CN111719006A - 一种基于mcda-lfb技术的b组链球菌检测方法及其专用引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于MCDA‑LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组。本发明设计了能够针对B组链球菌cfb基因进行特异性扩增的成套引物组，并建立了针对B组链球菌的敏感、特异的MCDA‑LFB快速检测体系。通过实验证明：本发明提供的基于MCDA‑LFB技术的B组链球菌检测方法可以在30分钟内完成整个MCDA扩增，检测下限可以低至100fg，具有非常高的灵敏度。另外，本发明提供的扩增方法具有很高的扩增特异性，能准确地鉴别B组链球菌与其他常见致病菌，无假阳性及假阴性结果产生。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于MCDA-LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组。
背景技术
B组链球菌(Group B streptococci，GBS)感染是新生儿和孕产妇面临的严重问题。在新生儿，B组链球菌可入侵血液引起严重的侵袭性感染，如肺炎、败血症、脑膜炎等。定植于孕妇阴道和直肠的GBS可造成逆行性的感染，对妊娠结局产生较大的影响，如早产、产后出血等。为了减少新生儿感染GBS的可能，目前临床医生根据风险评估经验性给予抗生素预防性干预，但缺乏早期准确GBS检出实验室诊断技术，会导致漏诊误诊的可能。因此，亟需研发快速、准确的诊断GBS的技术以更好的治疗和管理患者。
传统的检测GBS的方法有：细菌培养和免疫学检测。目前，诊断GBS的金标准为在选择性培养基中对样本进行培养。然而，培养所需时间较长，一般需要48小时才能得到阳性的结果，且培养的敏感性较低。血清学检测由于其假阴性率和假阳性率很高，使得这种方法的应用迅速减少。一些酶免疫分析、对流免疫电泳等方法可对GBS进行分型，但需要昂贵的试剂盒及高滴度的抗血清，限制了其在临床上的应用。因此，大量的工作都致力于以核酸为基础的检测GBS的方法。在这方面，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可以实现快速、准确检测目标病原体。但它需要热循环仪器和复杂的操作程序，并且需要专业的实验操作员进行规范操作，使得它们在欠发达地区无法实现推广应用。GeneXpert分子诊断系统(系美国产品)亦可实现GBS的床旁快速检测，具有较高的敏感性和特异性，且该试剂盒操作简便，但由于单次检测的价格为38.8英镑，其昂贵的价格限制了应用。
近年来恒温扩增技术发展迅速，可以在恒定温度下实现快速有效的核酸扩增，因此无需使用热循环扩增设备，简单的PCR仪即可实现。目前已有10余种恒温核酸扩增技术应用于实验室，例如超支化滚环扩增(HRCA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。除LAMP仅需一种DNA聚合酶就可实现扩增外，其他方法均需要其它的酶或蛋白质共同工作才能实现扩增。这些检测方法存在不够快速、敏感、特异的问题。
为克服PCR技术和现有的恒温扩增技术的劣势，实现简单、快速、灵敏、特异的核酸诊断，发明人近期新建了一种核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple CrossDisplacement Amplification，MCDA)。MCDA(多交叉恒温扩增)在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。此外，为了进一步提高MCDA技术的推广价值，发明人还将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术，实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple Cross Displacement Amplification label-basedNanoparticles Lateral Flow Biosensor，MCDA-LFB)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供用于检测或辅助检测B组链球菌的成套引物组。
本发明提供的用于检测或辅助检测B组链球菌的成套引物组由引物1-引物10组成；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物3为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物4为如下a7)或a8)：
a7)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物5为如下a9)或a10)：
a9)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物6为如下a11)或a12)：
a11)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物7为如下a13)或a14)：
a13)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物8为如下a15)或a16)：
a15)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物9为如下a17)或a18)：
a17)序列表中序列9所示的单链DNA分子；
a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物10为如下a19)或a20)：
a19)序列表中序列10所示的单链DNA分子；
a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的单链DNA分子。
进一步的，所述引物5或所述引物6的5’端标记有荧光素；所述引物7或所述引物8的5’端标记有生物素。在本发明的具体实施例中，所述引物5的5’端标记有荧光素；所述引物7的5’端标记有生物素。
