CN111676287B

CN111676287B - 一种基因标志物组合及其应用

Info

Publication number: CN111676287B
Application number: CN202010494245.XA
Authority: CN
Inventors: 吴孝林; 李仕良; 张志伟; 陈新周; 吴幽治; 古云娟; 邹鸿志
Original assignee: Guangzhou Kangliming Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Kangliming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: WO2021243904A1; EP4163386A1; BR112022023887A2; EP4163386A4; CN111676287A; KR20230017885A; CA3185836A1; AU2020451827B2; JP7612715B2; TWI775168B; TW202146661A; JP2023527868A; AU2020451827A1; US20230279500A1

Abstract

本发明属于生物医药领域，特别涉及肿瘤标志物、甲基化检测试剂、试剂盒及其应用。本发明通过研究发现：通过检测HOXB4、SRCIN1基因组合的甲基化水平，可以很好的区分肺癌标本。本发明的试剂经试验证实，可以高灵敏、高特异地检测和诊断肺癌，有极高的临床应用价值。

Description

一种基因标志物组合及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种基因标志物组合及其应用。

发明背景

肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1)小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感；2)非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1)中心型肺癌(central lung cancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌；2)周围型肺癌(peripheral lung cancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。

近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于Ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。

肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：

(1)血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。

(2)肿瘤标志物检查：1)CEA：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的CEA，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中CEA的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。2)NSE：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)CYFRA21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。

(3)影像学检查：1)胸部X线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部CT检查。2)CT检查：胸部CT是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。CT引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。近年来，多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。低剂量螺旋CT被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后淋巴结有无转移，也用于颈部淋巴结的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。

(4)其它检查：1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(TBNA)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应证的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。

影像学检查中的多层螺旋CT和低剂量CT(LDCT)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(NLST)已经表明LDCT相比胸部X线筛查可降低20％肺癌的死亡率。在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。风险模型通过协助临床医生改进干预措施或治疗手段，从而进一步改善肺癌患者的疗效。虽然世界已经认同针对高危人群的筛查能够降低肺癌目前较高的死亡率，但高危人群界定仍然是难以解决的问题。为了使肺癌筛查的效益-伤害比达到最大化，关键的问题第一是如何界定高危患病风险的人群；第二是用什么方法对该人群进行筛查，包括高危因素的界定，总体风险的量化汇总以及筛查效益界值的选择。

随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。

越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过DNA核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖DNA序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的CpG岛。

许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。这些生物样品比较容易获得，并且通过PCR技术将其中的DNA进行大量的扩增后能够很灵敏的检测到，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比，检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。Esteller等检测了22例非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤组织和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的启动子区异常甲基化状态，发现68％(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化；而在15例组织阳性病例中，有11例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化。

现有的肺癌检测技术中主要存在灵敏度低、假阳性高，有创，并且，目前常规检测技术难以检出早期肺癌。

而肺癌的无创检测，例如，痰液检测，难度则更大。尽管也有研究者研究肺癌患者痰液中的肿瘤标志物，然而，对比起其他肿瘤患者血液样本的肿瘤标志物检测及评估，痰液样本的成功率却很低。这主要由于以下原因：①痰液的成分比较复杂，不同的人群在不同的疾病或者环境下痰液的成分和粘度等差异比较大；②痰液中含有较多的气管上皮细胞和细菌，口腔黏膜细胞等非肺癌细胞的成分，一般的样本处理方法无法有效的富集到数目充足的肺癌来源的DNA；③有很多的吸烟患者并不表现出咳痰。AJ Hubers等人在《Molecularsputum analysis for the diagnosis of lung cancer》中对过去10篇文献研究显示，肺癌组织中标志物的中位数的甲基化程度为48％，而痰液的中位数的甲基化程度为38％，结果显示甲基化标志物在组织中的检出率明显高于痰液。同时，Rosalia Cirincione(Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancerpatientsdetected by spiral computed tomography:A nested case–contro)报道了RARbeta2、P16、RASSF1A在肺癌组织中检出率分别达到65.5％、41.4％、51.7％，而在痰液中分别只有44.4％、5％、5％。

目前肺癌的漏检率较高。特别是，对于腺癌这种类型，痰液无创检测更加是难上加难，检出率极其低。这是因为，多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，肺深部的脱落细胞更加难以通过痰液咳出。因此，目前腺癌的痰液检测手段几乎为零。

降低漏检率在肿瘤早期筛查中是尤其重要的。如果一个肿瘤早期筛查产品无法将所有或绝大部分的病患筛查出来的话，那么漏检的那些将无法得到足够的风险提示，从而延误的治疗时机，这对患者来说是一个巨大的损失。

