CN111705129A - Ncapg基因及表达产物在检测早复发型肝癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂在制备用于检测早复发型肝癌的工具中的应用。本发明还提供了一种用于检测早复发型肝癌的工具，包括检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。本发明通过建立NCAPG基因或蛋白质表达水平与早复发型肝癌之间的关系从而提供了一种有效预测肝癌患者术后复发情况的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，涉及了一种用于检测早复发型肝癌的生物标志物，具体地，本发明涉及检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂在制备用于检测早复发型肝癌的工具中的应用。
背景技术
肝癌是世界范围内最常见的10大恶性肿瘤之一，从全球而言，在各种肿瘤致死的原因中，肝癌在男性中排在第2位，女性中排在第6位。随着现代医学的发展，确立了肝癌以外科治疗为主的综合治疗原则。然而，由于肝癌恶性度高、发病隐匿、转移早、复发率高、死亡率高等特点，造成了肝癌切除术后5年生存率较低。因此，迫切需要寻找与肝癌尤其是早复发型肝癌发生相关及可以评估肝癌切除术后生存的敏感指标，以便更早的、更准确的对肝癌术后患者进行预后评估，及时指导临床医师为患者制定个体化针对性的综合治疗及早期复查方案，进而更好的对肝癌的发展进行干预。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的发明人基于早复发型肝癌(ER，术后6个月到两年内复发)和晚复发型肝癌(LR，术后5年内没有复发)在mRNA表达水平上存在很大差异进行研究，发现了NCAPG基因在肝癌早复发型样本中有显著的高表达，在此基础上提出NCAPG基因或蛋白质表达水平与早复发型肝癌之间存在显著的相关性。
具体地，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂在制备用于检测早复发型肝癌的工具中的应用。
进一步，所述检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
进一步，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括NCAPG基因的特异性引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
可选地，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括内参基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
进一步，检测早复发型肝癌包括：
从受试者获得样本；
采用所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂对所述样本进行rt-qPCR技术检测以确定NCAPG基因mRNA表达水平；
将所述NCAPG基因mRNA表达水平与参考值进行比较以确定所述受试者发生早复发型肝癌的风险。
进一步，所述检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
进一步，所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。
进一步，检测早复发型肝癌包括：
从受试者获得样本；
采用所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂对所述样本进行免疫组化染色定量法检测以获得染色结果；
将所述染色结果与参考值进行比较以确定所述受试者发生早复发型肝癌的风险。
进一步，所述样本是肝癌肿瘤组织。
另一方面，本发明提供了一种用于检测早复发型肝癌的工具，包括检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。
进一步，所述工具是试剂盒、药物、芯片、检测试纸或高通量测序平台。
进一步，所述工具是试剂盒。
进一步，所述试剂盒包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
进一步，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括NCAPG基因的特异性引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
可选地，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括内参基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
进一步，所述试剂盒包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
进一步，所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。
相比于现有技术，本发明的技术方案至少具有如下有益效果：
本发明首次发现了NCAPG基因或蛋白质表达水平与早复发型肝癌之间的相关性，通过检测受试者样本中NCAPG的表达能够判断受试者发生早复发型肝癌的风险，进而对临床治疗和预后具有指导意义。
本发明提供的应用方法和检测工具相比于传统检测方法具有灵敏性高、特异性强、易于操作和使用，能够实现针对早复发型肝癌的早期诊断。
附图说明
图1显示了本发明实施例1中NCAPG基因在无肿瘤样本、LR肿瘤样本和ER肿瘤样本中的表达情况；
图2显示了本发明实施例1中样本通过Kaplan meier生存曲线分析的结果；
图3显示了本发明实施例2中样本进行ANOVA分析结果；