更进一步的，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9和所述引物10的摩尔比为1:1:4:4:2:2:2:2:2:2。
本发明的成套引物组具有如下c1)-c3)中任一种功能：
c1)检测或辅助检测B组链球菌；
c2)检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌；
c3)鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌。
本发明的第二个目的是提供上述成套引物组的新用途。
本发明提供了上述成套引物组在如下b1)-b6)中任一所述的应用：
b1)制备用于检测或辅助检测B组链球菌的产品；
b2)检测或辅助检测B组链球菌；
b3)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌的产品；
b4)检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌；
b5)制备鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌的产品；
b6)鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌。
本发明的第三个目的是提供含有上述成套引物组的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下c1)-c3)中任一种：
c1)检测或辅助检测B组链球菌；
c2)检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌；
c3)鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌。
进一步的，所述试剂盒还包括生物传感检测器；所述生物传感器包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板；
所述结合垫包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素；
所述硝酸纤维素膜含有检测线和质控线；所述检测线包被有抗荧光素抗体；所述质控线包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
更进一步的，所述试剂盒还包括2×reaction mix和Bst DNA聚合酶。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围；所述试剂盒的制备方法为如下d1)或d2)：
d1)将上述成套引物组中的各条引物分别单独包装；
d2)将上述成套引物组中的各条引物按比例混合在一起。
进一步的，所述d2)中，将所述成套引物组中的所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9和所述引物10按照摩尔比为1:1:4:4:2:2:2:2:2:2的比例混合在一起。
更进一步的，所述生物传感器的制备方法包括如下步骤：制备包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素的结合垫和含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后将样品垫、所述包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素的结合垫、所述含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜及吸水垫依次组装在背板上，得到所述生物传感器。
本发明的第四个目的是提供如下方法一或方法二：
所述方法一：一种检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌的方法，为如下e1)或e2)：
e1)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述成套引物组进行MCDA扩增，MCDA反应结束后通过上述生物传感检测器判断待测样品是否感染B组链球菌：若质控线区域及检测线区域均出现红色条带，则待测样品感染或候选感染B组链球菌；若质控线区域出现红色条带且检测线区域未出现红色条带，则待测样品未感染或候选未感染B组链球菌；
e2)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述成套引物组进行MCDA扩增，所述MCDA扩增体系中含有可视染料，MCDA反应结束后通过肉眼观察反应体系的颜色判断待测样品是否感染B组链球菌：若反应体系为绿色，则待测样品感染或候选感染B组链球菌；若反应体系为无色，则待测样品未感染或候选未感染B组链球菌；
所述方法二：一种鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌的方法，为f1)或f2)：
f1)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述成套引物组进行MCDA扩增，MCDA反应结束后通过上述生物传感检测器判断待测样品为B组链球菌还是其它致病菌：若质控线区域及检测线区域均出现红色条带，则待测样品为或候选为B组链球菌；若质控线区域出现红色条带且检测线区域未出现红色条带，则待测样品为其它致病菌或候选为其它致病菌；
f2)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述成套引物组进行MCDA扩增，所述MCDA扩增体系中含有可视染料，MCDA反应结束后通过肉眼观察反应体系的颜色判断待测样品为B组链球菌还是其它致病菌：若反应体系为绿色，则待测样品为或候选为B组链球菌；若反应体系为无色，则待测样品为其它致病菌或候选为其它致病菌。
