喹、nivaquine、卤泛群、醌亚胺或其组合。在一些情况下，喹啉内体溶解部分包括但不限于7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(氯喹)；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(羟基氯喹)；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉；4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基氯喹)；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉)；4-(4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基-乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基-)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；磷酸羟基氯喹；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基-1)-氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基羟基氯喹)；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基]-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-丁酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；3-氯-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉，4-[(4-二乙基-氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3-氟-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉,4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲苯氨基喹啉；4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3,4-二氢-1-(2H)-喹啉羧基醛；1,1′-五亚甲基二喹啉鎓二碘化物；8-羟基喹啉硫酸盐及其氨基、醛、羧基、羟基、卤素、酮基、巯基和乙烯基衍生物或类似物。在一些情况下，内体溶解部分是Naisbitt等人(1997,J Pharmacol Exp Therapy280:884-893)和美国专利5,736,557中描述的小分子。
在一些实施方案中，所述内体溶解部分是尼日利亚菌素或其缀合物，例如叶酸-尼日利亚菌素酯缀合物、叶酸-尼日利亚菌素酰胺缀合物或叶酸-尼日利亚菌素氨基甲酸酯缀合物。在一些情况下，该内体溶解部分是Rangasamy等人,“New mechanism for release ofendosomal contents:osmotic lysis via nigericin-mediated K+/H+exchange,”Bioconjugate Chem.29:1047-1059(2018)中描述的尼日利亚菌素。
连接体
在一些实施方案中，本文所述的连接体是可切割连接体或不可切割连接体。在一些情况下，该连接体是可切割连接体。在其他情况下，该连接体是不可切割连接体。
在一些情况下，所述连接体是非聚合连接体。非聚合连接体是指不含通过聚合过程生成的单体重复单元的连接体。示例性的非聚合连接体包括但不限于C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽连接体、无痕连接体、自牺牲(self-immolative)连接体、基于马来酰亚胺的连接体或其组合。在一些情况下，该非聚合连接体包含C1-C6烷基(例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基)、同双官能交联体、异双官能交联体、肽连接体、无痕连接体、自牺牲连接体、基于马来酰亚胺的连接体或其组合。在另外的情况下，该非聚合连接体不包含超过两个相同类型的连接体，例如，超过两个同双官能交联体，或超过两个肽连接体。在其他情况下，该非聚合连接体任选地包含一个或多个反应性官能团。
在一些情况下，该非聚合连接体不包含以上描述的聚合物。在一些情况下，该非聚合连接体不包含由聚合物部分C所包含的聚合物。在一些情况下，该非聚合连接体不包含聚环氧烷(例如PEG)。在一些情况下，该非聚合连接体不包含PEG。
在一些情况下，所述连接体包括同双官能连接体。示例性的同双官能连接体包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3′3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)乙二醇酯(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二甲基己二酰亚胺酯(DMA)、二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)、二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)、二甲基-3,3′-二硫代双丙酰亚胺酯(DTBP)、1,4-二-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4′-二氟-3,3′-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基氨基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3′-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α′-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N′-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N′-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。
在一些实施方案中，所述连接体包括异双官能连接体。示例性的异双官能连接体包括但不限于胺反应性和巯基交联体，诸如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-((((4-碘磺基琥珀酰亚胺)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对-硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)；羰基反应性和巯基反应性交联体，诸如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)；胺反应性和光反应性交联体，诸如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨基酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)乙基-1,3′-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3′-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3′-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(ρ-叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3′-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、ρ-硝基苯基重氮基丙酮酸酯(ρNPDP)、ρ-硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)；巯基反应性和光反应性交联体，诸如1-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、二苯甲酮-4-马来酰亚胺；羰基反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)；羧酸酯反应性和光反应性交联体，诸如4-(ρ-叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)；以及精氨酸反应性和光反应性交联体，诸如ρ-叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些情况下，所述连接体包含反应性官能团。在一些情况下，该反应性官能团包含对结合部分上存在的亲电子基团具有反应性的亲核基团。示例性的亲电子基团包括羰基，如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰卤或酸酐。在一些实施方案中，该反应性官能团是醛。示例性的亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基肼。
在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团。在一些情况下，马来酰亚胺基团也被称为马来酰亚胺间隔基。在一些情况下，该马来酰亚胺基团进一步包含己酸，形成马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该连接体包含马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该连接体是马来酰亚胺己酰基(mc)。在其他情况下，该马来酰亚胺基团包括马来酰亚胺甲基，例如如上所述的琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些实施方案中，所述马来酰亚胺基团是自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)并入邻近马来酰亚胺的碱性氨基，以提供硫代琥珀酰亚胺环水解的分子内催化，从而阻止马来酰亚胺发生通过逆迈克尔反应的消除反应。在一些情况下，自稳定的马来酰亚胺是Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimidesimprove the stability and pharmacological properties of antibody-drugconjugates,”Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)描述的马来酰亚胺基团。在一些情况下，所述连接体包含自稳定的马来酰亚胺。在一些情况下，所述连接体是自稳定的马来酰亚胺。
