CN111727242A

CN111727242A - 用于活化、修饰和扩增γδT细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法

Info

Publication number: CN111727242A
Application number: CN201880086374.6A
Authority: CN
Inventors: M·道; M·玛塔; A·诺维卡; Y·布拉德; S·瓦尔特; S·米赛尔; S·库特拉夫·科奎; N·希尔夫
Original assignee: Imatix Usa Inc
Current assignee: Imatix Usa Inc
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2020-09-29
Also published as: DE102017127984B4; US11690872B2; MX2020005503A; EP3717634B1; JP2021503959A; KR20200090233A; AU2018372206B2; JP7258364B2; US20240115609A1; AU2018372206A1; SG11202004910SA; DE102017127984A1; EP3717634A1; WO2019104269A9; TW201925464A; US12440541B2; EA202091333A1; WO2019104269A1; AU2018372206B8; US20190175650A1

Abstract

本公开内容涉及T细胞的扩增和活化。一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和活化。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的扩增和活化，同时消耗α‑和/或β‑TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和消耗或减少的α‑和/或β‑TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法。

Description

用于活化、修饰和扩增γδT细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法

相关申请的交叉引用

本文为专利合作条约下的国际申请，要求11月27日提交的美国临时申请序列号62/591,041的权益，2017年11月27日提交的德国申请102017127984.9，其内容通过引用整体并入本文。

背景

1.技术领域

本公开内容涉及T细胞的扩增和活化。一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和活化。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的扩增和活化，同时消耗α-和/或β-TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和消耗或减少的α-和/或β-TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法

2.技术背景

γδT细胞代表表达γδTCR而非αβTCR的T细胞子集。γδT细胞可分为两个主要子集：与组织结合的Vδ2阴性细胞和外周循环中的Vδ2阳性细胞，更具体地说是Vγ9δ2。两个子集已被证明都具有抗病毒和抗肿瘤活性。与常规表达αβTCR的细胞不同，表达γδTCR的细胞识别其靶标而不依赖于经典的MHC I和II。与自然杀伤(NK)T细胞相似，γδT细胞表达NKG2D，其结合于非经典MHC分子，即，存在于受应激细胞和/或肿瘤细胞上的MHC I类多肽相关序列A(MICA)和MHC I类多肽相关序列B(MICB)。γδTCR识别多种配体，例如，应激和/或肿瘤相关的磷酸抗原。γδT细胞透过多种机制(即TRAIL，FasL，穿孔素和颗粒酶分泌)介导其靶标的直接细胞溶解。此外，表达CD16的γδT细胞增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

γδT细胞(外周血中可能通常仅存在1％至5％的量)的一个问题是不能确保有足量用于医学治疗的γδT细胞的纯度和数量，尤其是因为只收集了少量血液，然后活化和/或增殖其中的细胞。增加患者采集血液量以确保足以用于医学治疗的γδT细胞的纯度和数量也带来了一个问题，即它给患者带来了很大的负担。

迄今为止，使用自体Vγ9δ2 T细胞的临床试验可能使用Vγ9δ2 T细胞扩增方案，该方案是用双膦酸盐(即唑来膦酸盐和帕米膦酸盐)和100U/ml IL-2处理PBMC 14天。该过程最多在14天内可使总Vγ9δ2 T细胞增加100倍；此后，扩增率降低，这与细胞死亡的增加相一致。因此，传统Vγ9δ2扩增方案可能无法产生足够数量的细胞以符合商业上可行的同种异体产品。

美国专利7,749,760描述了含有双膦酸盐，白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素18(IL-18)的Vγ9Vδ2 T细胞增殖剂。

美国专利8,962,313描述了通过向分离的外周血液中添加疾病抗原并在含有白细胞介素的培养基中培养所得的组合来同时增殖疾病抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和γδT细胞的方法。

WO2014/072446描述了使用γδT细胞活化剂和IL-33的组合诱导γδT细胞的无IL-2增殖的方法，其用于的治疗感染、癌症、自身免疫性以及其他疾病。

WO2016/166544描述了γδT细胞可在磷酸抗原异戊烯焦磷酸(IPP)的存在下扩增，并可在培养步骤中提供细胞因子以促进γδT细胞的增殖并维持外周血单核细胞的细胞表型。

美国专利2011/0158954描述了一种制备γδT细胞群的方法，其中该方法包括在(a)纤连蛋白，纤连蛋白片段或其混合物和(b)中γδT细胞活化因子存在下培养含有γδT细胞的细胞群的步骤。

美国专利2016/0175358描述了在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的阳性和/或阴性选择可用于直接从各种来源分离γδT细胞，例如：外周血样本、脐带血样本、肿瘤、肿瘤活组织检查、组织、淋巴、或来自受试者的上皮样本。基于CD4、CD8、TCRα、TCRβ、TCRδ和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达，可以从复杂样本中分离γδT细胞。

仍然需要能够制备足够数量的γδT细胞作为商业上可行的治疗产品的方法。权利要求中描述的实施方案提供了该技术问题的解决方案。

简要概述

一方面，本公开内容提供了活化和/或扩增γδT细胞的方法，包括从人受试者的血液样本中分离γδT细胞，在存在氨基二膦酸盐和细胞因子化合物或组合物的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在氨基二膦酸盐和存在细胞因子化合物或组合物的情况下扩增活化的γδT细胞。

一方面，本申请涉及扩增和活化γδT细胞的方法，包括从人受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离γδT细胞，其中分离包括使PBMC与抗-α和抗-βT细胞受体(TCR)抗体(例如，生物素或磁珠缀合的抗-αβTCR抗体)接触，从PBMC中消耗α-和/或β-TCR阳性细胞，例如，透过使用链霉抗生物素蛋白-微珠或磁体，在至少一种含有氨基二膦酸盐和/或磷酸抗原的化合物和至少一种包含人重组白细胞介素2(IL-2)和/或人重组白细胞介素15(IL-15)(例如，单独的IL-2、单独的IL-15、或IL-2和IL-15的组合)的细胞因子存在的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在至少一种化合物和存在至少一种细胞因子的情况下扩增活化的γδT细胞。

另一方面，本公开内容涉及扩增和活化γδT细胞的方法，包括从人受试者的白细胞分离术中分离γδT细胞，其中分离包括使白细胞分离产物与抗-α和抗-βT细胞受体(TCR)抗体(例如，生物素或磁珠缀合的抗-αβTCR抗体)接触，从PBMC中例如透过使用链霉抗生物素蛋白-微珠或磁体消耗α-和/或β-TCR阳性细胞，在至少一种包含氨基二膦酸盐和/或磷酸抗原的化合物和至少一种包含IL-2和/或IL-15的细胞因子存在的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在至少一种化合物和存在至少一种细胞因子的情况下扩增活化的γδT细胞。

再一方面，本公开内容提供了活化和扩增γδT细胞的方法，包括从人受试者的血液样本中分离γδT细胞，在存在氨基二膦酸盐，Toll样受体2(TLR2)配体和基本上由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在氨基二膦酸盐和存在所述细胞因子组合物的情况下扩增活化的γδT细胞。

一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法活化T细胞的方法。另一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法扩增T细胞的方法。再一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法活化和扩增T细胞的方法。

一方面，分离的γδT细胞是在存在唑来膦酸、TLR2配体和由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物的情况下活化。另一方面，细胞因子组合物由IL-2或IL-15组成。一方面，本文描述的方法为体外方法。

一方面，γδT细胞分离自受试者(例如人受试者)的白细胞分离产物，例如，

另一方面，γδT细胞不是从外周血单核细胞(PBMC)(例如脐带血)中分离的。一方面，血液样本包含外周血单核细胞(PBMC)和/或白细胞分离产物。

另一方面，α-和/或β-TCR阳性细胞包括αβT细胞和天然杀伤T(NKT)细胞。

再一方面，氨基二膦酸盐可能是唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐、膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐或奈立膦酸盐、其盐和/或其水合物。再一方面，本文所述方法中使用的唯一氨基二膦酸盐是唑来膦酸盐。

另一方面，磷酸抗原可能是(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)、类异戊二烯焦磷酸盐(法呢基焦磷酸盐(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯焦磷酸盐(IPP)或二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP))。

本公开内容还提供了在存在氨基二膦酸盐、IL-2和IL-15的情况下活化γδT细胞。再一方面，活化是在氨基二膦酸盐和IL-2或氨基二膦酸盐和IL-15存在的情况下进行的。

一方面，活化是在磷酸抗原、IL-2和IL-15存在的情况下或磷酸抗原和IL-15存在的情况下进行的。

另一方面，氨基二膦酸盐是唑来膦酸。

另一方面，磷酸抗原是IPP。

另一方面，氨基二膦酸盐的浓度可以为约0.1μM至约500μM、约0.1μM至约400μM、约0.1μM至约300μM、约0.1μM至约200μM、约0.1μM至约100μM、约0.5μM至约100μM、约1μM至约500μM、约1μM至约400μM、约1μM至约300μM、约1μM至约200μM、约1μM至约100μM、约1μM至约90μM、约1μM至约80μM、约1μM至约70μM、约1μM至约60μM、约1μM至约50μM、约1μM至约40μM、约1μM至约30μM、约1μM至约20μM、约1μM至约15μM、约1μM至约10μM、约1μM至约9μM、约1μM至约8μM、约1μM至约7μM、约1μM至约6μM、约1μM至约5μM、约2μM至约5μM、约3μM至约5μM、约2μM至约5μM、约2μM至约10μM、约3μM至约8μM或约4μM至约6μM。

另一方面，氨基二膦酸盐的浓度可以为约0.1μM至约100μM或约1μM至约100μM。另一方面，氨基二膦酸盐的浓度可以是约5μM。

另一方面，分离的γδT细胞在活化期间的接种密度为约0.01x10⁶个细胞/cm²至约1x10⁷个细胞/cm²、约0.1x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.25x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约4x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约3x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约2.5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.6x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.7x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.8x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.9x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约1x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²或约1.5x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²。

另一方面，分离的γδT细胞在活化期间的接种密度为约0.5x10⁶个细胞/cm²至约3x10⁶个细胞/cm²。

另一方面，由于在活化/扩增期间IL-2的浓度约10IU/ml至约1000IU/ml、约10IU/ml至约500IU/ml、约10IU/ml至约400IU/ml、约10IU/ml至约300IU/ml、约10IU/ml至约200IU/ml、约10IU/ml至约150IU/ml、约10IU/ml至约100IU/ml、约20IU/ml至约100IU/ml、约30IU/ml至约100IU/ml，约40IU/ml至约100IU/ml，约50IU/ml至约100IU/ml、75IU/ml至约125IU/ml、约20IU/ml至约80IU/ml、约25IU/ml至约100IU/ml或约50IU/ml至约150IU/ml。

另一方面，在活化和/或扩增期间IL-2的浓度为约50IU/ml至约100IU/ml。另一方面，在活化和/或扩增期间IL-15的浓度为约10ng/ml至约1μg/ml、约10ng/ml至约500ng/ml、约10ng/ml至约400ng/ml、约10ng/ml至约300ng/ml、约10ng/ml至约200ng/ml、约10ng/ml至约150ng/ml、约10ng/ml至约100ng/ml、约20ng/ml至约100ng/ml、约30ng/ml至约100ng/ml、约40ng/ml至约100ng/ml、约50ng/ml至约100ng/ml、约60ng/ml至约100ng/ml、约20ng/ml至约80ng/ml、约30ng/ml至约60ng/ml或约50ng/ml至约120ng/ml。

另一方面，在活化和/或扩增期间IL-15的浓度为约50ng/ml至约100ng/ml。

本公开内容进一步提供了在存在浓度为约1μM至约100μM的唑来膦酸、浓度为约10IU/ml至约200IU/ml的IL-2和浓度为约10-500ng/ml的IL-15的情况下活化的各方面情况。再一方面，扩增是在存在浓度为约10IU/ml至约100IU/ml的IL-2和/或浓度为约50-200ng/ml的IL-15的情况下进行。

另一方面，细胞因子可包括IL-7、IL-18和/或IL-21。一方面，本文描述的方法排除了扩增、活化或扩增和活化期间出现IL-12、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9和/或IL-23中的一种或多种。

再一方面，至少一种化合物还包括Toll样受体2(TLR2)配体。

一方面，TLR2配体选自两性霉素B、L-茶氨酸、单宁和多酚组成的组。

另一方面，TLR2配体是两性霉素B。

再一方面，至少一种化合物还包括N-乙醯半胱氨酸(NAC)和/或谷氨醯胺/谷氨酸。

一方面，NAC的浓度为约1mM至约10mM、约2mM至约8mM、约0.5mM至约5mM或约0.5mM至约2.5mM。

另一方面，至少一种化合物还包含COX-2抑制剂。

再一方面，COX-2抑制剂是布洛芬。

一方面，在存在N-乙醯半胱氨酸(NAC)和/或谷氨醯胺/谷氨酸的情况下进一步扩增。

一方面，NAC的浓度为约1mM至约10mM。

一方面，活化持续时间不超过约7天、约10天、约12天、约14天、约16天或约20天。

一方面，活化持续时间为1天至约10天、1天至约9天、1天至约8天、1天至约7天、1天至约6天、1天至约5天、1天至约4天、约2天至约10天、约2天至约8天、约2天至约7天、约3天至约7天或约4至约6天。

