CN111777662B - 一种活性多肽、制备方法和在抗衰老化妆品方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性多肽、制备方法和在抗衰老化妆品方面的应用。皮肤衰老的重要表现包括：皮肤抗氧化能力下降，从而出现老化；胶原蛋白、弹性蛋白逐渐流失，从而出现皱纹、松弛。本发明提供了一种活性多肽，该活性多肽一方面可以提高人皮肤成纤维细胞的抗氧化能力，这可能与活性多肽可以提高人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力有关；另一方面可以提高人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白的含量，从而可以克服皮肤皱纹和松弛。因此，本发明提供的活性多肽具有抗皮肤衰老的作用，可以作为抗衰老活性成分用于制备抗衰老化妆品。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，涉及一种活性多肽、制备方法和在抗衰老化妆品方面的应用。
背景技术
抗衰老一直是化妆品行业中长期关注的焦点，延缓皮肤衰老是大部分人的追求目标之一。一直以来都有很多人热衷于抗衰老实验的研究，并开发出很多有关抗衰老的化妆品。
皮肤衰老是其受内部及外部因素影响而使人体机能或快或慢自然发展的一个过程，主要是由于内源性老化和外源性老化。内源性老化作为不可抗拒的复杂的自然规律，主要表现为细胞代谢逐渐减缓，胶原蛋白逐渐流失，胶原质受到破坏，激素分泌出现失调，脂肪含量开始减少，部分细胞自然消亡等，反映在皮肤上就是肌肤失去弹性、光泽，干枯产生皱纹，更甚者出现黑色素沉着、加速老年斑产生等情况。外源性老化主要是受环境污染，过量紫外线照射等因素影响。皮肤衰老主要是从表皮层以及表皮-真皮连接层、真皮层逐渐表现，如肌肤出现皱纹就是皮肤衰老的一个主要标志，由于其皮肤厚度转薄，导致胶原蛋白流失，弹性纤维断裂，从而出现皱纹、松弛等皮肤衰老问题。
目前，在抗衰老化妆品中，多肽是最热门的几种抗衰老成分之一。具有抗衰老活性的多肽的研究因此也是层出不穷。
发明内容
本发明是为了提供一种活性多肽、制备方法和在抗衰老化妆品方面的应用。
本发明技术方案如下：
一种活性多肽，通过如下步骤制备：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用pH为8.5～9.5的氢氧化钠水溶液常温浸提，提取液以4000～5000r/min的转速离心8～12min；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入无水乙醇使乙醇终体积百分浓度为60％，充分搅拌后低温静置10～14h，以7500～8500r/min的转速离心15～25min，收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得艾蒿叶多肽粗提物；
步骤S5，凝胶柱层析：取艾蒿叶多肽粗提物用蒸馏水溶解，上样于Sephadex G-25凝胶色谱柱，以PBS缓冲液进行洗脱，流速1mL/min，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，收集第2个洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥即得。
优选地，步骤S1中，每公斤艾蒿叶使用8～12L体积的石油醚脱脂1～3次，每次1～2h。
优选地，步骤S2中，每公斤艾蒿叶使用6～10L体积的氢氧化钠水溶液常温浸提1～3次，每次6～10h。
优选地，步骤S3中，活性炭用量为0.2％w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min。
优选地，步骤S4中，低温指4℃。
优选地，步骤S5中，Sephadex G-25凝胶色谱柱的内径和柱床高度为1:10。
上述活性多肽用于提高皮肤抗氧化能力的用途。
上述活性多肽用于提高皮肤中胶原蛋白含量的用途。
上述活性多肽用于提高皮肤中弹性蛋白含量的用途。
上述活性多肽用于制备抗衰老化妆品的用途。
有益技术效果：
本发明提供了一种多肽，该多肽从艾蒿叶中分离得到。该活性多肽一方面可以提高人皮肤成纤维细胞的抗氧化能力，这可能与活性多肽可以提高人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力有关；另一方面可以提高人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白的含量，从而可以克服皮肤皱纹和松弛。由此可见，本发明提供的活性多肽具有抗皮肤衰老的作用，可以作为抗衰老活性成分用于制备抗衰老化妆品。