在一些实施方案中，所述连接体包含肽部分。在一些情况下，该肽部分包含至少2、3、4、5或6个或更多个氨基酸残基。在一些情况下，该肽部分包含至多2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基。在一些情况下，该肽部分包含约2个、约3个、约4个、约5个或约6个氨基酸残基。在一些情况下，该肽部分是可切割的肽部分(例如，酶促或化学地)。在一些情况下，该肽部分是不可切割的肽部分。在一些情况下，该肽部分包含Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly。在一些情况下，所述连接体包含肽部分，诸如：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly。在一些情况下，所述连接体包含Val-Cit。在一些情况下，所述连接体是Val-Cit。
在一些实施方案中，所述连接体包含苯甲酸基团或其衍生物。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含对氨基苯甲酸(PABA)。在一些情况下，该苯甲酸基团或其衍生物包含γ-氨基丁酸(GABA)。
在一些实施方案中，所述连接体包含任意组合的马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团中的一种或多种。在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在一些情况下，该马来酰亚胺基团是马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些情况下，该肽基团是val-cit。在一些情况下，该苯甲酸基团是PABA。在一些情况下，所述连接体包含mc-val-cit基团。在一些情况下，所述连接体包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，所述连接体包含mc-val-cit-PABA基团。
在一些实施方案中，所述连接体是自牺牲连接体或自消除连接体。在一些情况下，所述连接体是自牺牲连接体。在其他情况下，所述连接体是自消除连接体(例如，环化自消除连接体)。在一些情况下，所述连接体包括美国专利9,089,614或PCT公开WO2015038426中描述的连接体。
在一些实施方案中，所述连接体是树枝型连接体。在一些情况下，该树枝型连接体包含支化的多官能连接体部分。在一些情况下，该树枝型连接体用来增加多核苷酸B与结合部分A的摩尔比。在一些情况下，该树枝型连接体包含PAMAM树枝状高分子。
在一些实施方案中，所述连接体是无痕连接体或者在切割后不会给结合部分A、多核苷酸B、聚合物C或内体溶解部分D留下连接体部分(例如，原子或连接体基团)的连接体。示例性的无痕连接体包括但不限于锗连接体、硅连接体、硫连接体、硒连接体、氮连接体、磷连接体、硼连接体、铬连接体或苯肼连接体。在一些情况下，所述连接体是如Hejesen等人,“A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry,”Org Biomol Chem11(15):2493-2497(2013)描述的无痕芳基-三氮烯连接体。在一些情况下，所述连接体是Blaney等人,“Traceless solid-phase organic synthesis,”Chem.Rev.102:2607-2024(2002)描述的无痕连接体。在一些情况下，连接体是美国专利6,821,783中描述的无痕连接体。
在一些情况下，所述连接体是以下文献中描述的连接体：美国专利6,884,869；7,498,298；8,288,352；8,609,105；或8,697,688；美国专利公开2014/0127239；2013/028919；2014/286970；2013/0309256；2015/037360；或2014/0294851；或者PCT公开WO2015057699；WO2014080251；WO2014197854；WO2014145090；或WO2014177042。
在一些实施方案中，X、Y和L独立地为键或连接体。在一些情况下，X、Y和L独立地为键。在一些情况下，X、Y和L独立地为连接体。
在一些情况下，X为键或连接体。在一些情况下，X为键。在一些情况下，X为连接体。在一些情况下，该连接体为C1-C6烷基。在一些情况下，X为C1-C6烷基，例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基。在一些情况下，该C1-C6烷基是未取代的C1-C6烷基。如在连接体的语境中，特别是在X的语境中所使用的，烷基意指含有最多六个碳原子的饱和直链或支链烃基团。在一些情况下，X为非聚合连接体。在一些情况下，X包括以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，X包括异双官能连接体。在一些情况下，X包括sMCC。在其他情况下，X包括任选地缀合至C1-C6烷基的异双官能连接体。在其他情况下，X包括任选地缀合至C1-C6烷基的sMCC。在另外的情况下，X不包括上文描述的同双官能连接体或异双官能连接体。
在一些情况下，Y为键或连接体。在一些情况下，Y为键。在其他情况下，Y为连接体。在一些实施方案中，Y为C1-C6烷基。在一些情况下，Y为以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，Y为以上所述的同双官能连接体。在一些情况下，Y为以上所述的异双官能连接体。在一些情况下，Y包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺基己酰基(mc)或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，Y包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，Y包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，Y包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下，Y包含mc基团。在另外的情况下，Y包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，Y包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，Y包含mc-val-cit-PABA基团。
在一些情况下，L为键或连接体。在一些情况下，L为键。在其他情况下，L为连接体。在一些实施方案中，L为C1-C6烷基。在一些情况下，L为以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，L为以上所述的同双官能连接体。在一些情况下，L为以上所述的异双官能连接体。在一些情况下，L包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺己酰基(mc)或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，L包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，L包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，L包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下，L包含mc基团。在另外的情况下，L包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，L包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，L包含mc-val-cit-PABA基团。
在一些实施方案中，X1和X2各自独立地为键或非聚合连接体。在一些情况下，X1和X2各自独立地为键。在一些情况下，X1和X2各自独立地是非聚合连接体。
在一些情况下，X1为键或非聚合连接体。在一些情况下，X1为键。在一些情况下，X1为非聚合连接体。在一些情况下，该连接体为C1-C6烷基。在一些情况下，X1为C1-C6烷基，例如，C5、C4、C3、C2或C1烷基。在一些情况下，该C1-C6烷基是未取代的C1-C6烷基。如在连接体的语境中，特别是在X1的语境中所使用的，烷基意指含有最多六个碳原子的饱和直链或支链烃基团。在一些情况下，X1包括以上所述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，X1包括异双官能连接体。在一些情况下，X1包括sMCC。在其他情况下，X1包括任选地缀合至C1-C6烷基的异双官能连接体。在其他情况下，X1包括任选地缀合至C1-C6烷基的sMCC。在另外的情况下，X1不包括上文描述的同双官能连接体或异双官能连接体。
在一些情况下，X2为键或连接体。在一些情况下，X2为键。在其他情况下，X2为连接体。在另外的情况下，X2为非聚合连接体。在一些实施方案中，X2为C1-C6烷基。在一些情况下，X2是上文描述的同双官能连接体或异双官能连接体。在一些情况下，X2是上文描述的同双官能连接体。在一些情况下，X2是上文所述的异双官能连接体。在一些情况下，X2包含马来酰亚胺基团，诸如上述马来酰亚胺基己酰基(mc)或自稳定的马来酰亚胺基团。在一些情况下，X2包含肽部分，如Val-Cit。在一些情况下，X2包含苯甲酸基团，如PABA。在另外的情况下，X2包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在另外的情况下，X2包含mc基团。在另外的情况下，X2包含mc-val-cit基团。在另外的情况下，X2包含val-cit-PABA基团。在另外的情况下，X2包含mc-val-cit-PABA基团。
药物制剂
在一些实施方案中，本文所述的药物制剂通过多种给药途径施用于受试者，该给药途径包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内)、口服、鼻内、颊部、直肠或透皮给药途径。在一些情况下，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、鞘内、大脑内、脑室内或颅内)给药。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于口服给药。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于鼻内给药。