另一方面，活化持续时间为约1天至约7天。

一方面，扩增持续时间大于约7天、约10天、约12天、约14天、约16天、约20天、约22天、约24天、约26天、约28天或约30天。一方面，扩增持续时间为约7天至约30天、约7天至约25天或约10天至约20天。

一方面，扩增期间γδT细胞的细胞密度为约0.1x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.25x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约4x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约3x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约2.5x10⁶个细胞/cm²、约0.5x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.6x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.7x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.8x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约0.9x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²、约1x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²或约1.5x10⁶个细胞/cm²至约2x10⁶个细胞/cm²。

另一方面，用于扩增的细胞因子可进一步包括IL-18、IL-21和IL-7。

一方面，本申请涉及透过本文所述任一方面的方法制备的扩增和活化γδT细胞群。

另一方面，本申请涉及增强γδT细胞中病毒转导效率的方法，包括用重组病毒载体转导透过第一至第十六方面中任一方法制备的扩增和活化γδT细胞。

另一方面，病毒载体是逆转录病毒载体。

另一方面，病毒载体是γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体。

再一方面，病毒载体表达CD8和αβ-TCR。

一方面，本申请涉及透过本公开的方法制备的改造γδT细胞。

一方面，本申请涉及透过本公开的方法制备的扩增γδT细胞群，其中扩增γδT细胞的浓度为至少约1x10⁵个细胞/ml、至少约1x10⁶个细胞/ml、至少约1x10⁷个细胞/ml、至少约1x10⁸个细胞/ml或至少约1x10⁹个细胞/ml。

一方面，本申请涉及一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的透过本公开内容的方法制备的改造γδT细胞。

一方面，癌症选自由急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌肝癌)、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤征候群、骨髓增生异常征候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤组成的组。

一方面，癌症是黑色素瘤。

附图简要说明

图1A显示了根据本公开实施方案从PBMC中消耗αβT细胞。将PBMC与生物素缀合的αβTCR抗体一起孵育，然后根据制造商的方案与链霉抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然后使样本通过LS管柱以富集表达αβTCR的细胞。管柱流出液表示αβTCR消耗的部分。过夜培养后，富含αβTCR的部分和αβTCR消耗的部分用萤光染料缀合的αβTCR抗体与Vγ9抗体染色，然后进行流式细胞术分析。

图1B和1C显示了根据本公开内容实施方案的Vγ9δ2 T细胞产物中的最小残留αβT细胞。使用市售的生物素化抗αβT抗体/链霉抗生物素蛋白-微珠从正常供体(供体A、供体B和供体C)(图1B)和(供体12和供体13)(图1C)的PBMC中消耗αβT细胞。将αβT细胞消耗的PBMC与唑来膦酸盐/IL-2/IL-15一起培养14天，然后用各自的萤光染料缀合抗体(例如，抗-αβTCR抗体和抗-γδTCR抗体)进行细胞表面染色，透过CD3亚门控评估残留的αβT细胞和富集的γδT细胞。

图1D显示了根据本公开实施方案的Vγ9δ2 T细胞的细胞因子谱。在细胞收获之前，用Golgi Stop/Plug(即，蛋白质转运抑制剂)处理Vγ9δ2细胞6小时。对细胞进行表面Vδ2染色，然后固定并通透化。使用针对TNF-α、IL-17a和IFN-γ的萤光染料缀合抗体进行TNF-α、IL-17a和IFN-γ细胞内染色。

图1E显示了根据本公开另一实施方案从白细胞分离产物(例如，

)中消耗αβT细胞。来自白细胞分离产物的包括树突细胞和祖细胞的白细胞可以与生物素缀合αβTCR抗体一起孵育，然后与链霉抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然后使样本通过LS管柱以富集表达αβTCR的细胞。管柱流出液表示αβTCR消耗的部分。过夜培养后，将αβTCR消耗的部分用萤光染料缀合αβTCR抗体与γδTCR抗体染色，然后进行流式细胞术分析。

图2显示了分子对活化根据本公开实施方案的Vγ9δ2 T细胞的影响。在活化步骤期间，可能存在氨基二膦酸盐(例如，唑来膦酸盐(ZA))或磷酸抗原(例如，IPP)和细胞因子(例如，IL-2和/或IL-15)。

图3显示了分子对扩增根据本公开实施方案的Vγ9δ2 T细胞的影响。在扩增步骤期间，细胞因子可能在没有氨基二膦酸盐或磷酸抗原(IPP)的情况下继续存在。

图4A显示了根据本公开实施方案的扩增期间细胞密度对T细胞标志物的影响。在存在唑来膦酸盐、IL-2和IL-15的情况下活化14天后，在不存在唑来膦酸盐的情况下，使用稳态细胞因子(例如，IL-2和IL-15)，以高密度(如，2x10⁶个细胞/ml)和低密度(如，0.5x10⁶个细胞/ml)扩增Vγ9δ2T细胞。分析T细胞标志物，例如：CD122、CD80、CD83、CD86、CD95和CD95L。

图4B显示了根据本公开实施方案的扩增期间细胞密度对细胞死亡的影响。在存在唑来膦酸盐、IL-2和IL-15的情况下活化14天后，在不存在唑来膦酸盐的情况下，使用稳态细胞因子(例如，IL-2和IL-15)，以高密度(如，2x10⁶个细胞/ml)和低密度(如，0.5x10⁶个细胞/ml)扩增T细胞。测量细胞死亡。

图5显示了根据本公开内容一个实施方案，两性霉素B对表达IL-2Rα的Vδ2 T细胞的影响。在第0天，在补充有唑来膦酸盐、IL-2和IL-15的活化培养基中培养αβ消耗的PBMC。48小时后，加入两性霉素B，再过48小时，收集细胞，对CD3+Nδ2 T细胞上的CD25(或IL-2Rα)表面表达进行基于流式细胞术的分析。

图6显示了根据本公开内容的一个实施方案，唑来膦酸盐(Zometa)对细胞扩增的影响。使用唑来膦酸盐(Zometa)在含有IL-2、IL-15和两性霉素B的确定培养基中扩增γδT细胞。

图7显示了根据本公开内容的一个实施方案，病毒转导到Vγ9δ2 T细胞中的时间表。第1天，新鲜PBMC消耗αβT细胞并在存在IL-2和IL-15的情况下用唑来膦酸盐活化；24小时后(第2天)，使用各自的病毒上清液以MOI为1.5转导细胞；第7天(即，转导后第5天)透过流式细胞术评估GFP转基因表达以评估转导效率；第12天(即，转导后第10天)评估持续的转基因表达。

图8A显示了使用根据本公开内容的一个实施方案的γ-逆转录病毒载体在Vγ9δ2T细胞中的病毒转基因表达。在转导后第5天和第10天，测试表达不同包膜蛋白的病毒，例如：表达绿色萤光蛋白(GFP)的γ-逆转录病毒(例如，长臂猿白血病病毒(GALV)假型(例如，SEQ ID NO：4)、RD114TR假型(SEQ ID NO：1)和表达GFP的慢病毒(例如，VSV-G假型(例如，SEQ ID NO：3))转导至Vγ9δ2 T细胞的效率。

图8B显示了根据本公开内容的一个实施方案，病毒转基因(例如，CD8α)在RD114TR或VSV-G假型化慢病毒载体转导的Vγ9δ2 T细胞中的表达。

图9A显示了在转导过程中使用不同的转导增强子(

对比Vectofusin-1)用CD8αβ转导γδT细胞。在存在

(涂覆在平板上的纤连蛋白片段)或

(可溶性阳离子肽)的情况下，用编码CD8αβ的逆转录病毒转导从3个供体(供体1、供体2和供体3)获得的γδT细胞，然后进行流式细胞术以确定CD8αβ+细胞的百分比。

图9B显示了使用根据本公开内容一个实施方案的改造病毒对Vγ9δ2 T细胞的转导效率。Vγ9δ2 T细胞用无病毒的情况下进行转导(空白组)或单独用αβ-TCR病毒、单独用CD8病毒或用αβ-TCR病毒+CD8病毒进行转导。将转导的细胞与TAA/MHC-PE dextramer、抗CD8抗体或NYESO-PE dextramer(阴性对照)一起孵育，然后进行流式细胞术分析。

图10显示了使用根据本公开内容一个实施方案的改造病毒转导Vγ9δ2 T细胞的倍数扩增。Vα9δ2 T细胞(GD)或αβT细胞(AB)在无病毒的情况下(空白组)、用αβ-TCR病毒(TCR)、CD8病毒(CD8)或用CD8+TCR进行转导，然后测量从转导后第7天到第21天的倍数扩增。

图11A显示了根据本公开实施方案的改造Vγ9δ2 T细胞。在无病毒的情况下(空白组)或用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒(αβ-TCR+CD8)转导的Vγ9δ2 T细胞与TAA/MHC复合体一起孵育，然后进行流式细胞术分析以检测与TAA/MHC复合体结合的Vγ9δ2 T细胞。

图11B显示了对根据本公开实施方案的改造Vg9d2 T细胞的功能评估。在无病毒的情况下(空白组)或用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒(αβ-TCR+CD8)转导的Vγ9δ2 T细胞与靶细胞一起孵育，然后进行流式细胞术分析以检测凋亡标志物CD107a。

图11C显示了对根据本公开另一实施方案的改造Vγ9δ2 T细胞的功能评估。在无病毒的情况下(空白组)或用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒(αβ-TCR+CD8)转导的Vγ9δ2 T细胞与靶细胞一起孵育，然后进行流式细胞术分析以检测IFN-γ释放。

图11D显示了对根据本公开实施方案的改造Vγ9δ2 T细胞的溶细胞活性。在无病毒的情况下(空白组)或用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒(αβ-TCR+CD8)转导的Vγ9δ2 T细胞与靶细胞一起孵育，然后进行流式细胞术分析以检测凋亡细胞。

图11E显示了对根据本公开实施方案的改造γδT细胞的长期溶细胞活性。在84小时共培养测定期间即时评估细胞溶解活性。靶阳性A375-RFP肿瘤细胞不经T细胞(肿瘤细胞)或用未转导细胞(αβT细胞和γδT细胞)、用αβ-TCR病毒和CD8αβ病毒转导的αβT细胞(αβTCR+αβT细胞)或用αβ-TCR病毒和CD8αβ病毒转导的γδT细胞(αβTCR+γδT细胞)进行孵育，然后进行

活细胞分析以测量靶细胞生长。

图12A显示了对根据本公开内容实施方案的改造病毒的示意图。CD8/CD4嵌合受体-T2A-截短的CSF1R含有与CD4跨膜和细胞内结构域连接的CD8α细胞外结构域。

图12B显示了对根据本公开内容实施方案的改造病毒的示意图。CD8/CD4嵌合受体-T2A-CSF1R/41BB嵌合受体含有连接在嵌合CD8/CD4蛋白下游的CSF1R细胞外结构域。

图13显示了根据本公开内容实施方案的同种异体T细胞疗法。同种异体T细胞疗法可能包括从健康供体收集γδT细胞，透过病毒转导受关注的外源基因(如外源性TCR)进行γδT细胞改造，再进行细胞扩增，收集扩增的改造γδT细胞，这些细胞在输注入患者之前可冷冻保存为“现成的”T细胞产品。

图14显示了根据本公开内容实施方案的γδT细胞制造。γδT细胞的制造可能包括收集或获得白细胞或PBMC(例如，白细胞分离术产物)，从PBMC或白细胞分离术产物中消耗αβT细胞，然后活化、转导和扩增γδT细胞。

详细说明

同种异体T细胞疗法可能基于遗传改造同种异体γδT细胞以表达外源TCR。除了透过异位TCR的特异性肿瘤识别之外，γδT细胞可能具有针对如本文所述多种肿瘤类型的活性。

一方面，本公开内容涉及T细胞的扩增和/或活化。另一方面，本公开内容涉及在不存在结合于γδTCR的特异性表位的试剂(例如，针对γδTCR的抗体)的情况下，扩增和/或活化γδT细胞。另一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和/或活化。

本公开内容还涉及γδT细胞的扩增和活化，同时消耗α-和/或β-TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和消耗或减少的α-和/或β-TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法。