上述方法中，所述MCDA扩增的反应体系如下：12.5μL 2×reaction mix，1.25μLBst DNA聚合酶(10U)，1μL DNA模板，成套引物组，补加去离子水至25μL。置换引物F1和F2在反应体系中的终浓度均为0.4uM，交叉引物CP1和CP2在反应体系中的终浓度均为1.6uM，扩增引物C1*、C2、D1*、D2、R1、R2在反应体系中的终浓度均为0.8uM。进一步的，所述MCDA扩增的反应体系还含有可视染料VDR。更进一步的，所述可视染料VDR的加入量为1μL。
所述MCDA扩增的反应条件如下：61-66℃反应30min，进一步优选为64℃反应30min。
上述任一所述应用或方法中，所述其它致病菌为如下病原菌中至少一种：肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae、铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae、单增李斯特菌Listeria monocytogenes、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、阪崎肠杆菌Bntorobater sakazakii、空肠弯曲菌Campylobacterjejuni、大肠杆菌Escherichia coli、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、类志贺单胞菌Plesiomonas shigelloides、沙门氏菌Salmonella、福氏志贺菌Shigella flexneri、鲍氏志贺菌Shigella baumannii、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、创伤弧菌Vibriovulnificus、粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、海氏肠球菌Enterococcus hirae、A组链球菌Group A Streptococcus、百日咳杆菌Bordetellapertussis、流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae、鲍曼不动杆菌Acinetobacterbaumannii。
本发明以MCDA为基础，针对GBS特异保守基因cfb设计引物，将MCDA技术与纳米生物传感检测技术(Nanoparticles-based Lateral Flow Biosensor，LFB)相结合，首次建立了快速诊断GBS的GBS-MCDA-LFB技术，实现对GBS的便捷、稳定、快速、特异、可靠及敏感性检测。为孕妇产前及产时预防性使用抗生素提供快速准确的依据。
附图说明
图1为MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图。
图2为MCDA引物验证和MCDA-LFB检测结果图谱。A组采用可视化的染料，阳性管呈现绿色，阴性管呈无色。B组采用生物传感检测器进行检测。1、2、3、4分别为B组链球菌、A组链球菌、粪肠球菌、空白对照(1ul双蒸水)。
图3为GBS-MCDA-LFB技术的最佳反应温度测试结果图谱。图3A反应温度为61℃。图3B反应温度为62℃。图3C反应温度为63℃。图3D反应温度为64℃。图3E反应温度为65℃。图3F反应温度为66℃。图3G反应温度为67℃。图3H反应温度为68℃。
图4为GBS-MCDA-LFB技术的灵敏度检测结果图谱。图4A为可视颜色变化法检测结果。图4B为生物传感检测器检测结果。1-9依次为浓度为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul的GBS DNA溶液，10为空白对照(1ul双蒸水)。
图5为GBS-MCDA-LFB技术的特异性检测结果图谱。1-5为GBS DNA溶液；6-29为其他病原菌DNA溶液；30为空白对照(1ul双蒸水)。
图6为GBS-MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试结果图谱。图6A反应时间为10min。图6B反应时间为20min。图6C反应时间为30min。图6D反应时间为40min。其中，1-9依次为浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL的GBS DNA溶液，10为空白对照(1ul双蒸水)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的试剂及来源：DNA提取试剂盒(QIAamp DNAMini Kits；Qiagen,Hilden,Germany)德国Qiagen公司产品。恒温扩增试剂盒(
Amplification Kit)及恒温扩增可视染料(Visual Detection Reagent，VDR)是天津捷易特生物科技有限公司产品。其余试剂均为市售分析纯产品。抗荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白(Biotin-BSA)是Abcam公司产品。高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-NP)是北京海泰正元科技有限公司产品。背板、样品垫、结合垫、吸水垫及硝酸纤维素膜均为上海杰一公司产品。
下述实施例中涉及的主要仪器及来源：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken ChemicalCo.,Ltd,Japan)是日本荣研公司产品。PCR仪(东胜龙EDC-810)是北京东胜创新生物科技有限公司的产品。
实施例1、以cfb基因为靶标的MCDA扩增引物组的设计及MCDA扩增方法
一、以cfb基因为靶标的MCDA扩增引物组的设计
由于cfb基因存在于所有的B组链球菌(GBS)中，其保守性好且特异性高，可以区分GBS与其他菌种，因此利用引物设计软件PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0针对GBS的特异基因cfb设计了4套MCDA扩增引物组，第1套MCDA扩增引物组由表1所示的引物序列组成，第2套MCDA扩增引物组由表2所示的引物序列组成，第3套MCDA扩增引物组由表3所示的引物序列组成，第4套MCDA扩增引物组由表4所示的引物序列组成。
