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CN111699249A - 纯化的芳基硫酸酯酶a及其组合物 - Google Patents

纯化的芳基硫酸酯酶a及其组合物 Download PDF

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CN111699249A CN201880088888.5A CN201880088888A CN111699249A CN 111699249 A CN111699249 A CN 111699249A CN 201880088888 A CN201880088888 A CN 201880088888A CN 111699249 A CN111699249 A CN 111699249A
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Abstract

本发明尤其提供了治疗异染性脑白质营养不良疾病(MLD)的方法以及使用酶替代疗法的包含重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的组合物。

Description

纯化的芳基硫酸酯酶A及其组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求保护于2017年12月19日提交的美国临时专利申请序列号62/607,831、2017年12月20日提交的美国临时专利申请序列号62/608,569、2018年2月2日提交的美国临时专利申请序列号62/625,814以及2018年11月13日提交的美国临时专利申请序列号62/760,597的优先权，这些专利申请中的每一者的全部内容据此通过引用并入。
背景技术
异染性脑白质营养不良疾病(MLD)是一种由于缺乏芳基硫酸酯酶A(ASA)而引起的常染色体隐性疾病。由人中的ARSA基因编码的ASA是将脑苷脂3-硫酸盐或鞘脂3-O-磺基半乳糖苷神经酰胺(硫苷脂)分解为脑苷脂和硫酸盐的酶。在不存在酶的情况下，硫苷脂在神经系统(例如髓鞘、神经元和神经胶质细胞)中累积，并且在内脏器官中累积至较低程度。这些分子和细胞事件的后果是CNS和PNS内的进行性脱髓鞘和轴突丧失，其在临床上伴有严重的运动和认知功能障碍。
该病症的确定临床特征是中枢神经系统(CNS)变性，其导致认知损害(例如尤其是智力低下、神经病症和失明)。
MLD本身可以在幼儿中表现出来(晚婴型)，其中患病儿童通常在生命的第一年后(例如，在约15-24个月时)就开始显示出症状，并且通常在5岁以上就无法生存。MLD本身可以在儿童中表现出来(青少年型)，其中受患病儿童通常在约3-10岁显示出认知损害，并且寿命可能会有所不同(例如，在症状发作后的10-15年范围内)。MLD本身可以在成人中表现出来(成年发作型)，并且可以出现在任何年龄的个体中(例如，通常在16岁及以后)，并且该疾病的进展可能会有很大差异。
酶替代疗法(ERT)是批准的用于治疗MLD的疗法，该疗法涉及向MLD患者施用外源替代ASA酶，特别是重组芳基硫酸酯酶A(rhASA)(例如重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA))。
发明内容
本发明尤其提供了用于酶替代疗法的包含纯化的重组ASA蛋白的组合物及其制备方法。
如实施例部分中所述，使用本文所述的某些方法纯化的示例性重组ASA蛋白符合美国和许多其他国家的销售纯度要求。
另外，根据本发明纯化的重组ASA蛋白具有不同的特征，诸如聚糖图谱(例如，阈值量的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白))，其可以促进生物利用度、提高靶向和/或提高重组ASA蛋白的功效。
在一个方面，本发明提供了一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)的方法，该方法包括向有需要的受试者鞘内施用治疗有效剂量的包含纯化的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白的制剂，其中所述纯化的rhASA蛋白以蛋白聚糖图谱为特征，所述蛋白聚糖图谱包含一个或多个与中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)和混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)相对应的峰(即物质)，并且其中施用所述制剂使得稳定或降低MLD的至少一种症状的进展。
在一个实施方案中，纯化的rhASA的治疗有效剂量为100mg。
在一个实施方案中，纯化的rhASA的治疗有效剂量为150mg。
在一个实施方案中，该制剂每周施用一次。
在一个实施方案中，受试者患有晚婴型MLD。
在一个实施方案中，稳定或降低MLD的进展是使用粗大运动功能分类(GMFC-MLD)的变化来度量的。
在一个实施方案中，施用所述制剂使得在患有晚婴型MLD的受试者中治疗2年后GMFC-MLD级别与基线相比的变化≤4、≤3或≤2个级别。
在一个实施方案中，施用所述制剂使得在治疗两年后保持GMFC-MLD评分。
在一个实施方案中，保持GMFC-MLD评分是在治疗两年后GMFC-MLD与基线相比的变化不大于2个级别。
在一个实施方案中，基线是在第一次施用所述制剂之前GMFC-MLD的评估评分。
在一个实施方案中，稳定或降低MLD的进展是使用粗大运动功能测试量表(GMFM-MLD)的变化来度量的。
在一个实施方案中，施用所述制剂使得在治疗两年后保持GMFM-MLD评分。
在一个实施方案中，GMFM-MLD评分保持在>40。
在一个实施方案中，稳定或降低MLD的进展是通过脑脊髓液中的硫苷脂水平来度量的。
在一个实施方案中，稳定或降低MLD的进展是通过脑N-乙酰天冬氨酸/肌酸比率(NAA/cr)来度量的。
在一个实施方案中，稳定或降低MLD的进展是使用表达语言功能分类-MLD级别(ELFC-MLD)来度量的。
在一个实施方案中，受试者的基线GMFC-MLD级别为1-2。
在一个实施方案中，受试者的基线GMFC-MLD级别为3。
在一个实施方案中，受试者的基线GMFC-MLD级别为4。
在一个实施方案中，所述受试者是症状前的。在一个实施方案中，症状前受试者小于18月龄。在一个实施方案中，用阿尔伯塔婴儿运动量表(Alberta Infant Motor Scale)评估症状前受试者。
在一些实施方案中，rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种治疗晚婴型MLD的方法，该方法包括：向受试者施用包含纯化的重组芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白的制剂，所述蛋白具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列，其中所述纯化的rhASA蛋白以蛋白聚糖图谱为特征，所述蛋白聚糖图谱包含一个或多个与中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)和混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)相对应的峰(即物质)，并且所述制剂以150mg的剂量、以每周一次的间隔鞘内施用。
在一个实施方案中，所述制剂含有小于约150ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
在一些实施方案中，占总的纯化的重组ASA蛋白的至少约23％的所述纯化的重组ASA蛋白对应于甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)。
在一个实施方案中，纯化的重组ASA蛋白的蛋白聚糖图谱包括：约15％至约25％的中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、约35％至约45％的唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、约23％至约33％的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、约1％至约10％的N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)和约5％至约15％的混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。
在一个实施方案中，纯化的重组ASA蛋白的蛋白聚糖图谱包括：约18％至约22％的中性ASA蛋白、约37％至约41％的唾液酸ASA蛋白、约26％至约29％的M6P ASA蛋白、约4％至约6％的加帽M6P ASA蛋白和约7％至约9％的混合ASA蛋白。
在一个实施方案中，制剂的施用产生最小的副作用(AE)。
在一个方面，本发明提供了用于纯化重组ASA蛋白的新过程，该新过程可以通过以下方式提供诸如减少成本和时间的优势：通过在过程效率方面的改善(例如，减少制备药物物质(DS)或药品(DP)的步骤总数)或通过容许制备具有有益特征的组合物(例如，包含具有甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)的阈值群体的纯化重组ASA蛋白的组合物，其可以具有提高的生物利用率、靶向性或功效)或包含表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20(P20))的DS组合物(其可以具有提高的储存(例如冷藏)稳定性或产生提高的制备DS或DP的过程效率)。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列的纯化的重组芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白，其中所述纯化的rhASA蛋白以一种或多种选自以下的蛋白聚糖物质为特征：中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)或混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。在一些实施方案中，甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)以所述总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约23％的量存在。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含具有与SEQ IDNO:1至少70％相同的氨基酸序列的纯化的重组芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白，其中所述纯化的rhASA蛋白作为甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)存在，其量为总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约23％；并且所述纯化的重组ASA蛋白含有小于约150ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列的纯化的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白，其中所述总的纯化的重组ASA蛋白的至少约23％对应于以蛋白聚糖图谱为特征的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)；并且所述组合物含有小于约150ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
在一个实施方案中，M6P ASA蛋白在所述组合物中以总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约26％的量存在。在一个实施方案中，M6P ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约28％的量存在。在一个实施方案中，M6P ASA蛋白在所述组合物中以总的纯化的rhASA蛋白含量的约20％至约33％的量存在。
在一个实施方案中，所述总的纯化的rhASA蛋白包括中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)或混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)或它们的任何组合。
在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白包括：约23％至约33％的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、约15％至约25％的中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、约35％至约45％的唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、约1％至约10％的N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)和约5％至约15％的混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。
在一个实施方案中，中性ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约16％至约22％的量存在。
在一个实施方案中，中性ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约20％至约25％的量存在。
在一个实施方案中，唾液酸ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约35％至约40％的量存在。
在一个实施方案中，唾液酸ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约37％至约42％的量存在。
在一个实施方案中，加帽M6P ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约3％至约5％的量存在。
在一个实施方案中，加帽M6P ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约4％至约6％的量存在。
在一个实施方案中，加帽M6P ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约4.5％至约5.5％的量存在。
在一个实施方案中，混合ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约7％至约10％的量存在。
在一个实施方案中，混合ASA蛋白以总的纯化的rhASA蛋白的约7.5％至约8.5％的量存在。
在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白包含：约16％至约23％的中性ASA蛋白、约37％至约42％的唾液酸ASA蛋白、约23％至约27％的M6P ASA蛋白、约4％至约8％的加帽M6P ASA蛋白和约7％至约10％的混合ASA蛋白。在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白包含：约20％至约23％的中性ASA蛋白、约35％至约39％的唾液酸ASA蛋白、约26％至约32％的M6P ASA蛋白、约3％至约5％的加帽M6P ASA蛋白和约7％至约9％的混合ASA蛋白。
在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白包含：约18％至约22％的中性ASA蛋白、约37％至约41％的唾液酸ASA蛋白、约26％至约29％的M6P ASA蛋白、约4％至约6％的加帽M6P ASA蛋白和约7％至约9％的混合ASA蛋白。
在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白以约20mg/mL至约45mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白以约25mg/mL至约34mg/mL或约28mg/mL至约32mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，总的纯化的rhASA蛋白以约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL、约30mg/mL、约31mg/mL、约32mg/mL、约33mg/mL或约34mg/mL的浓度存在。
在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有约50至约130U/mL的比活性。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有约70至约100U/mg的比活性。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有约80至约90U/mg的比活性。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有约75至约95U/mg的比活性。
在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约140ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约100ng/mg的HCP。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约80ng/mg的HCP。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约60ng/mg的HCP。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约100pg/mg的宿主细胞DNA(HCD)。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约50pg/mg的HCD。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约10pg/mg的HCD。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白含有小于约5pg/mg的HCD、小于约4pg/mg的HCD、小于约3pg/mg的HCD、小于约2pg/mg的HCD或小于约1pg/mg的HCD。
在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述组合物包含约0.001％至约0.01％的聚山梨醇酯-20(P20)。在一个方面，本发明提供了一种制剂，该制剂包含如上详述的组合物和生理上可接受的载体。在一个实施方案中，该制剂适合于静脉内施用。
在一个实施方案中，该制剂适合于鞘内施用。在一个实施方案中，该制剂适合于皮下施用。
在一个方面，本发明提供了一种纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的方法，该方法包括：通过进行一个或多个色谱步骤从不纯的制备物中纯化出重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白；合并来自所述一个或多个色谱步骤的洗脱液；任选地将合并的洗脱液的pH调节至约6.0至约8.0的pH；任选地使合并的洗脱液或经pH调节的洗脱液经受超滤和/或渗滤；获得包含纯化的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的洗脱液；并且向包含纯化的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的所述洗脱液中添加表面活性剂。
在一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：将合并的洗脱液的pH调节至约6.0至约8.0的pH。在一个实施方案中，使所述经pH调节的洗脱液经受超滤和/或渗滤的步骤。
在一个实施方案中，所述表面活性剂的添加在冷藏包含纯化的重组ASA蛋白的洗脱液之前进行。
在一个实施方案中，所述表面活性剂以约0.0001％(v/v)至约0.01％(v/v)的浓度存在。在一个实施方案中，所述表面活性剂以约0.001％(v/v)至约0.01％(v/v)的浓度存在。在一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯-20(P20)。
在一个实施方案中，进行一个或多个色谱步骤的步骤包括按顺序进行阴离子交换色谱法、混合模式色谱法、疏水相互作用色谱法即苯基色谱法和阳离子交换色谱法。在一些实施方案中，阴离子交换色谱法使用具有TMAE树脂的柱。
附图说明
下面描述的共同构成了附图的图仅用于说明的目的，而非限制。
图1A-图1F示出了用过程A或过程B rhASA处理的MLD小鼠中的LAMP-1的免疫组织化学染色的代表性图像，以及对用来自过程A(iii、v)或过程B(iv、vi)或对照(ii)的0.04mg或0.21mg rhASA处理的免疫耐受MLD小鼠的(A)脊髓、(B)小脑、(C)海马伞、(D)大脑脚、(E)大脑皮层和(F)纹状体的白质进行了相应的形态测定分析。未处理的C57/B16小鼠用作WT对照(i)。LAMP-1，溶酶体相关膜蛋白1；MLD，异染性脑白质营养不良；NS，不显著；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A；WT，野生型。
图2A和图2B示出了在少年食蟹猴中在6.0mg鞘内单剂量之后过程A和过程B rhASA在(图2A)血清和(图2B)CSF中的浓度-时间曲线。
图3A和图3B示出了过程A和过程B rhASA在大鼠中的生物分布。代表性的全身放射自显影照片(autoradioluminogram)显示了在雄性Sprague Dawley大鼠中在鞘内单剂量的(图3A)过程A和(图3B)过程B[125I]-rhASA0.62mg后4小时的放射性组织分布。
图4示出了在雄性Sprague Dawley大鼠中在鞘内单剂量后，过程A和过程B[125I]-rhASA 0.62mg的尿排泄、粪便排泄和总排泄曲线(分别为n＝2和n＝3)。
图5示出了rhASA的开放标签、剂量递增安全性评估的剂量递增和扩展研究设计。CSF，脑脊髓液；GMFM-88，粗大运动功能测试量表88；IDDD，鞘内药物递送装置；IT，鞘内；MLD，异染性脑白质营养不良；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。
图6示出了CSF、CNS和血清中rhASA浓度的临床PK/PD模型以及对CSF硫苷脂浓度的影响。CL，药物清除率；CMT，隔室；CNS，中枢神经系统；CSF，脑脊髓液；kin，硫苷脂的形成速率；kout，硫苷脂的消耗速率常数；Ktrans，转运速率常数；PK/PD，药代动力学/药效学；QCSF，室间清除率；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。
图7A、图7B和图7C分别示出了群体预测的和个体预测的CSF中的rhASA浓度、CSF中的硫苷脂浓度和GMFM-88总评分的拟合优度图。
图8按剂量方案和基线年龄示出了脑脊髓液(CSF)(左图)和中枢神经系统(CNS)(右图)中代表性的模拟rhASA谷浓度。方案1：每隔一周100mg；方案2：每周100mg，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周100mg；方案3：每周150mg，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周150mg；方案4：每周按年龄调整给药，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周一次(方案4：80mg，<8个月；120mg，8–<30个月；150mg，≥30个月)。
图9示出了按给药方案模拟的个体层面预测的GMFM-88总评分。这四种给药方案包括：方案1，每隔一周(EOW)100mg；方案2，每周(EW)100mg，持续12周，然后是100mg EOW；方案3，每周150mg，持续12周，然后是150mg EOW；方案4，每周按年龄调整给药，持续12周，然后EOW(80mg，<8个月；120mg，8–<30个月；150mg，≥30个月)。
图10示出了rhASA的开放标签、剂量递增安全性评估的剂量递增和扩展研究设计。群组中所有患者均已接受至少两剂先前剂量后，才基于DSMB审查决定继续递增到更高的剂量。DSMB，数据安全监察委员会；EOS，研究结束；EOW，每隔一周；GMFM-88，粗大运动功能测试量表88；IDDD，鞘内药物递送装置；MLD，异染性脑白质营养不良；MRI，磁共振成像；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。
图11示出了对于确定为对治疗有反应者和无反应者的患者而言，在研究期间按患者年龄划分的个体GMFM-88总评分。
图12示出了对治疗有反应且具有可用数据的患者在基线和第40周时的个体MLD严重程度评分
图13示出了对治疗有反应且具有可用数据的患者在基线和第40周时额顶叶白质中的个体N-乙酰天冬氨酸(NAA)/肌酸比率。
图14示出了脑脊髓液中随时间变化的rhASA平均(±SD)浓度。
图15示出了群组1(过程A：10mg)、群组2(过程A：30mg)、群组3(过程A：100mg)、群组4(过程B：100mg)随时间变化的平均GMFM-88总评分。误差线表示均值的标准误差。
图16A和图16B分别示出了群组1(过程A：10mg)、群组2(过程A：30mg)、群组3(过程A：100mg)、群组4(过程B：100mg)的平均CSF硫苷脂和CSF溶硫苷脂水平。误差线表示均值的标准差。CSF硫苷脂(0.113μg/mL)和CSF溶硫苷脂(0.0277ng/mL)的正常上限是从60名未患脑白质营养不良但已经进行了脊椎穿剌(并且因此可能患有其他精神病)的儿童的CSF样品中观测到的最高浓度。CSF，脑脊髓液；LLOQ/2，定量下限。
图17A和图17B示出了在右额白质中(图17A)NAA/肌酸比率和(图17B)胆碱/肌酸比率随时间推移与基线相比的平均变化。16名患者基线数据可用，12名患者研究结束数据可用。误差线表示与均值的标准偏差。
图18A和图18B示出了在右额顶叶白质中(图18A)NAA/肌酸比率和(图18B)胆碱/肌酸比率随时间推移与基线相比的平均变化。误差线表示与均值的标准偏差。
图19A和图19B示出了在右顶枕白质中(图19A)NAA/肌酸比率和(图19B)胆碱/肌酸比率随时间推移与基线相比的平均变化。误差线表示与均值的标准偏差。
图20A和图20B示出了在枕中线白质中(图20A)NAA/肌酸比率和(图20B)胆碱/肌酸比率随时间推移与基线相比的平均变化。误差线表示与均值的标准偏差。
图21示出了随时间变化的平均MLD严重程度总评分。误差线表示均值的标准误差。
图22示出了来自rhASA临床研究的同胞患者中按月龄划分的个体GMFM-88总评分。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其它术语的另外定义阐述在整个本说明书中。
大约或约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
生物活性的：如本文使用的，短语“生物活性的”指在生物系统中，且特别是在生物体中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物时，对该生物体具有生物效应的试剂视为生物活性的。在特定实施方案中，当蛋白质或多肽是生物活性的时，共享蛋白质或多肽的至少一种生物活性的该蛋白质或多肽的一部分通常被称为“生物活性”部分。
阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)：如本文使用的，术语“阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”指结合高尔基体中的酸性水解酶前体上的甘露糖-6-磷酸(M6P)标签的细胞受体，其预定用于转运至溶酶体。除甘露糖-6-磷酸之外，CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。CI-MPR也称为“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”。这些术语及其缩写在本文中可互换使用。
色谱法：如本文使用的，术语“色谱法”是指用于分离混合物的技术。通常，将混合物溶解在称为“流动相”的流体中，该流体会携带混合物通过一种容纳有另一种称为“固定相”的材料的结构。柱色谱法是一种分离技术，其中固定床处于管内，即柱内。
稀释剂：如本文使用的，术语“稀释剂”指可用于制备重构制剂的药学可接受的(例如，对于施用于人安全和无毒的)稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸缓冲盐溶液)、无菌盐水溶液、林格溶液或右旋糖溶液。
洗脱：如本文使用的，术语“洗脱”是指通过用溶剂洗涤从一种物质中提取另一种物质的过程。例如，在离子交换色谱法中，洗脱是洗涤负载树脂以去除捕获的离子的过程。
洗脱液：如本文使用的，术语“洗脱液”是指流动相“载体”和通常由于洗脱而从色谱法中出现的分析物材料的组合。
酶替代疗法(ERT)：如本文使用的，术语“酶替代疗法(ERT)”指通过提供缺失的酶来纠正酶缺乏的任何治疗策略。一旦施用，酶就被细胞吸收并转运至溶酶体，在其中酶作用于消除由于酶缺乏已在溶酶体中累积的材料。通常，为了使溶酶体酶替代疗法有效，将治疗性酶递送至靶组织中的适当细胞中的溶酶体，在其中贮存缺陷是明显的。本文所述的纯化方法可用于纯化和配制重组芳基硫酸酯酶A作为用于MLD的ERT的药物物质。