一方面，本文提供了用于生产大规模药品生产品质管制规范(GMP)级TCR改造Vγ9δ2 T细胞的方法。

在不存在饲养细胞的情况下，向纯化的γδT细胞中添加IL-18增强了γδT细胞的扩增，IL-2的表面高亲和力受体(CD25或IL-2Ra)的量明显增加。此外，两性霉素B(一种Toll样受体2(TLR2)配体)可活化γδT细胞、CD8+T细胞和NK细胞，并增强CD25(高亲和力IL-2Rα)表面表达的检测。总之，这些观察结果强调了IL-2信号传导在Vγ9δ2 T细胞的唑来膦酸盐介导活化和扩增中的关键作用。因此，为了透过IL-2信号传导最大化IL-2对于γδT细胞增殖的可用性(或最小化由于大量αβT细胞而隔离IL-2)，本公开的方法可能包括使用抗-αβTCR市售GMP试剂消耗来自正常PBMC的αβT细胞。由于重组IL-18目前不能作为市售GMP试剂提供，本公开的方法可能在培养物中补充低剂量两性霉素B以增加CD25表面表达量以增强IL-2结合和信号传导，因而可以增强活化/扩张期间IL-2的反应性。此外，可以加入IL-15，因为IL-15已被证明可增加IPP处理的Vγ9δ2 T细胞的增殖和存活。

图13显示了过继同种异体T细胞疗法的方法，其可递送“现成的”T细胞产物，例如，γδT细胞产物，用于快速治疗其肿瘤中表达受关注靶标的特定癌症的合格患者。这种方法可能包括从健康供体收集γδT细胞，透过病毒转导受关注外源基因(如外源性TCR)进行γδT细胞改造，再进行细胞扩增，收集扩增的改造γδT细胞，这些细胞在输注入患者之前可冷冻保存为“现成的”T细胞产品。因此，该方法可消除个人化T细胞制造的需要。

为了分离γδT细胞，一方面，γδT细胞可从受试者或受试者的复杂样本中分离。一方面，复杂样本可能是外周血样本、脐带血样本、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活组织检查物、组织、淋巴，或来自直接接触外部环境的受试者的上皮部位样本或源自干前体细胞的样本。γδT细胞可能直接从受试者的复杂样本中分离，例如，透过用流式细胞术技术分选表达一种或多种细胞表面标志物的γδT细胞。野生型γδT细胞可表现出许多可与γδT细胞相关的抗原识别、抗原呈递、共刺激和黏附分子。一种或多种细胞表面标志物，例如，特异性γδTCR、抗原识别、抗原呈递、配体、黏附分子或共刺激分子可用于从复杂样本中分离野生型γδT细胞。与γδT细胞相关或由其表达的各种分子可用于从复杂样本中分离γδT细胞。另一方面，本公开内容提供了分离Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+细胞或其任意组合的混合群体的方法。

例如，可从受试者中收集外周血单核细胞，例如，采用血液成分分离机包括Ficoll-Paque^TM PLUS(GE Healthcare)系统或其他合适的装置/系统。例如，可采用流式细胞术技术从收集的样本中纯化γδT细胞或所需的γδT细胞亚群。脐带血细胞也可在受试者出生期间从脐带血中获得。

在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的阳性和/或阴性选择可用于直接自外周血样本、脐带血样本、肿瘤、肿瘤活组织检查、组织、淋巴或来自受试者上皮样本分离γδT细胞或表达相似细胞表面标志物的γδT细胞群。例如，可以基于CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRα、TCRδ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337(NKp30)、CD336(NKp46)、OX40、CD46、CCR7和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达从复杂样本中分离γδT细胞。

一方面，γδT细胞可从体外培养的复杂样本中分离。另一方面，在没有预先消耗特定细胞群(例如，单核细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞)的情况下可活化和扩增全部的PBMC群。另一方面，可以先产生富集的γδT细胞群，然后进行彼等之特异性活化和扩增。另一方面，可以在不存在天然或改造APC的情况下进行γδT细胞的活化和扩增。另一方面，可以使用固定的γδT细胞有丝分裂原(包括γδTCR特异性抗体)和其他γδTCR活化剂(包括凝集素)对来自肿瘤样本的γδT细胞进行分离和扩增。另一方面，可以在没有γδT细胞有丝分裂原(包括γδTCR特异性抗体)和其他γδTCR活化剂(包括凝集素)的情况下对来自肿瘤样本的γδT细胞进行分离和扩增。

一方面，γδT细胞分离自受试者(例如人受试者)的白细胞分离术。另一方面，γδT细胞不是从外周血单核细胞(PBMC)中分离的。

图14显示了根据本公开内容实施方案的γδT细胞制造。该过程可能包括从白细胞分离术产物中收集或获得白细胞或PBMC。白细胞分离术可能包括从供体收集全血并使用血液成分分离机分离组分。血液成分分离机分离出所需的血液组分，并将其余部分返回供体的血液循环。例如，可以使用血液成分分离设备收集白细胞、血浆和血小板，并将红细胞和中性粒细胞返回供体的血液循环。市售白细胞分离术产品可用于该程序。另一种方法是从血沉棕黄层获得白细胞。为了分离血沉棕黄层，从供体获得抗凝全血并离心。离心后，将血液分离成血浆、红细胞和血沉棕黄层。血沉棕黄层是位于血浆和红细胞层之间的层。与血沉棕黄层收集相比，白细胞分离术收集可以获得更高的纯度和显著增加的单核细胞含量。白细胞分离术可能获得的单核细胞含量通常比血沉棕黄层获得的单核细胞含量高20倍。为了富集单核细胞，可能需要使用Ficoll梯度进行进一步分离。

为了从PBMC中消耗αβT细胞，可透过磁分离将表达αβTCR的细胞与PBMC分离，例如，使用涂覆有抗αβTCR抗体的

磁珠，然后冷冻保存αβTCR-T细胞消耗的PBMC。为了制造“现成的”T细胞产品，可将冷冻保存的αβTCR-T细胞消耗的PBMC解冻，且在存在氨基二膦酸盐和/或异戊烯焦磷酸盐(IPP)和/或细胞因子(例如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)和/或白细胞介素18(IL-18))和/或其他活化剂(例如，Toll样受体2(TLR2)配体)的情况下，以小/中等规模(例如，在24至4-6孔板或T75/T175烧瓶中)或大规模(例如，在50ml-100升袋中)活化1-10天，例如2-6天。

一方面，分离的γδT细胞可以应对与一种或多种抗原接触而快速扩增。一些γδT细胞(例如Vγ9Vδ2+T细胞)可以在组织培养期间应对与一些抗原(如：异戊烯基-焦磷酸酯、烷基胺和代谢物或微生物提取物)接触而在体外快速扩增。刺激的γδT细胞可以表现出许多可以促进从复杂样本中分离γδT细胞的抗原呈递、共刺激和黏附分子。复杂样本中的γδT细胞可以用至少一种抗原在体外刺激1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或其他合适的时间段。用合适的抗原刺激γδT细胞可以在体外扩增γδT细胞群。

可用于在体外刺激复杂样本中γδT细胞扩增的抗原非限制性实例可包括异戊烯-焦磷酸盐，例如异戊烯焦磷酸盐(IPP)、烷基胺、人微生物病原体代谢物、共生细菌代谢物、甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸(2M3B1PP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、法呢基焦磷酸盐(FPP)、二甲基烯丙基磷酸盐(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸盐(DMAPP)、乙基三磷酸腺苷(EPPPA)、香叶基焦磷酸盐(GPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯基三磷酸腺苷(IPPPA)、磷酸单乙基酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、3-甲醯基-1-丁基-焦磷酸盐(TUBAg 1)、X-焦磷酸盐(TUBAg 2)、3-甲醯基-1-丁基-尿苷三磷酸盐(TUBAg 3)、3-甲醯基-1-丁基-去氧胸苷三磷酸(TUBAg 4)、单乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸盐、巴豆醯基焦磷酸盐、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸盐、巴豆醯基-γ-尿苷三磷酸盐、烯丙-γ-尿苷三磷酸盐、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮二膦酸盐。

可以使用本文所述的活化和共刺激剂进行γδT细胞的活化和扩增，以触发特异性γδT细胞增殖和持久性群体。一方面，来自不同培养物的γδT细胞的活化和扩增可以实现不同的克隆或混合多克隆群体亚群。另一方面，不同的激动剂可用于鉴定提供特异性γδ活化信号的药剂。另一方面，提供特异性γδ活化信号的试剂可以是针对γδTCR的不同单克隆抗体(MAb)。另一方面，可以使用伴随共刺激剂以帮助触发特异性γδT细胞增殖而不诱导细胞能量和细胞凋亡。这些共刺激剂可包括与γδ细胞上表达的受体结合的配体，如NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、ICOS、CD27、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CDl22、DAP和CD28。另一方面，共刺激剂可以是对CD2和CD3分子上的独特表位具特异性的抗体。当在αβ或γδT细胞上表达时，CD2和CD3可具有不同的构象结构。另一方面，CD3和CD2的特异性抗体可导致γδT细胞的不同活化。

在γδT细胞改造之前，可以离体扩增γδT细胞群。可用于促进体外γδT细胞群扩增的试剂非限制性实例可能包括抗CD3或抗CD2、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40抗体、IL-2、IL-15、IL-12、IL-9、IL-33、IL-18或IL-21、CD70(CD27配体)、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。

透过γδT细胞的基因改造可以增强γδT细胞识别广谱抗原的能力。一方面，可以将γδT细胞工程化以提供识别体内选择的抗原的通用同种异体疗法。γδT细胞的基因工程可包括稳定地整合一个表达肿瘤识别部分(例如，αβTCR，γδTCR，嵌合抗原受体(CAR))的构建体，其结合了抗原结合和T细胞活化功能集成的单一受体，抗原结合片段或淋巴细胞活化域成为分离的γδT细胞的基因组，细胞因子(IL-15，IL-12，IL-2，IL-7，IL-21，IL-18，IL-19，IL-33，IL-4，IL-9，IL-23，IL1β)可增强离体和体内T细胞增殖，存活和功能。分离的γδT细胞的基因工程还可包括从分离的γδT细胞的基因组例如MHC基因座(基因座)中的一个或多个内源基因中删除或破坏基因表达。

一方面，病毒是指天然存在的病毒以及人造病毒。根据本公开一些实施方案的病毒可能是包膜病毒或无包膜病毒。细小病毒(例如AAV)是无包膜病毒的实例。在一优选实施方案中，病毒可能是包膜病毒。在优选实施方案中，病毒可能是逆转录病毒，特别是慢病毒。可以促进真核细胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括经来自水疱性口炎病毒(VSV-G)、修饰的猫内源性逆转录病毒(RD114TR)和修饰的长臂猿白血病病毒(GALVTR)的包膜糖蛋白(GP)假型化的HIV-1衍生慢病毒载体(LV)。这些包膜蛋白可以有效地促进其他病毒的进入，例如细小病毒，包括腺相关病毒(AAV)，从而证明它们的广泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)4070 env(如Merten et al.，J.Virol.79：834-840，2005一文中所述；其透过引用并入本文)、RD114 env(SEQ ID NO：2)、嵌合包膜蛋白RD114pro或RDpra(透过用HIV-1基质/衣壳(MA/CA)切割序列取代RD114的R肽切割序列构建的RD114-HIV嵌合体，如Bell et al.Experimental Biology and Medicine 2010；235：1269-1276一文中所述；其透过引用并入本文)、杆状病毒GP64 env(如Wang etal.J.Virol.81：10869-10878，2007一文中所述；其透过引用并入本文)或GALV env(如Merten et al.，J.Virol.79：834-840，2005一文中所述；其透过引用并入本文)或其衍生物。

RD114TR

RD114TR是嵌合包膜糖蛋白，其由猫白血病病毒RD114的细胞外和跨膜结构域和双嗜性小鼠白血病病毒包膜的细胞质尾部(TR)构成。RD114TR假型载体可介导基因有效转移入人造血祖细胞和NOD/SCID再生细胞中。Di Nunzio et al.，Hum.Gene Ther：811-820(2007)一文的内容透过引用整体并入本文。RD114假型载体还可以在大型动物模型中介导有效的基因转移。(Neff et al.，Mal.Ther.2：157-159(2004)；Hu et al.，Mal.Ther：611-617(2003)和Kelly et al.，Blood Cells，Molecules，&Diseases30：132-143(2003))各参考文献的内容透过引用整体并入本文。

本公开可内容可能包括具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的RD114TR变体。例如，可能使用与RD114TR(SEQ ID NO：1)具有约96％序列同一性的RD114TR变体(RD114TRv1(SEQ ID NO：5))。一方面，本公开内容提供了具有修饰氨基酸残基的RD114TR变体。修饰的氨基酸残基可能选自氨基酸插入、删除或取代。一方面，本文描述的取代是保守氨基酸取代。也就是说，RD114TR的氨基酸可以被具有相似性质的其他氨基酸取代(保守变化，例如，相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或3-片结构的倾向)。保守取代的非限制性实例可见，例如，Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company，其内容透过引用整体并入。

另一方面，本公开内容可能包括与SEQ ID NO：1、2、3、4或5的氨基酸序列具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的变体。