表1、第1套用于cfb基因扩增的MCDA扩增引物组序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| S.ag-1-F1 | GGTGCATTGTTATTTTCACCA |
| S.ag-1-F2 | TCATAAACTGTCTCAGGGTT |
| S.ag-1-CP1 | GCCATTTGCTGGGCTTGATTATTACGTACATGCTGATCAAGTGAC |
| S.ag-1-CP2 | CAGGGAACAGATTATGAAAAACCGGGGCACGCAATGAAGTCTT |
| S.ag-1-C1 | GCCATTTGCTGGGCTTGATTATTAC |
| S.ag-1-C2 | CAGGGAACAGATTATGAAAAACCGG |
| S.ag-1-D1 | GATTTACCACTTGTGGAGT |
| S.ag-1-D2 | AGGCTATTACTAGTGTTGA |
| S.ag-1-R1 | CTATCTTGATCAAGCTTTTG |
| S.ag-1-R2 | CATTCAGTTGAGAAATATCAAAG |
表2、第2套用于cfb基因扩增的MCDA扩增引物组序列
表3、第3套用于cfb基因扩增的MCDA扩增引物组序列
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') |
| S.ag-3-F1 | ATGAACGTTACACATATGATGT |
| S.ag-3-F2 | AGTAATAGCCTCATTAACCGG |
| S.ag-3-CP1 | GTCACTTGATCAGCATGTACTTCTAAACTCTAGTGGCTGGTGC |
| S.ag-3-CP2 | CCAGCAAATGGCTCAAAAGCTTGATTTTCATAATCTGTTCCCTGAA |
| S.ag-3-C1 | GTCACTTGATCAGCATGTACTTCTA |
| S.ag-3-C2 | CCAGCAAATGGCTCAAAAGCTTGA |
| S.ag-3-D1 | TACAGCTGGTGAAAATAACA |
| S.ag-3-D2 | AGATAGCATTCAGTTGAGA |
| S.ag-3-R1 | TTACCACTTGTGGAGTT |
| S.ag-3-R2 | CATGTAAATAGTAATAATCAAGC |
表4、第4套用于cfb基因扩增的MCDA扩增引物组序列
注：C1*为5’端标记了FITC(荧光素)的引物，D1*为5’端标记了Biotin(生物素)的引物。
将针对GBS的cfb基因设计的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对，从而排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，然后针对4套引物通过恒温实时浊度仪LA-320C扩增，对反应产物进行检测后，发现第4套引物的扩增效率最高，扩增时间最短，所以最终确定第4套引物组为最佳的MCDA扩增引物组并进行后续验证。第4套引物组的引物设计的位置和方向见图1。
二、MCDA扩增及产物检测
1、MCDA扩增体系及条件
以GBS DNA为模板，配制MCDA反应体系，进行MCDA扩增，得到MCDA扩增产物。同时以A组链球菌DNA、粪肠球菌DNA为模板验证引物特异性，以双蒸水为模板作为阴性对照确保体系无污染。
MCDA反应体系：0.4uM置换引物F1和F2，1.6uM交叉引物CP1和CP2，0.8uM扩增引物C1*、C2、D1*、D2、R1、R2，12.5μL 2×reaction mix，1.25μL Bst DNA聚合酶(10U)，DNA模板1μL，补加去离子水至25μL。2×reaction mix和Bst DNA聚合酶(10U)均来自恒温扩增试剂盒(
Amplification Kit)。
MCDA反应条件：64℃反应40min。
2、MCDA扩增产物检测
MCDA扩增之后，有两种可用于MCDA扩增产物判别的检测方法，一种是通过在反应体系中加入1μL可视染料(VDR)，阳性反应管的颜色为绿色(图2A-1)，阴性反应为无色(图2A-2、图2A-3和图2A-4)。另一种最为简单直接的方法就是通过生物传感检测器对产物进行检测，阳性结果表现为CL和TL区域均出现红色条带(图2B-1)，阴性结果表现为仅CL区域出现红色条带(图2B-2、图2B-3和图2B-4)。
1)可视颜色变化法检测原理
本发明中运用的染料Visual Detection Reagent(VDR)为天津捷易特生物科技有限公司自主开发的高灵敏度的核酸扩增指示染料，VDR在扩增体系呈现为绿色，随着扩增体系温度的升高，VDR降解为A基团和B基团，扩增体系呈无色。当扩增体系中存在双链核酸时，A基团与双链核酸结合，呈绿色。阳性反应管呈绿色，阴性管呈无色。
可视颜色观察结果读取：阳性反应管的颜色为绿色(图2A-1)，阴性反应管为无色(图2A-2、图2A-3和图2A-4)。
2)生物传感检测器(LFB)检测原理
生物传感检测器(LFB)包含五个部分：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及背板。首先将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫依次组装在背板上，然后将高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-NP)，抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白(Biotin-BSA)分别包被在结合垫、检测线(TL)及质控线(CL)上。具体结构设计见专利公布号为CN106544434 A的发明专利申请的图1B。
