CN111778327B - 评估植物酚类物质抗镉诱导肝损伤的miRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评估植物酚类物质抗镉诱导肝损伤的miRNA及其应用。本发明研究发现，在镉诱导肝脏损伤HepG2细胞模型中，miR‑182‑5p的表达下调；因此，miR‑182‑5p可以作为标志物来诊断镉诱导生物体肝损伤的情况。进一步的，本发明还发现，利用植物酚类物质对镉损伤HepG2细胞进行干预，可显著上调miR‑182‑5p的表达。由此判定，miR‑182‑5p可以作为评估植物酚类物质抗镉损伤能力的miRNA标志物。本发明拓展了miR‑182‑5p的应用方向，也为深入阐释植物酚类物质对镉等重金属诱导肝脏损伤的保护机制开辟新途径。

Description

评估植物酚类物质抗镉诱导肝损伤的miRNA及其应用

技术领域

本发明涉及食品中活性成分健康效应评估技术领域，具体涉及一种评估植物酚类物质抗镉诱导肝损伤的miRNA及其应用。

背景技术

镉是一种世界公认的重金属污染物。我国是镉的开采和利用大国，一些地区土壤、水源镉污染严重，导致粮食、水产品镉含量严重超标，进而影响人和动物的健康。镉可引起人和动物多脏器损伤，其中，肝脏是金属镉长期低水平暴露蓄积量最高的器官，是短期暴露损伤的主要靶标。因此，镉的毒性防治一直为人们所关注。

植物酚类物质具有的药理活性非常广泛，有极强的抗炎、抗氧化活性、抗肿瘤、抗凋亡和防止心血管疾病的作用。植物酚类物质主要由类黄酮、酚酸、单宁等三类物质构成，各类又由许多亚类物质组成。类黄酮中主要包含黄酮、黄酮醇等物质，其中槲皮素是较为常见的黄酮类物质；酚酸分为羟基肉桂酸型和羟基苯甲酸型，其中咖啡酸苯乙酯是较为常见的酚酸衍生物；单宁分为水解单宁和缩聚单宁，其中花青素是常见的单宁类物质；此外，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是常见的植物多酚类物质。研究表明，植物酚类物质具有抵御金属镉诱导的肝脏损伤的作用。但对于如何评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤的能力目前还很少见有报道。

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，参与多种疾病及损伤的病理发展过程，已成为疾病研究的热点之一。miR-182-5p作为miRNA中的一种，已有研究表明miR-182-5p参与肺癌、肝癌、结直肠癌、膀胱癌以及乳腺癌等肿瘤的发生发展，但miR-182-5p是否参与重金属损伤，以及miR-182-5p是否可以作为标志物评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤的能力尚未有研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供miR-182-5p作为标志物在评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力中的应用，本发明为筛选和鉴定抗镉损伤的天然活性成分提供了评价依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供miR-182-5p作为标志物在制备诊断镉诱导生物体肝损伤的产品中的应用。

上述应用中，所述产品包括：检测miR-182-5p的试剂。

进一步的，所述试剂包括：特异性识别miR-182-5p的探针，或者特异性扩增miR-182-5p的引物。

优选的，所述特异性扩增miR-182-5p的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供miR-182-5p作为标志物在评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力中的应用。

上述应用中，所述植物酚类物质包括：槲皮素、花青素、EGCG和咖啡酸苯乙酯。

本发明的第三方面，提供检测miR-182-5p的试剂在制备评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力的产品中的应用。

优选的，所述检测miR-182-5p的试剂包括：特异性扩增miR-182-5p的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的第四方面，提供一种评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力的方法，包括以下步骤：