一方面，保守取代可能包括由Dayhoff在《The Atlas of Protein Sequence andStructure.Vol.5》，Natl.Biomedical Research中所述的取代，其内容透过引用整体并入本文。例如，一方面，属于以下组之一的氨基酸可彼此交换，因此构成保守交换：第1组：丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、天冬醯胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；第2组：半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)；第3组：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)；第4组：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；第5组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)；和第6组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。

一方面，保守氨基酸取代可包括用相同类别中的另一个取代氨基酸，例如，(1)非极性：Ala、Val、Leu、lle、Pro、Met、Phe、Trp；(2)不带电的极性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；和(4)碱性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下进行：(1)芳香族：Phe、Tyr、His；(2)质子供体：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和(3)质子受体：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln(参见美国专利号10106805)。

另一方面，保守取代可以根据表A进行。用于预测蛋白质修饰耐受性的方法可参加，例如，Guo et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，101(25)：9205-9210(2004)，其内容透过引用整体并入。

表A

一方面，RD114TR假型逆转录病毒载体在转导后约10天的转基因表达为约20％至约60％、约30％至约50％或约35％至约45％。一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约20％至约60％、约30％至约50％或约35％至约45％，而在相同条件下转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达为约5％至约25％、约2％至约20％、约3％至约15％或约5％至约12％。再一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约40％，而转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达为约3.6％。

再一方面，RD114TR假型逆转录病毒载体在转导后约5天的转基因表达为约20％至约50％、约15％至约30％或约20％至约30％。一方面，在相同条件下，转导后5天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约20％至约50％、约15％至约30％或约20％至约30％，而转导后5天VSV-G假型载体的转基因表达为约10％至约20％、约15％至约25％或约17.5％至约20％。再一方面，转导后5天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为约24％，而转导后5天VSV-G假型载体的转基因表达为约19％。

另一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达为转导后10天VSV-G假型载体的转基因表达的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍、约11倍或约12倍或更多。

一方面，本公开内容提供了使用具有RD114TR假型(例如，SEQ ID NO：1)的逆转录病毒来转导T细胞的方法。另一方面，与具有VSV-G假型(例如，SEQ ID NO：3)的逆转录病毒相比，具有RD114TR假型(例如，SEQ ID NO：1)的逆转录病毒可更有效地转导T细胞。另一方面，RD114TR包膜用于假型化慢病毒载体，然后该载体用于以极高的效率转导T细胞。

可用各种方法产生改造γδT细胞。例如，编码包含肿瘤识别或其他类型识别部分的表达盒的多核苷酸可透过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(例如，慢病毒或逆转录病毒系统)或其他合适的方法，如：转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(CaPO₄)、纳米改造物质(如Ormosil)，病毒传递方法，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或其他合适的方法稳定地引入γδT细胞。许多病毒方法已用于人基因治疗，例如WO1993020221中描述的方法，其内容透过引用整体并入本文。可用于改造γδT细胞的病毒方法的非限制性实例可包括γ-逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒或腺病毒相关病毒方法。

图14显示了活化T细胞可以透过用病毒载体(例如：RD114TRγ-逆转录病毒载体和RD114TR慢病毒载体)转导，将受关注外源基因(例如：针对特定癌抗原的αβTCR和CD8)表达到分离γδT细胞中来进行改造。病毒载体还可含有转录后调控元件(PRE)，例如：土拨鼠PRE(WPRE)，以透过增加细胞核和细胞质mRNA水平来增强转基因的表达。还可使用一种或多种调节元件，包括小鼠RNA转运元件(RTE)、猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)的组成型转运元件(CTE)和人热休克蛋白70的5′非翻译区(Hsp705′UTR)，和/或与WPRE组合使用以增加转基因表达。转导可以进行一次或多次以实现小规模(例如24至4-6孔板)或中/大规模的稳定转基因表达1/2至5天，例如1天。

RD114TR是嵌合糖蛋白，其含有与鼠白血病病毒的细胞质尾(TR)融合的猫内源病毒(RD114)的细胞外和跨膜结构域。一方面，转导后10天RD114TR假型逆转录病毒载体的转基因表达相对于VSV-G假型载体更高。

还可以使用其他病毒包膜蛋白，例如VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。

一方面，改造(或转导)的γδT细胞可以离体扩增而不受抗原呈递细胞或氨基二膦酸盐的刺激。本公开的抗原反应性改造T细胞可以离体和体内扩增。另一方面，本公开内容的改造γδT细胞的活性群体可以离体扩增，而无需抗原呈递细胞、抗原肽、非肽分子或小分子化合物(例如，氨基二膦酸盐)的抗原刺激，但是使用某些抗体、细胞因子、有丝分裂原或融合蛋白，例如：IL-17 Fc融合、MICA Fc融合和CD70 Fc融合。可用于扩增γδT细胞群抗体实例可能包括抗CD3、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40、抗NKG2D或抗CD2抗体，细胞因子的实例可能包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7和/或IL-33，有丝分裂原的实例可能包括CD70(人CD27的配体)、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆有丝分裂原(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。另一方面，改造γδT细胞群可在少于60天、少于48天、36天、少于24天、少于12天或少于6天内扩增。

另一方面，本公开内容提供了用于离体扩增用于过继转移疗法的改造γδT细胞群的方法。本公开内容的改造γδT细胞可离体扩增。本公开内容的改造γδT细胞可在体外扩增而不经APC活化或不与APC和氨基磷酸盐共培养。

另一方面，γδT细胞群体可在体外扩增少于36天、少于35天、少于34天、少于33天、少于32天、少于31天、少于30天、少于29天、少于28天、少于27天、少于26天、少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天或少于3天。

图14显示了转导或改造的γδT细胞的扩增可在存在细胞因子(例如：IL-2、IL-15、IL-18等)的情况下以小/中等规模(例如：烧瓶/G-Rex)或大规模(例如：50ml-100升袋)进行7-35天，例如14-28天。然后可将扩增转导的T细胞产物冷冻保存为「现成的」T细胞产物，用于输注到患者体内。

治疗方法

可以给予含有本文所述的改造γδT细胞的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，药物组合物可以以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症症状的量给予已患有疾病或病症的受试者。还可给予改造γδT细胞以减少病症发展、发生或恶化的可能性。用于治疗用途的有效量改造γδT细胞群可能根据疾病或病症的严重程度和病程、先前疗法、受试者的健康状况、体重和/或对药物的反应和/或治疗医师的判断而不同。

本公开内容的改造γδT细胞可用于治疗需要治疗病症(例如，本文所述的癌症)的受试者。

用γδT细胞治疗受试者病症(例如，疾病)的方法可能包括给予受试者治疗有效量的改造γδT细胞。本公开内容的γδT细胞可以以各种方案(例如，时间、浓度、剂量、治疗之间的间隔和/或制剂)施用。在接受本公开的改造γδT细胞之前，还可以用，例如，化学疗法、放射疗法或两者的组合对受试者进行预处理。在施用于受试者之前，改造的γδT细胞群还可经冷冻或冷冻保存。改造的γδT细胞群可包括表达相同、不同或相同和不同肿瘤识别部分组合的两种或更多种细胞。例如，改造的γδT细胞群可包括几种不同的改造γδT细胞，其被设计用于识别不同抗原或相同抗原的不同表位。

本公开内容的γδT细胞可用于治疗各种病症。一方面，本公开内容的改造γδT细胞可用于治疗癌症，包括实体瘤和恶性血液病。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道基质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤征候群、骨髓增生异常征候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤。

一方面，本公开内容的改造γδT细胞可用于治疗传染病。另一方面，本公开内容的改造γδT细胞可用于治疗传染病，传染病可由病毒引起。再一方面，本公开内容的改造γδT细胞可用于治疗免疫疾病，例如，自体免疫疾病。

可以在病症临床发作之前、发作期间和发作之后向受试者提供本公开内容的γδT细胞治疗。在疾病临床发作后1天、1周、6个月、12个月或2年后，可向受试者提供治疗。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可能包括在临床试验中治疗人。治疗可包括向受试者施用包含本公开内容的改造γδT细胞的药物组合物。

另一方面，向受试者施用本公开内容的改造γδT细胞可以调节受试者体内内源性淋巴细胞的活性。另一方面，向受试者施用改造γδT细胞可以向内源性T细胞提供抗原并且可增强免疫应答。另一方面，记忆T细胞可以为CD4+T细胞。另一方面，记忆T细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，向受试者施用本公开内容的改造γδT细胞可活化另一种免疫细胞的细胞毒性。另一方面，其他免疫细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，其他免疫细胞可以为天然杀伤T细胞。另一方面，向受试者施用本公开内容的改造γδT细胞可抑制调节性T细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3+Treg细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3-Treg细胞。其活性可透过本公开内容的改造γδT细胞调节的细胞非限制性实例可能包括：造血干细胞；B细胞；CD4；CD8；红血球；白血球；树突细胞，包括树突抗原呈递细胞；白细胞；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；中性粒细胞；T辅助细胞；和T杀伤细胞。

在大多数骨髓移植期间，环磷醯胺与全身照射组合可常规用于防止受试者免疫系统对移植体的造血干细胞(HSC)产生排斥。一方面，可以进行供体骨髓与白细胞介素-2(IL-2)离体孵育以增强供体骨髓中杀伤性淋巴细胞的产生。白细胞介素-2(IL-2)是野生型淋巴细胞生长、增殖和分化所必需的细胞因子。目前关于将γδT细胞过继转移到人体中的研究可能需要共同施用γδT细胞和白细胞介素-2。然而，低剂量和高剂量的IL-2都可能具有高度的毒性副作用。IL-2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。另一方面，本公开内容提供了用于向受试者施用改造γδT细胞而不共同施用天然细胞因子或其修饰形式(例如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21)的方法。另一方面，改造的γδT细胞可以在不与IL-2共同施用的情况下施用于受试者。另一方面，改造的γδT细胞可以在程序期间施用于受试者，例如，骨髓移植而不共同施用IL-2。

给药方法

可以以任何顺序或同时向受试者施用一种或多种改造的γδT细胞群。如果同时施用，多种改造的γδT细胞可以为单次统一形式提供，例如：静脉内注射，或以多种形式提供，例如，多次静脉内输注、皮下注射、注射或丸剂。改造的γδT细胞可以一起包装或分开包装在单个包装中或在多个包装中。可以以多剂量给予一种或所有改造的γδT细胞。如果不是同时施用，多次剂量之间的时间间隔可能为大约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或大约一年。另一方面，改造的γδT细胞可以在施用于受试者后在受试者体内扩增。可以冷冻改造γδT细胞以提供细胞以相同的细胞制剂进行多次治疗。本公开内容的改造γδT细胞和包含该细胞的药物组合物可以包装为套件。套件可包括改造γδT细胞和包含该细胞的组合物的使用说明书(例如，书面说明书)。

另一方面，治疗癌症的方法包括向受试者施用治疗有效量的改造γδT细胞，其中所述给药治疗癌症。在另一实施方案中，治疗有效量的改造γδT细胞可以施用至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。另一方面，治疗有效量的改造γδT细胞可以施用至少一周。另一方面，治疗有效量的改造γδT细胞可以施用至少二周。

本文所述的改造γδT细胞可以在疾病或病症发生之前、发生期间或发生之后施用，并且施用含有改造γδT细胞的药物组合物的时间可能不同。例如，改造的γδT细胞可以用作预防剂，并且可以连续给予有病症或疾病倾向的受试者，以减少疾病或病症发生的可能性。可以在症状发作期间或发作之后尽可能快地给予受试者改造的γδT细胞。改造γδT细胞可以在症状发作后立即、症状发作的前3小时内、症状发作的前6小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的48小时内或症状发作后的任何一段时间内给予。初始施用可透过任何实用的途径，例如：透过本文描述的任何途径使用本文描述的任何制剂给予。另一方面，本公开内容的改造γδT细胞可以是静脉内施用。一种或多种剂量的改造γδT细胞可在癌症、传染病、免疫疾病、败血症或骨髓移植开始后尽快施用，并持续一段治疗免疫疾病所需的时间，例如，从约24小时到约48小时、从约48小时到约1周、从约1周到约2周、从约2周到约1个月、从约1个月到约3个月。对于癌症治疗，可以在癌症发作后数年和其他治疗之前或之后施用一剂或多剂量的改造γδT细胞。另一方面，改造的γδT细胞可以施用至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每个受试者的治疗时间可能不同。