LFB的检测原理：将MCDA扩增产物直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将检测样品加到样品垫区域，MCDA扩增产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA扩增产物到达结合垫后，SA-NP(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)与双标产物的一端(即生物素标记端)反应。当MCDA扩增产物继续向吸水垫方向运动，检测线区域的抗体与双标产物的另一端(即荧光素标记端)相结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物不断在检测线区域的累积，另一端的SA-NP(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)与之发生显色反应，从而实现MCDA扩增产物的可视化检测。同时，剩余的SA-NP(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)继续向上运动，与CL(质控线)区域的Biotin-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)进行显色反应，以此判断LFB功能是否正常。
LFB结果读取：阳性结果(图2B-1)表现为CL(质控线)区域及TL(检测线)区域均出现红色条带；阴性结果(图2B-2、图2B-3和图2B-4)表现为仅CL区域出现红色条带。当LFB试纸条没有出现红色条带时，表示LFB检测无效；当仅TL区域出现红色条带，而CL区域没有出现红色条带时，表示检测结果不可靠，需要重新进行检测。
实施例2、GBS-MCDA-LFB技术的最佳反应温度测试
以浓度为100ng/ul的GBS DNA溶液为模板，采用实施例1步骤二的1中的MCDA反应体系进行MCDA扩增，反应条件分别如下：61℃反应40min、62℃反应40min、63℃反应40min、64℃反应40min、65℃反应40min、66℃反应40min、67℃反应40min、68℃反应40min。运用实时浊度仪检测结果，在不同的温度下得到不同的动态曲线图。
结果见图3。图3表示针对cfb基因序列设计的检测GBS的MCDA引物筛选温度的动态曲线图。结果表明：64℃为MCDA引物的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择64℃作为恒温条件进行MCDA扩增反应。
实施例3、GBS-MCDA-LFB技术检测GBS的灵敏度
一、可视颜色变化法检测GBS的灵敏度
将浓度为100ng/ul的GBS DNA溶液连续倍比稀释后，分别得到浓度依次为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul的GBS DNA溶液。分别以不同浓度的GBS DNA溶液为模板，采用实施例1步骤二的1中的MCDA反应体系和MCDA反应条件进行MCDA扩增，在标准的MCDA反应体系中加入可视染料(VDR)。GBS阳性反应管表现为绿色，GBS阴性反应管则由绿色变为无色。
可视颜色变化法检测结果显示：可视颜色变化法检测GBS DNA的模板量范围为100fg-100ng，阳性扩增管为绿色(图4A-1、图4A-2、图4A-3、图4A-4、图4A-5、图4A-6、图4A-7)，当反应体系中GBS DNA的模板量降低至100fg以下时，反应管的颜色由绿色变为无色，表示阴性结果(图4A-8、图4A-9)。图4A-10为阴性对照。
二、GBS-MCDA-LFB技术检测GBS的灵敏度
将浓度为100ng/ul的GBS DNA溶液连续倍比稀释后，分别得到浓度依次为100ng/ul、10ng/ul、1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul的GBS DNA溶液。分别以不同浓度的GBS DNA溶液为模板，采用实施例1步骤二的1中的MCDA反应体系和MCDA反应条件进行MCDA扩增，MCDA扩增产物运用LFB进行检测。
LFB检测结果显示：生物传感检测器检测GBS DNA的模板量范围是100fg-100ng，LFB在CL和TL区域均出现红色条带，为阳性结果(图4B-1、图4B-2、图4B-3、图4B-4、图4B-5、图4B-6、图4B-7)。当GBS DNA的模板量降为100fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色条带，为阴性结果(图4B-8、图4B-9)。图4B-10为阴性对照。
实施例4、GBS-MCDA-LFB技术的特异性测试
分别以如下致病菌的基因组DNA：1-5号样本均为B组链球菌Group BStreptococcus(无乳链球菌Streptococcus agalactiae)；6-29号样本分别为肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae、铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae、单增李斯特菌Listeria monocytogenes、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、阪崎肠杆菌Bntorobater sakazakii、空肠弯曲菌Campylobacterjejuni、大肠杆菌Escherichia coli、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、类志贺单胞菌Plesiomonas shigelloides、沙门氏菌Salmonella、福氏志贺菌Shigella flexneri、鲍氏志贺菌Shigella baumannii、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、创伤弧菌Vibriovulnificus、粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、海氏肠球菌Enterococcus hirae、A组链球菌Group A Streptococcus、百日咳杆菌Bordetellapertussis、流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae、鲍曼不动杆菌Acinetobacterbaumannii为模板，采用实施例1步骤二的1中的MCDA反应体系和MCDA反应条件进行MCDA扩增，评价GBS-MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息详见表5。