在一些实施方案中，所述药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如，纳米颗粒制剂)以及立即和控制释放混合型制剂。
在一些情况下，所述药物制剂包括多颗粒制剂。在一些情况下，所述药物制剂包括纳米颗粒制剂。在一些情况下，纳米颗粒包含cMAP、环糊精或脂质。在一些情况下，纳米颗粒包括固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、自乳化纳米颗粒、脂质体、微乳液或胶束溶液。另外的示例性纳米颗粒包括但不限于顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些情况下、纳米颗粒是金属纳米颗粒，例如钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑及其组合、合金或氧化物的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒包含核或者核和壳，如在核-壳纳米颗粒中。
在一些情况下，纳米颗粒进一步涂覆有用于附接功能元件的分子(例如，与本文所述的多核酸分子或结合部分中的一种或多种)。在一些情况下，涂层包含硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、羧甲基葡聚糖、藻酸、果胶、角叉菜聚糖、岩藻多糖、琼脂胶、紫菜聚糖、刺梧桐胶、结冷胶、黄原胶、透明质酸、葡糖胺、半乳糖胺、壳多糖(或壳聚糖)、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚赖氨酸、聚精氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、卵清蛋白、糊精或环糊精。在一些情况下，纳米颗粒包括石墨烯涂覆的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒具有小于约500nm、400nm、300nm、200nm或100nm的至少一个维度。
在一些情况下，纳米颗粒制剂包含顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯样材料、无机纳米管、树枝状高分子(诸如具有共价连接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳或量子点。在一些情况下，本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。在一些情况下，至少1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个本文所述的多核酸分子或结合部分直接或间接地缀合至纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含递送载体，例如重组载体，将多核酸分子递送到细胞中。在一些情况下，该重组载体是DNA质粒。在其他情况下，该重组载体是病毒载体。示例性的病毒载体包括衍生自腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒的载体。在一些情况下，能够表达多核酸分子的重组载体在靶细胞中提供稳定的表达。在另外的情况下，使用提供多核酸分子的瞬时表达的病毒载体。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择的载体或载体材料。示例性的载体材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这样的酸、碱和缓冲液以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量包含在内。
在一些情况下，所述药物制剂包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这样的盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些情况下，所述药物制剂进一步包含用来稳定化合物的稀释剂，因为它们提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如
Figure BDA0002494424650001234
磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如
Figure BDA0002494424650001235
(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
在一些情况下，所述药物制剂包含崩解剂以便于物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当与胃肠液接触时剂型的溶解和分散。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如National 1551或
Figure BDA0002494424650001231
或羟基乙酸淀粉钠如
Figure BDA0002494424650001232
或
Figure BDA0002494424650001233
纤维素如木制品，甲基结晶纤维素，例如
Figure BDA0002494424650001241
PH101、
Figure BDA0002494424650001242
PH102、
Figure BDA0002494424650001243
PH105、
Figure BDA0002494424650001244
P100、
Figure BDA0002494424650001245
和
Figure BDA0002494424650001246
甲基纤维素，交联羧甲纤维素，或交联纤维素如交联羧甲基纤维素钠
Figure BDA0002494424650001247
交联羧甲基纤维素或交联的交联羧甲纤维素，交联淀粉如羟基乙酸淀粉钠，交联聚合物如聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐如藻酸或藻酸的盐如藻酸钠，粘土如
Figure BDA0002494424650001248
HV(硅酸镁铝)，树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘浆，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合，等等。
在一些情况下，所述药物制剂包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物制剂中，用于预防、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油
Figure BDA0002494424650001249
高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，
Figure BDA00024944246500012410
硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，
Figure BDA00024944246500012411
淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
增塑剂包括用来软化微胶囊化材料或膜涂层以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂也用作分散剂或润湿剂。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
悬浮剂包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
表面活性剂包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如
Figure BDA0002494424650001251
(BASF)等化合物。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。有时，包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
润湿剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些实施方案中，施用本文所述的药物组合物用于治疗应用。在一些实施方案中，该药物组合物每天一次、每天两次、每天三次或更多次施用。该药物组合物每日、每天一次、每隔一天、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更多次施用。该药物组合物施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更久。
在一些实施方案中，一种或多种药物组合物同时、依次或间隔一段时间施用。在一些实施方案中，一种或多种药物组合物同时施用。在一些情况下，一种或多种药物组合物依次施用。在另外的情况下，一种或多种药物组合物间隔一段时间施用(例如，第一药物组合物的第一次施用在第一天，然后在施用至少第二药物组合物之前间隔至少1、2、3、4、5天或更多天)。
在一些实施方案中，两种或更多种不同的药物组合物共同施用。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物同时共同施用。在一些情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，而在施用之间没有时间间隔。在其他情况下，两种或更多种不同的药物组合物依次共同施用，在施用之间间隔约0.5小时、1小时、2小时、3小时、12小时、1天、2天或更久。
在患者的状况确实得到改善的情况下，根据医生的判断，继续给予组合物的施用；或者，将所施用的组合物的剂量暂时减少或暂时暂停某一时间长度(即“休药期”)。在一些情况下，休药期的长度在2天与1年之间不等，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。休药期期间的剂量减少为10％-100％，仅举例而言，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的病况出现改善，如有必要，施用维持剂量。随后，根据症状的变化，可将给药剂量或频率或两者降低至该疾病、病症或病况的改善得以保持的水平。
在一些实施方案中，对应于这样的量的给定药剂的量根据诸如具体化合物、疾病严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特征(例如，体重)等因素而变化，然而其仍然根据与该实例有关的具体情况以本领域已知的方式常规地确定，该具体情况包括例如所施用的具体药剂、给药途径以及所治疗的受试者或宿主。在一些情况下，所需的剂量方便地以单剂量或以分剂量呈现，该分剂量同时(或在短时间段内)施用或以适当的间隔施用，例如每天2、3、4个或更多个亚剂量。
