CN111728977A - 罗汉果苷iie在制备消炎食品、保健品或药品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药用天然产物技术领域，具体涉及罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的应用。本发明研究发现罗汉果苷IIE剂量依赖地抑制细胞中iNOS、COX‑2和PGE2的表达，并抑制了三种典型炎症细胞因子的产生；其也可以明显降低JNK、p‑38、MEK和IκBα的磷酸化水平，说明其通过抑制MAPK‑NF‑κB炎症信号通路和PI3K/AKT1信号通路的激活来发挥其抗炎效果。本发明提出了罗汉果苷IIE的新应用，为罗汉果的开发利用提供了新的方向，同时罗汉果苷IIE作为一种食品功能成分，毒副作用较小，可用于消炎类食品、保健品或药品的制备，市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于药用天然产物技术领域，具体涉及罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的应用。
背景技术
罗汉果(Corsvenor Momordica Fruit)是葫芦科的多年生草本植物，主要分布在我国部分南部地区，具有良药佳果之称，作为民间疗法治疗肺淤血，咽喉痛和便秘数百年。在中国，该植物因其作为甜味水果而备受推崇，广泛应用于药用和食品甜味剂。
罗汉果苷IIE(Mogroside IIE)是一种典型的三萜皂苷，具有苦味，是不到50天青涩罗汉果果实内最主要含有的成分,这一苦味化合物在果实成熟至70天缓慢消失，它同时也是市售甜味剂罗汉果苷V的前体和代谢产物。罗汉果苷V作为一种低热量食品添加剂，由于其具有抗氧化，抗致癌物质和抗炎等特性，成为了最具潜能的化学预防物质之一，也被认为是炽手可热的商业糖代用品，在我国罗汉果苷V作为膳食补充剂可以无限制地添加在各类食品当中。随着食品和医药行业对罗汉果苷V的需求逐渐增加，苦味物质罗汉果苷IIE的潜在价值也变得更加重要，但每年在收获季节的后期，有相当多不适应天气条件的苦果被丢弃。很多年来，虽然人们试图改进栽培和育种方法，以减少生长停滞的影响，但还是有大量的未成熟果实被遗弃，很多罗汉果苷IIE未被利用，同时其生物活性至今鲜有人进行全面的研究和阐述。申请号为2019100276527的发明专利中公开了罗汉果苷IIE在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，其具体公开了罗汉果苷IIE通过抑制腺泡细胞本底的胰蛋白酶活性，并抑制急性胰腺炎诱导剂——雨蛙素对胰蛋白酶原的激活作用，同时其抑制胰蛋白酶原的激活与组织蛋白酶B有关，因此罗汉果苷IIE可用于制备胰蛋白酶抑制剂。
炎症(Inflammation)是指生物体内特定的组织应对某些有害物质刺激所产生的一系列复杂的生物和化学反应，这种生化反应是指血管、细胞和分子的保护性措施。炎症的发生在一定程度上修复了刺激物带给细胞和组织的损伤。然而，如果炎症刺激一直持续下去，炎症反应可能会对宿主自身的细胞和组织产生不利影响，从而导致一系列慢性疾病的产生。
发明内容
针对目前罗汉果苷IIE利用率较低的技术问题，本发明的目的是提供一种罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的新应用，罗汉果苷IIE通过抑制MAPK-NF-κB炎症信号通路，减少了炎症靶标蛋白iNOS和COX-2的表达，并抑制了炎症因子PGE2的产生，从而发挥其抗炎特性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的应用。
所述罗汉果苷IIE的结构式为：
进一步地，所述食品或保健品中包括罗汉果苷IIE作为活性成分。
进一步地，所述食品或保健品中还包括食品添加剂或食品原料。
进一步地，所述食品添加剂为防腐剂、着色剂、甜味剂、矫味剂、膨松剂、增稠剂、乳化剂、消泡剂的其中一种或多种。
进一步地，所述药品中包括罗汉果苷IIE作为活性成分。
进一步地，所述药品中还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质的其中一种或多种。