平衡(equilibrate)或平衡(equilibration)：如本文使用的，与色谱法有关的术语“平衡(equilibrate)”或“平衡(equilibration)”是指使第一液体(例如，缓冲液)与另一种液体平衡的过程，通常是为了实现液体(例如，缓冲液)的组分的稳定且均匀的分布。例如，在一些实施方案中，色谱柱可以通过使一个或多个柱体积的所需液体(例如，缓冲液)通过该柱而平衡。
改进、增加或减少：如本文使用的，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等价物指示相对于基线测量的值，例如在本文所述治疗开始之前在同一个体中的测量，或在不存在本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是患有与待治疗个体相同形式的溶酶体贮积病的个体，其与待治疗个体约相同年龄(以确保所治疗的个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的)。
杂质:如本文使用的，术语“杂质”是指在限定量的液体、气体或固体内，与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为污染物。
上样:如本文使用的，术语“上样”是指在色谱法中，将含有样品的液体或固体添加到柱上。在一些实施方案中，上样到该柱上的样品的特定组分然后在上样样品穿过该柱时被捕获。在一些实施方案中，上样到该柱上的样品的特定组分在上样样品穿过该柱时未被该柱捕获，或“流过”该柱。
多肽：如本文使用的，“多肽”，一般而言，是通过肽键彼此附着的至少两个氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，所述氨基酸各自通过至少一个肽键与其他氨基酸附着。本领域普通技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或任选的其它实体，其仍然能够整合到多肽链内。
库:如本文使用的，关于色谱法的术语“库”是指将已经通过柱的流体的一个或多个级分组合在一起。例如，在一些实施方案中，可以将含有已通过色谱法分离的样品的所需组分的一个或多个级分(例如“峰级分”)“合并”在一起以产生单个“合并”级分。
替代酶：如本文使用的，术语“替代酶”指可作用于至少部分替代待治疗疾病中缺乏或缺失的酶的任何酶。在一些实施方案中，术语“替代酶”指可作用于至少部分替代待治疗的溶酶体贮积病中的缺陷或缺失的溶酶体酶的任何酶。在一些实施方案中，替代酶(例如，rhASA)能够减少哺乳动物溶酶体中累积的物质，或者可以挽救或改善一种或多种溶酶体贮积病(例如，MLD)症状。适合于本发明的替代酶包括野生型或经修饰的溶酶体酶两者，并且可使用重组方法和合成方法产生或从者天然源纯化。替代酶可为重组的、合成的、基因活化的或天然的酶。
可溶的：如本文使用的，术语“可溶的”指治疗剂形成同质溶液的能力。在一些实施方案中，在向其中施用治疗剂并通过其将治疗剂转运至目标作用部位的溶液中治疗剂的溶解度足以容许将治疗有效量的治疗剂递送至目标作用部位。几种因素可影响治疗剂的溶解度。例如，可影响蛋白质溶解度的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和其它共增溶剂或盐(例如钙盐)的存在。在一些实施方案中，根据本发明的治疗剂可溶于其相应的药物组合物中。
稳定性：如本文使用的，术语“稳定的”指治疗剂(例如重组酶)经过延长的时间段维持其治疗功效(例如，其预期的生物活性和/或生理化学完整性的全部或大部分)的能力。治疗剂的稳定性和药物组合物维持此类治疗剂稳定性的能力可在延长的时间段内(例如，至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更久)进行评价。在制剂的情况下，稳定制剂是其中的治疗剂在贮存时和在加工期间(例如冷冻/解冻、机械混合和冻干)基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性的制剂。对于蛋白质稳定性，它可通过高分子量(HMW)聚集体的形成、酶活性的损失、肽片段的生成和电荷分布的转变来测量。
病毒处理：如本文使用的，术语“病毒处理”是指“去除病毒”，其中仅从样品中去除病毒(例如病毒过滤)，或“病毒灭活”，其中病毒留在样品中但是为非感染性形式。在一些实施方案中，去除病毒可以利用纳米过滤和/或色谱技术等。在一些实施方案中，病毒灭活可以利用溶剂灭活、洗涤剂灭活、巴氏灭菌、酸性pH灭活和/或紫外线灭活等。
具体实施方式
本发明尤其提供了包含用于酶替代疗法的方法和包含纯化的重组ASA(rhASA)蛋白的组合物。本发明至少部分地基于以下发现：rhASA安全并且对婴儿和儿童具有良好的耐受性；从而支持剂量递增以获得更高的疗效。本发明部分涉及改进的重组rhASA治疗剂量和施用间隔用于治疗MLD以改善运动功能，或至少降低或阻止ASA缺乏的受试者的运动功能的逐步下降。
在一个方面，本发明涉及一种治疗MLD的方法，该方法包括以下步骤：以合适的剂量间隔施用治疗有效剂量的rhASA，以降低或阻止MLD的进展。
在一些实施方案中，治疗有效剂量为100mg或更高。在一些实施方案中，合适的剂量间隔是每隔一周一次。在一些实施方案中，合适的剂量间隔是每周一次。在一些实施方案中，该方法包括每隔一周一次以100mg或更高的剂量施用包含rhASA的制剂。在一些实施方案中，包含rhASA的制剂以每周一次(EW)100mg或更高的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，将包含rhASA的制剂以EOW一次150mg的剂量施用给受试者。在一些实施方案中，将包含rhASA的制剂以EW一次150mg的剂量施用给受试者。
在一些实施方案中，受试者在施用100mg的剂量之前已经接受了至少10mg的剂量一段时间。在一些实施方案中，受试者在施用100mg的剂量之前已经接受了至少30mg的剂量一段时间。在一些实施方案中，受试者已经接受了100mg的剂量一段时间，然后继续接受100mg rhASA。在一些实施方案中，持续时间为20周、30周、35周或40周。在一些实施方案中，持续时间为40周。
在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者是先前用10mg治疗的反应者。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者是先前用30mg治疗的反应者。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者是先前用10mg治疗的无反应者。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者是先前用30mg治疗的无反应者。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者对先前用10mg治疗没有表现出任何副作用(AE)。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者对先前用30mg治疗没有表现出任何AE。在一些实施方案中，接受至少100mg剂量的受试者对先前用100mg治疗没有表现出任何AE。
在一些实施方案中，包含rhASA的制剂以100mg或更高的剂量施用，EW一次，持续12周，然后进行EOW施用。在一些实施方案中，包含rhASA的制剂以150mg的剂量施用，EW一次，持续12周，然后进行EOW施用。在一些实施方案中，受试者对施用没有表现出副作用。
本发明部分地基于以下发现：rhASA的治疗应用在治疗更广泛的MLD，尤其是晚婴型MLD中有效。在一个方面，本发明提供了一种治疗晚婴型MLD的方法。在一些实施方案中，该方法包括向患有晚婴型MLD的受试者施用包含rhASA的制剂。在一些实施方案中，该方法包括以合适的剂量间隔向患有晚婴型MLD的受试者施用有效治疗剂量的包含rhASA的制剂，以降低或阻止晚婴型MLD的进展。在一些实施方案中，该方法包括鞘内施用。在一些实施方案中，用于治疗晚婴型MLD的有效治疗剂量是150mg。在一些实施方案中，用于治疗晚婴型MLD的合适剂量间隔是每周一次。
在一些实施方案中，患有晚婴型MLD的受试者为72月龄或更小。在一些实施方案中，患有晚婴型MLD的受试者为48月龄或更小。在一些实施方案中，患有晚婴型MLD的受试者为24月龄或更小。在一些实施方案中，患有晚婴型MLD的受试者为18月龄或更小。以通过粗大运动功能分类(GMFC)确定的运动功能为基础，对受试者进行选择和分类。
在一些实施方案中，该方法包括以EW一次150mg的剂量向患有晚婴型MLD的受试者鞘内施用包含rhASA的制剂。在一些实施方案中，施用持续至少两年。
用包含rhASA的制剂治疗晚婴型MLD的受试者选择包括基于年龄、疾病状态和运动功能表征的几个因素。在一些实施方案中，向早期症状受试者施用治疗。在一些实施方案中，患有早期症状性晚婴型MLD的受试者为18-48月龄。在一些实施方案中，患有早期症状性晚婴型MLD的受试者具有MLD[GMFC-MLD]1-2级的粗大运动功能分类。
在一些实施方案中，向中期症状受试者施用针对晚婴型MLD的治疗。在一些实施方案中，晚期症状受试者为18-72月龄。在一些实施方案中，晚期症状受试者具有GMFC MLD 4级。
在一些实施方案中，向症状前或微小症状受试者施用针对晚婴型MLD的治疗。在一些实施方案中，症状前或微小症状受试者为18月龄或更小，或是具有相同ASA等位基因构成的参与者的症状前同胞。在一个实施方案中，用阿尔伯塔婴儿运动量表对症状前受试者进行评估(Piper M和Darrah J,“Motor Assessment of a Developing Infant,”1994年2月9日出版，第222页；ISBN:9780721643076,Saunders)。
在一些实施方案中，本发明提供了用于向患有MLD的受试者施用的纯化的rhASA组合物。
异染性脑白质营养不良疾病(MLD)的治疗
本发明的组合物和方法可用于通过递送至CNS来有效治疗患有MLD或易患MLD的个体。本发明的用于治疗MLD的某些方法通常包括以下步骤：以治疗有效剂量和一定施用间隔向需要治疗的受试者鞘内施用重组芳基硫酸酯酶A(ASA)，持续足以稳定或减缓通过GMFC-MLD级别(指示运动功能下降)度量的运动功能障碍的进展的治疗期。根据本公开内容提供的许多方法，在受试者中未观察到与重组芳基硫酸酯酶A施用相关的严重副作用。
运动功能
在一些实施方案中，MLD患者的神经损害的特征在于运动功能例如粗大运动功能的下降。在一些实施方案中，治疗功效包括涉及一种或多种运动功能的测量。
在一些实施方案中，提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)综合征的方法，该方法包括以下步骤：以治疗有效剂量和一定施用间隔向需要治疗的受试者鞘内施用重组芳基硫酸酯酶A(ASA)，持续足以改善、稳定或减少一种或多种运动功能相对于基线的下降的治疗期。在一些实施方案中，重组ASA酶的施用还使得改善、稳定或减少一种或多种认知功能、适应功能和/或执行功能的下降。
一种或多种运动功能可包括例如粗大运动功能。应了解，可通过任何适当的方法评价粗大运动功能。例如，在一些实施方案中，使用粗大运动功能测试量表诸如粗大运动功能测试量表88(GMFM-88)的总原始评分或百分比或粗大运动功能分类(GMFC)来度量粗大运动功能相对于运动功能基线的变化。
粗大运动功能测试量表88(GMFM-88)
在一些实施方案中，MLD患者的神经损害的特征在于粗大运动功能的下降。应了解，可通过任何适当的方法评价粗大运动功能。例如，在一些实施方案中，使用粗大运动功能测试量表88(GMFM-88)的总原始评分来度量粗大运动功能相对于运动功能基线的变化。在一些实施方案中，所治疗的受试者具有大于40％的基线GMFM-88评分。在一些实施方案中，所治疗的受试者具有小于40％的基线GMFM-88评分。
在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得运动功能比没有施用时通常观察到的下降更小。例如，在一些实施方案中，根据本发明的方法施用重组ASA酶使得GMFM-88评分下降小于10％、20％、30％、40％或50％。
在一些实施方案中，所治疗的受试者的基线GMFM-88评分为35。在一些实施方案中，所治疗的受试者的基线GMFM-88评分高于35。在一些实施方案中，所治疗的受试者的基线GMFM-88评分为40。在一些实施方案中，所治疗的受试者的基线GMFM-88评分高于40。在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得相对于基线保持运动功能。在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得保持通过GMFM-88评分测量的运动功能。
在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得基本稳定运动功能，例如基本稳定评分诸如GMFM-88评分。“基本稳定”意指经过一段时间，例如经过治疗期和/或经过在期间不存在治疗的情况下通常预期下降或恶化的时期，没有下降或恶化。
在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得改善运动功能，例如改善评分诸如GMFM-88评分。
应进一步理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用酶替代疗法或监督施用酶替代疗法的人的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅为示例性的，并不预期限制本发明的范围或实践。
粗大运动功能分类(GMFC-MLD)
粗大运动功能分类(GMFC-MLD)可以用作对MLD中的粗大运动功能进行标准化评估的工具。GMFC-MLD由七个级别组成，分别表示从正常(0级)到全部粗大运动功能丧失(6级)的所有临床相关阶段。在一些实施方案中，使用GMFC-MLD度量粗大运动功能。
在一些实施方案中，所治疗的受试者的基线GMFC级别小于或等于2(能够辅助站立和行走)。在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得通过GMFC级别评估的相对于基线保持运动功能。在一些实施方案中，根据本文公开的方法施用重组ASA酶使得保持GMFC级别等于或小于2。
在一些实施方案中，根据本发明的方法施用重组ASA酶使得到2年时其GMFC-MLD级别与基线相比增加(指示运动功能下降)不超过2。在一些实施方案中，根据本发明的方法施用重组ASA酶使得到2年时其GMFC-MLD级别与基线相比增加(指示运动功能下降)不超过3。在一些实施方案中，如GMFC-MLD与基线相比的变化不大于2个级别评估的，根据本发明的方法施用重组ASA酶使得保持粗大运动功能。
治疗性施用
可以根据已知方法将纯化的重组ASA蛋白施用给MLD患者。例如，纯化的重组ASA蛋白可以静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如，经口或经鼻)递送。
在一些实施方案中，通过静脉内施用将重组ASA或含有重组ASA的药物组合物施用给受试者。
在一些实施方案中，通过鞘内施用将重组ASA或含有重组ASA的药物组合物施用给受试者。如本文使用的，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”指注射到椎管(脊髓周围的鞘内空间)内。可使用各种技术，包括但不限于通过钻孔或脑池或腰椎穿刺等等的侧脑室注射。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”指经由腰部区域或腰区的IT施用或递送，即腰部IT施用或递送。如本文使用的，术语“腰区”或“腰部区域”指第三和第四腰(腰背部)椎骨之间的区域，并且更包含地指脊柱的L2-S1区。在一些实施方案中，通过鞘内施用将重组ASA或含有重组ASA的药物组合物施用给受试者，如在PCT国际公开WO2011/163648和WO2011/163650中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，通过皮下(即，在皮肤下)施用向受试者施用重组ASA或含有重组ASA的药物组合物。为了这样的目的，可使用注射器注射制剂。然而，其他用于施用制剂的装置也可用，诸如注射装置(例如，Inject-Ease和Genject装置)；注射器笔(诸如GenPen)；无针装置(例如MediJector和BioJector)；和皮下贴片递送系统。
在一些实施方案中，鞘内施用可与其他施用途径(例如静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或透粘膜(例如经口或经鼻))联合使用。
本发明考虑了治疗有效量的重组ASA或本文所述的含有ASA的药物组合物的单次施用或多次施用。重组ASA或含有重组ASA的药物组合物可以按有规律的间隔施用，这取决于受试者病状(例如，溶酶体贮积病)的性质、严重性和程度。在一些实施方案中，治疗有效量的重组ASA或含有重组ASA的药物组合物可以按有规律的间隔周期性施用(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、两月一次(每两个月一次)、每月一次(每个月一次)、两周一次(每两周一次)、每周一次、每天一次或连续地)。
CNS递送
考虑本文所述的各种稳定制剂一般适合于治疗剂的CNS递送。根据本发明的稳定制剂可经由各种技术和途径(径包括但不限于实质内、脑内、脑室内(ICV)、鞘内(例如、IT-腰椎、IT-小脑延髓池)施用)用于CNS递送，以及用于直接或间接注射到CNS和/或CSF的任何其它技术和途径。术语“小脑延髓池”指经由头骨和脊柱顶部之间的开口在小脑周围和下方的空间。通常，通过小脑延髓池注射也称为“小脑延髓池递送”。
鞘内递送
在一些实施例中，将替代酶以本文所述的制剂递送至CNS。在一些实施例中，通过施用于需要治疗的受试者的脑脊髓液(CSF)内，将替代酶递送至CNS。在一些实施例中，鞘内施用用于将所需替代酶(例如ASA蛋白)递送到CSF内。如本文使用的，鞘内施用(也称为鞘内注射)指注射到椎管(脊髓周围的鞘内空间)内。可使用各种技术，包括但不限于腰椎穿刺。示例性方法在Lazorthes等人Advances in Drug Delivery Systems and Applicationsin Neurosurgery,143-192中描述，所述参考文献的内容以引用的方式并入本文。
根据本发明，可在椎管周围的任何区域处注射酶。在一些实施例中，将酶注射到腰部区域内。如本文使用的，术语“腰区”或“腰部区域”指第三和第四腰(腰背部)椎骨之间的区域，并且更包含地指脊柱的L2-S1区。通常，经由腰区或腰部区域进行的鞘内注射也称为“腰椎鞘内递送”或“腰椎鞘内施用”。
在一些实施例中，治疗性蛋白质，例如重组芳基硫酸酯酶A通过腰部鞘内施用递送，例如在第三腰椎和第四腰椎(下背部)椎骨之间递送，并且更包含脊柱的L2-S1区在内。考虑腰部鞘内施用或递送区别于小脑延髓池递送之处在于根据本发明的腰部鞘内施用或递送向远端椎管提供对远端椎管更好和更有效的递送，而尤其地，小脑延髓池递送通常不能很好地递送到远端椎管。
用于鞘内递送的装置
根据本发明，各种装置可用于鞘内递送。在一些实施例中，用于鞘内施用的装置含有流体进入端口(例如，可注射端口)；空心主体(例如导管)，其具有与流体进入端口流体连通的第一流动孔和配置用于插入脊髓内的第二流动孔；以及固定机构，用于固定空心主体在脊髓中的插入。作为非限制性示例，合适的固定机构包含安装在空心主体的表面上的一个或多个小块和在一个或多个小块上可调节的缝合环，以防止空心主体(例如，导管)滑出脊髓。在各种实施例中，流体进入端口包括储库。在一些实施例中，流体进入端口包括机械泵(例如，输注泵)。在一些实施例中，植入的导管连接到储库(例如，用于推注递送)或输注泵。流体进入端口可为植入的或外部的。
在一些实施例中，鞘内施用可通过腰椎穿刺(即，缓慢推注)或经由端口-导管递送系统(即输注或推注)来执行。在一些实施例中，将导管插入腰椎骨的椎板之间，并且将尖端向上螺旋穿过囊空间至所需水平(一般为L3-L4)。
在一些实施例中，鞘内施用是通过对植入的鞘内药物递送装置(IDDD)的间歇或连续接近。
相对于静脉内施用，适合于鞘内施用的单次剂量体积通常很小。通常，根据本发明的鞘内递送维持CSF的组成以及受试者的颅内压的平衡。在一些实施例中，在不存在从受试者中相应去除CSF的情况下执行鞘内递送。在一些实施例中，合适的单次剂量体积可为例如小于约10ml、8ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1.5ml、1ml或0.5ml。在一些实施例中，合适的单次剂量体积可为约0.5-5ml、0.5-4ml、0.5-3ml、0.5-2ml、0.5-1ml、1-3ml、1-5ml、1.5-3ml、1-4ml或0.5-1.5ml。在一些实施例中，根据本发明的鞘内递送涉及首先去除所需量的CSF的步骤。在一些实施例中，在鞘内施用之前首先去除小于约10ml(例如，少于约9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1ml)的CSF。在那些情况下，合适的单次剂量体积可为例如多于约3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml。
用于向个体鞘内施用治疗组合物或制剂的其它装置在美国专利号6,217,552中描述，所述美国专利以引用的方式并入本文。可替代地，药物可例如通过单次注射或连续输注鞘内给予。应当理解，剂量治疗可为单次剂量施用或多剂量的形式。
对于注射，可将本发明的制剂配制在液体溶液中。另外，酶可配制成固体形式，并且在使用前立即重新溶解或悬浮。还包括冻干形式。注射可为例如酶的推注注射或连续输注(例如，使用输注泵)的形式。
非鞘内递送方法
治疗性酶，例如重组芳基硫酸酯酶A，可以通过非鞘内方式施用，例如，通过侧脑室注射到受试者的脑部中。例如，可通过在受试者的头骨中制造的钻孔来进行注射。在另一个实施例中，酶和/或其它药物制剂通过手术插入的分流器施用到受试者的脑室内。例如，注射可在更大的侧脑室内进行。在一些实施例中，注射还可在第三和第四较小的心室内进行。
可替代地，药物组合物可通过注射到受试者的小脑延髓池或腰部区域内施用。
某些装置可用于实现治疗组合物的施用。例如，含有所需酶的制剂可使用Ommaya储库给予，所述储库通常用于鞘内施用用于脑膜癌病的药物(Lancet 2:983-84,1963)。更具体地，在该方法中，心室管穿过在前角中形成的洞插入，并且连接到安装在头皮下的Ommaya储库，并且将储库皮下穿刺以鞘内递送待替换的特定酶，其被注射到储库内。
缓慢释放/持续递送
在本发明的方法的另一个实施例中，在药学可接受的制剂施用于受试者后，药学可接受的制剂提供了本发明中使用的酶或其它药物组合物持续递送，例如“缓慢释放”至受试者至少一、二、三、四周或更长时间段。
如本文使用的，术语“持续递送”是指本发明的药物制剂在施用后的一段时间内，优选至少几天、一周或几周内在体内连续递送。组合物的持续递送可通过例如随着时间推移的酶的持续疗效来证实(例如，酶的持续递送可通过受试者中持续减少量的贮存颗粒来证实)。可替代地，酶的持续递送可通过随着时间推移而检测体内酶的存在来证实。
对靶组织的递送
如上文讨论的，本发明的令人惊讶和重要的特征之一是治疗剂，特别是使用本发明的发明方法和组合物施用的替代酶能够有效且广泛地扩散穿过脑表面，并且穿透脑的各个层或区域，包括深层脑区。另外，本发明的发明方法和组合物有效地将治疗剂(例如ASA酶)递送至脊髓的各种组织、神经元或细胞，包括腰区，其通过现有的CNS递送方法例如ICV注射难以靶向。此外，本发明的发明方法和组合物将足够量的治疗剂(例如ASA酶)递送至血流以及各种外周器官和组织。
因此，在一些实施例中，将治疗性蛋白质(例如ASA酶)递送至受试者的中枢神经系统。在一些实施例中，将治疗性蛋白质(例如ASA酶)递送至脑、脊髓和/或外周器官的一种或多种靶组织。如本文使用的，术语“靶组织”是指受待治疗的溶酶体贮积病影响的任何组织或其中正常表达缺乏的溶酶体酶的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括在患有或易患溶酶体贮积病的患者中，其中存在例如贮存于组织的细胞溶酶体中的可检测或异常高量的酶底物的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。在一些实施例中，靶组织包括其中缺陷型溶酶体酶通常以升高的水平表达的那些组织。如本文使用的，靶组织可为脑靶组织、脊髓靶组织和/或外周靶组织。下文详细描述了示例性靶组织。
脑靶组织
一般而言，脑可分为不同的区域、层和组织。例如，脑膜组织是包裹中枢神经系统包括脑的膜系统。脑膜包含三层，包括硬脑膜、蛛网膜物质和软脑膜。一般而言，脑膜和脑脊髓液的主要功能是保护中枢神经系统。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至脑膜的一个或多个层。
脑有三个主要分区，包括大脑、小脑和脑干。脑半球位于大多数其它脑结构上方，并且覆盖有皮质层。大脑下面是脑干，其类似大脑与之附着的茎。在脑后部处、在大脑下方和在脑干后面是小脑。
间脑位于脑中线附近和中脑上方，包含丘脑、后丘脑、下丘脑、上丘脑、前丘脑(prethalamus)和前顶盖。中脑(mesencephalon)也称为中脑(midbrain)，包含顶盖、被盖、心室中隔腔、以及大脑脚、红核和颅神经III核。中脑与视力、听力、运动控制、睡眠/觉醒、警觉和温度调节有关。
可基于组织的深度来表征中枢神经系统包括脑的组织区域。例如，CNS(例如，脑)组织可表征为表面或浅层组织、中深层组织和/或深层组织。
根据本发明，可将治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至与受试者中待治疗的特定疾病相关的任何适当的脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至表面或浅层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至中深层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至深层脑靶组织。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送至表面或浅层脑靶组织、中深层脑靶组织和/或深层脑靶组织的组合。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质递送到脑的外表面下方(或内部)至少4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更多的深层脑组织。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至大脑的一个或多个表面或浅层组织。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织位于距大脑表面4mm内。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织选自软脑膜组织、大脑皮质带组织、海马、Virchow Robin空间、VR空间内的血管、海马体、脑的内表面上的下丘脑部分、视神经和束、嗅球和突起及其组合。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至大脑的一个或多个深层组织。在一些实施例中，大脑的靶向表面或浅层组织位于大脑表面下方(或内部)4mm(例如，5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm)。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括大脑皮质带。在一些实施例中，大脑的靶向深层组织包括间脑(例如下丘脑、丘脑、前丘脑、丘脑底部等)、后脑、豆状核、基底神经节、尾状核、壳核、杏仁核、苍白球及其组合中的一种或多种。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至小脑的一种或多种组织。在某些实施例中，小脑的靶向的一种或多种组织选自分子层的组织、浦肯野细胞层的组织、颗粒细胞层的组织、小脑脚及其组合。在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至小脑的一种或多种深层组织，包括但不限于浦肯野细胞层的组织、颗粒细胞层的组织、深层小脑白质组织(例如，相对于颗粒细胞层的深层)和深层小脑核组织。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脑干的一种或多种组织。在一些实施例中，脑干的靶向的一种或多种组织包括脑干白质组织和/或脑干核组织。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至各种脑组织，包括但不限于灰质、白质、室周区、柔脑膜、脑膜、新皮质、小脑、大脑皮质中的深层组织、分子层、尾状核/壳核区、中脑、脑桥或髓质的深层区域及其组合。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脑中的各种细胞，包括但不限于神经元、神经胶质细胞、血管周细胞和/或脑膜细胞。在一些实施例中，将治疗性蛋白质递送至深白质的少突胶质细胞。
脊髓
一般而言，脊髓的区域或组织可基于组织的深度来表征。例如，脊髓组织可表征为表面或浅层组织、中深层组织和/或深层组织。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的一个或多个表面或浅层组织。在一些实施例中，脊髓的靶向表面或浅层组织位于距脊髓表面4mm内。在一些实施例中，脊髓的靶向表面或浅层组织包含软脑膜和/或白质束。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的一种或多种深层组织。在一些实施例中，脊髓的靶向深层组织位于距脊髓表面4mm的内部。在一些实施例中，脊髓的靶向深层组织含有脊髓灰质和/或室管膜细胞。