前述范围仅为提示性的，因为关于个体治疗方案的变量的数量巨大，并且相距这些推荐值的相当大的偏差并不罕见。这样的剂量根据多个变量而改变，这些变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、给药方式、受试个体的需求、所治疗的疾病或病况的严重程度以及执业医师的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，包括但不限于LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％在治疗上有效的剂量)的确定。毒性效果与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且表示为LD50与ED50之比。优选表现出高治疗指数的化合物。使用从细胞培养试验和动物研究获得的数据来制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选处于包含ED50且具有最小毒性的循环浓度范围内。根据所用的剂型和所用的给药途径，剂量在该范围内变化。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种组合物和方法一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。
例如，容器包含本文所述的靶核酸分子。这样的试剂盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。
试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。
在一个实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。
在某些实施方案中，药物组合物在含有一个或多个单位剂型的包装或分配器装置中提供，该单位剂型含有本文提供的化合物。例如，该包装包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，该包装或分配器装置伴随有给药说明书。在一个实施方案中，该包装或分配器还伴随有由监管药物制造、使用或销售的政府机构所规定形式的、与容器相关联的公告，该公告反映出该机构已批准该药物形式用于人类或兽医给药。这样的公告例如是由美国食品和药品管理局批准用于处方药的标记或已批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备含有在相容性药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将该组合物置于适当的容器中，并标出用于治疗所指示的病况。
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所请求保护的主题所属领域的技术人员所一般理解的含义相同的含义。应当理解，前面的一般描述和以下详细描述均仅为示例性和说明性的，并非限制任何所请求保护的主题。在本申请中，除非另有具体说明，否则单数的使用包括复数。必须指出，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用是非限制性的。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”还包括准确量。因此，“约5μL”意指“约5μL”，并且还指“5μL”。通常，术语“约”包括预期在实验误差内的量。
本文使用的章节标题仅用于组织结构的目的，而不应理解为限制所描述的主题。
如本文所用的，术语“个体”、“受试者”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物为人。在一些实施方案中，该哺乳动物为非人类。这些术语均不要求或不限于以医疗保健工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇性)为特征的情况。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.反义寡核苷酸序列和合成
合成了二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)、硫代磷酸酯反义寡核苷酸(PS ASO)和反义寡核苷酸(ASO)。
PMO序列是5’GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT3’伯胺(SEQ ID NO:28)并且可见于图1，其末端核苷酸扩展。PMO在分子的3’端含有C3-NH2缀合柄以供缀合。使用标准固相合成方案将PMO完全装配在固相上，并通过HPLC纯化。
PS ASO序列是胺-C6-GGCCAAACCUCGGCUUACCU(SEQ ID NO:29)并且可见于图2A-2B，其末端核苷酸扩展。PS ASO的结构包含磷酸骨架，该磷酸骨架为100％硫代磷酸酯连接，并且所有核糖均含有2’2’OMe修饰。PS ASO还在分子的5’端含有C6-NH2缀合柄以供缀合。使用标准固相亚磷酰胺化学法将PS ASO完全装配在固相上，并通过HPLC纯化。
使用标准固相亚磷酰胺化学法将ASO完全装配在固相上，并通过HPLC纯化。ASO在分子的5’端含有C6-NH2缀合柄以供缀合。
实施例2.DMD外显子跳读的检测
确定分化的C1C12细胞中DMD外显子23跳读的方法
将小鼠成肌细胞C2C12细胞以50,000-100,000/孔接种在24孔板中的0.5mL 10％FBS RPMI 1640培养基中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。在第二天，将细胞转换到分化培养基(2％马血清RPMI 1640和1μM胰岛素)并孵育3-5天。孵育后，加入样品并孵育24小时。样品处理后，每天更换1mL新鲜培养基(不含化合物)再持续2天。在处理开始后72小时，收获细胞。使用InviTrap RNA Cell HTS 96试剂盒(B-Bridge International#7061300400)分离RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse transcription试剂盒(ThermoFisher#4368813)进行逆转录。使用DreamTaqTM PCR Mastermix(ThermoFisher#K1072)进行PCR反应。初级PCR采用表2中的方案，使用外显子20引物(Ex20F 5’-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG)(SEQ ID NO:30)和外显子26引物(Ex26R 5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC)(SEQ ID NO:31)来扩增跳读的和未跳读的分子。
表2.PCR方案
Figure BDA0002494424650001301
Figure BDA0002494424650001311
对于巢式PCR，将初级PCR反应用水稀释100倍，并用5μl进行巢式PCR反应(50μl总反应体积)。巢式PCR采用表3中的方案，使用外显子20引物(Ex20F2：5’-ACCCAGTCTACCACCCTATC)(SEQ ID NO:32)和外显子25引物(Ex25R：5’-CTCTTTATCTTCTGCCCACCTT)(SEQ ID NO:33)来扩增跳读的和未跳读的分子。
表3.巢式PCR方案
热启动 95℃持续2分钟
变性 95℃持续0.5分钟
引物的退火 50℃持续0.5分钟
引物延伸 72℃持续1分钟
最终延伸 72℃持续5分钟
循环数 35
使用4％TAE琼脂糖凝胶分析PCR反应。野生型(WT)DMD产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
动物
所有动物研究均按照机构动物管理和使用委员会(IACUC)的方案在ExploraBioLabs进行，遵守USDA动物福利法案中概述的规定以及“实验动物管理和使用指南(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)”(国家研究委员会(National ResearchCouncil)出版物，第8版，2011年修订)。所有小鼠均获自Charles River Laboratories或Harlan Laboratories。
体内小鼠模型
通过静脉内(iv)注射向WT CD-1小鼠(4-6周龄)给予指定的反义缀合物(ASC)和剂量。“裸”PMO或ASO通过肌肉内注射以指定的剂量给药。在4天、7天或14天后，收获心脏和腓肠肌组织，并在液氮中骤冻。用Trizol和RNeasy Plus 96试剂盒(Qiagen，#74192)分离RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse transcription试剂盒(ThermoFisher#4368813)进行逆转录。如所述进行巢式PCR反应。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应，其通过光密度测定法进行定量。
为了证实在处理的小鼠中的外显子23跳读，从4％琼脂糖凝胶中分离DNA片段并测序。
为了定量地确定跳读的DMD mRNA拷贝数，设计qPCR引物/探针组，以对跳读的和WTDMD mRNA进行定量(图3)。设计qPCR定量标准，并使用如表4所见的设计的PCR引物通过PCR产生。对于WT和DMD的qPCR标准，在PCR后，从琼脂糖凝胶中分离出733个碱基对的片段。对于跳读DMA的qPCR标准，使用巢式引物。
qPCR引物/探针的扩增效率经确定在预期效率的10％以内。按照制造商的说明书，在QuantStudio 7和TaqmanTM PCR Universal Mastermix II(ThermoFisher#4440041)中进行qPCR反应。
表4.
Figure BDA0002494424650001321
实施例3：缀合物合成
分析和纯化方法
分析和纯化方法按照表5-11进行。
表5.大小排阻色谱(SEC)方法
Figure BDA0002494424650001331
表6.疏水相互作用色谱(HIC)方法1
Figure BDA0002494424650001332
表7.疏水相互作用色谱(HIC)方法2
Figure BDA0002494424650001333
表8.疏水相互作用色谱(HIC)方法3
Figure BDA0002494424650001334
表9.疏水相互作用色谱(HIC)方法4
