CN111733157B - 一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法，该方法包括从NK细胞分泌的外泌体中获得具有靶向能力和结合位点的miRNA，再进行碱基替换以使其与病毒基因组序列的部分区域完全匹配，从而获得靶向病毒的特异性miRNA。通过该方法获得的特异性miRNA与病毒的基因组序列的部分区域完全匹配，其亲和力强，因此具有有效的抗病毒能力；而且与aNK外泌体中内容物具有极高的相似性，安全可控。

Description

一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法

技术领域

本发明涉及一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是真核生物中存在的一类20个核苷酸长度左右的内源性非编码RNA，可以与mRNA结合从而调控基因的表达。目前,在人类基因组中已知的miRNA有2000种,miRNA几乎在所有生物途径中都发挥着重要作用，其表达谱的变化与许多人类疾病相关。miRNA通过抑制翻译和诱导mRNA降解来抑制基因的表达,在病毒的复制或抑制过程中也是如此。

病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒依赖宿主细胞而存活，其感染复制周期大致包括：吸附、穿入、脱壳、生物合成(病毒核酸复制；病毒蛋白质合成)、装配与释放。根据病毒核酸类型的不同，动物病毒可以分为三大类：DNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒、RNA病毒。其中，DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、肝炎病毒等，DNA和RNA逆转录病毒包括肉瘤病毒和艾滋病毒等，RNA病毒包括SARS冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒等。

目前针对病毒性传染病的防治主要以抗病毒抑制剂及特异性疫苗的研制与应用为主。然而，大多数病毒性疾病至今尚无特效抑制剂，而能够应用疫苗进行防治的病毒性疾病也很少。

目前抗RNA病毒都是基于病毒复制过程依赖宿主细胞的RNA聚合酶等机理而研发特异性的RNA聚合酶抑制剂(小分子化合物，瑞德西韦)，而此类抑制剂的研发周期长、失败率高，使得开发针对逆转录酶的特异性抑制剂难度很大，此外，COVID-19病毒的RNA可以直接指导蛋白质合成，RNA聚合酶抑制剂对此根本无效。

SARS-CoV-2作为全新发现的单股正链RNA病毒，依赖宿主细胞进行新病毒的合成。虽然目前COVID-19病毒基因组全测序已经完成，但是COVID-19病毒在宿主细胞内的复制和调控过程仍有待研究。冠状病毒的正链RNA进入宿主细胞后，可以直接作为mRNA链指导蛋白质的合成；也可以通过依赖RNA的RNA聚合酶(RDRP)作用，生成负链，再以负链为模板，在RDRP作用下，生成正链，达到复制的目的。同时，生成的正链也可作为mRNA指导蛋白质的合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法，通过该方法获得的特异性miRNA与病毒的基因组序列的部分区域完全匹配，其亲和力强，因此具有有效的抗病毒能力。

本发明的另一个目的在于提供一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法，通过该方法获得的特异性miRNA与激活的NK细胞(以下简称aNK)分泌的外泌体(以下简称aNK外泌体)中获得miRNA具有极高的相似性。外泌体是一类由细胞分泌的携带胞质组分的纳米级别的膜性小泡，机体各种各样的细胞都能分泌这类膜性小泡，其广泛分布于唾液、血浆、乳汁等体液中。外泌体中含有蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性物质，通过膜融合的方式将内容物如miRNA和蛋白质传递给其他细胞，作为细胞之间相互交流的桥梁。因此，与aNK外泌体内容物有极高相似性的特异性miRNA安全可控。

具体的，该方法至少包括：

(1)从激活的NK细胞分泌的外泌体中获得miRNA；

(2)将步骤1获得的miRNA序列和病毒基因组序列进行比对，筛选出具有靶向能力和结合位点的miRNA；

(3)对步骤2筛选得到的miRNA进行分别进行碱基替换，以使其与病毒基因组序列的部分区域完全匹配，从而获得靶向病毒的特异性miRNA。

所述病毒包括但不限于甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)、新冠病毒COVID-19(MN908947.3)。

所述的病毒的基因组序列包括但不限于病毒的全基因组序列，或该病毒包含的某个功能蛋白的序列，例如，COVID-19病毒S蛋白存在于病毒表面，是COVID-19病毒进入人体细胞的核心蛋白，病毒失去了S蛋白将不再能够进一步感染人体细胞；而人体本身没有S蛋白，攻击COVID-19病毒S蛋白不会造成副作用。因此，可以针对COVID-19病毒S蛋白的序列进行比对筛选。