在一些实施例中，将治疗剂(例如酶)递送至脊髓的神经元。
外周靶组织
如本文使用的，外周器官或组织指并非中枢神经系统(CNS)的部分的任何器官或组织。外周靶组织可包括但不限于血液系统、肝、肾、心脏、内皮、骨髓和骨髓衍生细胞、脾、肺、淋巴结、骨、软骨、卵巢和睾丸。在一些实施例中，将根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)递送至外周靶组织中的一种或多种。
生物分布和生物利用度
在各种实施例中，一旦递送至靶组织，治疗剂(例如ASA酶)就在细胞内定位。例如，治疗剂(例如酶)可定位至靶细胞的外显子、轴突、溶酶体、线粒体或液泡(例如神经元，例如浦肯野细胞)。例如，在一些实施例中，鞘内施用的酶证实易位动力学，使得酶在血管周间隙内移动(例如，通过脉动辅助的对流机制)。另外，与施用的蛋白质或酶与神经丝的结合有关的活性轴突运输机制也可促成或以其他方式促进鞘内施用的蛋白质或酶分布到中枢神经系统的更深层组织内。
在一些实施例中，根据本发明递送的治疗剂(例如ASA酶)可在本文所述的各种靶组织中达到治疗或临床有效水平或活性。如本文使用的，治疗或临床有效水平或活性是足以在靶组织中赋予疗效的水平或活性。疗效可为客观的(即，可通过一些测试或标记物测量的)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感觉到效果)。例如，治疗或临床有效水平或活性可为足以改善与靶组织中的疾病相关的症状(例如，GAG贮存)的酶促水平或活性。
治疗有效剂量和施用间隔
治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可例如根据施用途径、与其他药物试剂的组合而变。另外，关于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药学试剂的活性；所采用的具体成分；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所采用的特定融合蛋白的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域众所周知的相似因素。
在一些实施方案中，治疗有效剂量为或大于约60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg或约200mg。在特定实施方案中，治疗有效剂量为或大于约150mg。在一些实施方案中，治疗有效剂量为或小于约500mg、450mg、400mg、350mg、300mg、250mg、200mg或150mg。在特定实施方案中，治疗有效剂量小于约200mg。在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围在约10-200mg、约20-200mg、约30-200mg、约40-200mg、约50-200mg、约160-200mg、约70-200mg、约80-200mg、约90-200mg、约100-200mg、约125-200、约150-200、约50-300mg、约75-300mg、约100-300mg、约150-300或约10-50mg之间。在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围在约100mg和约200mg之间。
在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围为约0.005mg/kg脑重量至500mg/kg脑重量，例如约0.005mg/kg脑重量至400mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至300mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至200mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至100mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至90mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至80mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至70mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至60mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至50mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至40mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至30mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至25mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至20mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至15mg/kg脑重量、约0.005mg/kg脑重量至10mg/kg脑重量。
在一些实施方案中，治疗有效剂量大于约0.1mg/kg脑重量、大于约0.5mg/kg脑重量、大于约1.0mg/kg脑重量、大于约3mg/kg脑重量、大于约5mg/kg脑重量、大于约10mg/kg脑重量、大于约15mg/kg脑重量、大于约20mg/kg脑重量、大于约30mg/kg脑重量、大于约40mg/kg脑重量、大于约50mg/kg脑重量、大于约60mg/kg脑重量、大于约70mg/kg脑重量、大于约80mg/kg脑重量、大于约90mg/kg脑重量、大于约100mg/kg脑重量、大于约150mg/kg脑重量、大于约200mg/kg脑重量、大于约250mg/kg脑重量、大于约300mg/kg脑重量、大于约350mg/kg脑重量、大于约400mg/kg脑重量、大于约450mg/kg脑重量、大于约500mg/kg脑重量。
在一些实施方案中，治疗有效剂量还可通过mg/kg体重来定义。如本领域技术人员将了解的，脑重量和体重可为相关联的。Dekaban AS.“Changes in brain weights duringthe span of human life:relation of brain weights to body heights and bodyweights,”Ann Neurol 1978；4:345-56。因此，在一些实施方案中，剂量可以如表2所示进行转化。
表2
Figure BDA0002622931220000241
在一些实施方案中，治疗有效剂量还可由mg/15cc的CSF来定义。如本领域技术人员将了解的，基于脑重量和体重的治疗有效剂量可转换为mg/15cc的CSF。例如，成年人中的CSF体积为大约150mL(Johanson CE等人，“Multiplicity of cerebrospinal fluidfunctions:New challenges in health and disease,”Cerebrospinal Fluid Res.2008年5月14日；5:10)。因此，0.1mg至50mg蛋白质对成人的单次剂量注射将是在成人中大约0.01mg/15cc的CSF(0.1mg)至5.0mg/15cc的CSF(50mg)剂量。
应进一步理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用酶替代疗法或监督施用酶替代疗法的人的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅为示例性的，并不预期限制本发明的范围或实践。
在某些实施方案中，重组芳基硫酸酯酶A酶以施用间隔施用例如规则间隔施用。例如，施用间隔可为每周一次、每两周一次、或每月一次。
在某些实施方案中，施用重组芳基硫酸酯酶A酶达到治疗期。治疗期可为预先确定的，或者可根据患者对治疗的应答进行调整，包括但不限于如本文讨论的可能的不良症状和/或治疗功效的证据。例如，治疗期可为至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少24个月、或甚至更大。
考虑在一些实施方案中，受试者将经历经过某一治疗期的治疗，经历某一时期，在此期间他们不接受治疗或替代治疗，然后再次经历另一治疗期。
在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可实现的酶促水平或活性为靶组织中相应溶酶体酶的正常水平或活性的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。在一些实施方案中，与对照或基线(例如，没有治疗的内源水平或活性)相比，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可实现增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的酶水平或活性。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在靶组织中实现至少大约10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg或600nmol/hr/mg的酶水平或活性增加。
在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可特别用于靶向腰区。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在腰区中实现至少大约500nmol/hr/mg、600nmol/hr/mg、700nmol/hr/mg、800nmol/hr/mg、900nmol/hr/mg、1000nmol/hr/mg、1500nmol/hr/mg、2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000nmol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg或10,000nmol/hr/mg的酶水平或活性增加。
一般而言，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在CSF以及脑、脊髓和外周器官的靶组织中具有足够长的半衰期。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可具有至少大约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、最多3天、最多7天、最多14天、最多21天或最长一个月的半衰期。在一些实施方案中，在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)可在施用后12小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时或一周后在CSF或血流中保持可检测的水平或活性。可使用本领域已知的各种方法确定可检测水平或活性。
在某些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在施用后(例如，在药物组合物鞘内施用于受试者后一周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更短时间)在受试者的CNS组织和细胞中达到至少30μg/ml的浓度。在某些实施方案中，根据本发明递送的治疗剂(例如替代酶)在施用于此类受试者后(例如，在此类药物组合物鞘内施用于受试者后一周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更短时间)在受试者的靶向组织或细胞(例如脑组织或神经元)中达到至少20μg/ml、至少15μg/ml、至少10μg/ml、至少7.5μg/ml、至少5μg/ml、至少2.5μg/ml、至少1.0μg/ml或至少0.5μg/ml的浓度。
治疗制剂
重组ASA或含有重组ASA的药物组合物可以与生理上可接受的载体或赋形剂一起配制以制备药物组合物。载体和治疗剂可以是无菌的。该制剂应该适合施用模式。
合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(诸如甘露糖醇、蔗糖等)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等及其组合。需要时，药物制剂可与助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等等)混合，所述助剂不会有害地与活性化合物反应或干扰其活性。在一些实施方案中，使用适于静脉内施用的水溶性载体。
如果需要，组合物或药物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂。还可将组合物与传统粘合剂和载体诸如甘油三酯一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
可以根据常规程序将组合物或药物配制成适于向人类施用的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂，以缓解在注射部位处的疼痛。一般地，成分分开供应或以单位剂型混合在一起供应，例如作为在指示活性剂数量的气密密封容器例如安瓿或小药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注施用时，它可以用含有无菌药物级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶来分配。当组合物通过注射施用时，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，以便可在施用之前混合成分。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A配制在等渗溶液中，该等渗溶液诸如154mMNaCl或0.9％NaCl和10-50mM磷酸钠(pH 6.5-8.0)或磷酸钠、甘氨酸、甘露醇或相应钾盐。在实施方案中，制剂的摩尔渗透压浓度为约250至约350mOsmol/kg(例如，约255至约320mOsmol/kg、约260至约310mOsmol/kg或约280至约300mOsmol/kg)。
在另一个实施方案中，将ASA配制在生理缓冲液中，诸如：
a)含有以下物质(以mM为单位)的配制缓冲液I：Na2HPO4(3.50-3.90)、NaH2PO4(0-0.5)、甘氨酸(25-30)、甘露醇(230-270)和注射用水；或
b)含有以下物质(以mM为单位)配制缓冲液II：Tris-HCl(10)、甘氨酸(25-30)、甘露醇(230-270)和注射用水。
通过本文的方法纯化的芳基硫酸酯酶A可用作在患有和/或诊断出异染性脑白质营养不良的受试者中，降低外周神经系统中和/或中枢神经系统内的细胞内的鞘脂3-O-磺基半乳糖苷神经酰胺(半乳糖基硫苷脂)水平的药物。ASA的施用将导致运动学习技能的损害降低和/或导致神经运动传导速度和/或神经传导幅度增加。如本文使用的，术语“治疗有效量”在很大程度上基于本发明药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。一般地，治疗有效量足以对受试者实现有意义的益处(例如，预防、治疗、调节、治愈、防止和/或改善潜在的疾病或状况)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量，例如足以调节溶酶体酶受体或其活性从而治疗此类溶酶体贮积病或其症状的量(例如，在将本发明的组合物施用于受试者后，“斑马体”或细胞空泡形成的存在或发生率的减少或消除)。一般地，施用于有此需要的受试者的治疗剂(例如，重组溶酶体酶)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够容易地根据这些和其他相关因素确定适当剂量。另外，可任选地采用客观和主观测定来确定最佳剂量范围。
在实施方案中，纯化的重组ASA蛋白的特征(例如，特征性聚糖图谱，诸如具有阈值量的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白的纯化的重组ASA蛋白)以及其他特性，诸如宿主细胞蛋白(HCP)的特征性最大水平、宿主细胞DNA(HCD)的特征性最大量和/或特定的比活性)可以包含纯化的重组ASA蛋白的组合物的所需特性(例如，改善的储存稳定性、改善的治疗特性等)。
在实施方案中，本发明提供了一种使用仅涉及色谱后超滤/渗滤的单个步骤的过程从不纯的制备物(例如，未加工的生物材料，诸如含ASA的细胞培养基)中纯化出重组ASA蛋白的方法。在实施方案中，通过合并来自色谱步骤的洗脱液并将所合并的洗脱液的pH调节至6.0或高于约6.0来实现这种单步UF/DF过程。在一些实施方案中，这种简化过程与高上样量色谱步骤组合以促进大规模生产重组ASA蛋白。
在下述小节中进一步详细描述本发明的各个方面。小节的使用并不意欲限制本发明。每个小节可适合于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
芳基硫酸酯酶A
芳基硫酸酯酶A(ASA、ARSA或脑苷脂硫酸酯酶)是一种将脑苷脂3-硫酸盐(或硫苷脂)分解为脑苷脂和硫酸盐的酶。具体地说，半乳糖基硫苷脂通常是通过溶酶体酶芳基硫酸酯酶A(EC 3.1.6.8)(Austin等人Biochem J.1964,93,15C-17C)和称为皂素B的鞘脂激活蛋白的联合作用来水解3-O-硫酸酯键而代谢形成半乳糖脑苷脂。芳基硫酸酯酶A的缺乏发生在所有来自患有晚婴型、青少年型和成年型异染性脑白质营养不良(MLD)的患者的组织中。如本文使用的，芳基硫酸酯酶A蛋白将被称为“ASA”或“ARSA”，而皂素B将被称为“Sap-B”。
芳基硫酸酯酶A是具有低等电点的酸性糖蛋白。在pH 6.5以上，该酶作为分子量为大约100kDa的单体存在。ASA在酸性条件下(pH≤约5.0)作为480kDa的八聚体存在，但在中性pH水平下会离解为二聚体。在人体尿液中，该酶由63kDa和54kDa的两个不同亚基组成(Laidler PM等人Biochim Biophys Acta.1985,827,73-83)。从人肝脏、胎盘和成纤维细胞中纯化出的芳基硫酸酯酶A还由两个大小稍有不同、在55kDa至64kDa之间变化的亚基组成(Draper RK等人Arch Biochemica Biophys.1976,177,525-538,Waheed A等人HoppeSeylers Z Physiol Chem.1982,363,425-430,Fujii T等人Biochim Biophys Acta.1992,15 1122,93-98)。与其他溶酶体酶的情况一样，芳基硫酸酯酶A在膜结合的核糖体上作为糖基化前体合成。然后，它穿过内质网和高尔基体，在那里其N-连接的寡糖经过加工形成复杂类型的磷酸化且硫酸化的寡糖(Waheed A等人Biochim Biophys Acta.1985,847,53-61,Braulke T等人Biochem Biophys Res Commun.1987,143,178-185)。在正常培养的成纤维细胞中，产生62kDa的前体多肽，该前体多肽经由甘露糖-6-磷酸受体结合(Braulke T等人JBiol Chem.1990,265,6650-6655)转移至酸性前溶酶体内体(Kelly BM等人Eur J CellBiol.1989,48,71-78)。
本文所述的方法可用于从任何来源，例如从重组产生芳基硫酸酯酶A的组织或培养的细胞(例如人细胞(例如成纤维细胞))中纯化出芳基硫酸酯酶A。可以通过本文所述的方法产生任何起源(包括但不限于人和其他动物，诸如哺乳动物)的芳基硫酸酯酶A。
人芳基硫酸酯酶A信号肽的长度(18个氨基酸)基于共有序列和信号序列的特异性加工位点。因此，信号肽从推导的人ASA cDNA(EMBL GenBank登录号J04593和X521151)的裂解在所有细胞中都发生18号残基(Ala)之后，从而产生人芳基硫酸酯酶A的成熟形式。如本文使用的，重组芳基硫酸酯酶A将缩写为“rASA”。芳基硫酸酯酶A的成熟形式(包括人芳基硫酸酯酶A的成熟形式)将称为“mASA”，而成熟的重组人ASA被称为“mrhASA”。
已经在来自人体尿液(Luijten JAFM等人J Mol Med.1978,3,213)、白细胞(Dubois等人Biomedicine.1975,23,116-119,Manowitz P等人Biochem Med MetabBiol.1988,39,117-120)、血小板(Poretz等人Biochem J.1992,287,979-983)、培养的成纤维细胞(Waheed A等人Hoppe Seylers Z Physiol Chem.1982,363,425-430,Stevens RL等人Biochim Biophys Acta.1976,445,661-671,Farrell DF等人Neurology.1979,29,16-20)和肝脏(Stevens RL等人Biochim Biophys Acta.1976,445,661-671,Farrell DF等人Neurology.1979,29,16-20,Sarafian TA等人Biochem Med.1985,33,372-380)的酶制剂的电泳和等电聚焦方面，证明了多种形式的芳基硫酸酯酶A。用糖苷内切酶H、唾液酸酶和碱性磷酸酶处理可降低电泳图谱的分子大小和复杂性，这表明芳基硫酸酯酶A的许多电荷异质性是由于该酶碳水化合物含量的变化所致。
芳基硫酸酯酶A的活性位点含有一个必需的组氨酸残基(Lee GD和Van Etten RL,Arch Biochem Biophys.1975,171,424-434)和两个或更多个精氨酸残基(James GT,ArchBiochem Biophys.1979,97,57-62)。许多阴离子是浓度在毫摩尔范围或更低范围内的酶抑制剂。
已经描述了人芳基硫酸酯酶A的基因结构。如本文使用的，该基因将称为“ARSA”。然而，在一些情况下，“ARSA”也可以指芳基硫酸酯酶A蛋白。ARSA基因位于22号染色体(22ql3.31-qter)长臂的末端附近，它跨越3.2kb(Kreysing等人Eur J Biochem.1990,191,627-631)，由指定507个氨基酸酶单位的八个外显子组成(Stein等人J Biol Chem.1989,264,1252-1259)。在成纤维细胞中已检测到2.1kb、3.7kb和4.8kb的信使RNA，而2.1kb的信使RNA显然是细胞产生的大部分活性芳基硫酸酯酶A的原因(Kreysing等人Eur JBiochem.1990,191,627-631)。ARSA序列已经以登录号X521150保藏在EMBL GenBank。Kreysing等人描述了ARSA的已公布cDNA与编码部分之间的差异(Eur J Biochem.1990,191,627-631)。Stein等人最初描述的cDNA序列(J Biol Chem.1989,264,1252-1259)和Kreysing等人描述的cDNA序列(Eur J Biochem.1990,191,627-631)已经分别以下列登录号J04593和X521151保藏在EMBL GenBank。
已在ARSA基因中鉴定出几种多态性和40多种与疾病相关的突变(Gieselmann等人Hum Mutat.1994,4,233-242,Barth等人Hum Mutat.1995,6,170-176,Draghia等人HumMutat.1997,9,234-242)。ARSA基因中与疾病相关的突变可分为两大类别，它们与MLD的临床表型具有很好的相关性。当引入培养的动物细胞系中时，一个类别(I)不产生活性酶，不产生免疫反应性蛋白，并且不表达ASA活性。另一个类别(A)在培养的细胞中产生少量的交叉反应性物质和低水平的功能酶。类别(I)突变的纯合个体，或具有两个来自该类别的不同突变的个体表现出晚婴型MLD。大多数具有一个类别(I)型突变和一个类别(A)型突变的个体发展成青少年发作形式，而具有两个类别(A)型突变的个体通常表现出成年MLD。一些突变已相对频繁地发现，而其他突变仅在单个家族中检测到。可以通过许多家族的成员来追踪特异性突变，但是常规的携带者筛查尚不可行。
除了上述与疾病相关的突变外，在ARSA基因中还发现了几种多态性。已在一些MLD患者的临床正常父母中，还有在一般群体中，发现了极低的ASA活性。已将这种所谓的假缺乏性ASA与ARSA基因的常见多态性关联起来(Gieselmann等人Dev Neurosci.1991,13,222-227)。
重组ASA蛋白
如本文使用的，术语“重组ASA蛋白”是指可以替代天然存在的芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的至少部分活性或挽救与ASA缺乏相关的一种或多种表型或症状的任何分子或分子的一部分。如本文使用的，术语“重组ASA酶”和“重组ASA蛋白”以及语法等价物可互换使用。在一些实施方案中，本发明用于纯化重组ASA蛋白，该蛋白是具有与成熟的人ASA蛋白基本上相似或相同的氨基酸序列的多肽。
通常，人ASA作为被加工为成熟形式的前体分子产生。该过程一般通过去除18个氨基酸的信号肽而发生。通常，前体形式也称为全长前体或全长ASA蛋白，其含有507个氨基酸。N端18个氨基酸被裂解，产生长度为489个氨基酸的成熟形式。因此，预期ASA蛋白活性通常不需要N端的18个氨基酸。表1中示出了典型野生型或天然存在的人ASA蛋白的成熟形式(SEQ ID NO:1)和全长前体(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
表1.人芳基硫酸酯酶A
Figure BDA0002622931220000311
Figure BDA0002622931220000321
因此，在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白是成熟的人ASA蛋白(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白可以是成熟的人ASA蛋白的同源物或类似物。例如，成熟的人ASA蛋白的同源物或类似物可为与野生型或天然存在的ASA蛋白(例如，SEQ ID NO:1)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留基本的ASA蛋白活性的经修饰的成熟的人ASA蛋白。因此，在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白与成熟的人ASA蛋白(SEQ ID NO:1)基本上同源。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白具有与SEQ IDNO:1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白与成熟的人ASA蛋白(SEQ ID NO:1)基本上相同。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白含有成熟的人ASA蛋白的片段或一部分。
可替代地，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白是全长ASA蛋白。在一些实施方案中，重组ASA蛋白可以是全长人ASA蛋白的同源物或类似物。例如，全长人ASA蛋白的同源物或类似物可为与野生型或天然存在的全长ASA蛋白(例如，SEQ ID NO:2)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时保留基本ASA蛋白活性的经修饰的全长人ASA蛋白。因此，在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白与全长人ASA蛋白(SEQ ID NO:2)基本上同源。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白具有与SEQ ID NO:2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白与SEQ ID NO:2基本上相同。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白具有与SEQ ID NO:2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，通过本发明的实施方案纯化的重组ASA蛋白含有全长人ASA蛋白的片段或一部分。如本文使用的，全长ASA蛋白通常含有信号肽序列。
人ASA蛋白的同源物或类似物可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法制备，所述方法例如在汇编此类方法的参考文献中可以找到。在一些实施方案中，氨基酸的保守性取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方案中，“保守性氨基酸取代”是指不改变在其中进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。
在一些实施方案中，重组ASA蛋白可以含有与靶细胞表面上的受体结合的部分，以促进细胞摄取和/或溶酶体靶向。例如，此类受体可为与阳离子不依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其结合甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。另外，CI-MPR还结合其它蛋白质，包括IGF-II。在一些实施方案中，重组ASA蛋白在蛋白表面上含有M6P残基。具体而言，重组ASA蛋白可以含有对CI-MPR具有更高结合亲和力的双磷酸化寡糖。在一些实施方案中，合适的酶含有至多约平均约至少20％的双磷酸化寡糖/酶。在其他实施方案中，合适的酶可含有约10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％的双磷酸化寡糖/酶。