图4显示了本发明实施例2中样本通过Kaplan meier生存曲线分析的结果；
图5显示了本发明实施例3中通过rt-qPCR来验证训练样本组数据准确性的结果；
图6显示了本发明实施例3中训练样本组通过ROC曲线分析的结果；
图7显示了本发明实施例3中独立验证组NCAPG mRNA表达水平的结果；
图8显示了本发明实施例3中独立验证组通过ROC曲线分析的结果；
图9显示了本发明实施例4中对样本进行免疫组化染色定量法检测的结果。
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。除非另有说明，否则本发明中涉及的术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。例如，本发明中涉及的术语或未注明的实验方法可以参考Sambrook和Russel，分子克隆实验指南第4版，冷泉港出版社(冷泉港，NY2012)(Sambrook and Russel，Molecular Cloning：A LaboratoryManual 4th ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，NY2012))中的记载。本领域的技术人员将认识到可用于本发明实践的与本文所述的那些方法和材料相似或等效的许多方法和材料。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。
根据RefSeq数据库(2012年8月)中的记录，NCAPG即非染色体结构维护凝缩蛋白I复合体G亚基(non-SMC condensin I complex subunit G)。NCAPG基因编码凝缩蛋白复合体的一个亚基，该亚基负责有丝分裂和减数分裂期间染色体的凝缩和稳定。8号染色体和15号染色体上存在该基因的假基因。NCAPG基因序列如SEQ ID NO：5所示。
肝癌(即肝细胞肝癌，HepatoCellular Carcinoma，HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌，也是一种全球范围最常见的恶性肿瘤。根据术后可能复发的时间，肝癌分为早复发型肝癌(ER)和晚复发型肝癌(LR)。早复发型肝癌和晚复发型肝癌在mRNA表达水平上有很大差异，通过对相关生物标志物的研究，可以标记肝癌的早复发，进而预测肝癌患者术后的复发情况。
本发明的发明人通过对肝癌早复发型(ER)样本、肝癌晚复发(LR)型样本和无肿瘤样本的mRNA表达谱对比分析，发现了NCAPG基因在肝癌早复发型(ER)样本中有显著的高表达。进一步，本发明的发明人对比分析TCGA数据库中已有肝癌数据，同样也发现了肝癌早复发型肿瘤中存在NCAPG的高表达，进一步验证了NCAPG的高表达与肝癌的早复发存在关联。
应当说明的是，在本发明中，“NCAPG基因”包括NCAPG基因以及NCAPG基因的任何功能等同物的多核苷酸，例如包括：(1)如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，(2)在严格条件下与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，(3)与(1)或(2)中限定的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％以上同源性并且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
应当说明的是，在本发明中，“NCAPG蛋白质”包括NCAPG蛋白质以及NCAPG蛋白质的任何功能等同物。其中，功能等同物包括NCAPG蛋白质保守性变异蛋白质或者其活性片段或活性衍生物、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在严格条件下能与NCAPG基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。例如包括：(1)由序列表中SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(2)将SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列衍生的蛋白质，其中取代、缺失、添加的氨基酸个数通常是1-50个，优选1-30个，更优选1-20且最优选1-10个，(3)与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(也即序列同一性)的多肽，优选地，与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少90％-95％或者96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
基于上述发现，本发明提出了通过NCAPG基因或蛋白质表达水平来检测早复发型肝癌。
第一方面，本发明提供了检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂在制备用于检测早复发型肝癌的工具中的应用。
在本发明中，检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂可以是通过PCR或免疫检测来检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。其中，PCR可以是rt-qPCR(实时荧光定量PCR)，通过PCR检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括能够特异性扩增NCAPG基因的引物；免疫检测可以是免疫组化染色定量法，通过免疫检测来检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括能够与NCAPG蛋白质特异性结合的抗体。