在某些较为优选的实施例中，先按照miRNA与病毒基因组序列结合能力进行排序，针对结合能力强的miRNA进行碱基替换。miRNA与病毒基因组序列结合能力越强，需要替换的碱基数量越低，替换后得到的miRNA的安全性越高。

所述激活的NK细胞可以为经IL-21激活的NK细胞，但不限于此。基于经IL-21激活的NK细胞分泌的外泌体，针对COVID-19病毒S蛋白的序列进行比对筛选，得到的具有靶向能力和结合位点的miRNA至少包括SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示的miRNA；SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示的miRNA经所述碱基替换后，得到的特异性miRNA如SEQ ID NO.1～SEQID NO.12所示。

通过大量实验证明，不同于现有的NK细胞和RNA聚合酶抑制抗病毒机制，上述SEQID NO.1～SEQ ID NO.12所示的特异性miRNA均能特异性靶向COVID-19病毒S蛋白mRNA，促进COVID-19病毒S蛋白mRNA在宿主细胞内被剪切和降解，阻断COVID-19病毒S蛋白的合成，抑制COVID-19病毒侵袭能力，快速和高效的降低病人体内的病毒拷贝数。

本发明的有益效果在于：

(1)从抑制侵袭蛋白的机制出发，特异性好，速度快，效果显著；

(2)不同于蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂等抗病毒制剂治疗病毒感染患者，本发明不具有副作用，安全可控；

(3)可通过与常规治疗方案联合使用增强治疗效果；

(4)miRNA可以人工合成、外泌体可低温储存，成本低，可以实现大规模的生产。

附图说明

图1透射电镜观察aNK外泌体的形态图(A)和aNK外泌体对HEK-293细胞的细胞毒性测试图(B)；

图2 Werstern blot检测aNK外泌体的蛋白表达情况图；

图3流式细胞仪检测aNK细胞和aNK外泌体的表面蛋白表达情况图；

图4 miRNA靶向病毒基因组的生物信息学结果；

图5具有COVID-19病毒基因组靶向能力的miRNA的Energy和Score分布图；

图6在不同载体中的人工碱基替换miRNA抑制COVID-19病毒spike蛋白的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1:aNK外泌体的获取及其结构特征

1.1收集IL-21培养18天的NK细胞培养液以获得激活后的NK细胞aNK，流式细胞仪检测aNK细胞的纯度达到95％以上，并且培养液无细菌和支原体污染。

1.2aNK细胞培养液通过台式低速离心机400g离心5min去除细胞沉淀，收集上清4度保存待用。

1.3采用中空纤维切向过滤系统(Spectrum Laboratories KrosFlo Research IITFF System)对培养液中的外泌体进行纯化。首先，利用0.45μm mPES中空纤维过滤柱(P-S02-E45U-10-N)去除细胞培养液中的细胞碎片；滤出液进一步通过截留分子量在300-kDa的mPES中空纤维过滤柱(S02-E300-05-N)进行浓缩，获得外泌体粗制品；为了进一步缩小体积并且去除残余的培养基和盐离子，用3倍体积的PBS对外泌体粗制品进行稀释，并采用截留分子量在300-kDa的mPES中空纤维过滤柱(D02-E300-05-N)进行浓缩，得到纯度很高的外泌体。

1.4将获取的外泌体用去离子水重悬，取少量外泌体置于有碳涂层的铜网，去除多余的水分，并用2％乙酸铀酰进行染色，自然干燥后利用透射电镜观察外泌体的形态和大小。如图1A所示，TEM结果显示分离的aNK外泌体具有典型的外泌体结构，呈现内部半透明、椭圆、大小不一的封闭膜结构。

1.5用BCA蛋白定量试剂盒对外泌体进行蛋白定量，并用裂解液释放外泌体中的蛋白，采用Werstern blot方法对外泌体Marker蛋白CD63、ALIX，aNK外泌体特有的NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和perforin进行检测。如图2所示，与HEK-293细胞相比，aNK外泌体含有NK细胞特有的细胞毒受体NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和穿孔素。

1.6将获取的外泌体，用thermo fisher scientific的4微米latex beads与外泌体结合，然后用流式抗体孵育。采用流式细胞学方法对aNK外泌体表面蛋白NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D进行检测。如图3所示，与aNK细胞相同，aNK外泌体含有NK细胞特有的细胞毒受体NKp30、NKp44、NKp46和NKG2D。