尽管现有技术中已经发现了一些肺癌相关的肿瘤标志物，但是，受限于针对这些肿瘤标志物的检测试剂或者检测手段，导致这些肿瘤标志物的灵敏度和特异性不能满足需求，因此，目前本领域中仍然需要进一步研究能够切实地应用于肺癌的筛查手段。然而，虽然无创式的筛查具有取样方面独到的优势，然而，其也具有其他方面的一些局限，例如，肺癌中的腺癌这种类型，由于其肺深部的脱落细胞难以通过痰液咳出，通常说来，本领域技术人员会认为该种类型的肺癌不适宜采用无创筛查。另一方面，即使是其他类型的肺癌，目前已报道的无创筛查方法也很难达到临床使用的要求。尽管相关研究已进展多年，但至今仍未有可以推向临床的肺癌无创筛查方法。

发明内容

本申请的目的之一在于提供一种基因标志物组合，以及检测该基因标志物组合的检测/诊断试剂及其应用。

一方面，本申请提供了一种基因标志物组合，所述基因标志物包括HOXB4和SCRIN1。

本申请的基因标志物组合，还包括了各基因标志物中的任意长度的片段，也就是说，来自HOXB4、SCRIN1各自任意一个片段(该片段可以为任意长度)组合，均落入本申请的保护范围中。

HOXB4基因是Antp同源盒基因家族的一员，属于染色体17上的同源盒B簇基因。编码带有同源盒DNA结合结构域的核蛋白，编码的蛋白作为参与发育的特异性序列转录因子。该蛋白的细胞内或异位表达可在体内和体外扩增造血干细胞和祖细胞，使其成为治疗性干细胞扩增的潜在候选者。

SRCIN1(SRC kinase signaling inhibitor 1)全称为SRC激酶信号传导抑制基因1。SRCIN1基因和蛋白质作为SRC的负调控因子，通过激活CSK抑制SRC活性和下游信号传导，导致细胞扩散和迁移受损。调节树突棘的形态。参与钙依赖性的胞吐作用。

本申请还提供了多基因的甲基化联合检测试剂在制备肺癌检测试剂或者试剂盒中的应用，所述基因包括HOXB4和SCRIN1。

本申请还提供了一种多基因甲基化联合检测试剂或试剂盒，包括HOXB4和SRCIN1基因的甲基化检测的试剂。

“甲基化检测试剂”，包括以下内容：针对所述基因或基因内容的更小/短的任意序列进行检测的试剂。也就是说，任意针对所述基因中的任意位点(例如，一段更小的片段)进行的检测及检测试剂，均落入本申请的保护范围中。

本申请中的基因标志物HOXB4和SCRIN1是联合检测的，也就是说，本发明中的几个基因标志物是同时被检测的。

本申请中的“检测”同诊断，除了肺癌的早期诊断，还包括肺癌中期和晚期的诊断，且也包括肺癌筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。

肺癌标志物组合HOXB4和SCRIN1的应用使得肺癌的早期诊断成为可能。当确定在癌症细胞中甲基化的基因在临床上或形态学上正常表象的细胞中甲基化时，这就表明该正常表象的细胞向癌症发展。这样，肺癌可在早期通过在正常表象的细胞中的肺癌特异性HOXB4和SCRIN1基因组合的甲基化而诊断。

其中，早期诊断包括在转移之前发现癌症的可能性，优选在可观察到组织或者细胞的形态学变化之前。

除了肺癌的早期诊断，本发明的试剂/试剂盒还有希望用于肺癌筛选、风险评估、预后诊断、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。

作为病症阶段可选的实施方式，可通过在肺癌在不同阶段或时期的进展可通过从样品中获取的HOXB4和SCRIN1基因组合的甲基化程度的测量进行诊断。通过比较从肺癌的每个阶段的样品中分离出的核酸的HOXB4和SCRIN1基因组合甲基化程度与从没有细胞增殖性异常的组织中的样品中分离出的一个或多个核酸的HOXB4和SCRIN1因组合甲基化程度，可检测样品中肺癌的具体阶段。

通常来说，CpG岛是指富含CpG二核苷酸的一些区域，通常位于启动子及其附近的区域，本发明中的CpG岛，不仅指启动子及其附近的区域富含CpG二核苷酸，也包括杂合甲基化的CpG位点，或者是孤立的CpG位点。

所述的HOXB4和SCRIN1基因组合的甲基化联合检测试剂可以是现有技术中的甲基化检测试剂。现有技术中，已经有多种方法可以检测目的基因的甲基化，如甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性定量PCR(qMSP)、甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性内切酶、重亚硫酸盐测序法或者焦磷酸测序等等。每种检测方法均有其相对应的试剂，这些试剂均可以用于本发明检测HOXB4和SCRIN1基因组合的甲基化。