在一种优选的实施方案中，检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
优选地，通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括了PCR扩增过程中采用的NCAPG基因的特异性引物对，其中，上游引物的核苷酸序列是：AAGAAAGAACTCAAGATGGCTG(SEQ ID NO：1)，下游引物的核苷酸序列是：AGCATCATTCTTCTCTATGTGG(SEQ ID NO：2)。
更优选地，通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括了PCR扩增过程中采用的内参基因GAPDH的特异性引物对，其中，上游引物的核苷酸序列是：CATTTCCTGGTATGACAACGA(SEQ ID NO：3)，下游引物的核苷酸序列是：CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT(SEQ ID NO：4)。
选择内参基因的目的主要是在分析过程中将不同样品的起始量均一化，在本发明中，选择了在不同样品中均能表达量一致并且稳定的GAPDH基因，并进一步结合上述两组引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，从而能够精确定量NCAPG基因mRNA表达水平。
当检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂时，检测早复发型肝癌方法主要包括如下步骤：
S101：从受试者获得样本，其中，样本可以是受试者的肝癌肿瘤组织；
S102：采用rt-qPCR技术检测NCAPG基因和内参GAPDH的mRNA表达水平；
S103：将检测到的NCAPG基因在与GAPDH内参校对以后的mRNA表达水平与参考值进行比较以确定受试者发生早复发型肝癌的风险。
其中，步骤S102具体包括：
S1021：从受试者的肝癌肿瘤手术切除样本中提取总RNA；
S1022：以提取的总RNA为模板，进行反转录；
S1023：以反转录产物cDNA为模板，采用上述两组引物对进行PCR扩增，采用实时PCR的方法在Biorad CFX96，Thermo Fisher实时PCR检测仪器(例如：7500，QuanStudio)确定mRNA表达水平。
其中，在步骤S103中，参考值是通过rt-qPCR对ER肿瘤和LR肿瘤内的GAPDH校对后NCAPG mRNA进行接收者操作特征曲线(ROC曲线)的分析，得到最佳的二进制的截止值(binary cutoff value)为0.0048。GAPDH校对后的NCAPG mRNA水平超过0.0048，该肿瘤则被定义为ER肿瘤；GAPDH校对后的NCAPG mRNA水平低于0.0048，该肿瘤则被定义为LR肿瘤。
在另一种优选的实施方案中，检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
优选地，通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。NCAPG蛋白质的特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体；NCAPG蛋白质的特异性抗体可以包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰等，只要片段能够保留与NCAPG蛋白质的结合能力即可。可选地，NCAPG蛋白质的特异性抗体可以通过自行制备来获得，在实际应用中，本领域技术人员能够根据实际需要采用公知的抗体制备方法来制备所述抗体。可选地，NCAPG蛋白质的特异性抗体也可以是能够与NCAPG蛋白质特异性结合的市售抗体，例如，Sigma公司的Anti-NCAPG(HPA039613)。
当检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂时，检测早复发型肝癌的方法主要包括如下步骤：
S201：从受试者获得样本，其中，样本可以是受试者的肝癌肿瘤组织；
S202：采用免疫组化染色法对样本染色；
S203：将获得的样本染色结果与参考值进行比较以确定受试者发生早复发型肝癌的风险。
其中，步骤S202具体包括：
S2021：将样本切片；
S2022：对切片进行脱蜡水化处理；
S2023：采用热诱导法对水化后的切片进行抗原修复处理；
S2024：采用上述NCAPG蛋白质的特异性抗体进行抗体染色；
S2025：对染色后的切片进行脱水与裱片处理。
其中，在步骤203中，参考值是指健康个体样本的染色结果，具体的比较标准是：分别对ER肿瘤和LR肿瘤的石蜡样本染色切片拍摄10x图像，使用ImageJ IHC profiler开源软件对切片样本中的肿瘤部分做定量分析。IHC profiler读值大于1.95为positive(阳性)和high positive(高阳性)的样本检测为ER肿瘤。IHC读值小于1.95为low positive(低阳性)和negative(阴性)的样本检测为LR肿瘤。
第二方面，本发明提供了一种用于检测早复发型肝癌的工具，包括检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。
在本发明中，检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂可以是通过PCR或免疫检测来检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。具体地，检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂可以是上述本发明第一方面中列举的通过PCR或免疫检测来检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。