(1)构建镉诱导肝脏损伤的细胞模型，以U6表达量为内参，计算镉诱导肝脏损伤细胞模型中miR-182-5p/U6表达量的比值，记为A；

(2)采用植物酚类物质对镉诱导肝脏损伤的细胞模型进行处理，计算处理后的细胞模型中miR-182-5p/U6表达量的比值，记为a；

(3)将正常细胞中miR-182-5p/U6比值设为1，根据如下公式评估植物酚类物质抗镉损伤能力；

抗镉损伤能力(R)＝|A-a|/1*100％。

优选的，步骤(1)中，构建的镉诱导肝脏损伤的细胞模型为HepG2细胞模型。

本发明的有益效果：

本发明研究发现，在镉诱导肝脏损伤HepG2细胞模型中，miR-182-5p的表达下调；因此，miR-182-5p可以作为标志物来诊断镉诱导生物体肝损伤的情况。进一步的，本发明还发现，利用植物酚类物质对镉损伤HepG2细胞进行干预，可显著上调miR-182-5p的表达。由此判定，miR-182-5p可以作为评估植物酚类物质抗镉损伤能力的miRNA标志物。本发明拓展了miR-182-5p的应用方向，也为深入阐释植物酚类物质对镉等重金属诱导肝脏损伤的保护机制开辟新途径。

附图说明

图1A为本发明具体实施例中MTT实验检测镉对HepG2细胞存活率的影响示意图。

图1B为本发明具体实施例中MTT实验检测槲皮素、EGCG、咖啡酸苯乙酯、花青素等植物酚类物质对HepG2细胞存活率的影响示意图。

图2为本发明具体实施例中荧光定量PCR检测槲皮素、EGCG、咖啡酸苯乙酯、花青素等植物酚类物质对HepG2细胞中miR-182-5p相对表达量的影响示意图。

图中的“+”表示添加有对应的物质；“-”表示未添加有对应的物质。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

本发明中的miR-182-5p记载在mirBase中，在基因组中的定位为：chr7:129770383-129770492；MiRNA ID为：hsa-miR-182-5p；miR-182-5p的核苷酸序列为：UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU(SEQ ID NO.3)。

正如背景技术部分所介绍的，植物酚类物质具有抵御金属镉诱导的肝脏损伤的作用。但对于如何评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力目前还很少见有报道。本专利发明人致力于重金属损伤机制的研究多年，在前期的研究中发现，环状RNA--hsa_circ_0040768可以作为标志物来评估植物酚酸类物质抗镉损伤的能力。为进一步拓展可以作为评估植物酚酸类物质抗镉损伤能力的标志物，本发明将研究重点转移至miRNA上。miRNA广泛存在于动植物中，并参与转录后基因表达调控。来源于不同生物、或生物体不同组织部位的miRNA表现出不同的生物学功能，对于不同种类的miRNA是难以预测其功能的。

miR-182-5p是其中一种miRNA，目前主要作为癌症的分子标志物和治疗靶点，有研究发现miR-182-5p在结直肠癌患者直肠粘膜组织中异常高表达，与结直肠癌不良预后呈正相关；还有研究表明，miR-182-5p在非小细胞肺癌细胞中过表达可促进细胞生长、集落形成能力和细胞周期进程，并抑制细胞凋亡。但还未见有关于miR-182-5p在镉诱导肝脏损伤中的相关报道。

本发明首先构建了镉诱导肝损伤HepG2细胞模型，考察镉诱导的肝损伤细胞组织中的生理活性物质变化情况，结果意外的发现，在镉诱导肝脏损伤HepG2细胞模型中，miR-182-5p的表达下调。由此，miR-182-5p可以作为标志物来诊断镉诱导生物体肝损伤的情况。

植物酚酸类物质具有抵御金属镉诱导的肝损伤的作用，因此，本发明利用植物酚酸类物质对镉损伤HepG2细胞进行干预，结果发现，经植物酚酸类物质干预后，miR-182-5p的表达明显有所上调。这表明miR-182-5p与植物酚酸类物质抵御金属镉诱导的肝损伤的能力呈相关性，因此，miR-182-5p可以作为评估植物酚类物质抗镉损伤能力的miRNA标志物。

为了能够有效的利用miR-182-5p作为标志物来评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤的能力。本发明进一步的以U6表达量为内参，通过构建植物酚类物质抗镉损伤能力评估公式：R＝|A-a|/1*100％来定量评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤的能力，R值越大，则植物酚酸类物质抗镉损伤的能力越强。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：评估咖啡酸苯乙酯(CAPE)对镉诱导肝脏损伤HepG2细胞模型的保护能力