在一些实施方案中，重组ASA酶可以与能够结合靶细胞表面上的受体的溶酶体靶向部分融合。合适的溶酶体靶向部分可为IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段(例如，包括具有与野生型成熟的人IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列至少70％、75％、80％、85％、90％或95％相同的序列的那些肽)。溶酶体靶向部分可以在N端、C端或内部与ASA蛋白或酶缀合或融合。
重组芳基硫酸酯酶A的纯化
本发明的实施方案包括用于产生芳基硫酸酯酶A(“ASA”)，特别是重组人ASA(“rhASA”)药物物质的纯化过程。
多种技术，全部或部分，任选地进行如本文所述的修改，可以用于产生纯化的ASA药物物质。
例如，示例性的纯化过程包括以下的一个或多个步骤(例如，这些步骤中的1、2、3、4、5、6个或全部7个)：
·解冻并合并未纯化的散装rhASA(UPB)。
·捕获并通过超滤和渗滤来过滤UPB(“UFDF”或“捕获UFDF”)。
·过滤后，可以在色谱纯化之前将捕获的物质进行病毒灭活。
·一种方法，包括相继使用四个色谱柱：阴离子交换柱(例如，Fractogel TMAEHiCap树脂柱)、陶瓷羟磷灰石I型(HA)柱、疏水作用柱(HIC；例如苯基琼脂糖FF柱)和阳离子交换(例如SP)柱。
·合并SP洗脱液并对合并的洗脱液进行pH调节(例如，调节至约5.5至约6.5(例如，约6.0)的pH)。
·然后将所得的经pH调节的阳离子交换洗脱液进行病毒过滤，然后进行单一浓缩和渗滤步骤，以达到最终目标蛋白浓度。
·向洗脱液中添加聚山梨醇酯20(P20)(例如在冷冻储存之前)。
如本文使用的，“污染物”是与所需多肽产物，例如芳基硫酸酯酶A(ASA)不同的物质。污染物可以是所需多肽的变体(例如所需多肽的脱酰胺基变体或氨基天冬氨酸变体)或另一种分子，例如多肽、核酸和内毒素。
如本文使用的，通过从包含多肽和一种或多种污染物的组合物或样品中“纯化”多肽意指通过从组合物或样品中(完全或部分)去除至少一种污染物来提高组合物或样品中的多肽纯度。
“纯化步骤”可以是整个纯化方法的一部分，从而产生基于组合物的总重量，包含按重量计至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的目标多肽的组合物。
芳基硫酸酯酶A的纯度可以通过例如以下的一种或多种来测量：宿主细胞蛋白(HCP)蛋白质印迹(Western blot)、SDS-PAGE考马斯染色、SDS-PAGE银染色、反相HPLC和尺寸排阻HPLC。
例如，本文所述的组合物和方法中使用的芳基硫酸酯酶A也可以通过特征性聚糖图谱(例如，本文所述的任何示例性聚糖图谱)来描述。
在一些实施方案中，纯化的芳基硫酸酯酶A的比活性为至少约50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg、100U/mg、110U/mg、120U/mg、130U/mg、140U/mg，例如通过本文所述的方法测定的。在一些实施方案中，纯化的重组ASA具有范围为约50-200U/mg(例如约50-190U/mg、50-180U/mg、50-170U/mg、50-160U/mg、50-150U/mg、50-140U/mg、50-130U/mg、50-120U/mg、50-110U/mg、50-100U/mg、60-140U/mg、60-130U/mg、60-120U/mg、60-110U/mg、60-100U/mg、70-140U/mg、70-130U/mg、70-120U/mg、70-110U/mg、70-100U/mg、80-140U/mg、80-130U/mg、80-120U/mg、80-110U/mg、80-100U/mg、90-140U/mg、90-130U/mg、90-120U/mg、90-110U/mg、90-100U/mg、100-140U/mg、100-130U/mg、100-120U/mg、100-110U/mg、110-140U/mg、110-130U/mg、110-120U/mg、120-140U/mg、120-130U/mg或130-140U/mg)的比活性，例如通过本文所述的方法测定的。
纯化方法的原材料是任何不纯的制备物。例如，不纯的制备物可以是含有从产生ASA蛋白的细胞(例如，哺乳动物细胞)分泌的重组ASA蛋白的未加工的细胞培养基或是含有ASA蛋白的原细胞裂解物。在一些实施方案中，不纯的制备物可以是经过部分加工的细胞培养基或细胞裂解物。例如，细胞培养基或细胞裂解物可以浓缩、稀释，经病毒灭活、病毒加工或病毒去除进行处理。在一些实施方案中，去除病毒可以利用纳米过滤和/或色谱技术等。在一些实施方案中，病毒灭活可以利用溶剂灭活、洗涤剂灭活、巴氏灭菌、酸性pH灭活和/或紫外线灭活等。细胞培养基或细胞裂解物也可以用蛋白酶、DNase和/或RNase处理以降低宿主细胞蛋白和/或核酸(例如，DNA或RNA)的水平。在一些实施方案中，可以将未加工的或经部分加工的生物材料(例如，细胞培养基或细胞裂解物)冷冻并储存在所需温度(例如，2-8℃、-4℃、-25℃、-75℃)下一段时间，然后解冻进行纯化。如本文使用的，不纯的制备物也称为原材料或上样材料。
本文所述的纯化方法可包括但不限于以下的一个或多个步骤：深度过滤、病毒灭活、离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)、混合模式色谱法、疏水性相互作用色谱法、超滤/渗滤和病毒去除过滤。在一些实施方案中，本文所述的纯化方法还包括亲和色谱法。
在色谱步骤中，当填充到色谱柱中时所用树脂的适当体积由柱的尺寸(即柱的直径和树脂的高度)反映出来，并且根据例如所施加的溶液中蛋白质的量和所用树脂的结合能力而变化。然而，为了以工业规模获得ASA的生产和纯化，增加生产过程以及纯化过程的规模也在本公开的范围内。因此，可以增加诸如柱的大小、直径和流速之类的参数，以符合此类大规模生产的速度和效率。在一些实施方案中，柱的直径范围为约50-100mm，体积范围为约100-300ml，流速范围为约40-400cm/小时(例如在约100cm/小时至150cm/小时之间)或为约5至100ml。
超滤–捕获
在本发明的一些实施方案中，本文公开的纯化方法包括上游超滤以捕获由灌注生物反应器产生的ASA(例如，人重组ASA)的一个或多个步骤。如本文使用的，超滤是指膜过滤、交换缓冲液和总体分馏，膜过滤的过滤器孔径大小为0.001μm和0.1μm，其可用于对溶解的分子(蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和其他生物分子)进行浓缩和脱盐。用于本发明的实施方案中的超滤方法包括切向流超滤或错流过滤。
如本文使用的，切向流过滤和超滤是指这样的布置，其中当一部分穿过膜时(渗透物)，进料流平行于膜面通过，而其余部分(截留物)再循环回到进料储器中。在一些实施方案中，选择切向流超滤过滤器的孔径以允许重组ASA渗透通过该过滤器。在其他实施方案中，选择孔径以便将基本上所有的ASA保留在通过该过滤器的进料中。如别处所述，ASA在酸性条件下(pH≤约5.0)作为480kDa的八聚体存在，但在中性pH水平下会离解为二聚体。因此，可以结合对适当孔径的选择来调节进料的pH，以将ASA保留在滤膜上或允许其作为渗透物穿过。
可以选择截流分子量为至少10kDa、至少20kDa、至少30kDa、至少40kDa、至少50kDa、至少60kDa、至少70kDa、至少80kDa、至少90kDa、至少100kDa、至少300kDa、至少400kDa或至少500kDa的孔径。例如，孔径为至少10kDa的过滤器将在进料中保留大部分分子量为大约11kDa或更高的蛋白质。作为另一个实例，孔径为至少400kDa的过滤器将保留大部分分子量高于400kDa的蛋白质。在一些实施方案中，进料保留率为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高。同样，可以选择孔径以分离特定大小的渗透物。例如，孔径为至少500kDa的过滤器将允许大部分分子量小于500kDa的蛋白质渗透通过。在一些实施方案中，渗透率为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高。
过滤面积或容量也可以优化用于本文公开的方法中。影响过滤面积选择的考虑因素包括坚固性、成本、进料流速(即错流速度)、跨膜压力、渗透通量率、设备适合度和通过量。在一些实施方案中，渗透通量为每小时50-100升/米2(“LMH”)。在一些实施方案中，进料流量为约250-600LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约250-350LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约175-245LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约170-230LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约120-160LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约15-30LMH，包括端值。在一些实施方案中，进料流量为约11-21LMH，包括端值。在一些实施方案中，过滤面积为约0.02m2、约0.14m2、约0.7或约3.5m2。在特定的实施方案中，跨膜压力为约55-60psi，包括端值。在一些实施方案中，跨膜压力为约15-25psi，包括端值。在一些实施方案中，跨膜压力为约10-20psi，包括端值。在一些实施方案中，跨膜压力为约5-15psi。
用于本发明的实施方案中的超滤过滤器可以包括本领域技术人员已知的膜材料，包括但不限于聚醚砜和稳定的纤维素。
用于本发明实施方案中的一种示例性过滤盒是Sartorius
Figure BDA0002622931220000361
用于本发明的实施方案中的另一示例性过滤盒是Sartorius
Figure BDA0002622931220000362
30kD标准膜。用于本发明的实施方案中的又一示例性过滤盒是Cuno深度过滤器ZB。在本发明的一些实施方案中，使用Cuno Zeta Plus深度过滤器。
深度过滤
本文所述的纯化方法可包括深度过滤的一个或多个步骤。深度过滤器是使用多孔过滤介质在整个介质中而不是仅在介质表面上保留颗粒的各种过滤器。它们含有具有分级密度的过滤介质，该过滤介质允许较大的颗粒截留在过滤器表面附近，而较小的颗粒穿透过滤器表面的较大开口区域，仅截留在更靠近过滤器中心的较小开口中。尽管某些实施方案仅在上游回收阶段(即，在后续色谱纯化步骤之前)采用深度过滤步骤，但是其他实施方案在一个或多个附加的纯化阶段期间采用深度过滤器。在本发明的一些实施方案中，使用Cuno Zeta Plus深度过滤器。
深度过滤之后，可以任选地进行0.45微米(±2μm)的过滤，以去除微粒并减少制剂中的生物负荷，进行下游加工。
病毒灭活
本文所述的纯化方法可包括病毒灭活的一个或多个步骤。在一些实施方案中，病毒灭活包括溶剂和/或洗涤剂。溶剂或洗涤剂可包括，例如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80、磷酸三正丁酯(TnBP)或它们的组合。病毒灭活可涉及在溶剂或洗涤剂中孵育3-24小时。在另一个实施方案中，病毒灭活包括病毒过滤，例如通过使用PlanovaTM过滤器进行过滤。
应当理解，这些方法旨在产生一种酶的制剂，该制剂基本上不含感染性病毒，并且可以称为“病毒安全性产品”。另外，可以预期，各种方法可以独立地或组合地使用。
病毒灭活可以通过向包含酶的溶液中添加一种或多种“病毒灭活剂”来实现。在一些实施方案中，在色谱纯化步骤之前(即，在将不纯的制备物上样到第一色谱柱上之前)进行病毒灭活步骤，以便确保在最终产物中不存在任何量或浓度的试剂，所述量或浓度当用作药物时或将该产物用于制备药物时，将会损害产物的安全性；其他实施方案在一个或多个附加的纯化阶段期间采用深度过滤器。例如，在一些实施方案中，根据本发明的发明方法在最后一个色谱柱之后还包括病毒去除的步骤。
术语“病毒灭活剂”旨在表示可以使用以便灭活脂质包膜病毒以及非脂质包膜病毒的试剂(例如，洗涤剂)或方法。术语“病毒灭活剂”应被理解为既涵盖此类试剂和/或方法的组合(只要适当的话)，又涵盖仅一种类型的此类试剂或方法。
典型的病毒灭活剂是洗涤剂和/或溶剂，最典型地是洗涤剂-溶剂混合物。应当理解，病毒灭活剂任选地是一种或多种洗涤剂与一种或多种溶剂的混合物。多种洗涤剂和溶剂可用于病毒灭活。洗涤剂可以选自非离子型洗涤剂和离子型洗涤剂，并且选择为基本上非变性的。通常，使用非离子型洗涤剂，因为它利于在后续纯化步骤中从rASA制备物中消除洗涤剂。例如Shanbrom等人，在美国专利4,314,997和美国专利4,315,919中描述了合适的洗涤剂。典型的洗涤剂是那些以Triton X-100和吐温(Tween)20或吐温80商标出售的那些洗涤剂。用于病毒灭活剂的优选溶剂是磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯，例如Neurath和Horowitz在美国专利4,764,369中所述。典型的溶剂是磷酸三正丁酯(TnBP)。用于本发明实践的特别优选的病毒灭活剂是吐温80，但是可替代地，可以使用其他试剂或试剂的组合。典型试剂以这样的体积添加，使得含ASA的溶液中吐温-80的浓度在约0.5重量％-4.0重量％的范围内，优选浓度为约1重量％。然后可以添加TnBP，达到基于含ASA的样品的新体积计算为0.3％的最终浓度。
病毒灭活步骤是在灭活包膜病毒的条件下进行的，从而产生了基本上病毒安全性的含rhASA的溶液。通常，此类条件包括4-37℃的温度，诸如19℃-28℃、23℃-27℃，通常为约25℃，以及通过验证研究发现有效的孵育时间。通常，1-24小时的孵育时间足够，优选10-18小时，诸如约14小时，以确保充分的病毒灭活。然而，适当的条件(温度和温育时间)取决于所采用的病毒灭活剂、pH以及溶液的蛋白质浓度和脂质含量。
预期也可以采用其他去除病毒或灭活病毒的方法来生产病毒安全性产品，诸如添加亚甲基蓝，随后通过紫外线辐射进行灭活。
本文所述的纯化方法可包括病毒去除过滤的一个或多个步骤。通常，在通过一个或多个色谱步骤进行酶纯化后进行病毒过滤。在一些实施方案中，病毒过滤步骤是通过使作为纯化步骤的结果的含ASA的溶液通过无菌过滤器，然后使经过无菌过滤的溶液通过纳米过滤器而进行的。“无菌过滤器”意指将会基本上去除所有能够繁殖和/或引起感染的微生物的过滤器。尽管典型的情况是过滤器的孔径为约0.1微米，但是孔径范围也可以在约0.05至0.3微米之间。将纯化过程中所进行的样品的病毒过滤替换为使样品与洗涤剂接触或与之组合是可行的。
本发明的一些实施方案包括病毒灭活和/或过滤的至少两个步骤。例如，可以将柱色谱法之前的病毒灭活与完成所有色谱步骤后的病毒去除组合。色谱后病毒去除可以在超滤/渗滤(UFDF)(例如，切向流超滤)的一个或多个步骤之前或之后进行。在一个具体实例中，从色谱纯化(例如，阳离子交换(SP)色谱法)的最后一个步骤获得洗脱液，并将洗脱液库的pH调节至约5.5、约6.0、约6.5或约7.0，然后进行病毒过滤。因此，在某些实施方案中，在UFDF的单个步骤之前进行病毒过滤(例如，使用PlanovaTM过滤器)。在另一个实例中，从色谱纯化(例如，阳离子交换(SP)色谱法)的最后一个步骤获得洗脱液，使其经受UFDF的第一步骤，无需进行pH调节，然后进行病毒过滤和UFDF的第二步骤。
在某些实施方案中，将经过pH调节的阳离子交换洗脱液库在Planova20N过滤器上进行病毒过滤。在某些实施方案中，经过pH调节的阳离子交换洗脱液进行病毒过滤后，相对于输入的收率为约90％-100％；即，通过A280吸光度评估，为约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。因此，在一些实施方案中，在病毒过滤期间基本上没有重组ASA损失。病毒过滤的收率非常重要，因为它验证了将pH调节至约6.0允许ASA八聚体(直径为约20nm)离解为二聚体形式。因此，可以选择病毒过滤器的孔径以确保仅过滤二聚体形式(即，八聚体形式可以被过滤器保留，或引起病毒过滤器堵塞)。例如，孔径为20nm的病毒过滤器将保留ASA的八聚体形式，而不保留二聚体形式。
亲和色谱法
本文所述的纯化方法可以包括亲和色谱法(例如，免疫亲和色谱法、固定化金属离子亲和色谱法和/或固定化配体亲和色谱法)的一个或多个步骤。
简言之，亲和色谱法是一种色谱技术，它依赖于高度特异性的相互作用，例如受体与配体之间、抗原与抗体之间或酶与底物之间的相互作用。如本领域技术人员将知道的，本文所述的纯化方法中的亲和色谱步骤中采用的选择性分子可以基于可以被选择性分子利用的重组产生的ASA的各种特性(例如，三维结构、糖基化等)。可以在亲和色谱法步骤中利用的示例性选择性分子(或捕获试剂)包括蛋白A、蛋白G、抗体、金属离子(例如镍)、特异性底物、配体或抗原。在一些实施方案中，适于本发明的亲和色谱法步骤的选择性分子利用抗芳基硫酸酯酶A抗体(例如，抗人芳基硫酸酯酶A抗体)。合适的抗芳基硫酸酯酶A抗体可商购获得或通过非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、鸡、山羊、绵羊、马或其他适于产生抗人类蛋白的抗体的动物)的免疫而获得。
通常，目标分子(例如，重组ASA)通过与选择性分子的相互作用而被截留在固体或固定相或介质上，而其他不合需要的分子由于未被选择性分子结合而未被截留。然后可以从混合物中去除固体介质，任选地将其进行洗涤，并通过洗脱使目标分子从截留物中释放出来。在一些实施方案中，可以通过梯度改变离子强度来洗脱亲和柱。例如，盐浓度、pH、pI和离子强度可用于分离或形成梯度以分离。
在一些实施方案中，重组ASA蛋白可以产生为具有标签，以便利于通过亲和色谱法纯化。如本领域技术人员将知道的，蛋白质标签可以包括例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、六组氨酸(His)、麦芽糖结合蛋白(MBP)等。在一些实施方案中，凝集素在亲和色谱法中用于分离样品中的组分。例如，某些凝集素特异性结合特定的碳水化合物分子，并且可用于将糖蛋白与非糖基化蛋白分离，或将一种糖型与另一种糖型分离。
离子交换色谱法
本文所述的纯化方法可包括离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)的一个或多个步骤。
如本领域技术人员所知，离子交换剂(例如，阴离子交换剂和/或阳离子交换剂)可以基于关于基质以及关于附接的带电基团的各种材料。例如，可以使用以下基质，其中提到的材料或多或少地是交联的：基于琼脂糖的(诸如SEPHAROSETMCL-6B、SEPHAROSETMFastFlow和SEPHAROSETMHigh Performance)、基于纤维素的(诸如DEAE
Figure BDA0002622931220000401
)、基于葡聚糖的(诸如
Figure BDA0002622931220000402
)、基于二氧化硅的和基于合成聚合物的。
可以根据已知方法制备离子交换树脂。通常，在将包含多肽和一种或多种污染物的样品或组合物上样到树脂上之前，可以使允许树脂结合其抗衡离子的平衡缓冲液穿过离子交换树脂。便利地，平衡缓冲液可以与上样缓冲液相同，但这不是必需的。
在本发明的一个任选实施方案中，在洗脱多肽之后，可以用再生缓冲液使离子交换树脂再生，使得该柱可以重复使用。通常，再生缓冲液的盐浓度和/或pH可以使得基本上所有的污染物和目标多肽都从离子交换树脂上洗脱。通常，再生缓冲液具有极高的盐浓度，以便从离子交换树脂上洗脱污染物和多肽。
阴离子交换色谱法
本发明的实施方案包括，例如，提供芳基硫酸酯酶A(例如，重组芳基硫酸酯酶A)的样品，并且使该样品经受阴离子交换色谱法，例如本文所述的阴离子交换色谱法。对于阴离子交换树脂，与基质共价附接的带电基团可以是例如二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨乙基(QAE)和/或季铵(Q)。在一些实施方案中，采用的阴离子交换树脂是Q Sepharose柱。阴离子交换色谱法可以使用例如Q SEPHAROSETMFast Flow、Q SEPHAROSETMHigh Performance、QSEPHAROSETMXL、CAPTOTMQ、DEAE、TOYOPEARL
Figure BDA0002622931220000404
Q、
Figure BDA0002622931220000403
TMAE(三甲基氨基乙基、季铵树脂)、ESHMUNOTMQ、NUVIATMQ或UNOSPHERETMQ进行。在本发明的范围内可以使用其他阴离子交换剂，包括但不限于但不限于季胺树脂或“Q树脂”(例如，CAPTOTM-Q、Q–
Figure BDA0002622931220000412
QAE
Figure BDA0002622931220000411
)；二乙基氨基乙烷(DEAE)树脂(例如，DEAE–
Figure BDA0002622931220000414
DEAE
Figure BDA0002622931220000413
苯甲酰化萘基化DEAE、二乙基氨基乙基
Figure BDA0002622931220000416
)；
Figure BDA0002622931220000415
树脂；
Figure BDA0002622931220000417
树脂、
Figure BDA0002622931220000418
树脂(例如，
Figure BDA0002622931220000419
IRA–67、
Figure BDA00026229312200004111
强碱性、
Figure BDA00026229312200004112
弱碱性)、消胆胺树脂、Pro
Figure BDA00026229312200004110
树脂(例如，
Figure BDA00026229312200004115
SAX–10、
Figure BDA00026229312200004113
WAX–10、
Figure BDA00026229312200004114
WCX–10)、TSK–
Figure BDA00026229312200004116
树脂(例如，TSKgel DEAE–NPR；TSKgel DEAE–5PW)和
Figure BDA00026229312200004117
树脂。
在实施方案中，使用
Figure BDA00026229312200004118
TMAE(三甲基氨基乙基、季铵树脂)进行阴离子交换色谱法。
在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阴离子交换色谱法是在约23℃或更低、约18℃或更低或约16℃或更低，例如约23℃、约20℃、约18℃或约16℃的温度下进行的。
阴离子交换色谱法的典型流动相包含相对极性的溶液，诸如水、乙腈、有机醇(诸如甲醇、乙醇和异丙醇)，或含有2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)的溶液。因此，在某些实施方案中，流动相包含约0％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的极性溶液。在某些实施方案中，在分离过程中的任何给定时间，流动相包含约1％至约100％、约5％至约95％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％的极性溶液。
在某些实施方案中，以约23AU/L树脂或更低，例如约19AU/L树脂或更低、约15AU/L树脂或更低或约12AU/L树脂或更低，例如在约12AU/L树脂至约15AU/L树脂之间，或在约15AU/L树脂至约19AU/L树脂之间的结合能力将rhASA上样。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品以至少约4.5g/L树脂(例如，至少约5g/L树脂、6g/L树脂、7g/L树脂、8g/L树脂、9g/L树脂、10g/L树脂、11g/L树脂、12g/L树脂、13g/L树脂、14g/L树脂或15g/L树脂)的结合能力上样到阴离子交换色谱柱上。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品以范围在约4.5-20g/L树脂之间(例如，范围在约5-20g/L树脂；5-19g/L树脂、5-18g/L树脂、5-17g/L树脂、5-16g/L树脂、5-15g/L树脂、7.5-20g/L树脂、7.5-19g/L树脂、7.5-18g/L树脂、7.5-17g/L树脂、7.5-16g/L树脂、7.5-15g/L树脂、10-20g/L树脂、10-19g/L树脂、10-18g/L树脂、10-17g/L树脂、10-16g/L树脂或10-15g/L树脂之间)的结合能力上样到阴离子交换色谱柱上。
可以使用具有使得多肽和污染物结合至阴离子交换树脂的盐浓度和/或pH的上样缓冲液，将包含ASA和污染物的水溶液作为流动相上样到阴离子树脂上。然后可以用一或多个柱体积的上样缓冲液洗涤树脂，然后用一或多个柱体积的洗涤缓冲液洗涤，其中盐浓度增加。最后，可以用增加盐浓度的洗脱缓冲液洗脱ASA。任选地，也可以通过逐渐或逐步降低pH来介导酶的洗脱。可以收集具有ASA活性的级分并合并进行进一步纯化。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到阴离子交换色谱柱上是用上样缓冲液进行的。在一实施方案中，上样缓冲液不含氯化钠。在另一个实施方案中，上样缓冲液含有氯化钠。例如，上样缓冲液的氯化钠浓度为约1mM至约25mM，例如约1mM至约10mM、约1mM至约5mM或约5mM至约10mM。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度为梯度(例如，线性或非线性梯度)。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度是恒定的。在一些实施方案中，流动相中的盐浓度可以逐步增加或降低。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到阴离子交换色谱柱上是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。
在一些实施方案中，洗涤阴离子交换色谱柱是用一种或多种洗涤缓冲液进行的。例如，洗涤阴离子交换柱可以包括两个或更多个(例如，第一和第二)洗涤步骤，每个步骤使用不同的洗涤缓冲液。在一个实施方案中，洗涤缓冲液不含氯化钠。在另一个实施方案中，洗涤缓冲液含有氯化钠。例如，洗涤缓冲液的氯化钠浓度为约50mM至约200mM，例如约50mM至约150mM、约100mM至约200mM或约100mM至约150mM，例如约80mM、约100mM、约120mM或约140mM。在一些实施方案中，洗涤阴离子交换色谱柱是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。
在一个实施方案中，洗脱缓冲液含有磷酸钠。例如，洗脱缓冲液的磷酸钠浓度为约20mM至约50mM，例如约25mM至约45mM，例如约30mM、约35mM或约40mM。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液不含氯化钠。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液含有氯化钠。例如，洗脱缓冲液的氯化钠浓度为约200mM至约300mM，例如约240mM至约280mM。在一些实施方案中，从阴离子交换色谱柱上洗脱芳基硫酸酯酶A是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。
在一些实施方案中，从阴离子交换色谱柱上洗脱芳基硫酸酯酶A包括一个或多个洗脱峰收集步骤。例如，洗脱峰收集从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约50mAU，例如从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约200mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约100mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约200mAU，或者从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约100mAU，例如通过分光光度法例如在280nM下测定的。
对于本领域的普通技术人员显而易见的是，在上样、洗涤和洗脱步骤中可以使用许多不同的缓冲液。然而，通常可以用包含0.05M MES-Tris的缓冲液(pH 7.0)将柱洗涤1–10次来平衡该柱。为方便起见，可以在来自纯化过程上一步骤的缓冲液中对样品进行上样，或者可以使用上样缓冲液对样品进行上样。可以用1-10柱体积的用于平衡的缓冲液来洗涤该柱，然后用包含0.02MES-Tris、0.12M NaCl的洗涤缓冲液(pH 7.0)洗涤。可替代地，可以用本文所述的用于阴离子交换色谱法的任何其他平衡缓冲液、上样缓冲液和洗涤缓冲液对该柱进行平衡、上样和洗涤。可以在包含0.02MES-Tris、0.26M NaCl的缓冲液(pH 7.0)中洗脱样品。可替代地，可以在本文所述的用于阴离子交换色谱法的任何其他洗脱缓冲液中洗脱样品。
本文所述的上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液可以包括一种或多种缓冲剂。例如，缓冲剂可以是TRIS、HEPES、MOPS、PIPES、SSC、MES、磷酸钠、乙酸钠或它们的组合。缓冲剂的浓度在约1mM至约500mM之间，例如在约10mM至约250mM之间、在约20mM至约100mM之间、在约1mM至5mM之间、在约5mM至10mM之间、在约10mM至50mM之间，或在约50mM至约100mM之间，例如约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。