进一步地，所述药品的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂的其中一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明研究发现罗汉果苷IIE剂量依赖地抑制细胞中一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化合酶2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)的表达，并抑制了炎症因子PGE2的产生；罗汉果苷IIE也可以明显降低JNK、p-38、MEK和IκBα的磷酸化水平，说明其通过抑制MAPK-NF-κB炎症信号通路来发挥其抗炎效果。罗汉果苷IIE还抑制PI3K/AKT1信号通路的激活。因此罗汉果苷IIE能够通过调节PI3K/AKT1-Nrf2/ARE信号通道来抵抗氧化应激并发挥其抗炎效果。本发明提出了罗汉果苷IIE的新应用，为罗汉果的开发利用提供了新的方向，同时罗汉果苷IIE作为一种食品功能成分，毒副作用较小，可用于消炎类食品、保健品或药品的制备，市场前景广阔。
附图说明
图1为罗汉果苷IIE对RAW264.7细胞存活的影响。
图2为罗汉果苷IIE对炎症蛋白酶的影响。
图3为罗汉果苷IIE对PGE2的影响。
图4为罗汉果苷IIE对MAPKs家族蛋白的磷酸化水平影响。
图5为罗汉果苷IIE对IκBα磷酸化水平的影响。
图6为罗汉果苷IIE对AKT磷酸化水平的影响。
图7为罗汉果苷IIE对谷草转氨酶(AST)水平的影响。
图8为罗汉果苷IIE对谷丙转氨酶(ALT)水平的影响。
图9为罗汉果苷IIE对白细胞介素-1b(IL-1b)水平的影响。
图10为罗汉果苷IIE对白细胞介素-6(IL-6)水平的影响。
图11为罗汉果苷IIE对干扰素-γ(IFN-γ)水平的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中罗汉果苷IIE来源于湖南绿蔓生物科技股份有限公司或实验室自制，通过高效液相色谱纯化使其纯度≥98％。小鼠巨噬细胞RAW 264.7来自于美国ATCC模式细胞中心，其他所使用的材料均可自常规途径购买得到。
应用例
本应用例提供一种罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的应用。
所述食品或保健品中还包括食品添加剂或食品原料，所述食品添加剂为防腐剂、着色剂、甜味剂、矫味剂、膨松剂、增稠剂、乳化剂、消泡剂的其中一种或多种。
所述药品中还包括药学上可接受的辅料，所述辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质的其中一种或多种；所述药品的剂型可为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂或注射剂等。
实施例1MTT法检测罗汉果苷IIE对RAW264.7细胞存活的影响
在美国ATCC模式细胞中心购买小鼠巨噬细胞RAW264.7。培养在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，培养箱环境为恒定37℃和充斥着稳定的5％CO2气体。经过细胞复苏、细胞培养、细胞传代和细胞计数后，使用MTT比色法进行细胞毒性测定，检测罗汉果苷IIE对RAW264.7细胞存活的影响。
具体测定步骤如下：
准备好96孔板，收集状态好的细胞，铺板使待测细胞调密度至4×104/孔，边缘孔培养基填充，确认细胞生长状态良好后即可加入浓度梯度的待测药物，设置好合适的梯度，并设置复孔，放入培养箱培养16-48小时。移出96孔板中的旧培养基，替换为新鲜的无血清培养基，放置于培养箱中37℃预培养2.5小时。加入罗汉果苷IIE于96孔板中，37℃培养箱继续培养2小时培养过后每孔加入20ul MTT溶液(0.5％MTT)，继续培养，等待测样品与MTT反应完成，终止培养，拿出96孔板，倾斜孔板以便吸除孔内培养液，把150ul二甲基亚砜分别加在每个孔内，低速摇动10min使结晶物完全溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测定每个孔的吸光度。
本实施例设置了空白、80μM、160μM、320μM和640μM五个梯度来检测罗汉果苷IIE对细胞存活率的影响情况。分别在3h、6h、9h和12h的时候检测其吸光度，检测结果如图1所示,检测到的吸光度越高代表细胞增殖越快，具有活力，样品毒性也就越小，如下图所示当样品浓度在0-160mg/ml的时候，吸光度随着浓度的上升而增加，而在160μM之后，吸光度随之下降，且这一结果不受时间的影响。说明在样品浓度为160μM时样品有促进细胞增殖提高细胞活力的作用，而之后随着样品浓度的增加细胞的生长会受到阻碍。同时平均间隔三个小时进行了测定，发现当处理时间为12h时，变化趋势最明显，样品效果也最好。因此以下实施例中将样品浓度控制在320μM之内进行，并且于巨噬细胞处理时间为12个小时时收取其蛋白进行实验。