在本发明中，用于检测早复发型肝癌的工具是试剂盒、药物、芯片、检测试纸或高通量测序平台。
其中，试剂盒可以是基因检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒。
其中，药物可以是包括上述任意一种或多种试剂并可用于检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的制剂。
其中，芯片可以是基因芯片或蛋白质芯片，具体地，基因芯片包括固相载体和固定于固相载体的能够与NCAPG基因的核酸序列杂交的探针，蛋白质芯片包括固相载体和固定于固相载体的能够与NCAPG蛋白质特异性结合的抗体。
其中，检测试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的核酸，该核酸能够检测NCAPG基因的转录水平。
其中，高通量测序平台属于一种诊断工具，检测NCAPG基因表达的产品可以应用于该平台实现对NCAPG基因的表达情况的检测。
在一种优选的实施方案中，用于检测早复发型肝癌的工具是基因检测试剂盒，包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
优选地，通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括了PCR扩增过程中采用的NCAPG基因的特异性引物对，其中，上游引物的核苷酸序列是：AAGAAAGAACTCAAGATGGCTG(SEQ ID NO：1)，下游引物的核苷酸序列是：AGCATCATTCTTCTCTATGTGG(SEQ ID NO：2)。
更优选地，通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括了PCR扩增过程中采用的内参基因GAPDH的特异性引物对，其中，上游引物的核苷酸序列是：CATITCCTGGTATGACAACGA(SEQ ID NO：3)，下游引物的核苷酸序列是：CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT(SEQ ID NO：4)。
在另一种优选的实施方案中，用于检测早复发型肝癌的工具是蛋白质免疫检测试剂盒，包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
优选地，通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。NCAPG蛋白质的特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体；NCAPG蛋白质的特异性抗体可以包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰等，只要片段能够保留与NCAPG蛋白质的结合能力即可。可选地，NCAPG蛋白质的特异性抗体可以通过自行制备来获得，在实际应用中，本领域技术人员能够根据实际需要采用公知的抗体制备方法来制备所述抗体。可选地，NCAPG蛋白质的特异性抗体也可以是能够与NCAPG蛋白质特异性结合的市售抗体，例如，Sigma公司的Anti-NCAPG(HPA039613)。
在此应当说明的是，本发明的试剂盒还可以包括其它适用组分，例如，测量工具、稀释剂、缓冲剂、酶、药学上可接受的载体、注射器或将易于由本领域技术人员认识到的其它适用附件，本领域技术人员能够根据预定目的进行合理选择和配制。可选地，本发明的试剂盒还包括使用说明书。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述，所需结果例如是检测NCAPG基因或蛋白质表达水平。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：筛选早复发型肝癌(ER)和晚复发型肝癌(LR)差异表达的基因
1.样本来源
自青岛大学第一附属医院采集70例肝癌临床手术肿瘤样本和36个无肿瘤肝组织的对照样本。在这70例样本中有35个定义为LR肿瘤、29个定义为ER肿瘤和6例样本缺乏复发信息。手术标本在切除以后，通过液氮保存。标本患者均有签署知情同意书。样本的具体临床信息见表1。
2.mRNA表达水平检测与分析
(1)采用Molecular Research Center公司的RNAzol试剂，根据试剂盒自带的操作手册提取各样本的总RNA；
(2)针对浓度超过200ng/μl、RIN大于8的高质量RNA，通过Affymetrix公司的GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array检测其mRNA表达；
(3)通过ANOVA分析，得到ER肿瘤和LR肿瘤对比后FC＞2、FDR＜0.05的与ER肿瘤相关的基因。
3.结果
通过比较得到的与ER肿瘤相关的基因发现，与无肿瘤样本和LR肿瘤样本相比，NCAPG基因在ER肿瘤样本中有显著的高表达，如图1所示，差异具有统计学意义(与无肿瘤样本相比，P＜0.001；与LR肿瘤样本相比，P＜0.05)。通过根据NCAPG mRNA表达的中位值把这70例病人分为NCAPG高表达和低表达两组，并作做临床相关性分析发现，NCAPG高表达与晚期肿瘤(III/VI期肿瘤)，高血清AFP表达(＞20ng/ml)和肿瘤的早期复发有显著相关(p＜0.05)(如表1所示)。
表1：人HCC中NCAPG上调的临床病理相关性
HBV，乙型肝炎病毒；HCV，丙型肝炎病毒；BCLC，巴塞罗那分期；AFP，甲胎蛋白。通过与中值表达式进行比较来确定高NCAPG水平和低NCAPG水平。根据费舍尔精确检验(Fisherexact test)来计算p-值。*代表p＜0.05。
进一步通过Kaplan meier生存曲线分析，NCAPG的高表达与肝癌病人术后的无复发存活率存在显著的负相关性(如图2所示)。
综上所述，NCAPG高表达与肝癌肿瘤的早期复发和肝癌患者的术后存活有显著的相关性。