阴离子交换色谱法之后的收率、活性和纯度可有所不同。在一些实施方案中，芳基硫酸酯酶A的活性收率为至少约75％，例如至少约85％，例如在约85％至约99％之间，或在约90％至约99％之间。在一些实施方案中，例如通过分光光度法例如在280nm下测定的，蛋白质收率(AU或吸光度单位)为约10％至50％，例如约20％至约35％，或约25％至约30％。在一些实施方案(例如，使用如下所述的TMAE柱的那些实施方案)中，例如通过分光光度法例如在280nm下测定的，洗脱库蛋白活性收率(AU或吸光度单位)为约70％至400％，例如约80％至约390％，或约90％至约350％，或约100％至150％，大于至少95％。在一些实施方案(例如，使用如下所述的TMAE柱的那些实施方案)中，宿主细胞蛋白(HCP)对数减少值(LRV)在约0.5至约1.1之间，例如在约0.6至0.9之间，或在约0.7至0.8之间。在一些实施方案中(例如，使用如下所述的TMAE柱的那些实施方案)，例如通过毛细管电泳-SDS PAGE测定的，纯度为至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％或更高。在优选的实施方案中，阴离子交换色谱法之后的活性收率、HCP LRV和纯度(如通过毛细管电泳-SDS PAGE测定的)分别为至少约90％、至少约0.6和至少约80％。
在本发明的优选实施方案中，使用具有高上样容量的阴离子交换柱。在本发明的某些实施方案中，柱的特征在于上样范围在约3-20g/L之间(即，约5-15g/L、约10-15g/L、约10-20g/L)。在一些实施方案中，上样容量显著大于4.3g/L(例如，等于或大于约10g/L、12.5g/L、15g/L、17.5g/L或20g/L)。在某些实施方案中，树脂的结合能力在约75-100AU/L之间(例如，约75AU/L、约80AU/L、约85AU/L、约90AU/L、约95AU/L)。在某些实施方案中，上样容量大于约80AU/L。在一些实施方案中，高上样容量柱是TMAE柱。在特定的实施方案中，柱选自由以下组成的组：
Figure BDA0002622931220000441
TMAE柱、Nuvia Q柱、Q Sepharose Fast Flow柱、Capto Q柱、Q Sepharose XL柱、Eshmuno Q柱、UNOsphere Q柱或GigaCap Q柱。
在本发明的特定实施方案中，TMAE柱用pH为7.0的包含约20mM MES-Tris和1000mMNaCl的缓冲液预平衡。在某些实施方案中，该柱用pH为7.0的包含50mM MES-Tris的缓冲液平衡。在一些实施方案中，TMAE柱的上样流速为约75-125cm/小时(即，约75-115cm/小时、约75-110cm/小时、约75-105cm/小时、约75-100cm/小时、约85-115cm/小时、约85-110cm/小时、约85-105cm/小时、约85-100cm/小时、约95-115cm/小时、约95-110cm/小时、约95-105cm/小时、约95-100cm/小时、约100-120cm/小时、约100-115cm/小时、约100-110cm/小时、约100cm/小时)。如本文所述，可以通过A280吸光度来优化和评估上样条件。
在利用TMAE柱(例如，Fractogel TMAE柱)的特定实施方案中，即使在大于15g/L的上样容量，上样过程中流过物中损失的产物也很少。能够在最小化流过物损失的同时增加上样容量是纯化方法的重大改进。在本发明的特定实施方案中，流过产物损失的量小于上样量的30％(例如，小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％)。
上样后，在一些实施方案中，将TMAE柱至少洗涤一次。在特定的实施方案中，将该柱洗涤两次。第一洗涤缓冲液或第二洗涤缓冲液可包含优化水平的氯化钠。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液或第二洗涤缓冲液中氯化钠的量在约50-150mM之间(例如约50-140mM、约50-130mM、约50-120mM、约50-110mM、约50-100mM、约50-90mM、约50-80mM、约80-150mM、约80-140mM、约80-130mM、约80-120mM、约80-110mM、约80-100mM、约80-90mM、约80mM或约120mM)。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液包含50mM MES-Tris，pH为7.0。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含20mM MES-Tris、100mM NaCl，pH为7.0。洗涤条件，特别是第二洗涤条件的进一步优化涵盖在本发明的实施方案中。例如，增加第二次洗涤的盐浓度可以改善宿主细胞蛋白(HCP)的对数减少值(LRV)和总体纯度，但会同时降低活性和A280收率。如本文所述，特定的洗涤条件必须与下述洗脱条件相平衡，以便提供纯度、活性和收率的最佳组合。
在本发明的实施方案中，用洗脱缓冲液洗脱结合至TMAE柱的重组ASA。在一些实施方案中，优化洗脱缓冲液中氯化钠的量。在特定实施方案中，洗脱缓冲液中氯化钠的量在约150-300mM之间(例如约150-290mM、约150-280mM、约150-270mM、约150-260mM、约150-250mM、约150-240mM、约150-230mM、约150-220mM、约150-210mM、约170-290mM、约170-280mM、约170-270mM、约170-260mM、约170-250mM、约170-240mM、约170-230mM、约170-220mM、约170-210mM about 180-290mM、约180-280mM、约180-270mM、约180-260mM、约180-250mM、约180-240mM、约180-230mM、约180-220mM、约180-210mM、约180mM、约220mM或约260mM)。在特定的实例中，洗脱缓冲液包含50mM MES-Tris和1M NaCl，pH为7.0。在一些实施方案中，洗脱后的A280收率大于上样量的60％(例如，约60％、约70％、约80％或更高)。洗脱条件的进一步优化涵盖在本发明的实施方案中。例如，增加洗脱盐浓度(即电导率)可提供更佳收率，但会导致较差的纯度和HCP去除。并且如上所述，特定的洗涤条件必须与洗脱条件，以便提供纯度、活性和收率的最佳组合。
阳离子交换色谱法
在一些实施方案中，该方法还包括使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法，例如，如本文所述的磺丙基(SP)阳离子交换色谱法。在一些实施方案中，芳基硫酸酯酶A样品在阳离子交换色谱法之前经受阴离子交换色谱法。在典型的实施方案中，阳离子交换色谱法包括磺丙基(SP)阳离子交换色谱法，但是可以使用其他阳离子色谱膜或树脂，例如MUSTANGTMS膜、S-SEPHAROSETM树脂或Blue SEPHAROSETM树脂。在一些实施方案中，该方法还包括例如通过超滤和/或渗滤，例如通过切向流超滤，浓缩和/或过滤芳基硫酸酯酶A样品。阳离子交换色谱法可以在最佳温度下进行，例如，如本文所述，以增强靶标结合和/或降低杂质结合。例如，阳离子交换色谱法可以在约23℃、18℃、16℃或更低的温度下进行。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱法包括磺丙基(SP)阳离子交换色谱法。在另一个实施方案中，阳离子交换色谱法是精制步骤。阳离子交换色谱法(例如磺丙基(SP)阳离子交换色谱法)可以使用例如以下的一种或多种进行：
Figure BDA0002622931220000461
SP-650、
Figure BDA0002622931220000462
SP-550、
Figure BDA0002622931220000463
SP-3PW、
Figure BDA0002622931220000464
SP-5PW、SP SEPHAROSETMFastFlow、SP SEPHAROSETMHigh Performance、SP SEPHAROSETMXL、
Figure BDA0002622931220000465
S膜、
Figure BDA0002622931220000466
HS50、UNOSPHERETMS和MACROCAPTMS。
可以使用具有使得多肽和污染物结合至阳离子交换树脂的盐浓度和/或pH的上样缓冲液，将包含芳基硫酸酯酶A和污染物的水溶液上样到阳离子树脂上。然后可以用一个或多个柱体积的平衡缓冲液或上样缓冲液洗涤树脂，然后任选地用一个或多个柱体积的洗涤缓冲液洗涤，其中盐浓度增加。最后，可以在洗脱缓冲液中洗脱芳基硫酸酯酶A。可以收集具有芳基硫酸酯酶A活性的级分并合并进行进一步纯化。
在典型的实施方案中，例如，如本文所述，可以优化上样缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液的NaCl浓度和/或pH，以增强靶标结合和/或降低杂质结合。在一些实施方案中，上样缓冲液中的NaCl浓度为约20mM、15mM、10mM或更低。在一些实施方案中，上样缓冲液的pH为约4.5、4.3、4.0或更低。在一些实施方案中，洗涤缓冲液中的NaCl浓度为约20mM、15mM、10mM或更低。在一些实施方案中，洗脱缓冲液中的NaCl浓度为约55mM、50mM、45mM、40mM或更低。
在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法包括：将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子色谱柱(例如，磺丙基(SP)阳离子交换柱)上，洗涤该阳离子交换色谱柱，并将芳基硫酸酯酶A从柱上洗脱。在一些实施方案中，可以用超过3个柱体积，例如5至10个柱体积的0.01M NaAc、0.01M NaCl、0.03M乙酸(pH 4.2)平衡所述柱。
在一些实施方案中，可以在来自纯化过程上一步骤的缓冲液中对样品进行上样，或者可以使用上样缓冲液对样品进行上样。在一个实施方案中，上样缓冲液含有氯化钠。例如，上样缓冲液的氯化钠浓度为约1mM至约25mM，例如约5mM至约20mM，例如约5mM、约10mM、约15mM或约20mM。在另一个实施方案中，上样缓冲液含有乙酸钠。例如，上样缓冲液的乙酸钠浓度为约10mM至约100mM，例如约20mM、约40mM或约60mM。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在约3.0至约6.0，例如约4.0至约5.0，例如约4.0、约4.3或约4.5的pH下进行的。在一些实施方案中，以约15AU/L树脂或更低，例如约14AU/L树脂或更低，或约12AU/L树脂或更低，例如在约10AU/L树脂至约14AU/L树脂之间，或在约10AU/L树脂至约12AU/L树脂之间的结合能力，将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上。
在一些实施方案中，洗涤阳离子交换色谱柱是用一种或多种洗涤缓冲液进行的。例如，洗涤阳离子交换柱可以包括两个或更多个(例如，第一和第二)洗涤步骤，每个步骤使用不同的洗涤缓冲液。可以用1-10个柱体积的用于平衡的缓冲液洗涤该柱。可替代地，可以用本文所述的用于阳离子交换色谱法的任何其他平衡缓冲液、上样缓冲液和洗涤缓冲液对该柱进行平衡、上样和洗涤。在一个实施方案中，洗涤缓冲液含有氯化钠。例如，洗涤缓冲液的氯化钠浓度为约1mM至约25mM，例如约5mM至约20mM，或约10mM至约15mM，例如约5mM、约10mM、约15mM或约20mM。在另一个实施方案中，洗涤缓冲液含有乙酸钠。例如，上样缓冲液的乙酸钠浓度为约10mM至约100mM，例如约20mM、约40mM或约60mM。在一些实施方案中，洗涤阳离子交换色谱柱是在约3.0至约6.0，例如约4.0至约5.0，例如约4.0、约4.3或约4.5的pH下进行的。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A从阳离子交换色谱柱洗脱是用洗脱缓冲液进行的。在一个实施方案中，洗脱缓冲液含有氯化钠。例如，洗脱缓冲液的氯化钠浓度为约25mM至约75mM，例如约45mM至约60mM，例如约45mM、约50mM、约55mM或约55mM。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A从阳离子交换色谱柱上洗脱是在约3.0至约6.0，例如约4.0至约5.0，例如约4.0、约4.3或约4.5的pH下进行的。因此，作为一个特定的实例，可以在包含pH4.5的的0.02M NaAc、0.05M NaCl的缓冲液中洗脱样品。可替代地，可以在本文所述的用于阳离子交换色谱法的任何其他洗脱缓冲液中洗脱样品。
在一些实施方案中，从阳离子交换色谱柱上洗脱芳基硫酸酯酶A包括一个或多个洗脱峰收集步骤。例如，洗脱峰收集从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约50mAU，例如从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约200mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约100mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约200mAU，或者从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约100mAU，例如通过分光光度法例如在280nM下测定的。可以将收集的洗脱峰合并。
本文所述的上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液可以包括一种或多种缓冲剂。例如，缓冲剂可以是TRIS、HEPES、MOPS、PIPES、SSC、MES、磷酸钠、乙酸钠或它们的组合。缓冲剂的浓度在约1mM至约500mM之间，例如在约10mM至约250mM之间、在约20mM至约100mM之间、在约1mM至5mM之间、在约5mM至10mM之间、在约10mM至50mM之间，或在约50mM至约100mM之间，例如约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。
在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约23℃或更低、约18℃或更低或约16℃或更低，例如约23℃、约20℃、约18℃或约16℃的温度下进行的。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约23℃至约16℃之间，例如在约23℃、约20℃、约18℃或约16℃下进行的，并且将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在约4.5至约4.3之间，例如在约4.5、约4.4或约4.3的pH下进行的。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约23℃下进行的，并且将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在pH为约4.5时进行的。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约23℃下进行的，并且将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在pH为约4.3时进行的。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约18℃下进行的，并且将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在pH为约4.5时进行的。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受阳离子交换色谱法是在约18℃下进行的，并且将芳基硫酸酯酶A样品上样到阳离子交换色谱柱上是在pH为约4.3时进行的。
阳离子交换色谱法之后的收率可有所不同。在一些实施方案中，芳基硫酸酯酶A的活性收率为至少约75％，例如至少约80％，例如在约80％至约105％之间。在一些实施方案中，例如通过分光光度法例如在280nm下测定的，蛋白质收率(AU或吸光度单位)为约65％至100％，例如约70％至约95％。
阳离子交换色谱法之后的纯度和活性大大提高。在一些实施方案中，宿主细胞蛋白(HCP)对数减少值(LRV)在约1.0至约2.5之间，例如在约1.5至约2.0之间或在约1.7至约1.9之间。例如通过本文所述的方法测定的，纯化的芳基硫酸酯酶A的比活性可以为至少约50U/mg至约140U/mg，例如至少约70U/mg、至少约90U/mg、至少约100U/mg或至少约120U/mg。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A纯化到至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％。芳基硫酸酯酶A的纯度可以通过例如以下的一种或多种来测量：宿主细胞蛋白(HCP)蛋白质印迹(Westernblot)、SDS-PAGE考马斯染色、SDS-PAGE银染色、反相HPLC和尺寸排阻HPLC。在某些实施方案中，降低上样缓冲液的盐浓度并降低其pH可增强ASA与阳离子交换柱的结合，但不影响杂质结合。换句话说，如上所述，盐浓度和pH的最佳平衡可以增加阳离子交换色谱法之后的收率，而不会对纯度产生不利影响。
在一些实施方案中，可以调节阳离子交换洗脱液库的pH。在某些实施方案中，在病毒过滤之前立即调节pH。可以使用包含0.25M磷酸钠、1.33M氯化钠、0.34M柠檬酸钠的pH调节缓冲液(pH 7.0)将阳离子交换洗脱液(例如，SP洗脱液)的pH调节至约5.5、约6.0、约6.5或约7.0。在某些实施方案中，将经过pH调节的SP洗脱液库在Planova 20N滤器上进行病毒过滤。在某些实施方案中，经过pH调节的阳离子交换洗脱液进行病毒过滤后，相对于输入的收率为约90％-100％；即，通过A280吸光度评估，为约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。病毒过滤的收率非常重要，因为它验证了将pH调节至约6.0允许ASA八聚体(直径为约20nm)离解为二聚体形式。因此，可以选择病毒过滤器的孔径以确保仅过滤二聚体形式(即，八聚体形式可以被过滤器保留，或引起病毒过滤器堵塞)。例如，孔径为20nm的病毒过滤器将保留ASA的八聚体形式，而不保留二聚体形式。
混合模式色谱法
本文所述的纯化方法可包括混合模式色谱法的一个或多个步骤。混合模式色谱法是一种类型的色谱法，其中通常在液相色谱法中应用几种分离模式来分解不同分子的混合物。例如，混合模式分离可以同时包括具有离子交换和反相特征的组合相。这些具有一种以上相互作用类型的固定相，可从几家色谱柱制造商处获得。
在一个方面，本公开特征在于一种从样品中纯化芳基硫酸酯酶A的方法，其中该方法包括例如提供芳基硫酸酯酶A(例如，重组芳基硫酸酯酶A)的样品，并且使芳基硫酸酯酶A样品经受混合模式色谱法，例如本文所述的混合模式色谱法，诸如包括陶瓷羟磷灰石(HA)色谱法(例如羟磷灰石I型或II型色谱法)的方法。在一些实施方案中，混合模式色谱法使用以下的一种或多种进行：CHTTM陶瓷羟磷灰石I型介质、CHTTM陶瓷羟磷灰石II型介质、BIO-
Figure BDA0002622931220000491
HT羟磷灰石和BIO-
Figure BDA0002622931220000492
HTP羟磷灰石。
在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受混合模式色谱法包括：将芳基硫酸酯酶A样品上样到混合模式色谱柱上(例如，HA色谱法)，洗涤混合模式色谱柱，并将芳基硫酸酯酶A从柱上洗脱。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受混合模式交换色谱法是在约23℃或更低、约18℃或更低或约16℃或更低，例如约23℃、约20℃、约18℃或约16℃的温度下进行的。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到混合模式色谱柱上是用上样缓冲液进行的。在一个实施方案中，上样缓冲液含有磷酸钠。例如，上样缓冲液的磷酸钠浓度为约1mM至约10mM，例如约1mM至约5mM、约5mM至约10mM，例如约1mM、约2mM或约5mM。在另一个实施方案中，上样缓冲液含有氯化钠。例如，上样缓冲液的氯化钠浓度为约100mM至约400mM，例如约200mM至约300mM，例如约220mM、约240mM、约260mM或约280mM。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到混合模式色谱柱上是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。
在一些实施方案中，混合模式色谱法包括陶瓷羟磷灰石(HA)色谱法。羟磷灰石(HAP)通常是指磷酸钙的结晶形式。HAP的机理涉及带负电荷的蛋白质羧基与树脂上带正电荷的钙离子之间的非特异性相互作用，以及带正电荷的蛋白质氨基基团与树脂上带负电荷的磷酸根离子之间的非特异性相互作用。通过调节缓冲液的pH值，可以选择性地将碱性或酸性蛋白质吸附到柱上；可以通过改变缓冲液的盐浓度来实现洗脱。同样，显然可以采用许多缓冲液组合物以及缓冲液的组合。然而，通常可以用包含0.001M NaPO4、0.02M MES-Tris、0.26M NaCl的缓冲液(pH 7.0)将柱洗涤1–10次来平衡该柱。为方便起见，可以在来自纯化过程上一步骤的缓冲液中对样品进行上样，或者可以使用上样缓冲液对样品进行上样。可以用1-10柱体积的用于平衡的缓冲液来洗涤该柱，然后用包含0.005M NaPO4、0.02MMES-Tris、0.26M NaCl的洗涤缓冲液(pH 7.0)洗涤。可替代地，可以用本文所述的用于混合模式色谱法的任何其他平衡缓冲液、上样缓冲液和洗涤缓冲液对该柱进行平衡、上样和洗涤。可以在包含0.04M NaPO4的缓冲液(pH 7.0)中洗脱样品。任选地，可以通过用1-10个柱体积的0.4M NaPO4(pH 12)进行洗涤来对柱进行汽提。可替代地，可以在本文所述的用于混合模式色谱法的任何其他洗脱缓冲液中洗脱样品。
在一些实施方案中，洗涤混合模式色谱柱是用一种或多种洗涤缓冲液进行的。例如，洗涤混合模式色谱柱可以包括两个或更多个(例如，第一和第二)洗涤步骤，每个步骤使用不同的洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，洗涤缓冲液含有磷酸钠。例如，洗涤缓冲液的磷酸钠浓度为约1mM至约10mM，例如约1mM至约5mM、约5mM至约10mM，例如约1mM、约5mM或约10mM。在另一个实施方案中，洗涤缓冲液含有氯化钠。例如，洗涤缓冲液的氯化钠浓度为约50mM至约600mM，例如约100mM至约500mM，或约200mM至约400mM，例如约220mM、约240mM、约260mM或约280mM。
在一些实施方案中，洗涤混合模式色谱柱是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。
在一些实施方案中，从混合模式色谱柱上洗脱芳基硫酸酯酶A是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。在一些实施方案中，从混合模式色谱柱上洗脱芳基硫酸酯酶A包括一个或多个洗脱峰收集步骤。例如，洗脱峰收集从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约50mAU，例如从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约200mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约100mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约200mAU，或者从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约100mAU，例如通过分光光度法例如在280nM下测定的。
本文所述的上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液可以包括一种或多种缓冲剂。例如，缓冲剂可以是TRIS、HEPES、MOPS、PIPES、SSC、MES、磷酸钠、乙酸钠或它们的组合。缓冲剂的浓度在约1mM至约500mM之间，例如在约10mM至约250mM之间、在约20mM至约100mM之间、在约1mM至5mM之间、在约5mM至10mM之间、在约10mM至50mM之间，或在约50mM至约100mM之间，例如约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。
在一些实施方案中，通过混合模式色谱法纯化ASA成功通过离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法)纯化。然而，可以预期，这些步骤可以按相反的顺序进行。
混合模式色谱法之后的收率可有所不同。在一些实施方案中，芳基硫酸酯酶A的活性收率为至少约80％，例如至少约90％，例如在约80％至约115％之间。在一些实施方案中，例如通过分光光度法例如在280nm下测定的，蛋白质收率(AU或吸光度单位)为约30％至80％，例如约35％至约75％，或约50％至约70％。
混合模式色谱法之后的纯度大大提高。在一些实施方案中，例如通过本文所述的方法测定的，纯化的芳基硫酸酯酶A的比活性为至少约50U/mg至约140U/mg，例如至少约70U/mg、至少约90U/mg、至少约100U/mg或至少约120U/mg。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A纯化到至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％。芳基硫酸酯酶A的纯度可以通过例如以下的一种或多种来测量：宿主细胞蛋白(HCP)蛋白质印迹(Western blot)、SDS-PAGE考马斯染色、SDS-PAGE银染色、反相HPLC和尺寸排阻HPLC。在一些实施方案中，宿主细胞蛋白(HCP)的对数减少值(LRV)在约0.3至约0.6之间，例如在约0.4至0.5之间。
疏水相互作用色谱法(HIC)
本文所述的纯化方法可包括使芳基硫酸酯酶A样品经受疏水相互作用色谱法(HIC)。在一个实施方案中，疏水相互作用色谱法包括苯基色谱法。在其他实施方案中，疏水相互作用色谱法包括丁基色谱法或辛基色谱法。在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受HIC是在约23℃或更低、约18℃或更低或约16℃或更低，例如约23℃、约20℃、约18℃或约16℃的温度下进行的。在一些实施方案中，在HIC之前使芳基硫酸酯酶A样品经受混合模式色谱法。
疏水相互作用色谱法利用给定分子对极性或非极性环境的吸引力，并且就蛋白质而言，这种倾向受蛋白质暴露的外表面上的残基的疏水性或亲水性控制。因此，根据蛋白质对疏水性基质(通常是具有链长为2-18个碳的烷基接头的惰性支持体)的不同吸引程度，对蛋白质进行分级分离。固定相由附接在亲水性聚合物主链(例如，交联的SepharoseTM、葡聚糖或琼脂糖)上的小的非极性基团(丁基、辛基或苯基)组成。因此，HIC柱通常是丁基SEPHAROSETM柱或苯基SEPHAROSETM柱，最典型的是苯基SEPHAROSETM柱。
在一些实施方案中，疏水相互作用色谱法包括使用苯基SEPHAROSETM高性能、苯基SEPHAROSETM6Fast Flow(低取代)或苯基SEPHAROSETM6Fast Flow(高取代)中的一种或多种的苯基色谱法。
在一些实施方案中，使芳基硫酸酯酶A样品经受疏水相互作用色谱法包括：将芳基硫酸酯酶A样品上样到HIC柱上，洗涤HIC柱，并从柱上洗脱芳基硫酸酯酶A。HIC中的上样、洗涤和洗脱基本遵循与上述离子交换色谱法相同的原理，但通常采用与离子交换色谱法中所用的那些条件几乎相反的条件。因此，HIC过程涉及使用高盐上样缓冲液，该缓冲液可解开蛋白质以暴露疏水位点。蛋白质被疏水配体保留在柱上，并暴露于含有递减盐浓度的梯度缓冲液中。随着盐浓度的降低，蛋白质恢复其天然构象，最终从柱上洗脱下来。可替代地，蛋白质可以用PEG洗脱。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到HIC柱上是用上样缓冲液进行的。在一个实施方案中，上样缓冲液含有氯化钠。例如，上样缓冲液的氯化钠浓度为约0.5M至约2.5M，例如约1M或约1.5M。在另一个实施方案中，上样缓冲液含有磷酸钠。例如，上样缓冲液的磷酸钠浓度为约10mM至约100mM，例如约25mM、约50mM或约75mM。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A样品上样到HIC柱上是在约5至约7，例如约5.5至约6.5，例如约5.5、约6.0或约6.5的pH下进行的。在一些实施方案中，以约12AU/L树脂或更低，例如约10AU/L树脂或更低、约9AU/L树脂或更低、约7AU/L树脂或更低或约5AU/L树脂或更低，例如在约5AU/L树脂至约9AU/L树脂之间，或在约5AU/L树脂至约7AU/L树脂之间的结合能力将芳基硫酸酯酶A样品上样到HIC柱。
使用苯基SEPHAROSETM作为HIC中的固相在本公开中是典型的。同样，显而易见的是，当涉及到确切条件以及用于上样、洗涤和洗脱过程的缓冲液和缓冲液的组合时，存在许多不同的可能性。在典型的实施方案中，可以在含有0.05M NaPO4、1M NaCl(pH 5.5)的缓冲液中对柱进行平衡。为方便起见，可以在来自纯化过程上一步骤的缓冲液中对样品进行上样，或者可以使用上样缓冲液对样品进行上样。