实施例2罗汉果苷IIE对RAW 264.7细胞中炎症蛋白酶的影响效果
诱导型一氧化氮合酶(iNOS)可以由多种细胞产生，在哺乳动物中，iNOS在细胞损伤和宿主防御中起重要作用。某些炎性介质例如细菌产物脂多糖(LPS)和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)是iNOS基因表达的有效诱导物。在免疫细胞内，iNOS可以诱发NO生成，而NO是一种机体保护免受各种病原体伤害的细胞毒性剂，一氧化氮本身及其不稳定，研究起来十分困难，所以测定生成一氧化氮的酶更为方便快捷。
环氧化合酶2(Cyclooxygenase，COX-2)是两种COX亚型之一，是花生四烯酸代谢的关键酶，环氧化合酶催化花生四烯酸生成前列腺素，前列腺素是胃、肾功能、炎症、发热和疼痛等多种生理和病理生理过程的重要介质，因此，研究COX-2抑制剂可以有效的预防急性和慢性炎症的发生。
本实施例通过测定小鼠巨噬细胞中COX-2和iNOS两种炎症蛋白合酶的表达情况研究罗汉果苷IIE对RAW 264.7细胞中炎症蛋白酶的影响效果，结果如图2所示。
如图2两条免疫印迹条带所示，在样品处理巨噬细胞12个小时后，随罗汉果IIE添加量上升，COX-2和iNOS两种蛋白合酶的表达量梯度下降，灰度值分析中可以看出COX-2在添加量为20μM、40μM和80μM都有明显的被抑制作用(p<0.05)，在添加量为160μM有显著性效果(p<0.01)。此外，iNOS在罗汉果IIE添加80μM和160μM时也有显著性的下降趋势(p<0.01)。由上述结果可知，罗汉果IIE对COX-2和iNOS两种炎症蛋白合酶都有抑制作用，且两种蛋白酶的表达随着样品浓度的上升均有梯度下降的趋势，呈量-效依赖关系。因此得知罗汉果IIE是通过抑制两种酶蛋白iNOS和COX-2的表达，来抑制下游炎症因子的表达。
实施例3罗汉果苷IIE对RAW 264.7细胞中前列腺素E2(PGE2)的影响效果
PGE2是一种重要的脂质介质，它通过自分泌和旁分泌方式向四种不同的G蛋白偶联受体传递信号。PGE2的作用主要是传递信号和参与基因的表达，诱导了各种病理生理反应，如脑部炎症、发热、血管扩张等。当机体受到生理或病理的有害刺激时，PGE2会被大量被释放，通过和靶细胞上的特异受体结合而参与多种炎性反应和促进肿瘤的形成。
本实施例通过测定PGE2的表达来研究罗汉果苷IIE的抗炎活性，测试结果如图3所示：LPS能促进PGE2的产生，但随着罗汉果IIE浓度的增加，PGE2的含量也随之有梯度的下降，当样品浓度达到在40μM时，PGE2的含量明显降低(p<0.05)。继续添加样品使其浓度达到80μM和160μM的时候，PGE2含量与对照组相比，有显著性的下降的趋势(p<0.01)。这说明随着罗汉果IIE添加量增加，能阻止炎症模型细胞中PGE2的生成。
实施例4罗汉果苷IIE对MAPKs信号通路的影响
MAPKs是调控细胞组织的急性应激反应和生长发育的一系列信号转导通路。它可以被内毒素LPS激活从而使NF-κB活化，把信号从胞外传至胞内，在炎症信号传导过程中发挥着不可或缺的作用。通过以上实施例得知罗汉果苷IIE是通过抑制iNOS和COX-2的表达，来抑制下游炎症因子的表达。同时发现随着罗汉果苷IIE浓度的增加，炎症因子PGE2分泌减少。本实施例通过对MAPKs家族几个主要蛋白：p-38、MEK和JNK进行实验，测定炎症信号传导过程中的变化。本实施例采用不同含量的罗汉果苷IIE处理RAW 264.7细胞1h后，收集其蛋白，采用蛋白免疫印迹的方法测定其表达情况，结果如图4所示。
图4中条带可以看出MEK、JNK和p-38的磷酸化水平被内毒素LPS刺激均有明显的提高。在样品浓度为25μM和50μM时，p-38的磷酸化水平明显被抑制，灰度值分析结果也说明，细胞内总p-38没有发生变化，但磷酸化p-38的水平随着罗汉果苷IIE浓度的增加呈梯度地下降；图中MEK的条带和灰度值分析结果和p-38的结果类似，与非磷酸化MEK的表达相比，在罗汉果苷IIE添加量为12.5μM时，并无明显的变化效果，当添加量至25μM时，磷酸化MEK表达水平明显被抑制(p<0.05)，当样品添加量至50μM时能显著地降低磷酸化MEK(p<0.01)；JNK的结果显示，在罗汉果苷IIE添加量为12.5μM和25μM时，JNK磷酸化水平有下降趋势，但其效果并不明显，当样品含量增加至50μM时才明显的抑制(p<0.05)，罗汉果苷IIE并没有影响非磷酸化JNK蛋白的变化。