保存

一方面，γδT细胞可以在冷冻介质中配制并置于低温储存装置(例如：液氮冷冻器(-196℃)或超低温冷冻器(-65℃、-80℃、-120℃或-150℃)中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻培养基可以含有二甲基亚碸(DMSO)和/或氯化钠(NaCl)和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(HES)以及生理pH缓冲剂，以将pH保持在约6.0至约6.5、约6.5至约7.0、约7.0至约7.5、约7.5至约8.0或约6.5至约7.5之间。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并透过用本文所述的抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激进行进一步加工。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并用本文所述的病毒载体(包括逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体)或非病毒手段(包括RNA、DNA，例如转座子和蛋白质)进行基因修饰。可以进一步冷冻保存修饰的γδT细胞以产生至少约1、5、10、100、150、200、500个小瓶量的细胞库，细胞浓度为至少约10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或至少10¹⁰个细胞/mL冷冻介质。冷冻保存的细胞库可以保留其功能并且可以解冻并进一步刺激和扩增。另一方面，可以在合适的封闭容器(例如：细胞培养袋和/或生物反应器)中刺激和扩增解冻的细胞，以产生大量细胞作为同种异体细胞产物。冷冻保存的γδT细胞可以在低温储存条件下维持其生物学功能至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。另一方面，制剂中不使用防腐剂。冷冻保存的γδT细胞可以解冻并作为同种异体现成的细胞产物输注到多个患者中。

一方面，本文所述的改造γδT细胞可能存在于组合物中，含量为至少1×10³个细胞/ml、至少2×10³个细胞/ml、至少3×10³个细胞/ml、至少4×10³个细胞/ml、至少5×10³个细胞/ml、至少6×10³个细胞/ml、至少7×10³个细胞/ml、至少8×10³个细胞/ml、至少9×10³个细胞/ml、至少1×10⁴个细胞/ml、至少2×10⁴个细胞/ml、至少3×10⁴个细胞/ml、至少4×10⁴个细胞/ml、至少5×10⁴个细胞/ml、至少6×10⁴个细胞/ml、至少7×10⁴个细胞

/ml、至少8×10⁴个细胞/ml、至少9×10⁴个细胞/ml、至少1×10⁵个细胞/ml、至少2×10⁵个细胞/ml、至少3×10⁵个细胞/ml、至少4×10⁵个细胞/ml、至少5×10⁵个细胞/ml、至少6×10⁵个细胞/ml、至少7×10⁵个细胞/ml、至少8×10⁵个细胞/ml、至少9×10⁵个细胞/ml、至少1×10⁶个细胞/ml、至少2×10⁶个细胞/ml、至少3×10⁶个细胞/ml、至少4×10⁶个细胞/ml、至少5×10⁶个细胞/ml、至少6×10⁶个细胞/ml、至少7×10⁶个细胞/ml、至少8×10⁶个细胞/ml、至少9×10⁶个细胞/ml、至少1×10⁷个细胞/ml、至少2×10⁷个细胞/ml、至少3×10⁷个细胞/ml、至少4×10⁷个细胞/ml、至少5×10⁷个细胞/ml、至少6×10⁷个细胞/ml、至少7×10⁷个细胞/ml、至少8×10⁷个细胞/ml、至少9×10⁷个细胞/ml、至少1×10⁸个细胞/ml、至少2×10⁸个细胞/ml、至少3×10⁸个细胞/ml、至少4×10⁸个细胞/ml、至少5×10⁸个细胞/ml、至少6×10⁸个细胞/ml、至少7×10⁸个细胞/ml、至少8×10⁸个细胞/ml、至少9×10⁸个细胞/ml、至少1×10⁹个细胞/ml或更多、从约1×10³个细胞/ml至约至少1×10⁸个细胞/ml、从约1×10⁵个细胞/ml至约至少1×10⁸个细胞/ml或从约1×10⁶个细胞/ml至约至少1×10⁸个细胞/ml。

为了开发可存活的同种异体T细胞产物，例如，其可以被改造以表达肿瘤抗原特异性TCR，例如嵌合CD8α-CD4tm/细胞内蛋白(图12A和12B)，本公开内容的实施方案可能包括可以最大限度地提高γδT细胞产量，同时最大限度地减少最终同种异体产物中存在残留αβT细胞的方法。例如，本公开内容的实施方案可能包括透过消耗γδT细胞并用分子(例如：两性霉素B、N-乙醯半胱氨酸(NAC)(或高剂量谷氨醯胺/谷氨酸)、IL-2和/或IL-15补充生长培养物来扩增和活化γδT细胞的方法。

一方面，根据本公开内容的一个方面，本文描述的方法可以用于产生自体或同种异体产物。

透过参考以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例不用来限制权利要求的范围。

实施例

实施例1

加工白细胞分离术产物

白细胞分离术产品(例如

)可处理如下：

袋的一端可以用酒精棉签擦拭并用剃刀刀片切开以排入烧瓶中。用Hank溶液将体积稀释至约500ml之间，然后等分到16-29个容量为50ml的试管中，每管30ml。试管可以400g离心30分钟，不制动、不加速。可以吸出白色液体，可以填充新的50ml试管至一半并用25ml PBS填满。该过程可以再重复2次，总共洗涤3次。在最后一次洗涤之前使用血球计数器计数细胞。产量可以是1×10⁸个细胞/管，共30-60管。

实施例2

消耗αβT细胞

图1A显示了从PBMC中消耗αβT细胞。将ficoll处理后的PBMC与生物素缀合的αβTCR抗体一起孵育，然后根据制造商的方案与链霉抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然后使样本通过LS管柱以富集表达αβTCR的细胞。管柱流出液表示αβTCR消耗的部分。过夜培养后，富含αβTCR的部分和αβTCR消耗的部分用萤光染料缀合的αβTCR抗体与Vγ9抗体染色，然后进行流式细胞术分析。资料显示，虽然富含αβTCR部分几乎不含(0％)Vγ9δ2细胞，但在αβTCR消耗的部分几乎富集所有Vγ9δ2细胞(45％)。

类似地，来自白细胞分离术产物的细胞可与生物素缀合的αβTCR抗体一起孵育，然后根据制造商的方案与链霉抗生物素蛋白-微珠一起孵育。然后使样本通过LS管柱以富集表达αβTCR的细胞。管柱流出液表示αβTCR消耗的部分。过夜培养后，将αβTCR消耗的部分用萤光染料缀合的αβTCR抗体与γδTCR抗体染色，然后进行流式细胞术分析。图1E显示，虽然白细胞分离产物中的起始细胞含有最少的(4.14％)Vγ9δ2细胞，但几乎所有Vγ9δ2细胞在αβTCR消耗的部分富集(95.5％)。一方面，使用前述方法，Vγ9δ2细胞可富集超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

图1B和1C显示了Vγ9δ2 T细胞产物中最少的残留αβT细胞。使用生物素化抗αβTCR抗体/链霉抗生物素蛋白微珠从正常供体(供体A、供体B、供体C、供体12和供体13)的PBMC中消耗αβT细胞。将αβT细胞消耗的PBMC与唑来膦酸盐/IL-2/IL-15一起培养14天，然后用各自的萤光染料缀合抗体(例如，抗-αβTCR抗体和抗-γδTCR抗体)进行细胞表面染色，透过CD3亚门控评估残留的αβT细胞和富集的γδT细胞。这些结果显示，αβT细胞消耗的γδT细胞富集，即90.1％(供体A)、78.6％(供体B)、28.9％(供体C)、89％(供体12)和74％(供体13)。此外，αβT细胞消耗的γδT细胞含有最少量的残余αβT细胞，即0.02％(供体A)、0.05％(供体B)、0.2％(供体C)、0.4％(供体12)和1％(供体13)。残留αβT细胞最少很重要，这是因为，例如，在半相合造血干细胞移植(HSCT)中，0.2-0.6％的残留αβT细胞不会导致慢性移植物抗宿主病(GVHD)，因此，使这些αβT细胞消耗的γδT细胞成为安全的同种异体产物。

图1D显示Vγ9δ2细胞的细胞因子谱。在收获细胞之前，用Golgi Stop/Plug(即，蛋白质转运抑制剂)处理用唑来膦酸盐/IL-2/IL-15培养的αβT细胞消耗的PBMC 6个小时。对细胞进行表面Vδ2染色，然后固定并通透化。使用针对TNF-α、IL-17a和IFN-γ的萤光染料缀合抗体进行TNF-α、IL-17a和IFN-γ细胞内染色。这些结果显示TNF-α、IL-17a和IFN-γ分别在12％、0.2％和4％的Vγ9δ2细胞中表达。IL-15介导的IL-17定型抑制由少量产生IL-17的Vγ9δ2 T细胞显示，例如0.2％。

实施例3

αβT细胞消耗的PBMC的适化和扩增

在不定型失能的情况下，最大程度的T细胞活化、增殖和存活可能需要三种信号：透过TCR引发的信号1、透过共刺激分子引发的信号2和透过生长因子信号传导引发的信号3。

图2和3分别显示了根据本公开内容的实施方案的活化步骤和扩增步骤。活化步骤和扩增步骤可以是两个连续的步骤。例如，在活化步骤期间(图2)，可能存在氨基二膦酸盐(例如，唑来膦酸盐(ZA))或磷酸抗原(例如，IPP)和细胞因子(例如，IL-2和/或IL-15)。而在扩增步骤期间(图3)，细胞因子可能在没有氨基二膦酸盐或磷酸抗原(如：IPP)的情况下继续存在。活化步骤(图2)可以在前14天期间发生，此时加入氨基二膦酸盐或磷酸抗原(例如IPP)并且不洗去。扩增步骤(图3)可以从第15天开始，因为在第14天结束时，可以透过除去含有氨基二膦酸盐或磷酸抗原(例如IPP)的所有培养基，并用无氨基二膦酸盐或磷酸抗原(例如IPP)存在的含有细胞因子的培养基替换来收集活化细胞。相反，用于Vγ9δ2唑来膦酸盐介导的生产的常规方案通常将第1-14天称为活化/扩增期，这是因为在这样的条件下，细胞不能在第14天之后保持存活。在本公开内容中，第1-14天被称为活化步骤，这是因为存在氨基二膦酸盐(例如，唑来膦酸盐或磷酸抗原，例如IPP)，第15天以后被称为扩增步骤，这是因为在超过常规的14天过程外细胞可以保持存活和扩增。

图2显示了透过氨基二膦酸盐诱导的γδTCR/IPP相互作用引发的信号1以活化Vγ9δ2 T细胞进行增殖，氨基二膦酸盐可包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物；或磷酸抗原，例如：(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)、类异戊二烯焦磷酸盐(法呢基焦磷酸盐(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯焦磷酸盐(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP))。例如，唑来膦酸盐(唑来膦酸(ZA)或Zometa)抑制单核细胞(Mo)中的甲羟戊酸途径，导致磷酸抗原(如IPP)积聚展示在单核细胞上(ZA-Mo)，从而透过PKC信号传导活化γ9δ2 TCR/CD3和诱导增殖，从而作为信号1。IPP本身也可以透过与γ9δ2 TCR结合直接作用于γδT细胞，从而避免了对单核细胞的需要。

图2还显示透过共刺激分子例如，两性霉素B(FDA批准的安必素)，即TLR2配体引发的信号2。例如，两性霉素B可以透过两种潜在的机制刺激γδT细胞。首先，作为信号2的两性霉素B可以作为共刺激分子作用于γδT细胞，共刺激γδT细胞活化、增殖和IFN-γ产生，并降低Vδ2 T细胞对αβT细胞的免疫抑制活性。两性霉素B还可以作为CD25的增强子，CD25是IL-2的高亲和力受体(IL-2Rα)，从而增加对IL-2的反应性，以透过信号3刺激增殖。其次，两性霉素B作为信号3，可作用于单核细胞(ZA-Mo)，促进IL-18的分泌，这可增强CD25的表达且支持中枢记忆T细胞，促进IL-15的分泌，从而增强效应子Vγ9δ2 T细胞的产生和阻断IL-17定型细胞。两性霉素B的合适替代物可能包括天然提取物，例如：来自茶叶的L-茶氨酸、来自苹果的单宁和来自蔓越莓和香菇的多酚。

用共刺激分子(如CD86和41BBL)补充Vγ9δ2培养物增强了它们的增殖。本公开内容的实施方案可能包括使用αβT细胞消耗的PBMC或αβT细胞消耗的白细胞分离产物，其中骨髓细胞可以是主要的细胞群。骨髓细胞摄取唑来膦酸盐，其抑制甲羟戊酸途径，导致IPP积累，IPP可表达为分泌形式或以骨髓细胞上的膜结合形式呈现。骨髓细胞也是优异的抗原呈递细胞，在不同的分化阶段表达各种共刺激分子。