表5、菌株信息
注：BCH：北京儿童医院；CP-CDC：昌平区疾病预防控制中心；P：GBS-MCDA-LFB检测阳性；N：GBS-MCDA-LFB检测阴性。
结果见图5。结果显示：只有B组链球菌经GBS-MCDA-LFB检测产生阳性结果，说明本发明建立的方法可以准确的鉴别B组链球菌与其他类型的病原体，无假阳性及假阴性结果产生，具有良好的特异性。
实施例5、GBS-MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试
分别以浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL和1fg/μL的GBS DNA溶液为模板，采用实施例1步骤二的1中的MCDA反应体系进行MCDA扩增，反应条件分别如下：64℃反应10min、64℃反应20min、64℃反应30min、64℃反应40min。
LFB检测结果显示：GBS-MCDA-LFB技术应用于GBS检测时，最佳反应时间为30分钟(图6)。当MCDA恒温扩增时间控制为30分钟时，检测线水平的模板均能够被检出(图6C)。图6C的LFB检测GBS DNA的模板量范围为100fg-100ng，LFB在TL和CL区域均出现红色条带(图6C-1、图6C-2、图6C-3、图6C-4、图6C-5、图6C-6、图6C-7)。当反应体系中GBS基因组DNA的模板量降低至100fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图6C-8、图6C-9)。图6C-10为阴性对照。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>首都医科大学附属北京儿童医院
<120>一种基于MCDA-LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组
<160>10
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
gcattcagtt gagaaatatc aaag 24
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
gcttagttat cccaaatccc ata 23
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
ggcacgcaat gaagtcttta attttaggga acagattatg aaaaaccg 48
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
agaagcctta acagatgtga ttgatcaata tttgcttgac taacct 46
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
ggcacgcaat gaagtcttta atttt 25
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>6
agaagcctta acagatgtga ttga 24
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
acactagtaa tagcctca 18
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
caatcacttt ttcaactcaa c 21
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>9
cataaactgt ctcagggtt 19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>10
gaattctatt ggtagtcgtg 20
Claims (10)
1.用于检测或辅助检测B组链球菌的成套引物组，由引物1-引物10组成；
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物2为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物3为如下a5)或a6)：
a5)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物4为如下a7)或a8)：
a7)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物5为如下a9)或a10)：
a9)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物6为如下a11)或a12)：
a11)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物7为如下a13)或a14)：
a13)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
a14)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物8为如下a15)或a16)：
a15)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
a16)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物9为如下a17)或a18)：
a17)序列表中序列9所示的单链DNA分子；
a18)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物10为如下a19)或a20)：