实施例2：验证NCAPG基因的高表达与肝癌的早复发之间存在关联
1.样本来源
TCGA数据库中记录了371个肝癌肿瘤的mRNA表达谱数据，其中绝大多数的数据没有完善的肿瘤复发信息。通过同样的分组条件，发明人鉴定出12个ER肿瘤和6个LR肿瘤。
2.肝癌mRNA表达谱数据的分析
通过对这12个ER肿瘤和6个LR肿瘤的mRNA表达谱数据进行ANOVA分析，以|FC|＞2，FDR＜0.05作为阈值(threshold)，确定与ER肿瘤相关的特异性基因表达。
3.结果
ANOVA分析结果表明，与无肿瘤样本和LR肿瘤样本相比，ER肿瘤中存在NCAPG的高表达，进一步验证了NCAPG的高表达与肝癌的早复发存在关联。如图3所示，差异具有统计学意义(与无肿瘤样本相比，P＜0.001；与LR肿瘤样本相比，P＜0.001)。
进一步，如图4所示，NCAPG的高表达在TCGA的肝癌病人组中同样与病人术后的无复发存活率存在显著的负相关性，这证明NCAPG的高表达在ER肿瘤中是一个通用的、常见的现象，并对肝癌病人的临床存活有显著的负相关性。
实施例3：通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平
1.样本来源
采用与实施例1相同的样本，样本的具体临床信息见表1。
通过rt-qPCR来验证微阵列(microarray)的数据的准确性并作为训练样本组。另外采集12个ER肿瘤和12个LR肿瘤作为独立验证组。
2.基因检测试剂盒
本实施例的通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂盒主要包括：
(1)特异性引物：
NCAPG上游引物：AAGAAAGAACTCAAGATGGCTG(SEQ ID NO：1)
NCAPG下游引物：AGCATCATTCTTCTCTATGTGG(SEQ ID NO：2)
GAPDH上游引物：CATTTCCTGGTATGACAACGA(SEQ ID NO：3)
GAPDH下游引物：CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT(SEQ ID NO：4)
(2)DNA聚合物酶
3.rt-qPCR检测
(1)提取总RNA：采用Molecular Research Center公司的RNAzol试剂，根据试剂盒自带的操作手册提取肿瘤组织总RNA，并将总RNA用无核酸酶水(Nuclease free water)稀释到终浓度100ng/μl。
(2)反转录：采用Applied Biosystem公司的High Capacity cDNA RT kit试剂盒，试剂盒中各个组分放置室温至完全融化，酶和RNA样本置于冰盒中，采用如下的反应液配置和反转录温度进行反转录：
反应液配制：
| 总RNA(200ng) | 2μl |
| 反转录缓冲液 | 2μl |
| 引物 | 2μl |
| dNTP(10mM) | 2μl |
| 反转录酶 | 1μl |
| 水 | 11μl |
| 总体积 | 20μl |
反转录温度条件：
| 25℃ | 10min |
| 37℃ | 120min |
| 85℃ | 5min |
| 10℃ | Hold |
(3)PCR扩增：将反转录产物cDNA稀释5倍，然后采用本实施例的基因检测试剂盒按照如下的反应液配置和温度进行PCR扩增：
反应液配制：
| cDNA | 2μl |
| 2xEnzyme Mix | 5μl |
| 特异性引物 | 1μl |
| 水 | 2μl |
| 总体积 | 10μl |
PCR反应温度条件：
结果：
如图5所示，通过rt-qPCR技术验证了NCAPG mRNA表达水平在训练组的ER肿瘤里有显著的提高。如图6所示，通过ROC曲线分析，NCAPG mRNA表达水平对于ER肿瘤和LR肿瘤的分辨率为AUC＝0.81。在独立验证组中，NCAPG mRNA表达水平同样有在ER肿瘤中显著提高，对ER肿瘤和LR肿瘤的分辨率为AUC＝0.82，具体如图7和图8所示。
实施例4：通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平
1.样本来源
样本采自淄博中医院，总共110个肿瘤肝组织的临床手术切除标本，其中ER样本35个，LR样本75个，标本患者均有签署知情同意书。
2.抗体
采用Sigma公司的Anti-NCAPG(HPA039613)。
3.蛋白质免疫检测试剂盒
本实施例的通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂盒主要包括：
(1)本实施例第2部分的抗体
(2)洗涤缓冲液：1xTBST，含0.2％吐温20的Tris缓冲盐溶液
(3)封闭溶液：TBST/5％普通山羊血清
4.免疫组化染色定量法检测
切片
用石蜡切片机切出4μm厚的石蜡切片，切片在37℃水浴锅水面展片，用带电荷载玻片捞出，使切片位于载玻片合适位置平铺展开。将载玻片室温干燥过夜，然后50℃烘箱烘烤12-24小时。
脱蜡水化
新鲜二甲苯溶液中浸泡5分钟，3次，在三个容器中进行。必须使用新鲜二甲苯，不完全脱蜡可导致染色不一致。
100％乙醇浸泡10分钟，2次。
95％乙醇浸泡10分钟，2次。
用蒸馏水冲洗切片10分钟。
抗原修复
热诱导法抗原修复：将水化后的切片放在回收缓冲液(10mM柠檬酸钠缓冲液，pH6)中，压力锅125℃，加热4分钟。完成后，将载玻片保留在压力锅中并使其慢慢冷却至90℃，总处理时间约为45分钟。
抗体染色，采用本实施例的蛋白质免疫检测试剂盒
蒸馏水洗涤切片三次，每次5分钟。
将载玻片置于3％过氧化氢中10分钟，灭活样品中内源性过氧化物酶，该酶可导致高背景染色。
蒸馏水洗涤切片两次，每次5分钟。
洗涤缓冲液(1xTBST，含0.2％吐温20的Tris缓冲盐溶液)洗涤切片5分钟。
用疏水笔在样品周围画一个大圆圈，切忌碰到样品。从而产生疏水边界，以便可以使用较小体积的抗体溶液染色，并且必要情况下，可以在一个载玻片上进行多个切片同时染色。
