CN111778335A - 用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用 - Google Patents
用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物，以及其在胰腺癌预后和生存判断中的应用。该tsRNA标志物为tRF‑Pro‑AGG‑004和/或tRF‑Leu‑CAG‑002。该标志物可用于制备胰腺癌监测及预后评估的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用。
背景技术
胰腺癌是最致命性的恶性肿瘤类型之一，其5年生存率仅有5％左右，中位生存期少于半年。因此，对于胰腺癌患者来说，能够提前快速地对某种治疗后的预后效果进行判断，以此筛选最佳的治疗方案，显得尤为重要。目前，肿瘤治疗中最常用的一个病理学指标就是肿瘤的分期，但是大量的临床数据表明，及时在同一分期中的肿瘤患者对同样的治疗方式仍然有差异显著的治疗效果。因此，筛选敏感有效的生物标志物，在早期对胰腺癌患者进行治疗预后评估，是改善胰腺癌患者治疗效果、延长患者生存周期的重要途径。
非编码小RNA是近年来肿瘤分子生物学研究领域的热点，RNA高通量测序技术的发展帮助人们发现和鉴定了多种新型非编码小RNA，其中一类被命名为tRNA来源的小RNA(tRNA-derived small RNAs，tsRNAs)。tsRNA长约18-40nt,来源于tRNA成熟体或前体。近期研究发现tsRNA参与调节多种生理、病理功能，包括应激、翻译调控、神经系统疾病、病毒感染、表观遗传等等。研究发现，tsRNA与肿瘤发生发展密切相关，已经有报道发现tsRNA在肺癌、慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌和急性髓细胞白血病中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关。
肿瘤组织的分子表型和特征能够提供更多关于肿瘤治疗、预后评估及存活判断的信息。如果能从手术切除的胰腺癌肿瘤组织中筛选到胰腺癌组织中特异的tsRNAs作为生物标志物，根据其表达对患者手术切除后的治疗及生存预后进行评估，将显著提高胰腺癌患者的治疗效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的主要目的是提出一种用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物，所述的tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：
tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；
tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。
本发明提供了一种原位杂交探针，所述的原位杂交探针检测上述的用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的tsRNA标志物；序列SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。该原位杂交探针是Exiqon公司的3′和5′端标记的锁核酸(LNA)寡核苷酸探针。
本发明提供了上述的tsRNA标志物、原位杂交探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。
本发明提供了一种胰腺癌诊断和预后判断的试剂盒，所述试剂盒用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的tRF-Pro-AGG-004和/或tRF-Leu-CAG-002中的一种或多种的表达量。
进一步的技术方案，所述的试剂盒中含有上述的原位杂交探针。
进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括原杂反应常用的试剂和酶。包括固定液、封闭液、杂交液、洗脱液、显色液等。
本发明的有益效果：
本发明提供的tsRNAs标志物作为胰腺癌诊断的标志物的优势在于：
(1)与传统蛋白生物标志物不同，组织tsRNAs是一种新型生物标志物，表达稳定、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，有助于胰腺癌的预后诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供参考。
(2)本发明的组织tsRNAs试剂盒是一种全面系统的预后判断和监测试剂盒，可用于胰腺癌患者的辅助诊断，有助于反映胰腺癌患者的疾病状态，为临床治疗提供更好的支持。
(3)本发明采用严密的设计和评价体系，初期采用原位杂交技术对60例胰腺癌病人的组织tsRNAs进行检测，并统计分析；保证了组织tsRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
(4)本发明系统的研究了组织tsRNAs在胰腺癌预后生存评估中的作用，揭示了其对胰腺癌诊断和预后的临床价值。因此，本发明获得了胰腺癌组织tsRNAs标志物；通过组织tsRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得胰腺癌的预后评估更加方便易行，为临床治疗提供基础。
附图说明
图1为原位杂交结果显示胰腺癌病人癌和癌旁组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的表达水平。
图2为2种tsRNA在60例胰腺癌病人癌和癌旁组织中的表达水平。
图3为2种tsRNA在存活时间较长的30例胰腺癌病人和存活时间较短的30例胰腺癌病人组织中的表达情况。
图4为生存曲线分析2种tsRNA与胰腺癌病人存活的相关性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例
一种用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物，所述的tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：
tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；
tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。
本发明提供了一种原位杂交探针，所述的原位杂交探针检测上述的用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的tsRNA标志物；序列SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。该原位杂交探针是Exiqon公司的3′和5′端标记的锁核酸(LNA)寡核苷酸探针。
本发明提供了上述的tsRNA标志物、原位杂交探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。
本发明提供了一种胰腺癌诊断和预后判断的试剂盒，所述试剂盒用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的tRF-Pro-AGG-004和/或tRF-Leu-CAG-002中的一种或多种的表达量。
所述的试剂盒中含有上述的原位杂交探针。所述的试剂盒还包括原杂反应常用的试剂和酶。包括固定液、封闭液、杂交液、洗脱液、显色液等。
本发明首先收集了60例胰腺癌病人的癌和癌旁组织样本，分别通过原位杂交(Insitu hybridisation，ISH)实验进行检测，发现了一组与胰腺癌高度相关的tsRNA组织标志物，并基于此研发出可应用于胰腺癌临床诊断的试剂盒，为胰腺癌的筛查和早期诊断提供基础。
具体来说，本发明解决问题的技术方案包括：
(1)收集胰腺癌患者癌和癌旁组织样本；
(2)分别进行组织切片，原杂杂交法检测tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的表达。
(3)基于以上方法，研发试剂盒。
本发明人按照SOP收集符合标准的胰腺癌组织样本，收集完整的病理学资料(包括年龄、性别、病理类型、WHO分级、TMN分期、存活时间等)，接着采用原位杂交方法进行检测。
具体来说包括以下几个部分：
(1)收集病人样本：经影像学诊断、病理学确认的胰腺癌病例；本研究共采用60例符合标准的胰腺癌病人组织样本进行研究。
(2)使用冰冻切片法对胰腺癌癌和癌旁组织进行切片。
(3)原位交杂(ISH)方法