一、构建镉诱导肝脏损伤模型

1.MTT法检测镉对HepG2细胞存活率的影响

HepG2细胞以1×10⁵个/ml密度接种于96孔板中，每孔200μL，重复5孔。置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h使细胞融合约80％-90％，弃去旧培养液，加入不同浓度(5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM)的氯化镉，培养24h后，弃废液，每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液，培养24h后弃去旧培养液，每孔加入100μL有机溶剂二甲基亚飒(DMSO)终止培养，不断震荡l0min使甲攒结晶物充分溶解，在570nm波长下分别测定溶液的吸光度(OD)值。

公式为：细胞活性(％)＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/(正常对照孔OD值-空白孔OD值)×100％。

结果见图1A，结果显示，镉会对HepG2细胞产生毒性，在镉浓度为25μM以上时会诱导HepG2细胞存活率下降约50％。后续试验中选择以浓度为25μM的氯化镉构建镉诱导肝脏损伤模型。

2.实时定量检测镉对HepG2细胞miR-182-5p表达的影响

(1)引物设计

在mirBase数据库中查找为miR-182-5p的序列，然后设计引物。

miR-182-5p的上游引物：5′-GGCAATGGTAGAACTCACACT-3′，(SEQ ID NO.1)

miR-182-5p的下游引物：5′-TCCAGGAGCTCACAATCTAGT-3′，(SEQ ID NO.2)

(2)miR-182-5p表达水平检测

采用荧光定量PCR法检测miR-182-5p表达水平；实时定量PCR检测miR-182-5p表达，以U6作为内对照，计算标准后的2-△△Ct值表示miR-182-5p的相对表达量，将正常细胞中miR-182-5p/U6设为1。

△Ct(n)＝Ct目的基因(n)－Ct内参基因(n)；△△Ct(n)＝△Ct(n)－△Ct(1)；Ct＝-1/lg(1+Ex)*lgX₀+lgN/lg(1+Ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，X₀为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

结果显示，镉损伤诱导miR-182-5p的表达下调，降低miR-182-5p/U6的比值(A)至64％(图2)。

二、咖啡酸苯乙酯对镉损伤HepG2细胞模型的保护作用

1.MTT法检测咖啡酸苯乙酯对镉诱导肝脏损伤HepG2细胞存活率的影响

以咖啡酸苯乙酯为例：四组细胞(正常对照组，咖啡酸苯乙酯对照组，镉损伤模型组，咖啡酸苯乙酯干预组)；其中：

正常对照组为采用常规的培养液培养HepG2细胞；咖啡酸苯乙酯对照组为在常规的培养液中添加10μM的咖啡酸苯乙酯；镉损伤模型组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉；咖啡酸苯乙酯干预组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉和10μM的咖啡酸苯乙酯。

结果显示，咖啡酸苯乙酯保护使细胞存活率升高至80％-90％；显示咖啡酸苯乙酯对镉诱导的损伤具有保护作用(图1B)。

2.实时定量检测咖啡酸苯乙酯对镉损伤HepG2中miR-182-5p/U6比值的影响

(1)实时定量PCR检测miR-182-5p的表达，具体方法与实施例1的相同。

结果显示，镉损伤组miR-182-5p/U6的比值(A)约为64％，咖啡酸苯乙酯保护组miR-182-5p/U6的比值(a)约为89％(图2)。

3.构建植物酚类物质抗镉损伤能力评估公式：R＝|A-a|/1*100％。

结果显示，R＝|A-a|/A*100％，R＝25％。

实施例2：评估EGCG对镉损伤HepG2细胞模型的保护能力

1.MTT法检测EGCG对镉损伤HepG2细胞存活率的影响

以EGCG为例：四组细胞(正常对照组，EGCG对照组，镉损伤模型组，EGCG干预组)；正常对照组为采用常规的培养液培养HepG2细胞；EGCG对照组为在常规的培养液中添加10μM的EGCG；镉损伤模型组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉；EGCG干预组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉和10μM的EGCG。

2.实时定量检测EGCG对镉损伤HepG2中miR-182-5p/U6比值的影响

实时定量PCR检测miR-182-5p的表达，具体试验方法与实施例1相同。

结果显示，镉损伤组miR-182-5p/U6的比值(A)约为63％，EGCG保护组miR-182-5p/U6的比值(a)约为92％，R＝|A-a|/1*100％，(R)约为29％(图2)。