每个切片滴加300μl封闭溶液(TBST/5％普通山羊血清)，加湿室中室温封闭1小时。
去除封闭溶液，每个切片添加300μl一抗(Sigma HPA039613)，该一抗需1∶60用
抗体稀释液稀释好，放在加湿室中4℃孵育过夜。
去除抗体溶液，洗涤缓冲液中洗涤切片5分钟，3次。
根据组织切片面积用1-3滴
增强检测试剂覆盖切片部分，加湿室中室温孵育30分钟。
洗涤缓冲液洗涤切片5分钟，3次。
取1滴(30μl)
色原浓缩物加入1ml
稀释剂中并充分混匀。
300μl上述
加到每个切片上并密切监测5分钟
载玻片浸入蒸馏水中。
苏木精染色7.5分钟。
切片用蒸馏水洗涤5分钟，2次。
脱水与裱片
切片置于两个95％乙醇的容器中，每个10秒。
切片置于两个100％乙醇的容器中，每个10秒。
切片放入两个二甲苯容器中，每个10秒。
滴加裱片介质缓慢倾斜放上盖玻片，小心避免引入气泡。
裱片介质凝结后，放显微镜上观察切片。
图像分析
拍摄10x图像，使用ImageJ IHC profiler开源软件分析。结果如图9所示，通过对肿瘤区域IHC PROFILER定量染色定量，高NCAPG蛋白表达(深棕色染色)可以达到80％的准确率预测早复发的HCC肿瘤。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂在制备用于检测早复发型肝癌的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括NCAPG基因的特异性引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
可选地，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括内参基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测早复发型肝癌包括：
从受试者获得样本；
采用所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂对所述样本进行rt-qPCR技术检测以确定NCAPG基因mRNA表达水平；
将所述NCAPG基因mRNA表达水平与参考值进行比较以确定所述受试者发生早复发型肝癌的风险。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测早复发型肝癌包括：
从受试者获得样本；
采用所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂对所述样本进行免疫组化染色定量法检测以获得染色结果；
将所述染色结果与参考值进行比较以确定所述受试者发生早复发型肝癌的风险。
8.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于，所述样本是肝癌肿瘤组织。
9.一种用于检测早复发型肝癌的工具，其特征在于，包括检测NCAPG基因或蛋白质表达水平的试剂。
10.根据权利要求9所述的工具，其特征在于，所述工具是试剂盒、药物、芯片、检测试纸或高通量测序平台。
11.根据权利要求10所述的工具，其特征在于，所述工具是试剂盒。
12.根据权利要求11所述的工具，其特征在于，所述试剂盒包括通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂。
13.根据权利要求12所述的工具，其特征在于，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂包括NCAPG基因的特异性引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
可选地，所述通过rt-qPCR技术检测NCAPG基因mRNA表达水平的试剂还包括内参基因GAPDH的特异性引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
14.根据权利要求11所述的工具，其特征在于，所述试剂盒包括通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂。
15.根据权利要求14所述的工具，其特征在于，所述通过免疫组化染色定量法检测NCAPG蛋白质表达水平的试剂包括NCAPG蛋白质的特异性抗体。
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|---|---|---|---|---|
| CN117987550A (zh) * | 2024-01-22 | 2024-05-07 | 深圳慕光生物科技有限公司 | 一种生物标志物、应用及对癌症患者总生存率的预测方法 |
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| WO2010085124A2 (ko) * | 2009-01-22 | 2010-07-29 | 재단법인 한국원자력의학원 | 간암진단과 재발 및 생존 예측용 마커, 이를 포함한 키트 및 상기 마커를 이용한 간암환자 예후 예측 |
| CN105368925A (zh) * | 2014-08-23 | 2016-03-02 | 陈铁华 | 用于肺癌预后的生物标志物及其用途 |
-
2020
- 2020-01-31 CN CN202010271916.6A patent/CN111705129A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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| 刘万伟: "非染色体结构维护凝缩蛋白I复合体G亚基与肝细胞癌预后的相关研究" * |
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