附图说明
图1为凝胶柱层析洗脱监测色谱图；
图2为各组人皮肤成纤维细胞增殖活力比较；
图3为各组人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力比较；
图4为各组人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白含量的比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：活性多肽的制备
一、试验材料
原料为干燥的艾蒿叶，艾蒿叶为菊科蒿属艾蒿Artemisia argyi Lévl.etVant.的叶。
活性炭为常规的脱色用活性炭粉，化学试剂均为常规试剂。
二、方法和结果
制备步骤如下：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂，每公斤艾蒿叶使用10L石油醚脱脂2次，每次1.5h；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用pH为9.0的氢氧化钠水溶液常温浸提，提取液以4500r/min的转速离心10min；其中，每公斤艾蒿叶使用8L体积的氢氧化钠水溶液常温浸提2次，每次8h；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；其中，活性炭用量为0.2％w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入无水乙醇使乙醇终体积百分浓度为60％，充分搅拌后4℃静置12h，以8000r/min的转速离心20min，收集上清液，50℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得艾蒿叶多肽粗提物；
步骤S5，凝胶柱层析：取艾蒿叶多肽粗提物用蒸馏水溶解(10mg/mL)，上样于内径和柱床高度比为1:10的Sephadex G-25凝胶色谱柱(上样体积为柱床体积的1/10)，以PBS缓冲液进行洗脱，流速1mL/min，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，图1为凝胶柱层析洗脱监测色谱图，收集第2个洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥即得。
实施例2：活性多肽的抗衰老活性
一、试验材料
活性多肽为实施例1制备，-20℃保存备用。
人皮肤成纤维细胞(HDF)购自赛默飞，为冻存的HDF-a细胞，来自成人皮肤的正常人皮肤成纤维细胞，于原代培养结束时冻存。
小牛血清、DMEM培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。
人过氧化氢酶(CAT)酶联免疫分析试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
二、试验方法
1、细胞培养
将HDF细胞用含10％小牛血清、1％青霉素和1％链霉素的DMEM培养基于37℃、5％CO2、相对饱和湿度条件培养，2～3d传代，取对数生长期细胞进行试验。
2、MTT法测定细胞增殖活力
取对数生长期HDF细胞，调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔200μL，培养24h后随机分为正常对照组、氧化损伤组、多肽防护组。多肽防护组用含有不同终质量浓度活性多肽(5、10、20μg/mL)的完全培养基继续培养，正常对照组和氧化损伤组用正常的完全培养基继续培养，24h后，氧化损伤组和多肽防护组更换为含有150μM H2O2的完全培养基继续培养12h。弃培养液，PBS洗涤，每孔加入100μL浓度为0.5mg/L的MTT溶液，孵育4h，小心吸弃孔内液体，每孔加150μLDMSO，振荡10min，在酶标仪490nm波长下测定各孔光吸收值A，根据公式计算细胞增殖活力。正常对照组、氧化损伤组和多肽防护组的各浓度分别设5个复孔。细胞增殖活力＝A氧化损伤组或多肽防护组/A正常对照组×100％。
3、试剂盒测定过氧化氢酶的活力
设置对照组和多肽组，多肽组用含有不同终质量浓度活性多肽(10、20μg/mL)的完全培养基培养，对照组用正常的完全培养基培养，72h后，离心弃上清，PBS洗涤后稀释成1×106个/mL细胞溶液，反复冻融制备细胞浆，离心取细胞上清液，按照人过氧化氢酶(CAT)酶联免疫分析试剂盒的说明书测定过氧化氢酶活力，平行实验3次。
4、Western blot法测定I型胶原蛋白(Collagen I)、弹性蛋白(Elasticin)的含量