Figure BDA0002494424650001341
表10.强阴离子交换色谱(SAX)方法1
Figure BDA0002494424650001342
表11.强阴离子交换色谱(SAX)方法2
Figure BDA0002494424650001343
抗转铁蛋白受体抗体
使用的抗小鼠转铁蛋白受体抗体或抗CD71 mAb是结合小鼠CD71或小鼠转铁蛋白受体1(mTfR1)的大鼠IgG2a亚类单克隆抗体。该抗体由BioXcell生产，并且可商购获得(目录号BE0175)。
抗CD71抗体吗啉代反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 mAb-PMO)
抗CD71 mAb-PMO缀合
通过加入4当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液并在37℃下孵育4小时，对硼酸盐缓冲液(25mM四硼酸钠，25mM NaCl，1mM二亚乙基三胺五乙酸，pH 8.0)中的抗CD71抗体(10mg/mL)进行还原。通过将DMSO中的PMO(50mg/mL)与DMSO中的10当量SMCC(10mg/mL)一起孵育一小时，将4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)偶联至二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)3’端上的伯胺。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(10mM乙酸钠，pH 6.0)洗涤PMO-SMCC三次并立即使用。将还原的抗体与2.25当量的PMO-SMCC混合，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.5，并在室温下向混合物中加入8当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过疏水相互作用色谱(HIC)方法2分析反应混合物显示了抗体-PMO缀合物以及未反应的抗体和PMO(图4)。图4显示了用HIC方法2产生的抗CD71mAb-PMO反应混合物的色谱图，其中显示游离抗体峰(1)、游离PMO(2)、DAR 1(3)、DAR 2(4)、DAR 3(5)、DAR>3(6)。“DAR”是指药物与抗体之比。括号中的数字是指色谱图中的峰。
纯化
使用HIC方法1，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有药物与抗体之比为1(DAR 1)和2(DAR 2)的缀合物的级分合并，并用MWCO为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元与DAR大于2的缀合物分开浓缩。在分析之前，使用Amicon Ultra-15离心过滤器单元对浓缩的缀合物进行PBS(pH 7.4)缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过大小排阻色谱法(SEC)和HIC来表征分离的缀合物。SEC方法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的PMO(图5A-5C)。图5A显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。图5B显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的色谱图。图5C显示了使用SEC方法1产生的DAR大于2的抗CD71 mAb-PMO的色谱图。“DAR”是指药物与抗体之比。
使用HIC方法2，通过分析型HPLC评估缀合物的纯度(图6A-6C)。图6A显示了使用HIC方法2产生的抗CD71 mAb的色谱图。图6B显示了使用HIC方法2产生的纯化的抗CD71mAb-PMO DAR 1,2缀合物的色谱图。图6C显示了使用HIC方法2产生的纯化的抗CD71 mAb-PMO DAR>2缀合物的色谱图。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的PMO和抗体的标准曲线进行比较，以确认DAR。DAR 1,2样品的平均DAR约为1.6，而DAR大于2的样品的平均DAR约为3.7。“DAR”是指药物与抗体之比。
抗CD71 Fab吗啉代反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 Fab-PMO)
用胃蛋白酶进行的抗体消化
将20mM乙酸盐缓冲液(pH4.0)中的抗CD71抗体(5mg/mL)与固定化的胃蛋白酶在37℃下孵育3小时。除去树脂，使用MWCO为30kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，用PBS(pH7.4)洗涤反应混合物。收集并使用大小排阻色谱(SEC)方法2纯化保留物以分离F(ab’)2片段。
抗CD71(Fab)-PMO缀合
通过加入10当量的TCEP水溶液并在37℃下孵育2小时来还原硼酸盐缓冲液(pH8.0)中的F(ab')2片段(15mg/mL)。通过将DMSO中的PMO(50mg/mL)与DMSO中的10当量SMCC(10mg/mL)孵育1小时，将SMCC添加至PMO 3’端的伯胺。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涤PMO-SMCC三次并立即使用。使用MWCO为10kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元将还原的F(ab')片段(Fab)缓冲液交换到硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中，添加1.75当量的PMO-SMCC，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.5，并在室温下向混合物中加入6当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过疏水相互作用色谱(HIC)方法3分析反应混合物显示了抗CD71(Fab)-PMO缀合物以及未反应的Fab(图7A)。图7A显示了使用HIC方法3对抗CD71 Fab-PMO进行FPLC纯化的色谱图。
纯化
使用HIC方法3，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有DAR为1、2和3的缀合物的级分合并并分别浓缩。在分析之前，使用MWCO为10kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，对浓缩的缀合物进行PBS(pH 7.4)缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过SEC和HIC表征分离的缀合物。SEC方法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的PMO。见图7B-7E。图7B显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab的色谱图。图7C显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。图7D显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。图7E显示了使用SEC方法1产生的抗CD71Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。使用HIC方法4通过分析型HPLC评估缀合物的纯度。见图7F-7I。图7F显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab的色谱图。图7G显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 1缀合物的色谱图。图7H显示了使用HIC方法4产生的抗CD71Fab-PMO DAR 2缀合物的色谱图。图7I显示了使用HIC方法4产生的抗CD71 Fab-PMO DAR 3缀合物的色谱图。“DAR”是指药物与抗体之比。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的PMO和Fab的标准曲线进行比较以确认DAR。
抗CD71抗体硫代磷酸酯反义寡核苷酸缀合物(抗CD71 mAb-PS ASO)
抗CD71 mAb-PS ASO
通过加入4当量的TCEP水溶液并在37℃下孵育4小时来还原硼酸盐缓冲液(pH8.0)中的抗CD71抗体(10mg/mL)。通过将250mM PB(pH 7.5)与DMSO的1:1混合物中的PS ASO(50mg/mL)与DMSO中的10当量SMCC(10mg/mL)一起孵育一小时，将4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)添加至PS ASO的5’端上的伯胺。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(pH 6.0)洗涤PS ASO-SMCC三次并立即使用。将还原的抗体与1.7当量的PS ASO-SMCC混合，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.4，并在室温下向混合物中加入8当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过强阴离子交换色谱(SAX)方法2分析反应混合物显示了抗体-PS ASO缀合物以及未反应的抗体和ASO(图8A)。图8A显示了用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO反应混合物的色谱图，其中显示游离抗体峰(1)、游离PSASO(5)、DAR 1(2)、DAR 2(3)、DAR>2(4)。“DAR”是指药物与抗体之比。括号中的数字是指峰。
纯化
使用SAX方法1，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。将含有药物与抗体之比(DAR)为1、2和3的缀合物的级分合并并分别浓缩，并在分析之前，使用MWCO为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元用PBS(pH 7.4)进行缓冲液交换。
纯化的缀合物的分析