a19)序列表中序列10所示的单链DNA分子；
a20)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的成套引物组，其特征在于：所述引物5或所述引物6的5’端标记有荧光素；
或，所述引物7或所述引物8的5’端标记有生物素。
3.根据权利要求1或2所述的成套引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9和所述引物10的摩尔比为1:1:4:4:2:2:2:2:2:2。
4.权利要求1-3任一所述的成套引物组在如下b1)-b6)中任一所述的应用：
b1)制备用于检测或辅助检测B组链球菌的产品；
b2)检测或辅助检测B组链球菌；
b3)制备用于检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌的产品；
b4)检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌；
b5)制备鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌的产品；
b6)鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌。
5.含有权利要求1-3任一所述成套引物组的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下c1)-c3)中任一种：
c1)检测或辅助检测B组链球菌；
c2)检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌；
c3)鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括生物传感检测器；所述生物传感器包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板；
所述结合垫包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素；
所述硝酸纤维素膜含有检测线和质控线；所述检测线包被有抗荧光素抗体；所述质控线包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
7.权利要求5或6所述试剂盒的制备方法，为如下d1)或d2)：
d1)将权利要求1-3任一所述的成套引物组中的各条引物分别单独包装；
d2)将权利要求1-3任一所述的成套引物组中的各条引物按比例混合在一起。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述d2)中，将所述成套引物组中的所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7、所述引物8、所述引物9和所述引物10按照摩尔比为1:1:4:4:2:2:2:2:2:2的比例混合在一起；
或，所述生物传感器的制备方法包括如下步骤：制备包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素的结合垫和含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，然后将样品垫、所述包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素的结合垫、所述含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜及吸水垫依次组装在背板上，得到所述生物传感器。
9.如下方法一或方法二
所述方法一：一种检测或辅助检测待测样品是否感染B组链球菌的方法，为如下e1)或e2)：
e1)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用权利要求1-3任一所述的成套引物组进行MCDA扩增，MCDA反应结束后通过权利要求6中所述的生物传感检测器判断待测样品是否感染B组链球菌：若质控线区域及检测线区域均出现红色条带，则待测样品感染或候选感染B组链球菌；若质控线区域出现红色条带且检测线区域未出现红色条带，则待测样品未感染或候选未感染B组链球菌；
e2)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用权利要求1-3任一所述的成套引物组进行MCDA扩增，所述MCDA扩增体系中含有可视染料，MCDA反应结束后通过肉眼观察反应体系的颜色判断待测样品是否感染B组链球菌：若反应体系为绿色，则待测样品感染或候选感染B组链球菌；若反应体系为无色，则待测样品未感染或候选未感染B组链球菌；
所述方法二：一种鉴别或辅助鉴别B组链球菌与其它致病菌的方法，为f1)或f2)：
f1)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用权利要求1-3任一所述的成套引物组进行MCDA扩增，MCDA反应结束后通过权利要求6中所述的生物传感检测器判断待测样品为B组链球菌还是其它致病菌：若质控线区域及检测线区域均出现红色条带，则待测样品为或候选为B组链球菌；若质控线区域出现红色条带且检测线区域未出现红色条带，则待测样品为其它致病菌或候选为其它致病菌；
f2)提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用权利要求1-3任一所述的成套引物组进行MCDA扩增，所述MCDA扩增体系中含有可视染料，MCDA反应结束后通过肉眼观察反应体系的颜色判断待测样品为B组链球菌还是其它致病菌：若反应体系为绿色，则待测样品为或候选为B组链球菌；若反应体系为无色，则待测样品为其它致病菌或候选为其它致病菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述MCDA扩增的反应条件如下：61-66℃反应30min。
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