此外，γδT细胞自身也可以表达各种共刺激分子。因此，在唑来膦酸盐治疗期间，可以以高细胞密度培养αβ消耗的PBMC或αβT细胞消耗的白细胞分离产物，以促进存在于骨髓细胞以及扩增的γδT细胞上的共刺激分子的参与，从而增强Vγ9δ2 T细胞的活化、增殖和存活。例如，可以将外源性IL-2(10-1000U/ml，优选为20-500U/ml，更优选为50-100U/ml)加入到αβ消耗的PBMC或αβT细胞消耗的白细胞分离产物中，其中CD4辅助T细胞(分泌IL-2)是αβT细胞消耗的细胞，以在活化和扩增期间维持存活和增殖。外源性IL-15(10-1000ng/ml，优选为20-500ng/ml；更优选为50-100ng/ml)可用于高细胞密度培养，以透过抑制产生IL-17的Vγ9δ2 T细胞的发展以最大活化Vγ9δ2，如图1D(中图)所示，从而增强γδT细胞增殖，促进幼稚Vγ9δ2 T细胞分化为效应细胞。因此，高密度培养利用γδ-γδT细胞(在γδT细胞上表达CD28、CD86、CD83、CD80)之间的相互共刺激作用。例如，与CD86和/或CD80相互作用的CD28共刺激分子可以增强γδT细胞的存活和增殖。

为了确定细胞密度对T细胞表型和细胞死亡的影响，在存在唑来膦酸盐、IL-2和IL-15的情况下活化14天后，在不存在唑来膦酸盐的情况下，使用稳态细胞因子(例如，IL-2和IL-15)，以高密度(如，2x10⁶个细胞/ml)和低密度(如，0.5x10⁶个细胞/ml)扩增T细胞，然后进行T细胞标志物分析。图4A显示了免疫表型标志物，例如CD122、CD80、CD83、CD86、CD95和CD95L在Vγ9δ2 T细胞上不受细胞密度影响，因为在高密度和低密度培养时，Vγ9δ2 T细胞标志物表达之间没有显著差异。然而，图4B显示了与低密度相比(51％)，高密度扩增期间细胞死亡显著降低(20％)。这些结果表明，以高密度(例如，至少1x10⁶个细胞/ml)扩增Vγ9δ2 T细胞可透过减少细胞死亡来促进细胞存活。

图5显示包含两性霉素B可增加表达CD25(或IL-2Rα)的Vδ2(即Vγ9δ2)T细胞的百分比。简言之，在第0天，在补充有唑来膦酸盐、IL-2和IL-15的活化培养基中培养αβ消耗的PBMC。48小时后，加入两性霉素B，再过48小时，收集细胞，对CD3+/Vδ2 T细胞上的CD25(或IL-2Rα)表面表达进行基于流式细胞术的分析。这些结果表明，与未处理的αβ消耗PBMC相比(0.55％)，唑来膦酸盐、IL-2和IL-15处理使表达CD25的Vδ2 T细胞的百分比增加至16％。然而，将两性霉素B加入唑来膦酸盐、IL-2和IL-15使Vδ2 T细胞的百分比从16％(不使用两性霉素B)增加至29％(使用两性霉素B)。这些结果表明，两性霉素B可以透过信号2和3进一步扩增由唑来膦酸盐、IL-2和IL-15扩增和活化的Vδ2 T细胞。

图6显示了使用唑来膦酸盐(Zometa)在确定培养基中的γδT细胞扩增，确定培养基中含有IL-2、IL-15和两性霉素B。对于供体20，γδT细胞绝对数量从第0天到第17天、从第0天到第22天以及从第0天到第29天的倍数增加分别为3,350倍、11,060倍和31,666倍。类似地，对于供体21，γδT细胞绝对数量从第0天到第17天、从第0天到第22天以及从第0天到第29天的倍数增加分别为4,633倍、12,320倍和32,833倍。相比之下，如上所述，经典Vγ9δ2 T细胞扩增方案充其量只能在14天内使总Vγ9δ2 T细胞增加100倍，此后，扩增率降低，这可能是细胞死亡增加引起的。一方面，使用前述方法，与第0天相比，第29天扩增后γδT细胞绝对数量的倍数增加可以为约1000倍至约40,000倍、约3000倍至约35,000倍、约5000倍至约35,000倍、约6000倍至约35,000倍、约7000倍至约35,000倍、约8000倍至30,000倍、约10,000倍至约35,000倍、约15,000倍至约35,000倍、约20,000倍至约35,000倍、约25,000倍至约35,000倍、约30,000倍至约35,000倍、大于约10,000倍、大于约15,000倍、大于约20,000倍、大于约25,000倍、大于约30,000倍、大于约40,000倍或大于约40,000倍。

中性粒细胞(血液中最丰富的白细胞)可以抑制γδT细胞的生长和存活。因此，中性粒细胞的去除或失活可促进γδT细胞的生长和存活。为了实现这一目的，可以使用中性蛋白酶(如：蛋白酶3、弹性蛋白酶和组织蛋白酶G)透过蛋白水解切割IL-2和调节丁酸菌素3A1(CD277)来抑制(1)中性粒细胞增殖，(2)细胞因子产生，和(3)γδT细胞的细胞毒性。此外，如在多微生物脓毒症小鼠中观察到的，施用谷氨醯胺和/或N-乙醯半胱氨酸(NAC)可减少了中性粒细胞的数量并增加γδT细胞的百分比。此外，正如在LPS诱导的急性肺损伤大鼠中所观察到的，补充谷氨醯胺可降低γδT细胞的凋亡率，部分是透过增强谷胱甘肽(GSH)(一种抗氧化剂)合成，从而减少自由基的破坏性影响，即，端粒侵蚀。基于这些观察结果，如图2和3所示，本公开内容的实施方案还可包括用高剂量谷氨醯胺/谷氨酸(或低剂量N-乙醯半胱氨酸(NAC)，例如1-10mM，优选为2.5-7mM)补充培养物以抵抗自由基介导的损伤并维持T细胞复制潜力，从而最大化培养扩增。NAC或高剂量谷氨醯胺/谷氨酸可维持高GSH细胞内水平并抵消培养物中单核细胞和中性粒细胞产生的高自由基(活性氧(ROS))。此外，如图2所示，布洛芬(环氧化酶-2(COX-2)抑制剂)可以抵消单核细胞(ZA-Mo)中两性霉素B介导的COX-2活化，从而限制与单核细胞共培养过程中前列腺素E2(PGE2)的积累。也可以使用其他COX-2抑制剂，例如，伐地考昔、罗非考昔、塞来昔布。

实施例4

用RD114TR假型逆转录病毒载体对Vγ9δ2 T细胞进行TCR改造

图7显示了病毒转导到Vγ9δ2 T细胞中的时间表。新鲜的白细胞消耗αβT细胞，并在存在IL-2和IL-15的情况下用唑来膦酸盐活化至少1天或最多7天。使用表达αβTCR和/或CD8的病毒上清液，可以在活化后24至168小时内转导γδT细胞。

为了确定透过本公开内容的方法制备的Vγ9δ2 T细胞是否适合用表达不同包膜蛋白的病毒进行病毒转染，对表达绿色萤光蛋白(GFP)的-逆转录病毒(例如，长臂猿白血病病毒(GALV)假型(SEQ ID NO：4)、RD114TR假型(SEQ ID NO：1))和表达GFP的慢病毒(例如，VSV-G假型(例如，SEQ ID NO：3))转导至这些Vγ9δ2 T细胞的效率进行了测试。此外，测试用VSV-G和RD114TR假型化的表达CD8α的慢病毒(LV)转导至Vγ9δ2 T细胞的效率。

图8A显示，转导后第5天，GALV假型的GFP表达为12％，RD114TR假型为34％，VSV-G假型为46％。然而，转导后第10天，RD114TR假型维持GFP表达为40％，而GALV假型和VSV-G假型的GFP表达分别降低至7％和3.6％。这些结果表明，RD114TR-假型γ-逆转录病毒可能是唑来膦酸盐、IL-2和IL-15扩增的Vγ9δ2 T细胞中稳定基因表达的最佳基因递送方法。

图8B显示，转导后第4天，当用RD114TR假型化的LV转导Vγ9δ2 T细胞时，Vγ9δ2 T细胞上的CD8α表达范围为63.2％(使用2.18μl LV)至95.8％(使用35μl LV)。另一方面，当用VSV-G假型化的LV转导Vγ9δ2 T细胞时，Vγ9δ2 T细胞上的CD8α表达范围为17.9％(使用2.18μl LV)至31.2％(使用35μl LV)。尽管VSV-G是最常用的包膜，RD114TR常用于假型γ-逆转录病毒，但这些结果表明，RD114TR假型慢病毒不仅可用于转导Vγ9δ2 T细胞，而且对Vγ9δ2 T细胞的转导效率高于VSV-G假型慢病毒。

实施例5

改造表达αβ-TCR和CD8αβ的γδT细胞

本公开的改造γδT细胞可用于治疗需要治疗病症的受试者。为了改造表达特异性结合于TAA/MHC复合体的αβ-TCR的γδT细胞，产生了表达αβ-TCR的γ-逆转录病毒(αβ-TCR病毒)。因为γδT细胞可能不表达CD8，因此，除了αβ-TCR之外，γδT细胞可能需要CD8以识别靶细胞(例如，癌细胞)细胞膜上的TAA/MHC-I复合体。为此，产生了表达CD8的γ-逆转录病毒(CD8病毒)。

为了确定用改造γ-逆转录病毒转导Vγ9δ2 T细胞的转导效率，在补充有IL-2和IL-15的确定培养基中，用MOI为3的αβ-TCR病毒和/或CD8病毒转导唑来膦酸盐活化的Vγ962 T细胞。透过用TAA/MHC-PE dextramer(或阴性对照物NYESO-PE dextramer)染色，然后进行CD3、CD8α和Vδ2染色，在转导后96小时测量转导效率。在MacsQuant上采集后，对CD3群体进行了门控分析。

可以在存在转导增强子的情况下进行转导，以透过物理性地减少带负电的细胞和病毒粒子之间的静电排斥并因此增加细胞-病毒体相互作用来提高转导效率。为此，在用编码CD8αβ的逆转录病毒进行γδT细胞转导期间测试了两种转导增强子。测试了

(涂覆在平板上的纤连蛋白片段)和

(可溶性阳离子肽)。图9A显示，虽然

有更高的转导效率(平均49.7％)，但

也能够以27.5％的平均转导效率转导γδT细胞。

图9B显示，与阴性对照NYESO-PE dextramer染色相比(即，单独用αβ-TCR病毒(1.6％)以及用αβ-TCR病毒和CD8病毒一起转导(2％))，透过TAA/MHC-PE dextramer染色鉴定了71％单独用αβ-TCR病毒转导的Vγ9δ2 T细胞和49％用αβ-TCR病毒和CD8病毒一起转导的Vγ9δ2 T细胞。这些结果表明，特异性结合TAA/MHC复合体的αβ-TCR易于呈递在用αβ-TCR病毒转导的Vγ9δ2 T细胞的细胞表面上。此外，与空白组(无病毒)(4％)和单独用αβ-TCR病毒转导(4.4％)相比，透过CD8α染色鉴定了7.6％单独用CD8病毒转导的Vγ9δ2 T细胞和6.8％用αβ-TCR病毒和CD8病毒一起转导的Vγ9δ2 T细胞。这些资料显示透过唑来膦酸盐、IL-2和IL-15介导的活化和扩增制备的Vγ9δ2 T细胞可用于透过病毒转导表达TAA特异性TCR和CD8。

为了确定病毒转导后Vα9δ2 T细胞的倍数扩增，Vα9δ2 T细胞(GD)或αβT细胞(AB)用αβ-TCR病毒(TCR)和/或CD8病毒(CD8)进行转导，然后测量从转导后第7天到第21天的倍数扩增。图10显示，在没有转导的情况下，Vγ9δ2 T细胞(GD空白组)(1,040倍)通常比αβT细胞(AB空白组)(289倍)具有更高的倍数扩增。单独用αβ-TCR转导后，Vγ9δ2 T细胞(GD+TCR)的倍数扩增为517倍，高于αβT细胞(AB+TCR)(211倍)。在用CD8单独(GD+CD8)或CD8+αβ-TCR(GD+CD8+TCR)转导后，Vγ9δ2 T细胞分别具有620倍和540倍的扩增。这些结果表明，Vγ9δ2T细胞通常比αβT细胞具有更好的细胞扩增能力，并且更适用于病毒转导。

透过用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒转导Vγ9δT细胞，产生表达αβ-TCR的Vγ9δ2 T细胞，其中αβ-TCR特异性结合于TAA/MHC复合体。图11A显示，与无病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(空白组)相比，34.9％用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒(αβ-TCR+CD8)转导的Vγ9δ2 T细胞被TAA/MHC-dextramer(TAA/MHC-dex)和抗CD8抗体(CD8)染色阳性，表明产生了在细胞表面上表达αβ-TCR和CD8αβ的Vγ9δ2 T细胞(αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2T细胞)。

为了确定改造Vγ9δ2T细胞的溶细胞活性，将αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2 T细胞暴露于靶细胞，例如：A375细胞系，这是在细胞表面上呈递TAA/MHC复合体的人恶性黑色素瘤细胞系。四种功能测定：(1)CD107a脱粒，(2)IFN-γ释放，(3)6小时后A375细胞的凋亡，和(4)长期共培养后改造γδT细胞对A375的细胞毒性作用。