通过大小排阻色谱法(SEC)和SAX来表征分离的缀合物。大小排阻色谱法1用来证实不存在高分子量聚集体和未缀合的ASO。见图8B-8E。图8B显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb的色谱图。图8C显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。图8D显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 2缀合物的色谱图。图8E显示了使用SEC方法1产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。使用SAX方法2，通过分析型HPLC评估缀合物的纯度。见图8F-8H。图8F显示了使用SAX方法2产生的抗CD71mAb-PS ASO DAR 1缀合物的色谱图。图8G显示了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASODAR 2缀合物的色谱图。图8H显示了使用SAX方法2产生的抗CD71 mAb-PS ASO DAR 3缀合物的色谱图。将每个样品的260/280nm UV吸光度比值与已知比例的ASO和抗体的标准曲线进行比较，以确认药物与抗体之比(DAR)。
实施例4：抗CD71 mAb-PMO缀合物的体外活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PMO缀合物。使用与实施例2类似的方法，使用巢式PCR在分化的C2C12细胞中评估缀合物在体外介导外显子跳读的能力。简言之，将“裸”吗啉代ASO(“PMO”)的效力与多种浓度的抗CD71 mAb-PMO缀合物及相关媒介物对照进行比较。对照包括媒介物(“Veh”)、50μM的杂乱(scramble)吗啉代(“Scr50”)和无抗体(“Neg-Ab”)。所用PMO的浓度包括50μM、1μM和0.02μM。所用的抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2的浓度包括200nM、20nM和2nM。“DAR”是指药物与抗体之比。
cDNA合成后，使用两轮PCR扩增(初级和巢式PCR)检测外显子跳读。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应(图9)。
参见图9，抗CD71 mAb-PMO缀合物在分化的C2C12细胞中产生了可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PMO对照的浓度。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
第二个实验包括抗CD71 Fab-PMO缀合物和抗EGFR靶向的PMO(“Z-PMO”)作为阴性对照(图10)。所用PMO的浓度包括10μM和2μM。所用的抗CD71 mAb-PMO的浓度包括0.2μM和0.04μM。抗CD71 mAb-PMO的DAR为2。Z-PMO的使用浓度为0.2μM，DAR为2。抗CD71 Fab-PMO的浓度包括0.6μM和0.12μM。分析了0.6μM和0.12μM的抗-CD71 mAb-PMO的DAR 1、2和3。
参见图10，采用转铁蛋白受体、抗CD71 mAb-PMO和抗CD71 Fab-PMO缀合物的受体介导的摄取在C2C12细胞中导致了可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PMO对照的浓度。在测试的浓度下没有可测量的来自Z-PMO的外显子23跳读，这产生了来自抗CD71缀合物的跳读。
实施例5.抗CD71-ASO mAb PS缀合物的体外活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PS ASO缀合物。使用与实施例2所述类似的方法，使用巢式PCR在分化的C2C12细胞中评估缀合物在体外介导外显子跳读的能力。简言之，将“裸”硫代磷酸酯ASO(“PS ASO”)的效力与多种浓度的抗CD71 mAb-PS ASO缀合物及相关媒介物对照进行比较。在cDNA合成后进行两轮PCR扩增(初级和巢式PCR)以检测外显子跳读。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应(图11)。图11显示了PMO、ASO、DAR1的缀合的抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR1”)、DAR2的缀合的抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR2”)和DAR3的缀合的抗CD71 mAb-ASO(“ASC-DAR3”)的琼脂糖凝胶。“PMO”和“ASO”是指未与抗体缀合的游离PMO和ASO。“媒介物”是指仅有媒介物。测试的浓度包括0.2、1和5微摩尔(μM)。
参见图11，抗CD71 mAb-PS ASO缀合物在分化的C2C12细胞中产生可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PS ASO对照的浓度。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。
实施例6：抗CD71 mAb-PMO缀合物的体内活性
如实施例3所述制备并表征抗CD71 mAb-PMO缀合物。使用与实施例2所述类似的方法，在野生型CD-1小鼠中评估缀合物抗CD71 mAb-PMO DAR1,2抗CD71和mAb-PMO DAR>2在体内介导外显子跳读的能力。“DAR”是指药物与抗体之比。
通过静脉内(iv)注射以表12中提供的剂量向小鼠给予mAb、媒介物对照和反义缀合物(ASC)。“DAR”是指药物与抗体之比。通过肌肉内注射将“裸”PMO以表12中提供的剂量给予腓肠肌。在4天、7天或14天后，收获心脏和腓肠肌组织并在液氮中骤冻。分离RNA，逆转录，并进行巢式PCR反应。在4％TAE琼脂糖凝胶中分析PCR反应，然后通过光密度测定法进行定量。
表12.体内研究设计
Figure BDA0002494424650001401
Figure BDA0002494424650001411
图12A显示了来自施用抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2、抗CD71 mAb-PMO DAR>2、抗CD71mAb、PMO和媒介物4、7或14天的小鼠的腓肠肌样品的凝胶电泳。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2和抗CD71 mAb-PMODAR>2在腓肠肌中产生可测量的外显子23跳读，和低于“裸”PMO对照的浓度。凝胶上的条带强度(图12A)通过光密度测定法进行定量，如图12B所示。图12C显示了使用Taqman qPCR对野生型小鼠腓肠肌中的体内外显子跳读的定量。
图13A显示了来自施用抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2、抗CD71 mAb-PMO DAR>2、抗CD71mAb、PMO和媒介物4、7或14天的小鼠的心脏样品的凝胶电泳。野生型产物具有788个碱基对的预期大小和575个碱基对的跳读DMDΔ23。凝胶上的条带强度(图13A)通过光密度测定法进行定量，如图13B所示。获得与腓肠肌样品相似的结果。抗CD71 mAb-PMO DAR 1,2和抗CD71 mAb-PMO DAR>2在腓肠肌中产生可测量的外显子23跳读和低于“裸”PMO对照的浓度。
然后从4％琼脂糖凝胶中分离DNA片段并测序。测序数据证实了跳读的和野生型产物中的正确序列，如图14所示。
实施例7.序列
表13示出了使用如本文所述的组合物和方法在DMD基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性靶序列。表14示出了使用如本文所述的组合物和方法在DMD基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性核苷酸序列。表15和表16示出了用于在基因中诱导插入、缺失、复制或改变的几种基因中的示例性靶序列。表17示出了用于使用本文所述的组合物和方法在基因中诱导插入、缺失、复制或改变的示例性序列，包括DMD基因中的序列。
表13.
Figure BDA0002494424650001421
表14.
Figure BDA0002494424650001422
Figure BDA0002494424650001431
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Figure BDA0002494424650001461
Figure BDA0002494424650001471
Figure BDA0002494424650001481
*第一个字母表示物种(例如H：人，M：鼠，C：犬)。“#”表示靶DMD外显子编号。“A/D”分别表示在外显子开始和结束时的接受体或供体剪接位点。(x y)表示退火坐标，其中“-”或“+”分别表示内含子或外显子序列。
表15.
Figure BDA0002494424650001482
Figure BDA0002494424650001491
表16.
Figure BDA0002494424650001492
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表17.
Figure BDA0002494424650001502
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Figure BDA0002494424650001671
步骤1：抗体与马来酰亚胺-PEG-NHS缀合，随后与siRNA-
DMD缀合物缀合
用1X磷酸盐缓冲液(pH 7.4)对抗肌养蛋白抗体进行缓冲液交换，并使其浓度达到5mg/ml。向该溶液中加入2当量的SMCC连接体或马来酰亚胺-PEGxkDa-NHS(x＝1、5、10、20)，并在室温下旋转4小时。使用50kDa MWCO Amicon旋转过滤器和PBS pH 7.4通过旋转过滤除去未反应的马来酰亚胺-PEG。收集抗体-PEG-Mal缀合物并转移到反应容器中。使用表13-17中列出的序列合成各种siRNA缀合物。将siRNA-DMD缀合物(2当量)在室温下加入到PBS中的抗体-PEG-马来酰亚胺中并旋转过夜。通过分析型SAX柱色谱法分析反应混合物，可以看到缀合物以及未反应的抗体和siRNA。
步骤2：纯化
使用阴离子交换色谱法，通过AKTA explorer FPLC纯化粗反应混合物。将含有抗体-PEG-DMD缀合物的级分合并，浓缩，并用pH 7.4的PBS进行缓冲液交换。抗体siRNA与SMCC连接体、PEG1kDa、PEG5kDa和PEG10kDa的缀合物基于siRNA加样进行分离。
步骤3：纯化的缀合物的分析
通过质谱法或SDS-PAGE表征所分离的缀合物。使用阴离子交换色谱法通过分析型FIPLC评估缀合物的纯度。
实施例8.另外的序列
表18示出了本文所述的其他多核酸分子序列。