在一些实施方案中，洗涤HIC柱是用一种或多种洗涤缓冲液进行的。例如，洗涤HIC柱可以包括两个或更多个(例如，第一和第二)洗涤步骤，每个步骤使用不同的洗涤缓冲液。在一些实施方案中，洗涤缓冲液含有氯化钠。例如，洗涤缓冲液的氯化钠浓度为约100mM至约1.5M，例如约250mM至约1M，例如约250mM、约500mM、约750mM或约1M。在另一个实施方案中，洗涤缓冲液含有磷酸钠。例如，上样缓冲液的磷酸钠浓度为约10mM至约100mM，例如约25mM、约50mM或约75mM。在一些实施方案中，洗涤HIC柱是在约5至约7，例如约5.5至约6.5，例如约5.5、约6.0或约6.5的pH下进行的。例如，洗涤可以通过用平衡缓冲液进行1-2次柱洗涤，然后用1-5倍柱体积的0.02M MES、0.05M NaPO4、0.5M NaCl(pH5.5)进行。可替代地，可以用本文所述的用于HIC的任何其他平衡缓冲液、上样缓冲液和洗涤缓冲液对该柱进行平衡、上样和洗涤。
在一些实施方案中，从HIC柱上洗脱芳基硫酸酯酶A是用洗脱缓冲液进行的。在一些实施方案中，洗脱缓冲液含有氯化钠。例如，洗脱缓冲液的氯化钠浓度为约30mM至约100mM，例如约45mM至约85mM，例如约50mM、约60mM、约70mM或约80mM。在一些实施方案中，从HIC柱上洗脱芳基硫酸酯酶A是在约5至约9，例如约6至约8，例如约7的pH下进行的。例如，可以使用0.02M MES-Tris、0.06M NaCl(pH 7.0)洗脱芳基硫酸酯酶A。可替代地，可以在本文所述的用于HIC的任何其他洗脱缓冲液中洗脱样品。
在一些实施方案中，从HIC柱上洗脱芳基硫酸酯酶A包括一个或多个洗脱峰收集步骤。例如，洗脱峰收集从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约50mAU，例如从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约200mAU开始到下降侧的约50mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约100mAU，从上升侧的约50mAU开始到下降侧的约200mAU，或者从上升侧的约100mAU开始到下降侧的约100mAU，例如通过分光光度法例如在280nM下测定的。
在一些实施方案中，通过HIC纯化芳基硫酸酯酶A成功通过离子交换色谱法(例如，阴离子交换色谱法)和/或混合模式色谱法纯化。然而，可以预期，这些步骤可以按相反的顺序进行。
本文所述的上样缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液可以包括一种或多种缓冲剂。例如，缓冲剂可以是TRIS、HEPES、MOPS、PIPES、SSC、MES、磷酸钠、乙酸钠或它们的组合。缓冲剂的浓度在约1mM至约500mM之间，例如在约10mM至约250mM之间、在约20mM至约100mM之间、在约1mM至5mM之间、在约5mM至10mM之间、在约10mM至50mM之间，或在约50mM至约100mM之间，例如约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM。
HIC之后的收率可有所不同。在一些实施方案中，芳基硫酸酯酶A的活性收率为至少约60％，例如至少约70％，例如在约70％至约100％之间。在一些实施方案中，例如通过分光光度法例如在280nm下测定的，蛋白质收率(AU或吸光度单位)为约45％至100％，例如约50％至约95％，或约55％至约90％。
HIC之后的纯度大大提高。在一些实施方案中，例如通过本文所述的方法测定的，纯化的芳基硫酸酯酶A的比活性为至少约50U/mg至约140U/mg，例如至少约70U/mg、至少约90U/mg、至少约100U/mg或至少约120U/mg。
在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A纯化到至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％。芳基硫酸酯酶A的纯度可以通过例如以下的一种或多种来测量：宿主细胞蛋白(HCP)蛋白质印迹(Western blot)、SDS-PAGE考马斯染色、SDS-PAGE银染色、反相HPLC和尺寸排阻HPLC。在一些实施方案中，宿主细胞蛋白(HCP)的对数减少值(LRV)在约0.6至约1.2之间，例如在约0.7至0.95之间。
超滤/渗滤
本文所述的纯化方法可以包括下游超滤和/或渗滤的一个或多个步骤。在一些实施方案中，该方法还包括例如通过超滤和/或渗滤，例如通过切向流超滤，浓缩和/或过滤芳基硫酸酯酶A样品。
超滤是指由压力梯度驱动的膜分离过程，其中膜根据其溶剂化的大小和结构将液体的组分分级。渗滤是一种特殊类型的超滤过程，其中将截留物用水稀释并重新超滤，以降低可溶性渗透物组分的浓度并进一步增加保留组分的浓度。通常将超滤与渗滤组合到超滤/渗滤(UFDF)纯化步骤中。
本发明的实施方案利用至少一个、至少两个、至少三个或更多个下游UFDF纯化步骤。UFDF步骤(例如UFDFDF)内可发生一次或多次渗滤。在一些实施方案中，通过分光光度法例如在280nm下测定的，相对于来自之前纯化步骤的量，下游UFDF之后的蛋白质收率(AU或吸光度单位)为约90％至105％，例如约95％至约100％，例如约97％至约99％。在一些实施方案中，UFDF期间基本上没有蛋白质损失。
在本发明的一些实施方案中，通过尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)和/或反相-高效液相色谱(RP-HPLC)测定的，下游UFDF产生的rASA纯度为至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高。在一些实施方案中，将芳基硫酸酯酶A纯化到至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％或至少约99.9％。芳基硫酸酯酶A的纯度可以通过例如以下的一种或多种来测量：宿主细胞蛋白(HCP)蛋白质印迹(Western blot)、SDS-PAGE考马斯染色、SDS-PAGE银染色、反相HPLC和尺寸排阻HPLC。例如通过如下所述的硫酸酯酶释放测定法测定的，rASA的比活性为至少约60U/mg至约100U/mg，例如至少约65U/mg、至少约90U/mg、至少约70U/mg或至少约90U/mg。
在一些实施方案中，通过切向流过滤，在酸性环境中根据污染物的大小将芳基硫酸酯酶A与污染物分离，从而纯化芳基硫酸酯酶A。芳基硫酸酯酶A在低pH值下形成八聚体，其理论分子量为480kDa，因此将被相对开放的膜保留，而大部分污染物将通过该膜(Sommerlade等人，(1994)Biochem.J.,297；123-130；Schmidt等人，(1995)Cell,82 271-278；Lukatela等人，(1998)Biochemistry,37,3654-3664)。
在典型的实施方案中，渗滤缓冲液包含0.01M柠檬酸磷酸钠、0.137M NaCl(pH6.0)。
在一些实施方案中，由于该过程的起始物料是在该过程的上一步骤中从色谱柱上洗脱的芳基硫酸酯酶A的悬浮液，因此通过添加0.2-1M pH 4.5的乙酸钠将该悬浮液中的pH调节至4-5。然后以本领域技术人员熟知的方式用1-10倍缓冲体积的pH 4.0-5.5的乙酸钠进行渗滤。过滤可以采用几种标称重量截止值在20-450kDa范围内的不同过滤器类型进行，但是通常使用截止值在100-300kDa范围内的过滤器。为了进一步处理含有芳基硫酸酯酶A的溶液，通过添加Tris-碱将pH调节至7-8范围内的值，使其终浓度为大约20-50mM。
作为上述酸性切向流过滤的替代方法，可以使用基本上相同的条件和缓冲液组成，通过酸性凝胶过滤从污染物中分离ASA。过滤在低pH下通过凝胶过滤柱进行，该柱已在低pH的溶液(例如，0.2-0.9M pH 4-5的乙酸钠溶液)中进行了平衡。作为一种选择，可以通过在凝胶过滤之前通过20-50kDa的过滤器进行切向流过滤来浓缩芳基硫酸酯酶A的溶液。浓缩程度可有很大变化，使得芳基硫酸酯酶A可从约0.1mg/ml浓缩至约50mg/ml，优选浓缩至约5mg/ml。
在一些实施方案中，用30kDa的Biomax A筛浓缩样品库。渗滤通过用20mM乙酸钠(pH 5.4-5.7)进行3-5次柱洗涤进行。
在实施方案中，在冷藏之前，将表面活性剂诸如聚山梨醇酯-20(P20)添加到包含纯化的ASA蛋白的组合物中。在实施方案中，组合物包含浓度为约0.0001％(v/v)至约0.01％(v/v)、约0.001％(v/v)至约0.01％(v/v)、约0.001％(v/v)、约0.002％(v/v)、约0.003％(v/v)、约0.004％(v/v)、约0.005％(v/v)、约0.006％(v/v)、约0.007％(v/v)、约0.008％(v/v)、约0.009％(v/v)或约0.01％(v/v)的表面活性剂诸如P20。
纯化的ASA蛋白的表征
可使用各种方法来表征纯化的重组ASA蛋白。
纯度
纯化的重组ASA蛋白的纯度通常通过终产物中存在的各种杂质(例如，宿主细胞蛋白或宿主细胞DNA)的水平来测量。
例如，可通过ELISA或SDS-PAGE测量宿主细胞蛋白(HCP)的水平。在一些实施方案中，纯化的重组ASA蛋白含有少于150ng HCP/mg ASA蛋白(例如，少于140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、30、20、10ng HCP/mg ASA蛋白)。在实施方案中，纯化的重组ASA蛋白含有少于约100、约80或约60ng HCP/mg ASA。
在一些实施方案中，纯化的重组ASA蛋白含有少于约150pg/mg、140pg/mg、130pg/mg、120pg/mg、110pg/mg、100pg/mg、90pg/mg、80pg/mg、70pg/mg、60pg/mg、50pg/mg、40pg/mg、30pg/mg、20pg/mg或10pg/mg宿主细胞DNA(HCD)。在实施方案中，纯化的重组ASA蛋白含有小于约50、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1pg HCD/mg ASA蛋白。
在一些实施方案中，纯化的重组ASA蛋白在经受考马斯亮蓝染色SDS-PAGE时不具有强度大于0.05％、0.01％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％测定对照的新条带。
在一些实施方案中，纯化的重组ASA蛋白在经受针对HCP的蛋白质印迹SDS-PAGE时不具有强度大于15kDa HCP条带测定对照的条带，并且不具有强度大于0.05％、0.01％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％或1.0％测定对照的新条带。在实施方案中，检测到不超过三个HCP条带。
在一些实施方案中，纯化的重组ASA蛋白在经受银染色SDS-PAGE时不具有强度大于0.05％、0.01％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％测定对照的新条带。
在一些实施方案中，宿主细胞蛋白(HCP)的对数减少值(LRV)在约0.3至约0.6之间，例如在约0.4至0.5之间。可使用各种测定对照，特别是监管机构诸如FDA可接受的那些测定对照。
还可通过尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)、毛细管电泳-SDS PAGE(CE-SDS PAGE)和/或反相-高效色谱(RP-HPLC)中的一种或多种来测定纯化的重组ASA蛋白的纯度(例如，使用十八烷基(C18)键合的二氧化硅柱，并在酸性pH下以TFA作为抗衡离子进行)。在本发明的一些实施方案中，色谱图中的主峰是ASA。可改变或优化以提高分离度的参数包括梯度条件、有机改性剂、抗衡离子、温度、柱孔径和粒径、溶剂组成和流速。如本领域技术人员已知的，可通过主峰百分比来识别纯度水平。例如，可通过对观察到的主峰和侧峰进行积分并计算主峰占总面积的百分比来确定纯度。
在本发明的一些实施方案中，通过本文公开的方法纯化并由SEC-HPLC的主峰百分比确定的ASA的纯度大于或等于95％(例如，约96％、约97％、约98％、约99％或更高)。在本发明的一些实施方案中，通过本文公开的方法纯化并由SEC-HPLC的主峰百分比确定的ASA的纯度大于或等于97％(例如，约97％、约98％、约99％或更高)。
在本发明的一些实施方案中，通过本文公开的方法纯化并由RP-HPLC的主峰百分比确定的ASA的纯度大于或等于97％(即，约97％、约98％、约99％或更高)。在本发明的一些实施方案中，通过本文公开的方法纯化并由RP-HPLC的主峰百分比确定的ASA的纯度大于或等于98％(即，约98％、约99％或更高)。
比活性
还可通过评估功能和/或生物活性来表征纯化的重组ASA蛋白。可使用本领域已知的方法来确定重组ASA组合物的酶活性。通常，这些方法包括检测从合成底物中去除硫酸盐，这被称为硫酸盐释放测定。酶活性测定的一个实例涉及使用离子色谱法。该方法对通过重组ASA从底物酶促释放的硫酸根离子的量进行定量。底物可以是天然底物或合成底物。在一些情况下，底物是硫酸肝素、硫酸皮肤素或它们的功能等同物。通常，通过具有电导检测器的离子色谱法分析释放的硫酸根离子。在该实例中，结果可被表示为U/mg蛋白质，其中1单位被定义为每小时从底物释放1μmol硫酸根离子所需的酶量。在一些实施方案中，纯化的重组ASA的比活性为至少约50U/mg、60U/mg、70U/mg、80U/mg、90U/mg、100U/mg、110U/mg、120U/mg、130U/mg、140U/mg。在一些实施方案中，纯化的重组ASA的比活性在约50-200U/mg(例如，约50-190U/mg、50-180U/mg、50-170U/mg、50-160U/mg、50-150U/mg、50-140U/mg、50-130U/mg、50-120U/mg、50-110U/mg、50-100U/mg、60-200U/mg、60-190U/mg、60-180U/mg、60-170U/mg、60-160U/mg、60-150U/mg、60-140U/mg、60-130U/mg、60-120U/mg、60-110U/mg、60-100U/mg、70-200U/mg、70-190U/mg、70-180U/mg、70-170U/mg、70-160U/mg、70-150U/mg、70-140U/mg、70-130U/mg、70-120U/mg、70-110U/mg、70-100U/mg、80-200U/mg、80-190U/mg、80-180U/mg、80-170U/mg、80-160U/mg、80-150U/mg、80-140U/mg、80-130U/mg、80-120U/mg、80-110U/mg、80-100U/mg、90-200U/mg、90-190U/mg、90-180U/mg、90-170U/mg、90-160U/mg、90-150U/mg、90-140U/mg、90-130U/mg、90-120U/mg、90-110U/mg、90-100U/mg、100-200U/mg、100-190U/mg、100-180U/mg、100-170U/mg、100-160U/mg、100-150U/mg、100-140U/mg、100-130U/mg、100-120U/mg、100-110U/mg、110-200U/mg、110-190U/mg、110-180U/mg、110-170U/mg、110-160U/mg、110-150U/mg、110-140U/mg、110-130U/mg、110-120U/mg、120-200U/mg、120-190U/mg、120-180U/mg、120-170U/mg、120-160U/mg、120-150U/mg、120-140U/mg、120-130U/mg、130-200U/mg、130-190U/mg、130-180U/mg、130-170U/mg、130-160U/mg、130-150U/mg或130-140U/mg)的范围内。在实施方案中，纯化的重组ASA的比活性为约50至约130U/mg、约70至约100U/mg、约80至约90U/mg或约75至约95U/mg。
在另一个实例中，可通过测量从4-甲基伞形基-硫酸盐(4-MUF-硫酸盐)底物中去除硫酸盐以形成荧光甲基伞形酮来确定重组ASA组合物的酶活性。在该实例中，由测试样品产生的荧光信号可以用于使用4-MUF标准计算酶活性(单位为mU/mL)。一毫单位的活性被定义为在37℃下1分钟内将1nmol的4-MUF硫酸盐转化为4-MUF所需的酶量。然后可通过将酶活性除以蛋白质浓度来计算比活性。
在一些实施方案中，通过水解合成的发色底物对硝基邻苯二酚硫酸盐(pNCS)(其终产物对硝基邻苯二酚(pNC)吸收515nm的光)来确定活性。以下等式可用于计算酶活性，单位为μmol水解的pNCS/min×ml(＝单位/ml)：
V总(ml)xΔA＝单位/ml (1)
εM/1000x V样品(ml)x温育时间(min)，其中：
ΔA＝样品的吸光度–空白的吸光度
V总(ml)＝总反应体积，单位为ml(在这种情况下为0.15ml)
V样品(ml)＝添加的样品体积，单位为ml(在这种情况下为0.05ml)
εM＝产物pNC的摩尔消光系数，在这种情况下为12 400M-1cm-1。
等式1可以被简化为：
ΔA x(0.15/(12 400/1000x 0.05x 30))＝Xμmol/(min x ml)(＝单位/ml)(1)
为了计算比活性(单位为μmol消耗的pNC/(min x mg)(＝单位/mg))，将公式1除以样品的蛋白质浓度：
等式1/蛋白质浓度(mg/ml)＝Yμmol/(min x mg)＝单位/mg (2)
在任何实例中，可通过本领域已知的用于确定蛋白质浓度的任何合适方法来确定重组ASA组合物的蛋白质浓度。在一些情况下，通过紫外光吸收测定来确定蛋白质浓度。此类吸收测定通常在约280nm波长(A280)下进行。
在一些实施方案中，纯化的重组ASA对4-甲基伞形酮底物的比活性在约1.0x103mU/mg至100.0x 103mU/mg、约1.0x 103mU/mg至50.0x 103mU/mg、约1.0x 103mU/mg至40.0x 103mU/mg、约1.0x 103mU/mg至30.0x 103mU/mg、约1.0x 103mU/mg至20.0x 103mU/mg、约1.0x 103mU/mg至10.0x 103mU/mg、约4.0x 103mU/mg至8.0x 103mU/mg、约4.0x 103mU/mg至10.0x 103mU/mg、约4.5x 103mU/mg至10.0x 103mU/mg、约5.0x 103mU/mg至10.0x 103mU/mg、约5.5x 103mU/mg至15.0x 103mU/mg或约4.0x 103mU/mg至20.0x 103mU/mg的范围内。在一些实施方案中，纯化的重组ASA对4-甲基伞形酮底物的比活性为约1.0x 103mU/mg、2.0x103mU/mg、3.0x 103mU/mg、4.0x 103mU/mg、5.0x 103mU/mg、10.0x 103mU/mg、15.0x 103mU/mg、20.0x 103mU/mg、25.0x 103mU/mg、30.0x 103mU/mg、35.0x 103mU/mg、40.0x 103mU/mg、45.0x 103mU/mg、50.0x 103mU/mg或更大。
电荷分布
可通过与蛋白质相关的电荷分布来表征纯化的重组ASA。通常，蛋白质电荷分布反映通常存在于蛋白质表面上的残基侧链电荷的模式。可通过对蛋白质进行离子交换(IEX)色谱法(例如，HPLC)测定来确定电荷分布。在一些实施方案中，“电荷分布”是指表示在向离子交换柱中添加含有交换离子的流动相之后的某个时间点从柱中洗脱的蛋白质的量的一组值。
通常，合适的离子交换柱是阴离子交换柱。例如，可使用高效液相色谱(HPLC)系统通过强阴离子交换(SAX)色谱法来确定电荷分布。一般来讲，重组ASA吸附到强阴离子交换柱的固定正电荷上，并且使用流动相以预定流速增加离子强度的梯度与它们与带正电荷的柱的离子相互作用强度成正比从柱中洗脱出重组ASA物质。带较多负电荷(酸性较高)的ASA物质比带较少负电荷(酸性较低)的ASA物质较晚洗脱出来。通过紫外光吸收(在280nm处)检测洗脱液中蛋白质的浓度。
在一些实施方案中，重组ASA在约pH 8.0下在20mM TRIS-HCl中吸附到Mini Q PE柱的固定正电荷上，并且使用由20mM TRIS-HCL、1M氯化钠(pH 8.0)组成的流动相以0.8ml/min的流速增加离子强度的梯度与它们与带正电荷的柱的离子相互作用强度成正比从柱中洗脱出重组ASA物质。
在一些实施方案中，可通过从HPLC柱洗脱后吸收单位相对于时间的色谱图来描绘电荷分布。色谱图可包含一组一个或多个峰，该组中的每个峰鉴定具有相似表面电荷的组成的重组ASA亚群。
聚糖作图
在一些实施方案中，可通过蛋白聚糖组成(通常称为聚糖作图)来表征纯化的重组ASA蛋白。不希望受任何理论约束，据认为聚糖键以及分支结构的形状和复杂性可影响体内清除率、溶酶体靶向、生物利用度和/或功效。
通常，可通过酶促消化和后续的色谱分析来确定聚糖图谱。各种酶可用于酶促消化，包括但不限于合适的糖基化酶、肽酶(例如，内肽酶、外肽酶)、蛋白酶和磷酸酶。在一些实施方案中，合适的酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，合适的酶是神经氨酸酶。可通过色谱分析来检测聚糖(例如，磷酸聚糖)。例如，可通过具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法(HPAE-PAD)或尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC)来检测磷酸聚糖。可根据本领域已知和本文公开的方法，使用聚糖(例如，磷酸聚糖)的标准曲线来计算由聚糖图谱上的每个峰表示的聚糖(例如，磷酸聚糖)的量。
在实施方案中，纯化的重组ASA蛋白以以下物种的形式存在：中性重组ASA蛋白(组A)、唾液酸化重组ASA蛋白(组B)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(组C)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(组E)或混合重组ASA蛋白(组E)，或者它们的任何组合。在实施方案中，纯化的重组ASA蛋白以以下形式存在：中性重组ASA蛋白(组A)、唾液酸化重组ASA蛋白(组B)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(组C)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(组E)和混合重组ASA蛋白(组E)。
在一些实施方案中，根据本发明的纯化的重组ASA蛋白以聚糖图谱为特征，该聚糖图谱包含至少七个峰组，这些峰组分别指示中性ASA蛋白(峰组1)、单唾液酸化ASA蛋白(峰组2)、加帽甘露糖-6-磷酸化ASA蛋白(峰组3)、二唾液酸化ASA蛋白(峰组4)、单甘露糖-6-磷酸化ASA蛋白(峰组5)、混合ASA蛋白(峰组6)和二甘露糖-6-磷酸化ASA蛋白(峰组7)。
可基于相对于预定参考标准中对应峰组面积的峰组面积来确定对应于组(例如，组A-E或峰组1-7中的任何组)的聚糖的相对量。
在实施方案中，组A(中性重组ASA蛋白)相对于参考标准中对应峰组面积的峰组面积可在约15％至约25％(例如，约16％至约22％或约20％至约25％)的范围内。在实施方案中，中性重组ASA蛋白的峰组面积是实施例3中任何示例性制剂的范围特征，对于例示范围的每个端点，在任一方向上具有约1％至约10％的变化(例如，对于例示范围的每个端点，具有约1％至约5％的变化)。
在实施方案中，组B(唾液酸化重组ASA蛋白)相对于参考标准中任何对应峰组面积的唾液酸化重组ASA蛋白物质的总峰组面积可在约35％至约45％(例如，约35％至约42％或约37％至约42％)的范围内。在实施方案中，唾液酸化重组ASA蛋白的总峰组面积是实施例3中任何示例性制剂的范围特征，对于例示范围的每个端点，在任一方向上具有约1％至约10％的变化(例如，对于例示范围的每个端点，具有约1％至约5％的变化)。
在实施方案中，组C(甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白)相对于参考标准中任何对应峰组面积的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白的总峰组面积可在约20％至约30％(例如，约20％至约26％、约25％至约28％或约27％至约32％)的范围内。在实施方案中，甘露糖-6-磷酸化ASA蛋白的总峰组面积是实施例3中任何示例性制剂的范围特征，对于例示范围的每个端点，在任一方向上具有约1％至约10％的变化(例如，对于例示范围的每个端点，具有约1％至约5％的变化)。
在实施方案中，组D(N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白)相对于参考标准中任何对应峰组面积的N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白的总峰组面积可在约1％至约10％(例如，约3％至约5％、约4％至约6％或约4.5％至约5.5％)的范围内。在实施方案中，N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白的总峰组面积是实施例3中任何示例性制剂的范围特征，对于例示范围的每个端点，在任一方向上具有约1％至约10％的变化(例如，对于例示范围的每个端点，具有约1％至约5％的变化)。
在实施方案中，组E(混合重组ASA蛋白)相对于参考标准中任何对应峰组面积的混合重组ASA蛋白的峰组面积可在约5％至约15％(例如，约7％至约10％、约7％至约9％或约7.5％至约8.5％)的范围内。在实施方案中，混合重组ASA蛋白的总峰组面积是实施例3中任何示例性制剂的范围特征，对于例示范围的每个端点，在任一方向上具有约1％至约10％的变化(例如，对于例示范围的每个端点，具有约1％至约5％的变化)。
用于聚糖图谱的各种参考标准是本领域中已知的，并且可用于实践本发明。
预期纯化的重组ASA蛋白(例如，包含纯化的重组ASA蛋白的组合物，该纯化的重组ASA蛋白具有甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)阈值群体)的糖基化模式可影响蛋白质的生物利用度、靶向或功效。
肽作图
在一些实施方案中，肽作图可用于表征氨基酸组成、翻译后修饰和/或细胞加工，诸如信号肽的切割和/或糖基化。通常，可通过控制断裂或随机断裂将重组蛋白分解成离散的肽片段，以产生模式或肽谱图。在一些情况下，可先使纯化的ASA蛋白经受酶促消化，然后再进行分析。在分析之前，可使用肽酶、糖苷水解酶、磷酸酶、脂肪酶或蛋白酶和/或它们的组合进行消化。可使用本领域熟知的方法来确定肽的结构组成。示例性方法包括但不限于质谱、核磁共振(NMR)或HPLC。
金属分析
在一些实施方案中，可通过金属分析来表征纯化的重组ASA蛋白。分析纯化的药物物质中的痕量金属的各种方法在本领域中是已知的，并且可以用于实践本发明。
在一些实施方案中，测量残余磷并将其与参考样品进行比较。不希望受任何特定理论约束，假设残余磷有助于维持药物物质pH。在本发明的一些实施方案中，残余磷在约10-50ppm之间(即，在约10-45ppm、约10-40ppm，约10-30ppm、约20-50ppm、约20-45ppm、约20-40ppm、约20-30ppm、约30-50ppm、约30-40ppm之间)。在一些实施方案中，根据本文公开的方法纯化的重组ASA的pH范围在约5-7之间(即，在约5.5-7.0、约5.5-6.5、约5.5-6.0、约6.0-7.0、约6.0-6.5、约6.0-6.4、约6.0-6.3、约6.0-6.2、约6.0-6.1、约6.1-6.2之间)。
在一些实施方案中，根据本文公开的方法纯化的重组ASA含有钙。不希望受任何特定理论约束，假设存在于ASA的活性位点中的钙离子对于酶活性可能是必需的。在本发明的一些实施方案中，钙以约1-20ppm之间(即，约1-15ppm、约1-10ppm、约5-15ppm、约5-10ppm、约10-20ppm、约10-15ppm、约10-14ppm、约10-13ppm、约10-12ppm之间)的水平存在。
实施例
实施例1.示例性过程
根据本文所述的示例性过程制备纯化的重组ASA蛋白。表3规定了用于制备纯化的重组ASA蛋白的示例性过程的某些特定特征。在实施方案中，用于纯化重组ASA蛋白的过程包括表3中描述的一个或多个特征。
表3
Figure BDA0002622931220000631
实施例2.示例性制剂
如本文所述制备包含纯化的ASA蛋白的组合物。表4提供了包含根据本文所述的示例性过程制备的纯化的ASA蛋白的组合物的特征。在实施方案中，包含纯化的重组ASA蛋白的组合物以表4中描述的一个或多个特征为特征。在实施方案中，在提供数值范围的情况下，例示范围的每个边界可以变化约1％至约20％(例如，约1％至约15％、约1％至约10％、约1％至约7.5％、约1％至约5％或约1％至约2.5％)。
表4.包含重组ASA药物物质(DS)的示例性组合物
Figure BDA0002622931220000641
实施例3：可比性研究
进行一项非临床可比性计划来评估非临床可比性计划中过程B rhASA相较于过程A rhASA的活性、安全性和药代动力学(表5)。所有剂量均鞘内施用。使用溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)的免疫组织化学染色，在免疫耐受性MLD小鼠中评估药效可比性。在少年食蟹猴中一次给药6.0mg(相当于100mg/kg脑重量)过程A或过程B rhASA，评估药代动力学可比性。在大鼠中通过定量全身放射自显影比较生物分布。通过在少年食蟹猴中以18.6mg的剂量重复施用rhASA来评估过程B rhASA的潜在毒性。
表5.