结果显示，在炎症模型细胞中，罗汉果苷IIE单体对MAPKs信号通路中三个关键性蛋白：p-38、MEK和JNK的磷酸化水平都有明显的抑制效果，且不影响这些蛋白的非磷酸化水平表达。图4的灰度值分析可以看出p-38、MEK和JNK的磷酸化水平和样品添加量之间的抑制作用呈量-效依赖关系。
实施例5罗汉果苷IIE对NF-κB信号通路的影响效果
NF-κB信号通路中的经典途径主要是通过激活I-κB激酶，磷酸化诱导I-κBα抑制剂的蛋白水解，从而使细胞核内的炎症蛋白和炎症因子进行表达。因此，本实施例探究了罗汉果苷IIE对IκBα磷酸化水平的影响。
研究发现在样品浓度过高时，整体水平无明显变化，因此选择12.5μM、25μM和50μM三个梯度的低浓度样品进行实验，结果如图5所示，显示IκBα磷酸化水平的表达在添加了罗汉果苷IIE三个梯度浓度时均有差异性，样品浓度为25μM时具有显著性的抑制效果(P<0.05)，添加量为50μM时表现出完全抑制IκBα磷酸化的表达(p<0.001)。
由上说明，罗汉果苷IIE对NF-κB这条信号通路的活化同样也具有显著性抑制效果。
实施例6罗汉果苷IIE对PI3K/AKT1信号通路的影响
PI3K/AKT1信号通路在活性氧的产生和解毒过程中有重要的作用，AKT1也参与了炎症反应的调节。所以通过测定AKT1，可以进一步验证罗汉果苷IIE的抗炎作用。
如图5所示，细胞培养(1×106个细胞)并用罗汉果苷IIE(12.5-50μM)处理，检测总蛋白激酶和磷酸化蛋白激酶，用相应的抗体进行Western Blot实验。在LPS的刺激下，磷酸化AKT1被诱导，细胞内总AKT1没有变化，当罗汉果苷IIE加入，AKT1的磷酸化水平呈剂量依赖性被抑制，在样品添加量为25μM时，抑制效果明显(p<0.05)；罗汉果苷IIE浓度为50μM的时候，AKT1磷酸化水平显著性下降(p<0.01)。结果显示，罗汉果苷IIE通过调控AKT1来影响PI3K/AKT1信号通路的激活，从而调节细胞内氧化应激，实现抗炎和抗氧化的效果。
综上所述，在由LPS诱导的RAW 264.7炎症细胞模型中，利用蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附实验测定了细胞中iNOS、COX-2和PGE2的表达，结果发现经过罗汉果苷IIE处理后它们的表达随着样品浓度的上升均有梯度下降的趋势。罗汉果苷IIE通过抑制蛋白酶iNOS和COX-2的表达，抑制了炎症因子PGE2的表达，发挥了其抗炎特性。
同时罗汉果苷IIE对脂多糖诱导的炎症信号通路影响调查发现，罗汉果苷IIE可以明显抑制p-38、MEK、JNK和IκBα的磷酸化水平，罗汉果苷IIE是通过抑制MAPK-NF-κB炎症信号通路，减少相关通路蛋白和炎症因子的产生，发挥其抗炎特性。
通过研究罗汉果苷IIE对磷酸化AKT1的影响，还发现罗汉果苷IIE抑制了PI3K/AKT1信号通路的激活。因此罗汉果苷IIE可能通过调节PI3K/AKT1-Nrf2/ARE信号通道来抵抗氧化应激并发挥其抗炎效果。
通过上述研究可知，罗汉果苷IIE可应用于制备消炎食品、保健品、药品中，具有广泛的市场前景。
实施例7罗汉果苷ⅡE对肝脏转氨酶的影响
选取八周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠60只，控制其体重在25±2g的范围内。转氨酶(transaminase)是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶。普遍存在于动物、植物组织和微生物中，心肌、脑、肝、肾等动物组织以及绿豆芽中含量较高。转氨酶是人体肝脏正常运转过程中必不可少的“催化剂”，是肝脏的一个“晴雨表”，肝细胞是转氨酶的主要生存地。当肝细胞发生炎症、中毒、坏死等时会造成肝细胞的受损，转氨酶便会释放到血液里，使血清转氨酶升高。
(1)试剂配制
罗汉果苷ⅡE溶液配制：取1g罗汉果苷ⅡE粉末溶于40mL生理盐水，涡旋混匀，得到的浓度为25mg/mL，定义为高浓度；取25mg/mL浓度溶液5mL稀释至25mL，则浓度为5mg/mL，定义为为中浓度；取中浓度溶液1mL稀释至5mL，则得到低浓度溶液，其浓度为1mg/mL。
(2)动物分组及给药处理
适应性喂养一周后，将60只小鼠根据体重随机分为5个处理组，每组12只进行不同条件的喂养。组1(Standard diet,STD),小鼠给予标准日粮；组2(High fat diet,HFD)，小鼠给予高脂肪日粮；组3(HFD+100mg/kg·BW MIIE，HFD+L-MFE)，小鼠摄入高脂肪日粮并灌胃低剂量的MIIE(100mg/kg·BW)；组4(HFD+200mg/kg·BW MIIE，HFD+H-MFE)，小鼠接受高脂肪日粮和高剂量MIIE(200mg/kg·BW)的灌胃；组5(STD+200mg/kg·BW MIIE，STD+H-MFE),小鼠接受标准食物和高剂量的MIIE灌胃(200mg/kg·BW)。