CD107a脱粒测定的原理基于透过颗粒依赖性途径杀死靶细胞，所述途径利用位于细胞毒性细胞的细胞质内的预先形成的裂解颗粒。围绕这些颗粒的脂质双层含有溶酶体相关的膜糖蛋白(LAMP)，包括CD107a(LAMP-1)。透过T细胞受体复合体识别靶细胞后，细胞凋亡诱导蛋白(如：颗粒酶和穿孔素)被快速释放到免疫突触中，该过程称为脱粒。因此，跨膜蛋白CD107a暴露于细胞表面并可被特异性单克隆抗体染色。图11B显示，与没有病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(空白组)相比，23.1％用靶细胞(例如A375细胞)孵育的-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(αβ-TCR+CD8)透过抗-CD107a抗体染色阳性，表明当暴露于A375细胞时，αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2 T细胞透过脱粒具有细胞溶解性。

当T细胞的TCR特异性结合于细胞表面抗原呈递细胞的肽/MHC复合体时，IFN-γ释放测定透过释放的IFN-γ水平测量细胞介导的对抗原呈递细胞(例如，A375细胞)的应答。图11C显示，与没有病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(空白组)相比，19.7％用αβ-TCR逆转录病毒和CD8αβ逆转录病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(αβ-TCR+CD8)被抗-IFN-γ抗体染色阳性，表明当暴露于A375细胞时，αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2 T细胞透过释放IFN-γ具有细胞溶解性。

透过门控非CD3 T细胞(即，A375细胞)的凋亡，在暴露于A375细胞后24小时评估细胞溶解活性。透过用活/死染料染色收获的培养物来评估细胞凋亡。图11D显示，与没有病毒转导的Vγ9δ2 T细胞(空白组)相比，αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2 T细胞(αβ-TCR+CD8)诱导70％的A375细胞凋亡，表明αβ-TCR+CD8αβ改造的Vγ9δ2 T细胞透过杀死A375细胞而具有细胞溶解性。

在84小时共培养测定期间还即时评估细胞溶解活性。将未转导的和αβTCR+CD8αβ转导的γδT细胞与靶阳性A375-RFP肿瘤细胞共培养，效应细胞与靶标比例为3∶1。透过

活细胞分析系统(Essen BioScience)即时评估靶阳性A375-RFP肿瘤细胞的裂解。单独的肿瘤细胞和未转导的和αβTCR转导的αβT细胞分别用作阴性和阳性对照。如图11E所示，虽然由于γδT细胞的内在抗肿瘤特性，未转导γδT细胞显示出细胞毒性，但是，αβTCR+CD8αβ转导的γδT细胞与αβTCR转导的αβT细胞相比具有相似的细胞毒性，表明αβTCR+CD8αβ转导的γδT细胞可经改造以靶向于并杀死肿瘤细胞。

这些资料表明，透过本公开内容的方法产生的改造Vγ9δ2 T细胞具有功能，并且可用于以TAA肽特异性方式杀死靶细胞(例如：癌细胞)。

一方面，本文所述的能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的TAA肽包括，例如，美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633和美国专利公开号20170260249所述的TAA肽，本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。

实施例6

改造表达嵌合分子的γδT细胞

可以改造γδT细胞以表达嵌合肿瘤识别部分，该部分含有衍生自NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRPl、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1和NKp80的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体，如抗Her2neu或抗EGFR和从CD3-ζ、Dap10、CD28、4-IBB和CD40L获得的信号传导结构域。在一些实施例中，嵌合受体结合于MICA、MICB、Her2neu、EGFR、间皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、RON、CD30、CD22、CD37、CD38、CD56、CD33、CD30、CD138、CD123、CD79b、CD70、CD75、CA6、GD2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CEACAM5、CA-125、MUC-16、5T4、NaPi2b、ROR1、ROR2、5T4、PLIF、Her2/Neu、EGFRvIII、GPMNB、LIV-1、糖脂F77、成纤维细胞活化蛋白、PSMA、STEAP-1、STEAP-2、c-met、CSPG4、Nectin-4、VEGFR2、PSCA、叶酸结合蛋白/受体、SLC44A4、Cripto、CTAG1B、AXL、IL-13R、IL-3R、SLTRK6、gp100、MART1、酪氨酸酶、SSX2、SSX4、NYESO-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、MAGEA家族基因(如：MAGE3A、MAGE4A)、KKLC1、突变ras、βraf、p53、MHC I类链相关分子A(MICA)或MHC I类链相关分子B(MICB)、HPV或CMV。

可用于转导γδT细胞的其他改造病毒可包括两种病毒以分别表达αβTCR和嵌合CD8/CD4。或者，单一病毒中可能包括TAA特异性αβTCR和嵌合CD8/CD4(具有截短的集落刺激因子1受体(CSF1R))。

图12A显示了，例如，CD8/CD4嵌合受体-T2A-截短的CSF1R，其中CD8α细胞外结构域可能与CD4跨膜和细胞内结构域连接。CD8α是结合于MHC I分子的α3结构域所必需的，其中CD8β对于棕榈醯化很重要，因此，提供了适当CD8募集至脂筏以与TCR复合体相互作用。另一方面，CD4以单体起作用并且可以定位于脂筏，与CD8细胞内结构域类似，CD4细胞内结构域可以募集淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)，其分别可以与T辅助细胞和细胞毒性T细胞上的CD4和CD8共同受体的细胞质尾部相互作用，以辅助来自TCR复合体的信号传导。因此，代替表达CD8α和CD8β，可以产生可以结合于MHC I分子并定位于脂筏的嵌合CD8/CD4蛋白。截短的CSF1受体(CSF1R)细胞内催化结构域可以与嵌合CD8/CD4蛋白下游连接，当不再需要嵌合CD8/CD4蛋白的功能时用作杀伤开关。CSF1R不在T细胞上表达，并且在骨髓细胞中最丰富。因此，关闭CSF1R细胞内催化结构域介导的信号传导对T细胞(如γδT细胞)的影响最小。如要关闭CSF1R信号传导，可以使用多种酪氨酸激酶抑制剂，例如R7155、CYC11645、Ki20227、GW2580、BLZ945、PLX5622和PLX3397。其他受体可用作杀伤开关，包括但不限于截短的TNFR2、截短的ESR1和/或ESR1/Fas信号传导，其可活化雌激素受体以诱导Fas介导的T细胞死亡。

CSF1可以促进M1(经典活化的巨噬细胞)至M2(其他活化的巨噬细胞)极化。在肿瘤微环境中，CSF1可以将肿瘤相关巨噬细胞(TAM)从M1型极化为M2型。这可能不是所希望的，因为M1型TAM比M2型TAM具有更多的杀肿瘤活性。为了利用CSF1在肿瘤微环境中的存在，驱动T细胞功能/持久性并降低CSF1使TAM极化的可用性，结合CSF1的CSF1R细胞外结构域可包括于嵌合CD8/CD4蛋白中。

图12B显示，例如，CD8/CD4嵌合受体-T2A-CSF1R/41BB嵌合受体，其中CSF1R细胞外结构域与嵌合CD8/CD4蛋白下游连接，使CSF1R细胞外结构域可以结合并隔离CSF1远离巨噬细胞，从而减少M1到M2的极化。透过提供共刺激分子，例如41BB，该融合蛋白可以促进T细胞(例如γδT细胞)的存活和扩增。

本公开内容的优点可包括(1)使用γδT细胞来引发针对甲羟戊酸依赖性肿瘤的细胞毒性；(2)使用γδT细胞作为同种异体细胞，改造以在有或没有内源性γδTCR删除的情况下表达肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)或γδ-TCR；(3)透过与各种形式的抗体或T细胞接合者(T-cell engager)共同给予，使用γδT细胞作为同种异体免疫细胞以治疗免疫受损癌症患者；(4)使用γδT细胞增强癌症疫苗树突状细胞的成熟；(5)使用γδT细胞作为抗原呈递细胞，以增强细胞毒性CD8 T细胞的活化。

本专利说明书中引用的所有参考文献均透过引用并入本文，如同每篇参考文献被具体和单独地指出透过引用并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，不应解释为认可本公开内容无权凭借之前的发明而先于此类参考文献。

应当理解，上述每个元素或者两个或更多个元素一起也可以在与上述类型不同的其他类型方法中找到有用的应用。在无进一步分析的情况下，前述内容同样充分地揭示本公开的要点，其他人可以透过应用当前知识，容易地将其适用于各种应用场合而不会遗漏从现有技术观点来看公平构成所附权利要求中阐述的本公开的通用或具体方面基本特点的特征。前述实施方案仅作为示例呈现；本公开内容的范围仅透过以下权利要求进行限制。

序列名单

<110> 伊玛提克斯美国公司

<120> 用于活化、修饰和扩增 γδT 细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法

<130> 3000011-003001

<150> US62/591,041

<151> 2017-11-27

<150> DE102017127984.9

<151> 2017-11-27

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RD114TR 融合蛋白

<400> 1

Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val

1 5 10 15

Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys

20 25 30

Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr

50 55 60

Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Ile Ser

65 70 75 80

Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln Asp

85 90 95

Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Arg Ile

100 105 110

Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Ser

115 120 125

Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln Ser

130 135 140

Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr Ala

145 150 155 160

Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg Val

165 170 175

Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met Thr Pro

180 185 190

Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp Leu

195 200 205

Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg Leu

210 215 220

Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu

225 230 235 240

Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu Thr

245 250 255

Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile Pro

260 265 270

Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Ser

275 280 285

Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val Thr

290 295 300

Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys Ala

305 310 315 320

Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr

325 330 335

Leu Pro Gln Asn Trp Thr Arg Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu Pro

340 345 350

Asp Ile Asp Ile Asn Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile

355 360 365

Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro Leu

370 375 380

Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly

385 390 395 400

Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile

405 410 415

Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln

420 425 430

Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp

435 440 445

Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys

450 455 460

Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg

465 470 475 480

Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Ser Asn

485 490 495

Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu

500 505 510

Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro Cys

515 520 525

Val Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val

530 535 540

Gln Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu

545 550 555

<210> 2

<211> 662

<212> PRT

<213> 猫内源性病毒 (Feline Endogeneous Virus)

<400> 2

Met Lys Pro Pro Ala Gly Met Val Phe Leu Trp Val Leu Thr Ser Leu

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ile Gly Ala Lys Ile Val Lys Glu Gly Asn Pro His Gln

20 25 30

Val Tyr Thr Leu Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Ser Gly Glu Val Val

35 40 45

Trp Glu Val Gln Gly Asn His Ala Leu Asn Thr Trp Trp Pro Pro Leu

50 55 60

Thr Pro Asp Phe Cys Gln Leu Ala Ala Gly Leu Asp Thr Trp Asp Ile

65 70 75 80

Pro Ala Arg Ser Pro Lys Asn Leu Gln Ser Tyr Met Gly Glu Arg Ile

85 90 95

Gln Gln Met Thr Ala His Gly Cys Ser Ser Pro Thr Ala Arg Cys Arg

100 105 110

Leu Ala Gln Ala Glu Phe Tyr Val Cys Pro Arg Asp Asn Arg Asp Arg

115 120 125

Ala Thr Ala His Arg Cys Gly Gly Tyr Glu Glu Tyr Phe Cys Ser Ala

130 135 140

Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Asp Ala Tyr Trp Gln Pro Thr Ser Ser

145 150 155 160

Trp Asp Leu Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Thr Lys Pro Asp Pro Asp

165 170 175

Gly His Thr Cys Tyr Tyr Lys Lys Gly Thr Glu Gly Tyr His His Trp

180 185 190

Ile Ser Pro Leu Ser Leu Pro Leu Lys Ile Thr Phe Thr Asp Ser Gly

195 200 205

Lys Arg Ala Leu Gly Trp Gln Thr Gly Tyr Thr Trp Gly Leu Arg Trp

210 215 220

Tyr Leu Pro Gly Lys Asp Arg Gly Ile Val Leu Lys Ile Lys Leu Lys

225 230 235 240

Ile Asp Thr Ile Thr Gln Thr Val Gly Pro Asn Leu Val Leu Ala Asp

245 250 255

Gln Lys Ala Pro Val Gln Leu Ala Ile Pro Val Gln Pro Pro Arg Ala

260 265 270

Pro Thr Gln Thr Pro Gly Ile Asn Pro Val Asn Ser Thr Leu Ser Pro

275 280 285

Ser Leu Gly Tyr Pro Thr Pro Pro Leu Asp Arg Ala Gln Gly Asp Arg

290 295 300

Leu Leu Asn Leu Val Gln Gly Val Tyr Leu Thr Leu Asn Leu Thr Ala

305 310 315 320

Pro Asn Gln Thr Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu Thr Ala Lys Pro Pro