Figure BDA0002622931220000651
AUC，浓度-时间曲线下面积；CSF，脑脊髓液；M6P，甘露糖-6-磷酸；MLD，异染性脑白质营养不良；QWBA，定量全身放射自显影；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。
药效可比性
免疫耐受性MLD小鼠是ASA基因敲除小鼠(ASA-/-)，具有稳定整合的编码人ASA的无活性变体的转基因，使得它们对注射的rhASA具有免疫耐受性。将动物分配为六组：未处理组(n＝6)；媒介物组(154mM NaCl、0.005％聚山梨醇酯-20，pH 6.0，n＝4)；0.04mg(n＝9)和0.21mg(n＝10)的过程A rhASA组；以及0.04mg(n＝10)和0.21mg(n＝10)的过程B rhASA组。在第1、8、15和21或22天鞘内向动物给药。一组七只未处理的C57/B16小鼠用作野生型对照。最终剂量的rhASA后24小时将动物处死。
组织学分析涉及溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)(一种溶酶体蛋白标志物，用于检测溶酶体贮积病并作为疾病状态的指标)的免疫组织化学染色。使用兔多克隆抗LAMP-1抗体(Abcam，Cat#ab24170，Lot#ER127402-2，1:400，Cambridge，MA，USA)和BondTMPolymerRefine Detection Kit(Leica，Cat#DS9800，Buffalo Grove，IL，USA)在5μm石蜡切片中进行小鼠脑和脊髓的LAMP-1免疫染色。通过用3,3-二氨基联苯胺染色然后用苏木精复染获得LAMP-1信号。用阴性对照的同种型IgG代替一抗。使用Aperio扫描仪和ImageScope软件(Leica Microsystems Inc.，Buffalo Grove，IL，USA)创建并分析LAMP-1染色载玻片的数字图像。使用以下公式获得相对染色阳性率：阳性率(％)＝(LAMP-1-阳性像素数/总像素数)×100。使用Mann–Whitney检验对每种组织的媒介物和未处理的动物进行统计比较。基于该评估(所有组织的组间p>0.01)，将数据合并为一个组(以下称为对照)。将数据归一化为对照组，并使用单向方差分析和Tukey多重比较检验进行统计比较。p<0.01的比较结果被认为具有统计学显著性。
过程A和过程B rhASA的比活性分别为89U/mg和106U/mg，均在测定的目标范围内。两种物质的比较结果表明，M6P和唾液酸含量变化最大，比活性相似。
如图1A-图1F所示，免疫耐受性MLD小鼠的LAMP-1染色在小鼠的脊髓、小脑白质和海马伞以及大脑脚、大脑皮层和纹状体中进行。从先前的研究中选择显示出受过程A物质处理影响的区域进行评估。在给药过程A与过程B rhASA的动物之间，没有观察到脊髓、小脑白质和海马伞的LAMP-1染色具有统计学显著差异。类似地，在过程A与过程B rhASA之间，没有在大脑脚中观察到统计学差异，但是在大脑皮层和纹状体中观察到了差异。这些差异被认为是零星的，不是生物学相关的，因为所测试的两种剂量中只有一种剂量达到统计学显著性。
与对照组动物相比，在脊髓(0.21mg剂量组，p<0.0001；图1A)、小脑白质(0.04mg和0.21mg剂量组，p<0.01；图1B)、大脑脚(0.04mg和0.21mg剂量组；图1D)和海马伞(0.04mg剂量组，p<0.01；图1C)中，过程A和过程B rhASA的LAMP-1染色的统计学显著性降低。在大脑皮层(0.04mg和0.21mg剂量组，p≤0.0001；图1E)和纹状体(0.04mg剂量组，p＝0.0005；图1F)中，过程B rhASA也发生LAMP-1染色的统计学显著性降低。
药代动力学可比性
在阶段1中，基于体重将动物随机分为过程A rhASA 6.0mg组(n＝6[3雄3雌])或过程B rhASA 6.0mg组(n＝6[3雄3雌])。在用皮下硫酸阿托品(0.01mg/kg)进行预处理后，通过外科手术植入鞘内腰椎导管，然后在肌内盐酸氯胺酮(8mg/kg)和大约1L/min的氧气和2％的异氟烷下麻醉。通过植入的鞘内腰椎导管以1mL的剂量体积施用rhASA剂量。当在食蟹猴中标准化为60g脑重量时，6.0mg剂量相当于100mg/kg脑重量。该剂量基于在晚婴型MLD儿童中进行的1/2期临床研究中施用的rhASA的最高剂量。在该临床研究中，施用的最高剂量为100mg，当标准化为1kg脑重量(针对研究参与者的年龄组确定)时，相当于100mg/kg脑重量。
在经过至少8天的冲洗期后，开始阶段2中，在该阶段中，如果在阶段1中已经向动物给药过程A rhASA，则向它们给药过程B rhASA；相反，如果在阶段1中已经向动物给药过程B rhASA，则向它们给药过程A rhASA。最后剂量的rhASA后24小时，对动物实施人道安乐死。
监测体重、食物消耗和临床参数，并且在给药前以及给药后预先指定的时间间隔收集血液和CSF样品。使用酶联免疫吸附测定法测量血清和CSF中rhASA的浓度。使用GLP验证的ELISA测定法对少年食蟹猴的血清和CSF中rhASA的水平进行定量。用兔源抗rhASA多克隆抗体(SH040)包被微量滴定板。与样品和标准品温育后，洗涤微量滴定板，并将辣根过氧化物酶偶联的抗ASA小鼠单克隆抗体(克隆19-16-3)添加到所有孔中。猴血清的定量下限为39.1ng/mL，CSF的定量下限为19.5ng/mL，每种方法的定量上限为1250ng/mL。
当使用过程A和过程B rhASA时，在少年食蟹猴中施用单次6.0mg鞘内剂量后，血清(图2A)和CSF(图2B)中的rhASA的浓度-时间曲线相似。过程A和过程B rhASA在药代动力学参数方面相似，包括最大血浆浓度(Cmax)、暴露(从时间0到最后一次测量的浓度-时间曲线下面积[AUClast])和清除率(表6)。
表6.鞘内腰椎施用6.0mg使用过程A或过程B制造的rhASA后少年食蟹猴中的平均脑脊髓液和血清药代动力学参数。
Figure BDA0002622931220000671
Figure BDA0002622931220000681
血清样品中无法测定λz、t1/2、Vz、CL和MRTinf。
AUCinf，从时间0到无穷大的浓度-时间曲线下面积；AUClast，从时间0到最后一次测量的浓度-时间曲线下面积；CL，清除率；Cmax，最大血浆浓度；λz，末端速率常数；h，小时；MRTinf，到无穷大的平均停留时间；n，数量；ND，未检测到；t1/2，末端消除相半衰期；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A；SD，标准偏差；Tmax，达到最大血浆浓度的时间；Vz，分布体积。
生物分布可比性
该研究在施用单次鞘内剂量的[125I]-rhASA后使用定量全身放射自显影(QWBA)和伽马计数。为了评估组织分布，将28只植入鞘内端口的大鼠随机分组，使得每只大鼠接受0.62mg使用过程A(14只动物)或过程B(14只动物)制造的[125I]-rhASA剂量。在给药后的七个时间点(给药后大约1、4、12、24、48、96和168小时)中的每个时间点，对每个剂量组中的两只大鼠实施安乐死，并进行QWBA处理，针对所选组织确定放射浓度。在安乐死前，通过心脏穿刺从用异氟烷麻醉的动物中采集血液样品。为了评估药代动力学参数，使用伽玛计数分析全血、血浆和组织的等分试样的总放射性。为了评估rhASA的排泄模式，将六只雄性Sprague Dawley大鼠分配为一组，该组接受0.62mg使用过程A(3只动物)或过程B(3只动物)制造的[125I]-rhASA剂量。在施用[125I]-rhASA后168小时内，将大鼠饲养在单独的代谢笼中，以分别收集尿液和粪便。
血浆样品的三氯乙酸沉淀表明，大约33％的125I未与rhASA结合。代表性全身放射自显影显示了在施用单次鞘内0.62mg剂量后雄性Sprague Dawley大鼠后4小时，雄性Sprague Dawley大鼠中过程A(图3A)和过程B(图3B)[125I]-rhASA的分布。过程A和过程BrhASA的Cmax和AUClast以及不同组织中过程B rhASA与过程A rhASA的比例在表6中示出。[125I]-rhASA的最高计算浓度(Cmax)在甲状腺中发现，这可能是由于摄取了未结合的碘所致。其次是脑垂体、脊髓和肝脏，它们的水平都相似(表7)。[125I]-rhASA的最低浓度发生在脂肪、睾丸、肌肉和眼睛中(表7)。目视检查时，相对于邻近CSF和脑膜中的浓度，脊髓中的表观浓度非常低，这表明可能已经高估了脊髓中的计算值。靠近高浓度125I区域和较小定量区域可能导致高估脊髓值。
表7.雄性Sprague Dawley大鼠中单次鞘内0.62mg剂量的过程A或过程B[125I]-rhASA后rhASA等同物的药代动力学参数。
Figure BDA0002622931220000691
AUClast，从时间0到最后一次测量的浓度-时间曲线下面积；Cmax，最大血浆浓度；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A。
对于脑、脊髓和肺，过程B rhASA的Cmax值比过程A[125I]-rhASA的Cmax值高大约1.5倍(最高比例)，对于肾、肾上腺、胃和胰腺，过程B rhASA的Cmax值比过程A[125I]-rhASA的Cmax值低大约0.2–0.6倍(最低比例；表5)。对于除皮肤和肾上腺外的所有组织，过程B与过程A[125I]-rhASA的暴露差异(AUClast)均小于两倍，皮肤和肾上腺的比例分别为2.27和2.19(表5)。过程A[125I]-rhASA在血浆中的末端消除相半衰期为37.2小时，而过程B为42.5小时。
如图4所示评估尿液和粪便中的排泄曲线。过程A和过程B[125I]-rhASA的排泄模式相似。大多数过程A和过程B产品都从尿液中排出(分别为76％和71％)，这表明rhASA主要通过肾消除而被全身性清除，这两种产品约有6％从粪便中排出。在尸体中回收的施用剂量的比例对于过程A产品为6％，对于过程B产品为8％，其中大部分位于甲状腺、CSF和脑膜中。对于给药过程A或过程B[125I]-rhASA的动物，总回收率(所有排泄物和尸体总和)分别为90％和83％。
毒理学
在用美洛昔康(0.2mg/kg)然后用盐酸氯胺酮(5mg/kg)和美托咪定(0.06mg/kg)进行预处理后，通过外科手术植入鞘内端口导管。使用鞘内端口导管系统通过缓慢推注递送来施用rhASA剂量。每2周向动物给药剂量体积为0.6mL的过程B rhASA 18.6mg(n＝8[4雄4雌])或媒介物对照(NaCl 154mM，0.005％聚山梨醇酯-20，pH 6.0；n＝8[4雄4雌])，持续11周(共六个剂量)。在该研究中使用18.6mg的rhASA最大可行剂量，该剂量基于少年食猕猴中的最大可耐受体积(0.6mL)以及过程B rhASA制剂的浓度(31.0mg/mL)。
评估包括临床检查(体重评估、食物消耗评估、体格评估、心血管评估(心电图和血压)、神经评估和眼科评估)和病理检查(血清化学、血液学、凝血、尿液分析、CSF细胞计数和CSF化学)。在血清和CSF中评估过程B rhASA的抗原性。在给药前阶段(手术前以及手术后≥5天)对未镇静的动物进行两次体格和神经检查，并且在给药阶段(给药后大约24小时)的第1、5和9周进行一次体格和神经检查，以及在尸体剖检前进行一次体格和神经检查。在给药前阶段(手术后)和给药阶段第11周内(接近给药以及给药后3小时)，对未麻醉的暂时被约束的动物进行心电图检查。最终剂量后24小时，对所有动物实施人道安乐死。收集完整的一套组织，但是仅对在最初研究中使用过程A识别的目标组织(即，脊髓和背根神经节)进行组织病理学评估。
少年食蟹猴对鞘内施用过程B rhASA的耐受性良好，对临床、神经或病理检查均无药物相关影响。
每2周向少年食蟹猴鞘内施用18.6mg B rhASA(持续11周，共六个剂量)未观察到副作用水平。施用过程B rhASA与以下区域中的嗜酸性粒细胞浸润有关：脑和脊髓周围的脑膜区域；脑和脊髓中的血管周区域；脊髓中的小管周(邻近中央管)区域；以及脊神经根周围的神经束膜和神经外膜区域。这些与过程B rhASA相关的变化的严重性都没有被合理预期会改变神经系统功能，并且仅基于形态学，这些过程B rhASA相关的变化都未被认为是副作用。脊髓中存在浸润与在向鞘内间隙施用蛋白质的动物中预期的一致。
第2天，血清中过程B rhASA的平均浓度为544ng/mL，而CSF中为2185ng/mL。在第11周，血清中的平均浓度为37ng/mL，而CSF中为171ng/mL(图2)。所有给药rhASA的动物到第10周均已产生抗药物抗体，在血清中观察到的抗药物抗体水平比CSF中高(平均值：分别为391,462ng/mL与7,383ng/mL)；免疫组织化学和组织ELISA证实，抗药物抗体不会影响rhASA暴露于靶组织(数据未示出)。
实施例4：重组人芳基硫酸酯酶A在MLD患者中的药代动力学/药效学特征
在MLD患者中鞘内施用后，研究rhASA的药代动力学/药效学(PK/PD)特征。使用rhASA对脑脊髓液(CSF)中的硫苷脂水平的影响以及接受rhASA的MLD患者的粗大运动功能测试量表88(GMFM-88)总评分的变化来评估其临床效果并确定最佳给药方案。
所有患者每隔一周通过鞘内药物递送装置(IDDD)接受rhASA，长达338周。在最初的剂量递增研究中，群组1、2和3的患者入选时不到12岁，分别接受10、30和100mg rhASA。群组4的患者入选时不到8岁，接受100mg使用改进过程制造的rhASA。所有患者均接受在等渗水溶液中以30mg/ml rhASA配制的药物产品，该溶液含有154mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯-20(pH 6.0)，经由体内IDDD通过IT施用递送。多个功效度量的结果表明，rhASA可能与疾病进展减慢有关。
完成剂量递增研究的患者可以继续通过IDDD每隔一周接受rhASA，进入扩展研究。在初始rhASA剂量后和治疗第38周时评估血清rhASA浓度。群组4的患者接受使用改进过程制造的rhASA。在IT注射前≤1小时以及IT注射后0.5、1、2、4、8、12、24和48小时采集血液样品。在剂量递增研究期间，每2或4周评估CSF中的rhASA浓度，在扩展研究中，第52-104周每季度评估，第104-338周每半年评估。在剂量递增研究中，在第0、16、24和40周评估GMFM-88的观察结果，在扩展研究中，第52-104周每季度评估，第104-338周每半年评估。
评估包括治疗期间出现的不良事件(AE)；血清化学；12导联心电图(ECG)结果；生命体征；体格检查；细胞计数；脑脊髓液(CSF)中的葡萄糖和蛋白质水平；以及CSF和血清中的抗rhASA抗体。AE被定义为在研究产品的第一次剂量或装置植入手术(以较早发生者为准)与研究的最后一次随访日期之间发生的所有不良事件。在最后一次rhASA注射后4周或在移除最后的IDDD后2周(对于未参加扩展研究的患者，以较晚发生者为准)进行随访评估。对于参加扩展研究的个体，在研究结束访视时(第40周)进行随访评估。
首先使用电化学发光桥接免疫测定法(Meso Scale Diagnostics，LLC，Rockville，MD)筛选血清和CSF样品中的抗药物抗体(ADA)，该测定法分别利用生物素化和硫代标记的rhASA进行捕获和检测。使用相同的桥接免疫测定法通过配体竞争结合来确认ADA阳性样品，然后使用以4-硝基邻苯二酚硫酸盐为底物的芳基硫酸酯酶A活性测定法评估抗体滴度和中和活性。
评估施用后CSF和血清中rhASA的药代动力学评估，以及运动功能相对于基线的变化。在第0周(第一剂量)和第38周(最后剂量)从患者收集血清和CSF样品。使用经验证的酶联免疫吸附测定方法确定rhASA浓度。使用GMFM-88总评分(0-100％)评估运动功能相对于基线的变化。其他终点包括：液相色谱-串联质谱检测法评估的CSF硫苷脂和溶硫苷脂水平；质子磁共振波谱(MRS)评估的脑深部白质和灰质中的N-乙酰天冬氨酸(NAA)/肌酸和胆碱/肌酸水平；基于脑磁共振成像(MRI)总MLD严重性评分相对于基线的变化；以及通过神经电图评估的外周神经功能。基于在60名未患脑白质营养不良但已经进行了脊椎穿剌(并且因此可能患有其他精神病)的儿童的样品中观察到的最高浓度，CSF硫苷脂和溶硫苷脂的正常上限分别被定义为0.113μg/mL和0.0277ng/mL。每名患者均接受连续的脑部MRI测量。基于MRI的视觉评分方法(其中评分越高表示脑部症状越严重)，在每个时间点计算每个个体的总MLD严重性评分(范围：0-34)。还通过神经电图评估外周神经功能。如果可以在适当的年龄范围内获得总体平均值和标准偏差(SD)，则测量神经传导速度、幅度、远端延迟和F波延迟，并将它们转换为z评分。
用rhASA进行治疗的耐受性良好，没有死亡，没有因不良事件(AE)而中止，也没有报道威胁生命的AE。IT rhASA似乎没有很高的免疫原性潜力，尽管有10名患者的血清中产生了治疗诱导的抗体，但血清抗体反应与AE之间并没有相关性。
IT施用后，血清中rhASA的浓度缓慢增加(平均tmax在5.1-18.2小时的范围内)，观察到的最大血清浓度(Cmax)和血清浓度-时间曲线下面积随剂量的增加而增加。在CSF中，rhASA浓度通常以剂量依赖性方式增加，在给药前的每次访视中均检测到可测量的浓度，这表明在两次剂量之间的2周内rhASA始终存在于CSF中。按剂量群组和治疗周划分的rhASA的平均CSF浓度在图14中呈现。接受100mg使用过程A或过程B制造的rhASA的患者的药代动力学结果相似。
在rhASA治疗后，在四个群组中的每个群组中均观察到平均GMFM-88总评分相对于基线下降(图15)。与基线相比，两个100mg群组(群组3和4)的GMFM-88总评分在第40周的平均(SD)下降相似(分别为–19.0[16.12]和–22.6[25.48])。然而，这些下降没有在10mg和30mg群组(群组1和2；分别为–29.2[24.45]和–27.7[17.76])中观察到的明显。GMFM-88总评分随时间相对于基线的变化在表8中汇总。在所有患者中均观察到的粗大运动功能下降，表明随着rhASA剂量水平增加，有下降幅度变小的趋势。接受100mg rhASA(群组3；过程A)的患者的MLD严重性评分保持稳定。
表8.