表1饲粮组成及营养水平
Table 4-1 Composition of the experiment diets and nutrition level(g/100g diet)
高脂肪模型是最常用的氧化应激模型，便于创造和和人体接近的环境，小鼠和大鼠实验一般选择脂肪含量10-50％之间的高脂肪饲料，同时补充0.5％-2％的胆固醇，4-6周内可以诱导小鼠发生氧化应激状态。将称量得到的小鼠体重数据进行统计学分析，当出现显著性差异时即可判定高脂小鼠模型建立。
(3)病理学检测
C57BL/6小鼠连续灌胃8周后禁食12h，摘除眼球采血，静置20min，4000rpm离心15min，留取上清。使用谷草转氨酶测定试剂盒和谷丙转氨酶试剂盒检测AST和ALT，操作方法如下：
在测定孔中加入20μL已预热至37℃的基质液和5μL的待测样品，反复吹打混匀后37℃下再气浴30分钟。
在测定孔中加入2,4-二硝基苯肼液20μL，在对照孔中加入2,4-二硝基苯肼液20μL并加入待测样品5μL。反复吹打混匀，37℃气浴20分钟。
在测定孔和对照孔分别加入0.4mol/L氢氧化钠溶液200μL，反复吹打混匀，室温静置20min。使用酶标仪(波长510nm)测定各孔OD值。
谷草转氨酶(AST)浓度以(绝对OD值＝测定孔OD值减去对照孔OD值)，查标准曲线，计算得出的AST活力单位。谷丙转氨酶(ALT)浓度以(绝对OD值＝测定孔OD值-对照孔OD值)，查标准曲线，计算得出的ALT活力单位。
结果分析：
罗汉果苷ⅡE作用肥胖模型小鼠8周后，与标准日粮组相比，喂食高脂饲组的小鼠体重显著增加，且体内血清ALT和AST水平也显著增加(p<0.01)。随着灌胃罗汉果水提物的浓度增高，血清ALT和AST水平梯度下降，差异有统计学意义(p<0.05)。结果如图7和图8所示。
实施例8
实施例7中的小鼠经过8个星期的干预，将小鼠空腹12小时后，乙醚麻醉，摘眼睛取血至10mL塑料离心管。静置15分钟后，4℃,4000rpm离心15分钟。将分离得到的血清放置于-20℃冰箱中保存备用。进一步将小鼠处死，体表用75％乙醇擦拭消毒，打开腹腔，将肝脏、脾脏、肾等器官组织迅速取出后用滤纸吸掉多余水分后称重并记录其鲜重，然后经锡箔纸包裹后置于-80℃冰箱中保存。炎性细胞因子检测参照Mouse ELISA Ready-SET-Go kit(eBioscience)试剂包使用说明书。其中检测了白细胞介素(interleukin，IL)IL-1β，IL-6，干扰素(interferon，IFN)IFN-γ，三种典型的炎症细胞因子。
检测结果如图9、图10、图11所示，对收集的小鼠血清进行分离处理后，用酶联免疫法检测的几种典型炎症因子的结果，发现罗汉果苷能够显著地抑制由高脂饮食引起的IL-1β、IL-6和IFN-γ等三种炎症因子的高表达(p<0.05)。
Claims (9)
1.罗汉果苷IIE在制备消炎食品、保健品或药品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述罗汉果苷IIE的结构式为：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述食品或保健品中包括罗汉果苷IIE作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食品或保健品中还包括食品添加剂或食品原料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品添加剂为防腐剂、着色剂、甜味剂、矫味剂、膨松剂、增稠剂、乳化剂、消泡剂的其中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药品中包括罗汉果苷I I E作为活性成分。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药品中还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅料为填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质的其中一种或多种。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂的其中一种。
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