①对组织进行切片固定；
②蛋白酶消化样本；
③使用Exiqon公司的LNA荧光探针进行杂交反应，洗片，进行免疫检测和颜色反应；
④检测比较胰腺癌患者癌和癌旁组织样本中tsRNA的表达变化。
(4)制备胰腺癌tsRNA诊断试剂盒
①通过ISH技术对胰腺癌患者癌和癌旁组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002进行检测，作为辅助胰腺癌预后判断的指标。在此基础上研发胰腺癌诊断试剂盒，该试剂盒包括两个tsRNA的原杂探针，及固定液、封闭液、杂交液、洗脱液、显色液等试剂。
(5)数据分析
所有统计检验均使用GraphPad Prism软件7(圣地亚哥，CA)进行。数据以平均值±SEMs表示。P<0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用Shapiro-Wilk检验和Brown-Forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时，采用t检验分析。
以下是本发明进一步的说明：
本发明分别对60例胰腺癌病人癌组织和相匹配的癌旁组织，运用原位杂交方法检测，如图1所示，发现有tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌组织样本中显著升高，并对2种tsRNA在60例胰腺癌病人癌和癌旁组织中的表达水平进行分析，统计结果如图2所示。
接着根据患者的病理信息资料，将60例患者分为两组：存活较短组(shorter-survival group)和存活较长组(longer-survival group)，每组各30例，分析两组间的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002表达差异。结果显示，存活较短的病人组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002表达水平相对较高，而存活较长的病人组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002表达较低，结果如图3所示。
进一步分析上述两种tsRNAs用于预后判断的效果，生存曲线分析结果显示胰腺癌组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的表达与病人存活时间显著相关，结果如图4所示。
根据上述结果，制备了一种可用于胰腺癌诊断的试剂盒，包含检测患者组织中稳定存在且可检测的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的探针和其他检测试剂。
本发明的tsRNAs标志物及其探针、试剂等组成的相关诊断试剂盒有利于胰腺癌的预后评估，为临床上检测患者的疾病状态提供支持，有利于对患者进行早期治疗并提高胰腺癌患者的生存率。
SEQUENCE LISTING
<110> 王延博
<120> 用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggctcgttgg tctaggggta tgattctcgc 30
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcccactcc tgacacca 18
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
5'-DIG-gagaatcata cccctagacc aacgagcc- DIG-3' 28
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
5'-DIG-ggtgtcagga gtgggat- DIG-3' 17
Claims (8)
1.用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物，其特征在于，所述的tsRNA标志物为以下序列中的中的任意一种或组合：
tRF-Pro-AGG-004：SEQ ID No.1；
tRF-Leu-CAG-002：SEQ ID No.2。
2.一种原位杂交探针，其特征在于，所述的原位杂交探针检测如权利要求1所述的用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的tsRNA标志物；序列SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。
3.权利要求1所述的tsRNA标志物在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。
4.权利要求2所述的原位杂交探针在胰腺癌诊断试剂盒制备中的应用。
5.一种胰腺癌诊断和预后判断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织中的如权利要求1所述的tsRNA标志物中的一种或多种的表达量。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的原位杂交探针。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括原杂反应常用的试剂和酶。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括固定液、封闭液、杂交液、洗脱液、显色液。
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| CN202010692619.9A CN111778335A (zh) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 用于检测胰腺癌的癌组织和癌旁组织的tsRNA标志物、探针及其应用 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522262A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-03-19 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种与胰腺癌相关的tRF及其应用 |
| CN113308530A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-08-27 | 嘉兴市第一医院 | 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048460A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-05-18 | 浙江大学 | 一种新型分子标记及其在制备用于头颈癌诊断和预后的试剂盒中的应用 |
-
2020
- 2020-07-17 CN CN202010692619.9A patent/CN111778335A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048460A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-05-18 | 浙江大学 | 一种新型分子标记及其在制备用于头颈癌诊断和预后的试剂盒中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JUNPENG WANG等: "Expression Profiling of Exosomal miRNAs Derived from the Peripheral Blood of Kidney Recipients with DGF Using High-Throughput Sequencing", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112522262A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-03-19 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种与胰腺癌相关的tRF及其应用 |
| CN113308530A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-08-27 | 嘉兴市第一医院 | 一种带状疱疹的血液tsRNA标志物、制备及应用 |
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