为了确认aNK细胞所分泌的外泌体是否具有细胞毒性，我们将aNK细胞外泌体作用于HEK-293细胞。将实施例1获得的aNK外泌体按照不同比例加入HEK-293细胞，通过CCK-8试剂盒检测细胞的活力来评估aNK外泌体对HEK-293细胞的细胞毒性，测试结果如图1B所示。与阴性对照(不加入任何制剂)相比，200μg/ml以下的aNK外泌体对细胞没有任何的细胞毒性。

实施例2:aNK外泌体miRNA测序

根据实施例1获得的aNK外泌体，委托南京世和基因生物技术有限公司对aNK外泌体中miRNA进行测序。采用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set forIllumina(NEB,USA)进行建库，并对待测序样本添加测序接头。采用Illumina X-ten PE150平台对样本进行测序，每个样本至少300M reads。为了减少假阳性，信噪比大于100的独立序列纳入miRDeep log-odds score的计算，并设置miRDeep log-odds score的范围为-10～10.为了发掘aNK外泌体中全新的miRNA，以miRDeep score＝0作为cut-off值，所有超过cut-off值的miRNA作为全新的miRNA。测序结果显示，aNK细胞外泌体中存在大量的miRNA表达(43.92％)，说明miRNA在外泌体调控过程中具有重要作用。通过测序中发现了1162个已知的miRNA和全新序列的miRNA有148个。

实施例3:aNK外泌体miRNA测序和病毒基因组序列的比对分析

从NCBI数据库下载甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)、新冠病毒COVID-19(MN908947.3)的基因组序列。

如图4A所示，将aNK外泌体测序获得的miRNA序列和病毒基因组序列分别输入miRanda v3.3a软件进行比对，设置Gap Open Penalty:-9.0；Gap Extend Penalty:-4.0；Score Threshold:140；Energy Threshold:1kcal/mol；Scaling Parameter:4.0。通过miRanda软件和Lunix服务器的大数据计算，我们获得了针对这19种病毒基因组具有靶向能力和结合位点的miRNA种类和数量，如图4B所示。

我们对每一种病毒基因组上能够匹配的miRNA的Energy和Score进行了分析，如图5A和B所示。

实施例4:aNK外泌体miRNA优化及其抗COVID-19病毒性能

图6为实施例2获得的1162个已知的miRNA和全新序列的miRNA有148个miRNA与COVID-19病毒12个功能区域(包括E蛋白、N蛋白、M蛋白、ORF1ab等)能够匹配的Energy和Score。从图中可以看出，激活后的NK细胞外泌体包含有大量靶向COVID-19病毒的几个核心结构mRNA的miRNA。

COVID-19病毒S蛋白存在于病毒表面，是COVID-19病毒进入人体细胞的核心蛋白。病毒失去了S蛋白将不再能够进一步感染人体细胞，而人体本身没有S蛋白，攻击COVID-19病毒S蛋白不会造成副作用。因此，以下工作以S蛋白的mRNA作为靶标。

将实施例2筛选得到的miRNA输入到miRanda v3.3a软件进行比对，设置Gap OpenPenalty:-9.0；Gap Extend Penalty:-4.0；Score Threshold:140；Energy Threshold:1kcal/mol；Scaling Parameter:4.0。通过miRanda软件和Lunix服务器的大数据计算，我们获得了miRNA针对COVID-19病毒S蛋白mRNA的结合能力(energy)评估，根据结合能力(energy)进行排序，优选出12个结合能力(energy)最强的miRNA：hsa-miR-6734-5p、hsa-miR-4793-3p-2、hsa-miR-12159、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-12238-1、hsa-miR-365a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-12238-2、hsa-miR-4793-3p-1(依次如SEQ ID NO.13～24所示)。

将上述12个结合能力(energy)最强的miRNA进行碱基替换，以使其与COVID-19病毒S蛋白的部分区域完全匹配，如下表1中(M)所示。

表1：12个miRNA及碱基替换后的miRNA(M)的结合能

将上述碱基替换后的miRNA(M)(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12)进行结合能力(energy)测试，从表中可以看出，其结合能力(energy)显著增强。

上述碱基替换后的miRNA(M)(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12)可以完全通过人工设计合成。