GMFM-88总评分相对于基线的变化
Figure BDA0002622931220000731
评估CSF硫苷脂水平，作为CNS中药物活性的指标。如图16A所示，在群组3和4中，研究结束时平均CSF硫苷脂水平低于正常上限(分别为0.07[0.03]和0.08[0.03])。随着时间的推移，还在所有群组中观察到平均CSF溶硫苷脂水平降低(图16B)。从群组3的第2周、群组4的第4周和群组2的第12周开始，平均CSF溶硫苷脂水平始终低于正常上限。该数据表明，rhASA在CNS中具有活性。
NAA可用作成熟神经元和轴突的数量和/或密度的替代度量，在神经障碍中，NAA浓度降低与神经元和轴突的损伤和丧失有关。评估NAA/肌酸比例的变化，作为患者MLD严重性的指标(图17A)。在右额白质中，NAA/肌酸的比例从基线降低到研究结束，但这对于用30mg或100mg rhASA治疗的患者(群组2-4)而言没有用10mg rhASA治疗的患者(群组1)明显(图17A)。在右额顶白质和右顶枕白质中观察到相似的结果(图18A和图19A)。灰质中的NAA/肌酸比例和rhASA剂量在图20A中示出。
还评估所有群组中胆碱/肌酸的比例。已经表明，MLD患者的胆碱水平升高，可能是由于与脱髓鞘相关联的膜更新增加所致。在右额白质、右额顶白质和右顶枕白质中，胆碱/肌酸比例在用最低剂量治疗的患者(10mg；群组1)中相较于基线始终增加，但是在用30mg或100mg治疗的患者(群组2-4；图17B、图18B和图19B)中没有明显的趋势。在中枕灰质中，胆碱/肌酸比例在群组1和2中是可变的，但在群组3中相较于基线有所降低，并且在群组4中保持稳定(图20B)。
随着时间的推移，在用10mg、30mg和100mg(B)rhASA治疗的患者中，平均总MLD严重性评分增加(群组1、2和4)，这表明疾病有进展(图21)。相对于基线增加最多的是接受10mgrhASA的患者(群组1；平均变化为11.0)。相反，在用100mg(A)rhASA治疗的患者(群组3)中，平均总MLD严重性评分保持稳定，这可能表明CNS中的疾病稳定(图21)。
在所有群组中，均在基线处观察到正中运动大鱼际的神经传导能力的显著退化(表9)。在感觉神经中也发现了类似的结果(数据未示出)。在随后的时间点，四个群组的神经功能似乎没有恶化。
表9.通过神经电图访视获得的正中运动大鱼际的Z评分。
Figure BDA0002622931220000741
Figure BDA0002622931220000751
Figure BDA0002622931220000761
Figure BDA0002622931220000771
多项研究还报告了神经障碍(包括MLD)患者的CNS中的代谢物水平的变化。例如，NAA浓度降低与神经元和轴突的损伤和丧失有关，同时已经表明，MLD患者的胆碱水平升高。正如预期，我们发现脑白质中NAA/肌酸的比例通常随时间降低。然而，这对于100mg剂量而言没有10mg或30mg明显，这可能表明在最高剂量下神经元损伤较少。另外，在用最低剂量(10mg；群组1)治疗的患者中，脑白质中胆碱/肌酸的比例相较于基线始终增加，但在用更大剂量治疗的患者中结果的可变性更大。在我们的研究中，我们没有观察到其他代谢物(包括乳酸盐、肌醇和谷氨酰胺+谷氨酸盐)水平有任何明显的趋势。可能需要在更多的患者和不同的脑区域中进行代谢物水平分析，才能清楚地确定rhASA治疗的影响。
总体而言，这些发现表明，IT rhASA治疗可能与CNS中的疾病稳定有关，尤其是在100mg EOW剂量下。然而，样本量小意味着应谨慎解释我们的结果。特别地，可在每个时间点获得数据的患者数量随一些参数而变化，并且需要在更长的时间段内和在更多的患者中进行进一步研究才能确定rhASA在MLD患者中的长期功效。另外，患者与群组之间的入选年龄存在一定差异，这可能对比较不同剂量组之间的治疗反应具有影响。类似地，也未对通过MRS获得的代谢物水平数据进行标准化，以考虑患者年龄。
尽管存在这些限制，但我们的发现表明，MLD儿童对IT rhASA的耐受性通常良好。尽管随着时间的推移，运动功能普遍下降，但有证据表明，接受rhASA的患者尤其是在最高剂量下疾病进展有所降低。正在进行扩展研究，以评估与rhASA治疗相关的长期安全性、免疫原性和临床结果，随后更高剂量的rhASA临床阶段研究将很快开始招募患者。希望这些研究的结果将有助于指导给药，并确定将来是否可以将rhASA视为MLD患者的潜在治疗方法。
实施例5：MLD患者中重组人芳基硫酸酯酶A的建模和模拟
将实施例4中描述的临床研究的数据用于MLD患者中重组人芳基硫酸酯酶A的药代动力学(PD)和药效学(PD)建模和模拟。如图5所述，对于PK分析，所有患者均接受至少一个剂量的rhASA，并至少测量一次血清或CSF中的rhASA浓度。对于PK/PD分析：所有患者的PK参数估计值均可从PK分析中获得，并且可至少测量一次CSF硫苷脂或GMFM-88总评分。开发了基于rhASA的血清和CSF浓度的群体PK模型，如图6所示。rhASA的消除通过中枢神经系统(CNS)中的两室模型表示，该模型具有分布量VCNS和VCSF以及室间清除率QCSF。假设的转运室用于表征rhASA从CSF的清除率及其在血清中的延迟出现。
对PK/PD关系进行建模，包括rhASA对在CSF中测得的硫苷脂浓度的影响以及rhASA与GMFM-88总评分的暴露-反应(ER)关系。PK/PD关系的PK驱动因素是CSF和CNS中的患者特异性时间连续PK特征。对PD效果进行顺序建模，并且在估计PD参数期间固定所有与PK相关的参数。使用间接反应PK/PD模型来表征CSF硫苷脂测量时间进程，其中将rhASA建模为增强硫苷脂的消除。群体PK模型预测的CNS隔室中的rhASA浓度用作PD反应的驱动因素。使用由logit链接函数约束的β回归模型将模型预测限制在0-100％的范围内，评估rhASA暴露与GMFM-88总评分的E-R关系。
群体PK、PK/PD和E-R模型用于模拟预期的rhASA浓度-时间曲线和GMFM-88总评分。模拟750名患者的概况；每个年龄组均匀地随机抽样250名。使用R(v3.3或更高版本；LucentTechnologies，Swindon，UK；http://www.rproject.org)准备所有数据组合、绘图和汇总表。使用NONMEM软件(v7.3或更高版本；ICON Development Solutions，Ellicott City，MD，USA)进行群体PK、PK/PD和E-R建模分析和模拟。
如图8所示，使用四种不同的给药方案。方案1包括每隔一周100mg；方案2包括每周100mg，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周100mg；方案3包括每周150mg，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周150mg；并且方案4包括每周按年龄调整给药，持续12周(最初每周给药一次)，然后每隔一周一次(方案4：80mg，<8个月；120mg，8–<30个月；150mg，≥30个月)。使用R(v3.3或更高版本；Lucent Technologies，Swindon，UK；http://www.rproject.org)准备所有数据组合、绘图和汇总表。模拟750名患者的概况；每个年龄组均匀地随机抽样250名。使用NONMEM软件(v7.3或更高版本；ICON Development Solutions，Ellicott City，MD，USA)进行群体PK、PK/PD和E-R建模分析和模拟。
将患者(n＝24)平均分布在四个群组中。在基线处，平均患者年龄为44.9(标准偏差[SD]，22.8；范围，19.0-107.0)个月，平均体重为15.4(SD，4.14；范围，10.5-24.8)kg。
除了VCSF(76.1％RSE)、VCNS(121％RSE)和Ktrans(40.2％RSE)的比例系数外，以较高的精度估计了固定效应。估计的个体间可变性的精度较差。该模型表明rhASA迅速分布到脑组织和全身循环中：rhASA在CNS中的中值分布半衰期为1.02(范围0.394-1.66)小时，从CSF到血清的中值分布半衰期为1.19(范围0.555–2.09)小时。然而，rhASA在CNS中的中值末端半衰期为大约20天(477[范围256-1010]小时)(表10)。中值转运速率常数(表示为转运半衰期)为1.19(范围0.555-2.09)小时，与CSF生理更新(大约6小时)一致。
表10.各个PK参数估算值的汇总统计
Figure BDA0002622931220000791
CNS，中枢神经系统；CSF，脑脊髓液；PK，药代动力学；0CSF；CNS中的室间清除率；rhASA，重组人芳基硫酸酯酶A；SD，标准偏差
观察到CSF中硫苷脂的浓度依赖性有所降低(模型估计的EC50：184ng/mL rhASA，Hill斜率陡，为3.59)并且粗大运动功能丧失的浓度依赖性受到抑制(模型估计的IC50：120ng/mL rhASA，在脑组织中，Hill斜率浅，为0.554)。群体和个体预测的CSF中的rhASA浓度、CSF中的硫苷脂浓度和GMFM-88总评分的拟合优度图分别在图7A、图7B和图7C中示出。这三种模型都显示出观察到的rhASA浓度的合理表征；模型的精度有所不同，这可能是由于研究中包括的患者数量少引起的。对于四种模拟给药方案，CSF和CNS中的中值模拟剂量前波谷rhASA浓度在图8中示出。
在每隔一周给药100mg的情况下(方案1)，达到PK稳态需要大约16周，这与中值rhASA消除半衰期477小时一致。在每周给药100mg或150mg，持续12周，然后每隔一周给药一次的情况下(方案2和3)，与方案1相比，在CSF和CNS中达到了更高的rhASA波谷浓度。基于年龄的给药方案(方案4)显示出三个年龄组的rhASA稳态波谷浓度随时间更一致。然而，小于8月龄的患者在每周施用阶段并未达到与方案2和3相同的rhASA高波谷浓度。
GMFM-88总评分的模拟显示出预期的一些患者随时间稳定(图9)，这与观察到的临床研究结果一致。方案1-3预测，所有组中都有一些患者将对治疗表现出早期反应。方案3预测，分别在12个月和24个月时GMFM-88总评分高于35或50的患者的数量最大。基于年龄的给药方案(方案4)预测，<8个月和8–<30个月组中对治疗有反应的患者将比>30个月组中的患者少。
通过IDDD递送rhASA可降低MLD患者的CSF中的硫苷脂水平，并以剂量和暴露依赖性方式减慢运动功能丧失的速度。药物计量学建模方法用于预测群体PK、PK/PD和E–R与GMFM-88总评分的关系。在所有情况下，模型对在接受rhASA的患者中观察到的测量结果进行了良好表征。考虑到患者数量少，仅在给药前时间点观察到在CSF中观察到的rhASA浓度可变性以及CSF浓度可变性，模型之间的精度有所不同。然而，该模型表明rhASA快速分布到脑组织和全身循环中，但是CNS的末端消除半衰期较慢。
实施例6：在晚婴型异染性脑白质营养不良儿童中鞘内递送重组人芳基硫酸酯酶A的反应者和无反应者分析。
如图10所示，在第0至38周期间，患者每隔一周通过鞘内药物递送装置(IDDD)接受rhASA。群组1(n＝6)接受10mg rhASA，群组2(n＝6)接受30mg rhASA，群组3(n＝6)接受100mg rhASA，群组4(n＝6)接受100mg使用改进过程制造的rhASA。
群组1-4的合格标准包括确诊MLD(基于ASA缺乏，通过测定白细胞以及尿液中硫苷脂浓度升高来评估)；在30个月大时或之前首次出现MLD症状；筛查检查时存在MLD的神经症状；筛查时可以走动(能够用一只手支撑向前走10步)。筛查时群组1-3中包括的患者也小于12岁。群组4患者的其他合格标准包括筛查时粗大运动功能测试量表-88(GMFM-88)总评分为至少40并且基线处为至少35，以及筛查时小于8岁。
每名患者在接受第一剂量的rhASA之前，通过外科手术植入IDDD(PORT-A-
Figure BDA0002622931220000801
II[Smiths Medical ASD,Inc.，St Paul，MN，USA]或SOPH-A-
Figure BDA0002622931220000802
Mini S[Sophysa，Orsay，France])。手术后确认IDDD的位置。使用GMFM-88总评分(0–100％)(提供了运动功能的指示)事后评估群组3和4的患者的治疗反应(Bjornson KF等人，PediatrPhys Ther1998；10:43–7)。
反应者被定义为基线GMFM-88总评分≥35并且研究结束时GMFM-88总评分相对于基线保持不变(GMFM-88总评分降低≤10)或增加的个体。无反应者被定义为不符合该标准的个体。评估的其他关键结果包括脑脊髓液(CSF)中硫苷脂浓度的变化、MLD严重性的变化(使用与Eichler等人类似的评分方法(Giugliani R等人，JIEMS 2017；5:314:A699)通过脑部磁共振成像(MRI)测量，以获得MLD-MRI严重性评分)、脑白质中N-乙酰天冬氨酸(NAA)水平的变化(通过磁共振波谱(MRS)评估)。图22示出了来自rhASA临床研究的同胞患者中按月龄划分的个体GMFM-88总评分。生物标志物和运动反应似乎一起改善。另外，CSF硫苷脂和MRS NAA水平似乎一起改善。运动反应与CSF中积累的硫苷脂的剂量依赖性降低有关。
在入选NCT01510028且接受100mg rhASA的12名患者中，有四名被确认为反应者：两名来自群组3，两名来自群组4。群组3和4中的其余八名患者被确认为无反应者。图11示出了随时间推移12名患者的GMFM-88总评分。四名反应者的人口统计学和基线特征在表11中示出。
表11.被确定为反应者的个体的人口统计学和基线特征
Figure BDA0002622931220000811
CSF，脑脊髓液；GMFM-88，粗大运动功能测试量表-88；MLD，异染性脑白质营养不良；MRS，磁共振波谱；NAA，N-乙酰天冬氨酸
1个月后，反应者1、2和3的CSF硫苷脂浓度低于正常上限(0.113μg/mL)，没有反应者4的CSF硫苷脂浓度的随访信息。在研究结束时(第40周)，反应者1、2和3的CSF硫苷脂浓度分别被报告为0.0294μg/mL、0.0489μg/mL和0.0653μg/mL。
1个月后，八名无反应者中一名患者的CSF硫苷脂浓度低于正常上限。在其余患者中，在8–36周后，CSF硫苷脂浓度降到正常上限以下。群组1的一名患者也符合事后反应者标准，而CSF硫苷脂水平在研究结束时未达到正常水平。
到第40周，相对于基线的MLD-MRI严重性评分在两名反应者中降低，而在一名反应者中升高(图12)。无法获得研究结束时反应者4的MLD-MRI严重性评分信息。四名反应者中有两名在额顶白质中的NAA/肌酸比例在基线处≥1.0。基线数据可用的八个无反应者中没有一个的NAA/肌酸比例在基线处≥1.0。
一名应答者在第40周时额顶白质中的NAA/肌酸比例相较于基线有所增加，而在数据在基线和第40周时可用的其他两名应答者中，该比例仍保持稳定(图13)。
接受100mg rhASA的十二名患者中有四名被确认为对治疗有反应；响应者之间的年龄和基线特征有所不同。这些发现表明在接受最高剂量的患者亚组中存在疾病稳定的趋势，并且为对LI-MLD患者进行rhASA鞘内治疗提供了支持。影响治疗反应的因素可包括CSFrhASA浓度、基线NAA/肌酸比例、NAA/肌酸比例的稳定化、疾病持续时间、年龄以及CSF硫苷脂水平正常化所需的时间。
实施例7：在晚婴型异染性脑白质营养不良患者中鞘内施加重组人芳基硫酸酯酶A
MLD中缺乏溶酶体酶芳基硫酸酯酶A导致硫酸化糖鞘脂(统称为硫苷脂)积累。这些物质在维持轴突的中央和外周髓鞘绝缘鞘的细胞中积累，并且对这些细胞有毒。IT施用重组人芳基硫酸酯酶A可足以水解神经系统细胞中积累的硫苷脂，并且可以减慢或阻止进一步积累，这将转化为运动系统益处。通过例如IT递送进行直接CNS施用可以用于有效治疗MLD患者。本实施例说明了多中心开放标记的匹配历史对照临床研究，该研究被设计成评估在晚婴型MLD患者中每周一次鞘内给药150mg rhASA的功效。该研究将研究150mg IT施用的rhASA稳定或减缓晚婴型MLD儿科受试者的运动功能障碍的进展的潜力。
将招募大约35名患者，以评估rhASA以及通过SOPH-A-PORT Mini S鞘内药物递送装置对其进行递送的安全性和耐受性。在晚婴型MLD中充分记录了疾病进展的速率和严重性。晚婴型MLD的定义的一个显著特征是疾病症状发作的年龄早，大多数晚婴型MLD患者在18个月之前首次显示出运动功能障碍。基于入选时的年龄和运动功能障碍的程度，将包括四个治疗组：
·组A—早期症状(18-48个月；MLD的粗大运动功能分类[GMFC-MLD]级别为1-2；n＝16)，
·组B—中期症状(18-72个月；GMFC-MLD级别为3；n≤8)，
·组C—晚期症状(18-72个月；GMFC-MLD级别为4；n≤8)，以及
·组D—症状前或最轻症状(<18个月；参与者有症状前同胞，其具有相同的ASA等位基因构成；n＝3)。
在组A-C中，症状发作必须在30个月之前。所有受试者将每周接受一次150mg的ITrhASA剂量，持续105周。该研究将使用GMFC-MLD和GMFM-88总评分来衡量疾病进展，从而评估治疗方案对粗大运动功能的安全性和功效。将使用阿尔伯塔婴儿运动量表(Piper和Darrah，1994)来评估组D受试者。主要终点将是到2年时组A中GMFC-MLD级别相对于基线增加(表示运动功能下降)不超过2的儿童的比例。次要终点将是2年后A组中粗大运动功能测试量表-88总评分>40的儿童的比例。
其他次要终点将包括使用GMFC-MLD评估IT施用rhASA对使粗大运动功能下降的时间进程的影响；使用GMFM-88评估IT施用rhASA对使粗大运动功能下降的时间进程的影响；使用表达语言功能分类(ELFC-MLD)评估IT施用rhASA对表达语言的影响；评估IT施用rhASA对脑脊髓液(CSF)生物标志物(即硫苷脂水平)的影响；以及评估IT施用rhASA对脑部质子磁共振波谱(MRS)、特别是白质中的N-乙酰天冬氨酸/肌酸(NAA/Cr)的影响。将结果与MLD儿童中的倾向评分匹配的历史对照数据进行比较。
IT rhASA的安全性和耐受性将基于治疗期间出现的不良事件(TEAE)的发生、临床实验室测试(血清化学、血液学和尿液分析)和生命体征、体格检查(包括MLD体征和症状的记录)、12导联心电图(ECG)、CSF实验室参数(化学和细胞计数)、CSF和血清中抗rhASA抗体的存在和活性以及MLD受试者体内的SOPH-A-
Figure BDA0002622931220000831
Mini S装置。
施用IT rhASA的影响的其他评估可基于血清和尿液生物标志物(即硫苷脂水平)、通过脑部磁共振成像(MRI)测量的严重性评分、基于脑部MRI的容量分析、通过纤维内窥镜吞咽评估(FEES)评估的吞咽能力、通过神经电图(ENG)评估的神经传导以及使用巴特尔发展量表(BDI-2NU)评估的交流和认知。将通过评估照顾者负担(通过照顾者影响问卷(CIQ)评估)和健康相关的生活质量(HRQOL)(通过婴幼儿生活质量问卷-97项(ITQOL-97)评估)来探索照顾者负担和受试者的健康相关的生活质量在MLD儿童中的影响。
主要功效终点是被定义为组A在2年后(第106周)保持粗大运动功能的反应，被评估为GMFC-MLD相对于基线变化不大于2个级别。组A中的关键次要功效终点是在2年后(第106周)保持粗大运动功能，被评估为GMFM-88总评分>40。将通过比较组A中的入选受试者与匹配的历史对照受试者来评估rhASA的功效。这些未经治疗的MLD受试者(即未接受任何研究产品或疗法的受试者)的数据将来自正在进行的全球脑白质营养不良倡议组织(GLIA-MLD)自然史研究。也可使用在先前的研究中来自暴露于rhASA的MLD受试者的其他匹配的历史对照数据。来自GLIA-MLD和先前的Shire研究的匹配的历史对照必须至少具有基线数据和1个基线后粗大运动功能评估数据。这些对照的纳入/排除标准与本研究的入选受试者非常相似，并且在相似的时间点进行相当的功效评估。
虽然本文已经描述和示出了几个发明性实施方案，但是本领域普通技术人员将容易地设想用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且此类变化和/或修改中的每一个被认为在本文所述的发明性实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造均意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体发明性实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，可以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本发明的实施方案。本公开的发明性实施方案涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、套件和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、套件和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。

Claims (81)

1.一种治疗异染性脑白质营养不良(MLD)的方法，所述方法包括向有需要的受试者鞘内施用治疗有效剂量的包含纯化的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白的制剂，
其中所述纯化的rhASA蛋白以蛋白聚糖图谱为特征，所述蛋白聚糖图谱包含一个或多个与中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6PASA蛋白)和混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)相对应的峰，并且
其中施用所述制剂使得稳定或降低MLD的至少一种症状的进展。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效剂量是100mg。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效剂量是150mg。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述制剂每周施用一次。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有晚婴型MLD。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中稳定或降低MLD的进展是使用粗大运动功能分类(GMFC-MLD)的变化来测量的。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述制剂使得在所述受试者中治疗2年后GMFC-MLD级别相对于基线变化≤4、≤3或≤2个级别。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述制剂使得在治疗两年后保持GMFC-MLD评分。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述保持GMFC-MLD评分是在治疗两年后GMFC-MLD相对于基线变化不大于2个级别。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述基线是在第一次施用所述制剂之前GMFC-MLD的评估评分。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中稳定或降低MLD的进展是使用粗大运动功能测试量表(GMFM-MLD)的变化来测量的。
12.如权利要求11所述的方法，其中施用所述制剂使得在治疗两年后保持GMFM-MLD评分。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述GMFM-MLD评分保持在>40。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中稳定或降低MLD的进展是通过脑脊髓液中的硫苷脂水平来测量的。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中稳定或降低MLD的进展是通过脑部N-乙酰天冬氨酸/肌酸比例(NAA/cr)来测量的。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中稳定或降低MLD的进展是使用表达语言功能分类-MLD级别(ELFC-MLD)来测量的。
17.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线GMFC-MLD级别为1-2。
18.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线GMFC-MLD级别为3。
19.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述受试者的基线GMFC-MLD级别为4。
20.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中所述受试者是症状前的。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述受试者小于18月龄。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述受试者用阿尔伯塔婴儿运动量表进行评估。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。
24.一种治疗晚婴型MLD的方法，所述方法包括：
向受试者施用包含纯化的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白的制剂，所述rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列，其中
所述纯化的rhASA蛋白以蛋白聚糖图谱为特征，所述蛋白聚糖图谱包含一个或多个与中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)和混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)相对应的峰，并且其中
所述制剂以150mg的剂量、以每周一次的间隔鞘内施用。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制剂含有小于约150ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，占所述总的纯化的重组ASA蛋白的至少约23％的所述纯化的重组ASA蛋白对应于甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的重组ASA蛋白的蛋白聚糖图谱包含：
约15％至约25％的中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)，
约35％至约45％的唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)，
约23％至约33％的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)，
约1％至约10％的N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)，和
约5％至约15％的混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述纯化的重组ASA蛋白的蛋白聚糖图谱包含：
约18％至约22％的中性ASA蛋白，
约37％至约41％的唾液酸ASA蛋白，
约26％至约29％的M6P ASA蛋白，
约4％至约6％的加帽M6P ASA蛋白，和
约7％至约9％的混合ASA蛋白。
29.一种组合物，所述组合物包含具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列的纯化的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白，其中所述纯化的rhASA蛋白以一种或多种选自以下的蛋白聚糖物质为特征：中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)或混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述总的纯化的重组ASA蛋白的至少约23％对应于甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)。
31.一种组合物，所述组合物包含具有与SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列的纯化的重组芳基硫酸酯酶A(rhASA)蛋白，其中
所述总的纯化的重组ASA蛋白的至少约23％对应于以蛋白聚糖图谱为特征的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)；并且
所述组合物含有小于约150ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
32.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约26％的量存在。
33.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白含量的至少约28％的量存在。
34.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白含量的约20％至约33％的量存在。
35.如权利要求29-34中任一项所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白包含中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)、唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)、N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)或混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)或它们的任何组合。
36.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白包含：
约23％至约33％的甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(M6P ASA蛋白)，
约15％至约25％的中性重组ASA蛋白(中性ASA蛋白)，
约35％至约45％的唾液酸化重组ASA蛋白(唾液酸ASA蛋白)，
约1％至约10％的N-乙酰葡糖胺甘露糖-6-磷酸化重组ASA蛋白(加帽M6P ASA蛋白)，和
约5％至约15％的混合重组ASA蛋白(混合ASA蛋白)。
37.如权利要求29-36中任一项所述的组合物，其中中性ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约16％至约22％的量存在。
38.如权利要求29-37中任一项所述的组合物，其中中性ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约20％至约25％的量存在。
39.如权利要求29-38中任一项所述的组合物，其中唾液酸ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约35％至约40％的量存在。
40.如权利要求29-39中任一项所述的组合物，其中唾液酸ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约37％至约42％的量存在。
41.如权利要求29-40中任一项所述的组合物，其中加帽M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约3％至约5％的量存在。
42.如权利要求29-41中任一项所述的组合物，其中加帽M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约4％至约6％的量存在。
43.如权利要求29-42中任一项所述的组合物，其中加帽M6P ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约4.5％至约5.5％的量存在。
44.如权利要求29-43中任一项所述的组合物，其中混合ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约7％至约10％的量存在。
45.如权利要求29-44中任一项所述的组合物，其中混合ASA蛋白以所述总的纯化的rhASA蛋白的约7.5％至约8.5％的量存在。
46.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白包含：
约16％至约23％的中性ASA蛋白，
约37％至约42％的唾液酸ASA蛋白，
约23％至约27％的M6P ASA蛋白，
约4％至约8％的加帽M6P ASA蛋白，和
约7％至约10％的混合ASA蛋白。
47.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白包含：
约20％至约23％的中性ASA蛋白，
约35％至约39％的唾液酸ASA蛋白，
约26％至约32％的M6P ASA蛋白，
约3％至约5％的加帽M6P ASA蛋白，和
约7％至约9％的混合ASA蛋白。
48.如权利要求30或31所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白包含：
约18％至约22％的中性ASA蛋白，
约37％至约41％的唾液酸ASA蛋白，
约26％至约29％的M6P ASA蛋白，
约4％至约6％的加帽M6P ASA蛋白，和
约7％至约9％的混合ASA蛋白。
49.如权利要求29-48中任一项所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白以约20mg/mL至约45mg/mL的浓度存在。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白以约25mg/mL至约34mg/mL或约28mg/mL至约32mg/mL的浓度存在。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述总的纯化的rhASA蛋白以约25mg/mL、约26mg/mL、约27mg/mL、约28mg/mL、约29mg/mL、约30mg/mL、约31mg/mL、约32mg/mL、约33mg/mL或约34mg/mL的浓度存在。
52.如权利要求29-51中任一项所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有约50至约130U/mL的比活性。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有约70至约100U/mg的比活性。
54.如权利要求52所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有约80至约90U/mg的比活性。
55.如权利要求52所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有约75至约95U/mg的比活性。
56.如权利要求29-55中任一项所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约140ng/mg的宿主细胞蛋白(HCP)。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约100ng/mg的HCP。
58.如权利要求56所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约80ng/mg的HCP。
59.如权利要求56所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约60ng/mg的HCP。
60.如权利要求29-59中任一项所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约100pg/mg的宿主细胞DNA(HCD)。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约50pg/mg的HCD。
62.如权利要求60所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约10pg/mg的HCD。
63.如权利要求60所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白含有小于约5pg/mg的HCD、小于约4pg/mg的HCD、小于约3pg/mg的HCD、小于约2pg/mg的HCD或小于约1pg/mg的HCD。
64.如权利要求29-63中任一项所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有与SEQID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。
65.如权利要求64所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。
66.如权利要求64所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列。
67.如权利要求64所述的组合物，其中所述纯化的rhASA蛋白具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列。
68.如权利要求29-67中任一项所述的组合物，所述组合物包含约0.001％至约0.01％的聚山梨醇酯-20(P20)。
69.一种制剂，所述制剂包含权利要求29-68中任一项所述的组合物以及生理上可接受的载体。
70.如权利要求69所述的制剂，其中所述制剂适合于静脉内施用。
71.如权利要求69所述的制剂，其中所述制剂适合于鞘内施用。
72.如权利要求69所述的制剂，其中所述制剂适合于皮下施用。
73.一种纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的方法，所述方法包括：
通过进行一个或多个色谱步骤从不纯的制备物中纯化出重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白；
合并来自所述一个或多个色谱步骤的洗脱液；
任选地将合并的洗脱液的pH调节至约6.0至约8.0的pH；
任选地使合并的洗脱液或经pH调节的洗脱液经受超滤和/或渗滤；
获得包含纯化的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的洗脱液；并且
向所述包含纯化的重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的洗脱液中添加表面活性剂。
74.如权利要求73所述的方法，包括将合并的洗脱液的pH调节至约6.0至约8.0的pH这一步骤。
75.如权利要求74所述的方法，包括使经pH调节的洗脱液经受超滤和/或渗滤这一步骤。
76.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述添加表面活性剂在冷藏所述包含纯化的重组ASA蛋白的洗脱液之前进行。
77.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以约0.0001％(v/v)至约0.01％(v/v)的浓度存在。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述表面活性剂以约0.001％(v/v)至约0.01％(v/v)的浓度存在。
79.如权利要求73-78中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯-20(P20)。
80.如权利要求73-79中任一项所述的方法，其中所述进行一个或多个色谱步骤的步骤包括按顺序进行阴离子交换色谱法、混合模式色谱法、疏水相互作用色谱法即苯基色谱法和阳离子交换色谱法。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述阴离子交换色谱法使用具有TMAE树脂的柱。
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