设置对照组和多肽组，多肽组用含有不同终质量浓度活性多肽(10、20μg/mL)的完全培养基培养，对照组用正常的完全培养基培养，72h后，离心弃上清，PBS洗涤后稀释成1×106个/mL细胞溶液，反复冻融制备细胞浆，离心取细胞上清液，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶80V、30min，分离胶90min，将凝胶湿转到PVDF膜，5％脱脂牛奶常温封闭2h，4℃下一抗Collagen I、Elasticin、GAPDH孵育过夜，PBST洗膜3次，每次约15min，取相应的二抗常温孵育1.5h，PBST洗膜3次，每次15min，PVDF膜采用碧云天ECL发光液，用发光仪进行显影，拍照分析。
5、数据处理
所有数据采用SPSS15.0软件处理，以均值±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
三、试验结果
1、活性多肽对人皮肤成纤维细胞抗氧化损伤能力的影响
各组细胞增殖活力如表1和图2所示，与正常对照组相比，氧化损伤组HDF细胞的增殖活力显著下降；与氧化损伤组相比，多肽防护组HDF细胞的增殖活力显著升高。这说明，HDF细胞在氧化损伤环境中的增殖活力显著降低，而使用实施例1制备的活性多肽预先干预后，HDF细胞对氧化损伤的抗性显著提高，抗氧化损伤能力显著增强。
表1各组细胞增殖活力
2、活性多肽对人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力的影响
各组细胞中过氧化氢酶活力如表2和图3所示，与对照组相比，多肽组人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力显著升高，且与活性多肽的给药浓度正相关。本领域技术人员知道，过氧化氢酶活力的高低直接关系到细胞的抗氧化能力，过氧化氢酶活力越高，细胞抗氧化能力越强。
表2各组细胞中过氧化氢酶活力
3、活性多肽对人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白含量的影响
各组细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白含量如图4所示，与对照组相比，多肽组人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白含量显著升高。
皮肤衰老的重要表现包括：皮肤抗氧化能力下降，从而出现老化；胶原蛋白、弹性蛋白逐渐流失，从而出现皱纹、松弛。上述试验表明，本发明提供的活性多肽一方面可以提高人皮肤成纤维细胞的抗氧化能力，这可能与活性多肽可以提高人皮肤成纤维细胞中过氧化氢酶活力有关；另一方面可以提高人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、弹性蛋白的含量，从而可以克服皮肤皱纹和松弛。因此，本发明提供的活性多肽具有抗皮肤衰老的作用，可以作为抗衰老活性成分用于制备抗衰老化妆品。
Claims (1)
1.一种活性成分用于制备抗衰老化妆品的用途，所述抗衰老指提高皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白含量，该活性成分通过如下步骤制备：
步骤S1，脱脂：将干燥的艾蒿叶粉碎后用石油醚热回流脱脂，每公斤艾蒿叶使用10L石油醚脱脂2次，每次1.5h；
步骤S2，提取：将脱脂并挥干溶剂的艾蒿叶用pH为9.0的氢氧化钠水溶液常温浸提，提取液以4500r/min的转速离心10min；其中，每公斤艾蒿叶使用8L体积的氢氧化钠水溶液常温浸提2次，每次8h；
步骤S3，脱色：取离心后的上清液加入活性炭搅拌脱色，离心收集上清液；其中，活性炭用量为0.2% w/v，脱色温度为75℃，脱色时间为30min；
步骤S4，醇沉：向脱色离心后的上清液中加入无水乙醇使乙醇终体积百分浓度为60%，充分搅拌后4℃静置12h，以8000r/min的转速离心20min，收集上清液，50℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得艾蒿叶粗提物；
步骤S5，凝胶柱层析：取艾蒿叶粗提物用蒸馏水溶解配制成浓度为10mg/mL的溶液，上样于内径和柱床高度比为1:10的Sephadex G-25凝胶色谱柱，上样体积为柱床体积的1/10，以PBS缓冲液进行洗脱，流速1mL/min，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，收集第2个洗脱峰对应的洗脱液，冷冻干燥即得。
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