将hsa-miR-6734-5p、hsa-miR-4793-3p-2、hsa-miR-12159、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-12238-1、hsa-miR-365a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-4723-5p、hsa-miR-12238-2、hsa-miR-4793-3p-1及碱基替换后的miRNA(M)分别以终浓度5nM与转染载体Genmute、单核细胞所分泌的外泌体分别进行共孵育，待孵育结束后以载体浓度12.5μg/ml加入HEK-293细胞中。通过ELISA检测细胞中COVID-19病毒spike蛋白的OD值来评估miRNA对COVID-19病毒的抑制能力。测试结果如图6A(转染载体Genmute)、6B(单核细胞分泌的外泌体)所示。图中C表示未经碱基替换的miRNA，M表示碱基替换后的miRNA。

通过与阴性对照Blank组对比，可以证明，碱基替换前后的miRNA均能抑制COVID-19病毒spike蛋白的表达，实现COVID-19病毒的抑制，尤其是碱基替换后的hsa-miR-6734-5p(M)、hsa-miR-4793-3p-2(M)、hsa-miR-12159、hsa-miR-125a-3p(M)、hsa-miR-30c-1-3p(M)、hsa-miR-12238-1(M)、hsa-miR-365a-5p(M)、hsa-miR-221-3p(M)、hsa-miR-1244(M)、hsa-miR-4723-5p(M)、hsa-miR-12238-2(M)、hsa-miR-4793-3p-1(M)均能显著的抑制COVID-19病毒spike蛋白的表达，且联合所有的miRNA(M)抑制spike蛋白表达的效果最为明显。

单纯的单核细胞所分泌的外泌体和转染载体Genmute均无法抑制COVID-19病毒spike蛋白的表达，而人为的在单核细胞外泌体中加载碱基替换后的miRNA则具有抑制COVID-19病毒spike蛋白表达的能力。

最后说明的是，以上实施例，尤其是NK细胞的激活方法、aNK外泌体的获取方法等等，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 上海嘉慷生物工程有限公司

<120> 一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

cugaggcaag gacauaagau gauag 25

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

acuacaccau gaggugcuga cu 22

<210> 3

<211> 24

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

ucugagagag ggucaagugc acag 24

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

acaaaugagg ucucuagcag ca 22

<210> 5

<211> 24

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

cugagagagg gucaagugca cagu 24

<210> 6

<211> 25

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

gcugacugag ggaaggacau aagau 25

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

agggacuucu gugcaguuaa c 21

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

agcuacacua cgugcccgcc gag 23

<210> 9

<211> 26

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gaguaaguug aucugcauga auagca 26

<210> 10

<211> 25

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

gagggaagga cauaagauga uagcc 25

<210> 11

<211> 24

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

acuugcugug gaagaaagug aguc 24

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

gcuacacuac gugcccgccg agg 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

uugaggggag aaugaggugg aga 23

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

ucugcacugu gaguuggcug gcu 23

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

ucugggagug gggcuguggg ugg 23

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

acaggugagg uucuugggag cc 22

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

cugggagagg guuguuuacu cc 22

<210> 18

<211> 25

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

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ucccaggguc ggcuguggua gcccu 25

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

agggacuuuu gggggcagau gug 23

<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

agcuacauug ucugcugggu uuc 23

<210> 21

<211> 26

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

aaguaguugg uuuguaugag augguu 26

<210> 22

<211> 24

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 22

ugggggagcc augagauaag agca 24

<210> 23

<211> 25

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 23

ucccaggguc ggcuguggua gcccu 25

<210> 24

<211> 23

<212> RNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 24

ucugcacugu gaguuggcug gcu 23

Claims (4)

1.一种靶向病毒的特异性miRNA的获得方法，其特征在于，该方法至少包括：

（1）从激活的NK细胞分泌的外泌体中获得miRNA；所述激活的NK细胞为经IL-21激活的NK细胞；

（2）将步骤1获得的miRNA序列和病毒基因组序列进行比对，筛选出具有靶向能力和结合位点的miRNA；所述病毒基因组序列为编码病毒的功能蛋白的序列；

（3）对步骤2筛选得到的miRNA分别进行碱基替换，以使其与病毒基因组序列的部分区域完全匹配，从而获得靶向病毒的特异性miRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、1型艾滋病毒、2型艾滋病毒、人乳头瘤病毒6型、人乳头瘤病毒11型、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒58型、麻疹病毒、狂犬病毒、SARS冠状病毒、埃博拉病毒、或新冠病毒COVID-19。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2的病毒基因组序列为COVID-19病毒的S蛋白的mRNA序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，先按照miRNA与病毒基因组序列结合能力进行排序，针对结合能力强的miRNA进行碱基替换。