Figure BDA0002494424650001681
Figure BDA0002494424650001691
Figure BDA0002494424650001701
Figure BDA0002494424650001711
Figure BDA0002494424650001721
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Figure BDA0002494424650001751
Figure BDA0002494424650001761
Figure BDA0002494424650001771
实施例9.DMD外显子44和45跳读PMO在转染的原代人骨骼肌细胞中的筛选
按照制造商的说明，将预分化的原代人骨骼肌细胞(Gibco，#A11440)接种到1型胶原蛋白包被的24孔板(Gibco，#1970788)上补充有2％马血清和1x ITS的DMEM(Gibco，#1933286)中。使细胞在37℃+5％CO2中生长2天，以建立肌管。然后用确定浓度的PMO水溶液和2uM Endo-Porter(Gene Tools，#EP6P1-1)处理这些细胞，以促进PMO吸收到细胞中。处理后48小时，通过抽吸培养基来收获细胞，并且每孔加入300ul TRIZOL。在使用Direct-zolTM-96RNA试剂盒(Zymo Research，#R2056)制备RNA之前，将细胞在-80℃下冷冻。用分光光度法对总RNA浓度进行定量。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems，#4368813)对100-200ng总RNA进行逆转录。RT PCR反应在25℃下孵育10min，在37℃下孵育120min，在85℃下孵育5min，然后保持在4℃。用水将反应物1:1稀释。为了通过凝胶电泳对外显子跳读进行定量，使用Taqman Fast Advanced Master混合物(Applied Biosystems，#4444558)和特异性引物对(参见表19)，通过qPCR扩增代表总计(未跳读+跳读)和跳读mRNA的DNA片段。使用QuantStudio 7Flex(Applied Biosystems)，将qPCR反应在95℃下孵育20sec，随后进行32个循环的95℃下1sec和60℃下20sec。用TAE加样缓冲液将PCR产物4:1稀释，然后上样到含有GelGreen的24孔4％TAE凝胶(Embi Tec，#GG3807)上。通过电泳(50V，2小时)分离PCR产物。使用ChemiDoc TM XRS+(Bio-Rad)，通过密度测定法对与总DMD和跳读DMD产物相对应的条带强度进行定量。
Taqman qPCR引物和探针在表19中示出。
Figure BDA0002494424650001781
hDMD总Hs01049401_m1,人DMD VIC-MGB,360反应(Thermo Fisher Scientific)
表20A说明了靶向DMD外显子45的PMO(30聚体)在转染的原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
Figure BDA0002494424650001791
表20B说明了靶向DMD外显子44的PMO(30聚体)在转染的原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
Figure BDA0002494424650001801
Figure BDA0002494424650001811
图15示出了不同长度的hEx45_Ac9 PMO在转染的原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
实施例10.人TfR1 PMO缀合物的合成和纯化
产生了抗人转铁蛋白受体抗体。PMO(28-聚体)由GeneTools合成。通过加入4当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液并在37℃下孵育4小时，对在硼酸盐缓冲液(25mM四硼酸钠，25mM NaCl，1mM二亚乙基三胺五乙酸，pH 8.0)中的抗体(10mg/ml)进行还原。通过将DMSO中的PMO(50mg/ml)与DMSO中的10当量SMCC(10mg/ml)一起孵育一小时，将4(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)偶联至PMO的3’端上的伯胺。使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元，通过超滤除去未缀合的SMCC。用乙酸盐缓冲液(10mM乙酸钠，pH 6.0)洗涤PMO-SMCC三次并立即使用。将还原的抗体与2.25当量的PMO-SMCC混合，并在4℃下孵育过夜。然后将反应混合物的pH降至7.5，并在室温下向混合物中加入8当量的N-乙基马来酰亚胺保持30分钟以猝灭未反应的半胱氨酸。通过疏水相互作用色谱(HIC)方法2分析反应混合物显示了抗体-PMO缀合物以及未反应的抗体和PMO。
使用HIC方法1，用AKTA Explorer FPLC纯化反应混合物。根据缀合物，将含有药物与抗体之比为1(DAR 1)、2(DAR 2)和3(DAR3)的缀合物的级分或含有药物与抗体之比为3+(DAR 3+)或4+(DAR4+)的缀合物的级分合并，并用MWCO为50kDa的Amicon Ultra-15离心过滤器单元浓缩。在分析之前，使用Amicon Ultra-15离心过滤器单元对浓缩的缀合物进行PBS(pH 7.4)缓冲液交换。
疏水相互作用色谱(HIC)方法1。
1.柱：GE,HiScreen Butyl HP,4.7ml
2.溶剂A：50mM磷酸盐缓冲液，0.7M硫酸铵，pH 7.0；溶剂B：80％50mM磷酸盐缓冲液，20％IPA，pH 7.0；流速：1.0ml/min
3.梯度：
Figure BDA0002494424650001821
hTfR1.mAb-PMO缀合物与人转铁蛋白受体的结合
通过ELISA测量抗体缀合物(AOC)的结合。将重组人转铁蛋白受体(SinoBiological 11020-H07H)在PBS中以1ng/uL包被至高结合板(Costar 3690)上过夜。洗板，并以最高10nM的浓度添加AOC或mAb样品。通过HRP缀合的第二抗体(JacksonImmunoresearch 109-035-006)和TMB底物(ThermoFisher 34028)进行显色，并用2N硫酸终止。使用GraphPad Prism测定Kd。
图16示出了hTfR1.mAb-PMO缀合物在体外与人转铁蛋白受体的结合。
TfR1 mAb-PMO缀合物在原代人骨骼肌细胞中的活性
按照制造商的说明，将预分化的原代人骨骼肌细胞(Gibco，#A11440)接种到1型胶原蛋白包被的24孔板(Gibco，#1970788)上补充有2％马血清和1x ITS的DMEM(Gibco，#1933286)中。使细胞在37℃+5％CO2中生长2天，以建立肌管。将来自健康供体的无限增殖化人骨骼肌细胞(Myology Institute Paris)接种到1型胶原蛋白包被的24孔板(Gibco，#1970788)上补充有5％FBS的骨骼肌细胞生长培养基(Promocell，C-23160)中。在成肌细胞达到汇合后，在含有补充有庆大霉素(50ug/ml)(Invitrogen，15750-045)和胰岛素(10ug/ml)(sigma，91077)的DMEM的分化培养基中诱导肌管形成。然后用相应培养基中的确定浓度的AOC处理肌管。处理后72小时，通过抽吸培养基来收获细胞，随后每孔添加300ul TRIZOL。如实施例9中所详述的那样进行RNA分离和DMD外显子跳读的定量。
图17示出了hTfR1.mAb-PMO(28-聚体)缀合物在原代人骨骼肌细胞中的外显子跳读活性。
图18示出了hTfR1.mAb-PMO缀合物在原代和无限增殖化人骨骼肌细胞的肌管中的外显子跳读活性。
尽管已经在本文中示出并描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，在本公开的实践中可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (75)

1.一种多核酸缀合物，其包含与至少一个多核苷酸分子结合的靶细胞结合部分，所述至少一个多核酸分子与DMD基因的前mRNA转录物的靶区域杂交，其中所述至少一个多核酸分子诱导从前mRNA转录物中剪接出外显子，以生成编码功能性肌养蛋白蛋白质的mRNA转录物。
2.根据权利要求1所述的多核酸缀合物，其中所述功能性肌养蛋白蛋白质是肌养蛋白蛋白质的截短形式。
3.根据权利要求1所述的多核酸缀合物，其中所述靶区域在外显子-内含子接界处，其中所述外显子是将被剪接出的外显子。
4.根据权利要求3所述的多核酸缀合物，其中所述外显子是外显子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53或55。
5.根据权利要求3所述的多核酸缀合物，其中所述外显子-内含子接界位于将被剪接出的外显子的5’侧。
6.根据权利要求5所述的多核酸缀合物，其中所述靶区域是所述外显子-内含子接界上游的内含子区域。
7.根据权利要求5或6所述的多核酸缀合物，其中所述靶区域位于所述外显子-内含子接界上游约500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸。
8.根据权利要求3所述的多核酸缀合物，其中所述外显子-内含子接界位于将被剪接出的外显子的3’侧。
9.根据权利要求8所述的多核酸缀合物，其中所述靶标区域是所述外显子-内含子接界下游的内含子区域。
10.根据权利要求8或9所述的多核酸缀合物，其中所述靶区域位于所述外显子-内含子接界下游约500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述靶细胞结合部分与两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者八个或更多个多核酸分子结合。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子的长度为约10个至约50个核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子与选自SEQID NO:964-1285的序列具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:964-1285的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子进一步包含1、2、3或4个错配。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1094、1147-1162或1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