实施例3：评估槲皮素(quercetin)对镉损伤HepG2细胞模型的保护能力

1.MTT法检测槲皮素对镉损伤HepG2细胞存活率的影响

以槲皮素为例：四组细胞(正常对照组，槲皮素对照组，镉损伤模型组，槲皮素干预组)；正常对照组为采用常规的培养液培养HepG2细胞；槲皮素对照组为在常规的培养液中添加10μM的槲皮素；镉损伤模型组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉；槲皮素干预组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉和10μM的槲皮素。

2.实时定量检测槲皮素对镉损伤HepG2中miR-182-5p/U6比值的影响

实时定量PCR检测miR-182-5p的表达，具体试验方法与实施例1相同。

结果显示，镉损伤组miR-182-5p/U6的比值(A)约为60％，槲皮素保护组miR-182-5p/U6的比值(a)约为83％，R＝|A-a|/1*100％，(R)约为23％(图2)。

实施例4：评估花青素(anthocyanin)对镉损伤HepG2细胞模型的保护能力

1.MTT法检测花青素对镉损伤HepG2细胞存活率的影响

以花青素为例：四组细胞(正常对照组，花青素对照组，镉损伤模型组，花青素干预组)；正常对照组为采用常规的培养液培养HepG2细胞；花青素对照组为在常规的培养液中添加10μM的花青素；镉损伤模型组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉；花青素干预组为在常规的培养液中添加25μM的氯化镉和10μM的花青素。

2.实时定量检测花青素对镉损伤HepG2中miR-182-5p表达的影响

实时定量PCR检测miR-182-5p的表达，具体试验方法与实施例1相同。

结果显示，镉损伤组miR-182-5p/U6的比值(A)约为59％，花青素保护组miR-182-5p/U6的比值(a)约为88％，R＝(A-a)/1*100％，(R)约为29％(图2)。

结论：说明miR-182-5p对于植物酚类物质抗镉损伤的评估具有较高的灵敏度和特异性，植物酚类物质保护上调miR-182-5p/U6的比值(a)；miR-182-5p/U6的比值变化(R)＝|A-a|/1*100％，可用于判断植物酚类物质的抗镉诱导肝脏损伤的能力。

通过上述实施例可以看出，植物酚类物质保护能够升高miR-182-5p/U6，具有调节植物酚类物质的抗镉诱导肝脏损伤能力。

本发明首次提出miR-182-5p作为评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力的标志物，且在镉诱导肝脏损伤的细胞模型中，植物酚类物质显著升高miR-182-5p/U6的比值，为评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力提供一种miRNA标志物，为开发一种新的镉损伤保护剂提供实验依据，为深入阐释植物活性成分参与保护镉等重金属诱导肝脏损伤的调控分子机制开辟新途径。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 评估植物酚类物质抗镉诱导肝损伤的miRNA及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcaatggta gaactcacac t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaggagct cacaatctag t 21

<210> 3

<211> 24

<212> RNA

<213> miR-182-5p

<400> 3

uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

Claims (7)

1.检测miR-182-5p表达量的试剂在制备诊断镉诱导生物体肝损伤的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：特异性扩增miR-182-5p的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增miR-182-5p的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.检测miR-182-5p表达量的试剂在制备评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力的产品中的应用；

所述植物酚类物质为槲皮素、花青素、EGCG或咖啡酸苯乙酯。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测miR-182-5p表达量的试剂包括：特异性扩增miR-182-5p的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.一种评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力的方法，其特征在于，所述方法不用于疾病的诊断或治疗，包括以下步骤：

（1）构建镉诱导肝脏损伤的细胞模型，以U6表达量为内参，计算镉诱导肝脏损伤细胞模型中miR-182-5p/U6表达量的比值，记为A；

（2）采用植物酚类物质对镉诱导肝脏损伤的细胞模型进行处理，计算处理后的细胞模型中miR-182-5p/U6表达量的比值，记为a；

（3）将正常细胞中miR-182-5p/U6比值设为1，根据如下公式评估植物酚类物质抗镉诱导肝脏损伤能力；

抗镉诱导肝脏损伤能力（R）=|A-a|/1*100%；

步骤（2）中，所述植物酚类物质为槲皮素、花青素、EGCG或咖啡酸苯乙酯。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，构建的镉诱导肝脏损伤的细胞模型为HepG2细胞模型。

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