325 330 335

Tyr Tyr Gln Gly Val Ala Ile Ile Gly Asn Phe Thr Asn His Thr Asn

340 345 350

Ala Pro Leu Arg Cys Ser Thr Thr Pro Arg His Gly Leu Thr Leu Thr

355 360 365

Glu Val Thr Gly His Gly Leu Cys Ile Gly Lys Ile Pro Pro Ser His

370 375 380

Gln Asn Leu Cys Ser Gln Thr Ile Pro Ser Val Gly Gln Gly Pro Tyr

385 390 395 400

Tyr Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Val Cys Asn Thr Gly Leu

405 410 415

Thr Pro Cys Ile Ser Leu Gln Val Leu Asn Asn Thr Ala Asp Tyr Cys

420 425 430

Ile Leu Ile Glu Leu Trp Pro Lys Ile Phe Tyr His Asp Ser Glu Tyr

435 440 445

Ile Tyr Gly His Tyr Glu Pro Gly Gly Arg Phe Arg Arg Glu Pro Val

450 455 460

Ser Leu Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Gly Leu Thr Met Gly Ser Leu

465 470 475 480

Ala Ala Gly Ile Gly Thr Gly Thr Ala Ala Leu Ile Glu Thr Asn Gln

485 490 495

Phe Lys Gln Leu Gln Ile Ala Met His Ser Asp Ile Gln Ala Leu Glu

500 505 510

Glu Ser Ile Ser Ala Leu Glu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val

515 520 525

Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Leu Gln Glu Gly

530 535 540

Gly Leu Cys Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ala Asp His

545 550 555 560

Thr Gly Ile Val Arg Asp Ser Met Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Lys

565 570 575

Gln Arg Gln Lys Leu Phe Glu Ser Gln Gln Gly Trp Phe Glu Gly Trp

580 585 590

Tyr Asn Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Val Ser Ser Leu Met Gly

595 600 605

Pro Leu Ile Leu Leu Leu Leu Ile Leu Met Phe Gly Pro Cys Ile Leu

610 615 620

Asn Arg Leu Val Gln Phe Ile Arg Glu Arg Leu Ser Val Ile Gln Ala

625 630 635 640

Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Arg Gln Phe Asp Ala Glu

645 650 655

Arg Pro Asp Thr Ile Glu

660

<210> 3

<211> 511

<212> PRT

<213> 水泡性口炎病毒 (Vesicular Stomatitis Virus)

<400> 3

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn

20 25 30

Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp

35 40 45

His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser

50 55 60

His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp

65 70 75 80

Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His

85 90 95

Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln

115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln

130 135 140

Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu

180 185 190

Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys

225 230 235 240

Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala

245 250 255

Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly

260 265 270

Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile

275 280 285

Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp

290 295 300

Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn

325 330 335

Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala

340 345 350

Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr

355 360 365

Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile

370 375 380

Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu

385 390 395 400

Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser

405 410 415

Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln

420 425 430

Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys

435 440 445

Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser

450 455 460

Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu

465 470 475 480

Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys

485 490 495

Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

500 505 510

<210> 4

<211> 685

<212> PRT

<213> 长臂猿白血病病毒 (Gibbon ape leukemia virus)

<400> 4

Met Val Leu Leu Pro Gly Ser Met Leu Leu Thr Ser Asn Leu His His

1 5 10 15

Leu Arg His Gln Met Ser Pro Gly Ser Trp Lys Arg Leu Ile Ile Leu

20 25 30

Leu Ser Cys Val Phe Gly Gly Gly Gly Thr Ser Leu Gln Asn Lys Asn

35 40 45

Pro His Gln Pro Met Thr Leu Thr Trp Gln Val Leu Ser Gln Thr Gly

50 55 60

Asp Val Val Trp Asp Thr Lys Ala Val Gln Pro Pro Trp Thr Trp Trp

65 70 75 80

Pro Thr Leu Lys Pro Asp Val Cys Ala Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ser

85 90 95

Trp Asp Ile Pro Gly Thr Asp Val Ser Ser Ser Lys Arg Val Arg Pro

100 105 110

Pro Asp Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Tyr Lys Gln Ile Thr Trp Gly Ala

115 120 125

Ile Gly Cys Ser Tyr Pro Arg Ala Arg Thr Arg Met Ala Ser Ser Thr

130 135 140

Phe Tyr Val Cys Pro Arg Asp Gly Arg Thr Leu Ser Glu Ala Arg Arg

145 150 155 160

Cys Gly Gly Leu Glu Ser Leu Tyr Cys Lys Glu Trp Asp Cys Glu Thr

165 170 175

Thr Gly Thr Gly Tyr Trp Leu Ser Lys Ser Ser Lys Asp Leu Ile Thr

180 185 190

Val Lys Trp Asp Gln Asn Ser Glu Trp Thr Gln Lys Phe Gln Gln Cys

195 200 205

His Gln Thr Gly Trp Cys Asn Pro Leu Lys Ile Asp Phe Thr Asp Lys

210 215 220

Gly Lys Leu Ser Lys Asp Trp Ile Thr Gly Lys Thr Trp Gly Leu Arg

225 230 235 240

Phe Tyr Val Ser Gly His Pro Gly Val Gln Phe Thr Ile Arg Leu Lys

245 250 255

Ile Thr Asn Met Pro Ala Val Ala Val Gly Pro Asp Leu Val Leu Val

260 265 270

Glu Gln Gly Pro Pro Arg Thr Ser Leu Ala Leu Pro Pro Pro Leu Pro

275 280 285

Pro Arg Glu Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Asp Ser Asn Ser Thr Ala

290 295 300

Leu Ala Thr Ser Ala Gln Thr Pro Thr Val Arg Lys Thr Ile Val Thr

305 310 315 320

Leu Asn Thr Pro Pro Pro Thr Thr Gly Asp Arg Leu Phe Asp Leu Val

325 330 335

Gln Gly Ala Phe Leu Thr Leu Asn Ala Thr Asn Pro Gly Ala Thr Glu

340 345 350

Ser Cys Trp Leu Cys Leu Ala Met Gly Pro Pro Tyr Tyr Glu Ala Ile

355 360 365

Ala Ser Ser Gly Glu Val Ala Tyr Ser Thr Asp Leu Asp Arg Cys Arg

370 375 380

Trp Gly Thr Gln Gly Lys Leu Thr Leu Thr Glu Val Ser Gly His Gly

385 390 395 400

Leu Cys Ile Gly Lys Val Pro Phe Thr His Gln His Leu Cys Asn Gln

405 410 415

Thr Leu Ser Ile Asn Ser Ser Gly Asp His Gln Tyr Leu Leu Pro Ser

420 425 430

Asn His Ser Trp Trp Ala Cys Ser Thr Gly Leu Thr Pro Cys Leu Ser

435 440 445

Thr Ser Val Phe Asn Gln Thr Arg Asp Phe Cys Ile Gln Val Gln Leu

450 455 460

Ile Pro Arg Ile Tyr Tyr Tyr Pro Glu Glu Val Leu Leu Gln Ala Tyr

465 470 475 480

Asp Asn Ser His Pro Arg Thr Lys Arg Glu Ala Val Ser Leu Thr Leu

485 490 495

Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ile Gly Thr Gly Ser

500 505 510

Thr Ala Leu Ile Lys Gly Pro Ile Asp Leu Gln Gln Gly Leu Thr Ser

515 520 525

Leu Gln Ile Ala Ile Asp Ala Asp Leu Arg Ala Leu Gln Asp Ser Val

530 535 540

Ser Lys Leu Glu Asp Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val Val Leu Gln

545 550 555 560

Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Gly Leu Cys

565 570 575

Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ile Asp His Ser Gly Ala

580 585 590

Val Arg Asp Ser Met Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Asp Lys Arg Gln

595 600 605

Leu Glu Arg Gln Lys Ser Gln Asn Trp Tyr Glu Gly Trp Phe Asn Asn

610 615 620

Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Leu Ser Thr Ile Ala Gly Pro Leu Leu

625 630 635 640

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Gly Pro Cys Ile Ile Asn Lys Leu

645 650 655

Val Gln Phe Ile Asn Asp Arg Ile Ser Ala Val Lys Ile Leu Val Leu

660 665 670

Arg Gln Lys Tyr Gln Ala Leu Glu Asn Glu Gly Asn Leu

675 680 685

<210> 5

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RD114TR 融合蛋白

<400> 5

Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val

1 5 10 15

Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys

20 25 30

Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr

50 55 60

Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Asn Leu

65 70 75 80

Thr Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln

85 90 95

Asp Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Ala

100 105 110

Asn Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly

115 120 125

Ser Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln

130 135 140

Ser Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr

145 150 155 160

Ala Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg

165 170 175

Val Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met His

180 185 190

Pro Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp

195 200 205

Leu Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg

210 215 220

Leu Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys

225 230 235 240

Leu Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu

245 250 255

Thr Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile

260 265 270

Pro Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu

275 280 285

Ser Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val

290 295 300

Thr Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys

305 310 315 320

Ala Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr

325 330 335

Tyr Leu Pro Gln Asn Trp Thr Gly Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu

340 345 350

Pro Asp Ile Asp Ile Ile Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala

355 360 365

Ile Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro

370 375 380

Leu Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr

385 390 395 400

Gly Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu

405 410 415

Ile Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp

420 425 430

Gln Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu

435 440 445

Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu

450 455 460

Lys Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile

465 470 475 480

Arg Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Ser

485 490 495

Asn Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro

500 505 510

Leu Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro

515 520 525

Cys Val Phe Ser Arg Leu Met Ala Phe Ile Asn Asp Arg Leu Asn Val

530 535 540

Val His Ala Met Val Leu Ala Gln Gln Tyr Gln Ala Leu Lys Ala Glu

545 550 555 560

Glu Glu Ala Gln Asp

565

Claims

1.权利要求内容为：

一种活化和扩增γδT细胞的体外方法，包括

从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，

在存在氨基二膦酸盐、人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下活化所述分离的γδT细胞，和

在不存在氨基二膦酸盐和存在人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下扩增所述活化的γδT细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中所述γδT细胞从白细胞分离术人样本中分离。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述氨基二膦酸盐包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。

4.根据权利要求1至3任一项中所述的方法，其中所述氨基二膦酸盐是唑来膦酸。

5.根据权利要求1至4任一项中所述的方法，其中活化存在唑来膦酸和由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物。

6.根据权利要求1至5任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在Toll样受体2(TLR2)配体。

7.根据权利要求6的方法，其中所述TLR2配体选自两性霉素B、L-茶氨酸、单宁和多酚组成的组。

8.根据权利要求1至7任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在N-乙醯半胱氨酸(NAC)。

9.根据权利要求1至8任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在COX-2抑制剂。

10.根据权利要求9的方法，其中所述COX-2抑制剂是布洛芬。

11.根据权利要求1至10任一项中所述的方法，其中活化存在唑来膦酸，浓度为约1μM至约10μM。

12.根据权利要求1至11任一项中所述的方法，其中活化存在IL-2，浓度为约10IU/ml至约100IU/ml。

13.根据权利要求1至10任一项中所述的方法，其中活化存在浓度为约1μM至约100μM的唑来膦酸、浓度为约10IU/ml至约200IU/ml的IL-2和浓度为约10-500ng/ml的IL-15。

14.根据权利要求1至10任一项和权利要求13中所述的方法，其中扩增存在浓度为约10IU/ml至约100IU/ml的IL-2和/或浓度为约50-200ng/ml的IL-15。

15.一种透过权利要求1至14任一项所述的方法制备的扩增γδT细胞群，其中所述扩增γδT细胞的密度为至少约1x10⁵个细胞/ml、至少约1x10⁶个细胞/ml、至少约1x10⁷个细胞/ml、至少约1x10⁸个细胞/ml或至少约1x10⁹个细胞/ml。

16.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的权利要求15所述的改造γδT细胞。

17.根据权利要求16的方法，其中所述癌症选自肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。

18.根据权利要求17的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。

19.一种活化和扩增γδT细胞的体外方法，包括

从人体受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离γδT细胞，

其中所述分离包括

使所述PBMC与抗α和抗βT细胞受体(TCR)抗体接触，

消耗所述PBMC中的α-和/或β-TCR阳性细胞，

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，还包括用重组病毒载体转导所述活化的γδT细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)或转座子。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

23.根据权利要求20至22任一项中所述的方法，其中所述病毒载体包含与编码包膜蛋白的SEQ ID NO：1具有至少95％同一性的RD114TR基因。

24.根据权利要求20至23任一项所述的方法，其中所述病毒载体编码CD8和/或αβ-TCR。

25.根据权利要求20至24任一项中所述的方法，其中所述转导在存在转导增强子的情况下进行。

26.根据权利要求25的方法，其中所述转导增强子是

或

27.一种透过权利要求14至20中任一项所述的方法制备的改造γδT细胞。

28.一种透过权利要求1至14和权利要求19至26中任一项所述的方法制备的扩增和活化的γδT细胞群。

29.根据权利要求1至14和权利要求19至26中任一项所述的方法，进一步包括磷酸抗原，所述磷酸抗原选自由(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMBPP)、类异戊二烯焦磷酸盐(法呢基焦磷酸盐(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯焦磷酸盐(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP))组成的组。