17.根据权利要求16所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1056-1076的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
18.根据权利要求16所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1077-1094的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
19.根据权利要求16所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1147-1162的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
20.根据权利要求16所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含选自SEQ ID NO:1173-1211的碱基序列的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26个或更多个连续碱基。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述结合部分包含抗体。
22.根据权利要求21所述的多核酸缀合物，其中所述抗体包括抗转铁蛋白抗体。
23.根据权利要求1-19中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述结合部分包含血浆蛋白质。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸缀合物包含：
A-(X1-B)n
式(V)
其中，
A包含所述结合部分；
B由所述多核酸分子组成；
X1由键或第一非聚合连接体组成；且
n为选自1-12的平均值。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子包含过客链和指导链。
26.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述指导链包含至少一个修饰的核苷酸间连接、至少一个反向脱碱基部分、至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸或其组合。
27.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述指导链包含约2、3、4、5、6、7、8或9个硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸。
28.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述指导链包含1个硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述硫代磷酸酯修饰的非天然核苷酸位于所述多核苷酸的核苷酸间连接处。
30.根据权利要求26所述的多核酸缀合物，其中所述至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸位于距所述指导链的5’末端约1、2、3、4或5个碱基处。
31.根据权利要求26或30所述的多核酸缀合物，其中所述至少一个5’-乙烯基膦酸酯修饰的非天然核苷酸在2’-位进一步被修饰。
32.根据权利要求31所述的多核酸缀合物，其中所述2’-修饰选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸。
33.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。
34.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链包含100％的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物修饰的非天然核苷酸。
35.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链的长度短于所述指导链，从而产生5’突出端、3’突出端或其组合。
36.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链的长度与所述指导链的长度相等，从而在所述多核酸分子的每个末端产生平端。
37.根据权利要求35或36所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子是二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物/RNA异源双链体。
38.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个肽核酸修饰的非天然核苷酸。
39.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链包含100％的肽核酸修饰的非天然核苷酸。
40.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链的长度短于所述指导链，从而产生5’突出端、3’突出端或其组合。
41.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链的长度与所述指导链的长度相等，从而在所述多核酸分子的每个末端产生平端。
42.根据权利要求40或41所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸分子是肽核酸/RNA异源双链体。
43.根据权利要求25所述的多核酸缀合物，其中所述过客链缀合至A-X1。
44.根据权利要求43所述的多核酸缀合物，其中A-X1缀合至所述过客链的5’端。
45.根据权利要求43所述的多核酸缀合物，其中A-X1缀合至所述过客链的3’端。
46.根据权利要求24或43-45中任一项所述的多核酸缀合物，其中X1为键。
47.根据权利要求24或43-45中任一项所述的多核酸缀合物，其中X1为C1-C6烷基。
48.根据权利要求24或43-45中任一项所述的多核酸缀合物，其中X1为同双官能连接体或异双官能连接体，其任选地缀合至C1-C6烷基。
49.根据权利要求1所述的多核酸缀合物，其进一步包含C。
50.根据权利要求49所述的多核酸缀合物，其中C为聚乙二醇。
51.根据权利要求24-50中任一项所述的多核酸缀合物，其中C经由X2直接缀合至B。
52.根据权利要求51所述的多核酸缀合物，其中X2由键或第二非聚合连接体组成。
53.根据权利要求52所述的多核酸缀合物，其中X2为键。
54.根据权利要求52所述的多核酸缀合物，其中X2为C1-C6烷基。
55.根据权利要求52所述的多核酸缀合物，其中X2为同双官能连接体或异双官能连接体，其任选地缀合至C1-C6烷基。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述过客链缀合至A-X1和X2-C。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的多核酸缀合物，其中A-X1缀合至所述过客链的5’端，并且X2-C缀合至所述过客链的3’端。
58.根据权利要求1-56中任一项所述的多核酸缀合物，其中X2-C缀合至所述过客链的5’端，并且A-X1缀合至所述过客链的3’端。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的多核酸缀合物，其中所述多核酸缀合物包含：
A-X1-(B-X2-C)n
式(VI)
其中，
A包含所述结合部分；
B由所述多核酸分子组成；
C由聚合物组成；
X1由键或第一非聚合连接体组成；
X2由键或第二非聚合连接体组成；且
n为选自1-12的平均值。
60.根据权利要求1所述的多核酸缀合物，其进一步包含D。
61.根据权利要求60所述的多核酸缀合物，其中D为内体溶解部分。
62.一种多核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:1056-1058或1087-1089的碱基序列的至少23个连续碱基，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
63.一种包含SEQ ID NO:1056-1058的多核酸分子，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
64.一种包含SEQ ID NO:1087-1089的多核酸分子，其中所述多核酸分子在长度上包含不超过50个核苷酸。
65.一种药物组合物，其包含：
权利要求1-61的多核酸缀合物或权利要求62-64的多核酸分子；和
药学上可接受的赋形剂。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于全身递送。
67.根据权利要求65或66所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外给药。
68.一种治疗有需要的受试者中以缺陷mRNA为特征的疾病或病况的方法，其包括：
向所述受试者施用权利要求1-61的多核酸缀合物或权利要求62-64的多核酸分子，以诱导外显子的跳读，该外显子跳读导致所述缺陷mRNA产生编码功能性蛋白质的经加工的mRNA，从而治疗所述受试者的所述疾病或病况。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述疾病或病况是神经肌肉疾病、遗传病、癌症、遗传性疾病或心血管疾病。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述神经肌肉疾病是肌营养不良症。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症或强直性肌营养不良。
72.一种治疗有需要的受试者的肌营养不良症的方法，其包括：
向所述受试者施用权利要求1-61的多核酸缀合物或权利要求62-64的多核酸分子，从而治疗所述受试者的所述肌营养不良症。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述肌营养不良症是杜氏肌营养不良症。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
75.一种试剂盒，其包含权利要求1-61的多核酸缀合物或权利要求62-64的多核酸分子。
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