本申请还提供了HOXB4和SCRIN1基因组合的甲基化联合检测试剂，包括针对HOXB4和SCRIN1基因组合中每个基因的引物和/或探针。

在本申请的一些具体的实施方案中，包括针对HOXB4和SCRIN1基因组合中每个基因的CpG岛获得的引物和/或探针。

在本申请的一些具体的实施方案中，引物和/或探针通过quantitativeMethylation-Specific PCR(qMSP)检测HOXB4和SCRIN1基因组合中的每个基因的甲基化。

在本申请的一些具体的实施方案中，本申请提供的甲基化检测试剂通过检测HOXB4和SCRIN1基因组合中的每个基因的基因体、基因间区或启动子区及启动子区附近区域的甲基化水平。

在一些实施方案中，本申请提供的甲基化检测试剂包括针对HOXB4和SCRIN1基因组合中的每个基因的启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的引物和/或探针。

在一些实施方案中，本申请提供的甲基化检测试剂中所述HOXB4基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

I、具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列；及

II、如I所示序列的互补序列；和/或

所述HOXB4基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

III、具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；

IV、如III所示序列的互补序列；和/或

所述SRCIN1基因的甲基化检测的引物中的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

V、具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列；及

VI、如V所示序列的互补序列；和/或

所述SRCIN1基因的甲基化检测的引物中的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

VII、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；及

VIII、如VII所示序列的互补序列；

在一些实施方案中，所述HOXB4基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO.:1和SEQID NO.:2所示。

在一些实施方案中，所述HOXB4基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO.:16和SEQ ID NO.:17所示.

所述HOXB4基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20所示。

在一些实施方案中，所述SRCIN1基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示。

在一些实施方案中，所述SRCIN1基因的甲基化检测的引物对如SEQ ID NO.:22和SEQ ID NO.:5所示。

在一些实施方案中，所述HOXB4基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

IX、具有SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:21所示的核苷酸序列；及

X、如IX所示序列的互补序列；和/或

所述SRCIN1基因的甲基化检测的探针具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

XI、具有SEQ ID NO.:6所示的核苷酸序列；及

XII、如XI所示序列的互补序列。

在一些实施方案中，所述肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。

本申请还提供了一种检测肺癌的试剂盒，包括所述的甲基化联合检测试剂。

在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒还包括试剂盒中的常用试剂，如qMSP中常用转化剂，用于将非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。又如扩增基因中常用的DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺离子和缓冲液等等。

在一些实施方案中，所述的试剂或试剂盒还包括内参基因的检测试剂。

在一些实施方案中，所述的内参基因为β-actin。

在一些实施方案中，所述的内参基因的检测试剂为针对内参基因的引物和探针。

在一些实施方案中，所述的内参基因的检测试剂为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的引物对和SEQ ID NO：15所示的探针。

本申请提供了HOXB4和SCRIN1基因的甲基化联合检测试剂在制备肺癌检测试剂或者试剂盒中的应用。

本申请提供了一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22所示序列，和它们互补序列中的至少任意一条。

本申请提供了一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示序列，和它们互补序列中的至少任意一条。

作为本申请优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的至少一对引物对

作为本申请优选的实施方式，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的引物对。

另一方面，本发明还提供了一种核酸探针，所述核酸探针选自SEQ ID NO：3、SEQID NO：6、SEQ ID NO.:18和SEQ ID NO.:21所示序列，和它们互补序列中的至少任意一条。

作为本发明优选的实施方式，所述核酸探针选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的序列。

在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物对；第二容器，其包含探针。

本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、引物、探针在制备甲基化检测的试剂或试剂盒，或者制备检测肺癌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、引物、探针在甲基化检测中的应用，或者在检测肺癌中的应用。

本发明还提供了一种肺癌的检测系统，所述的系统包含有以下构件：

(1)HOXB4和SRCIN1基因的甲基化联合检测构件：

(2)数据处理构件；

(3)结果输出构件。

在一些实施方案中，所述的甲基化检测构件含有甲基化检测仪器。

在一些实施方案中，所述的甲基化检测构件还含有所述的甲基化联合检测试剂、试剂盒、引物、探针。

在一些实施方案中，所述的甲基化检测仪器包含荧光定量PCR仪、PCR仪、测序仪中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述的数据处理构件含有数据处理机器。

所述的数据处理机器包括本领域技术人员可使用的任何可以进行数据处理的设备或仪器或装置。

在一些实施方案中，所述的数据处理机器包含计算器、计算机中的一种或多种。

所述的计算机中附载有本领域技术人员可使用的任何可以进行数据处理或统计分析的软件或程序。

在一些实施方案中，所述的计算机包含附载有SPSS、SAS、Excel中一种或多种软件的计算机。

在一些实施方案中，所述的结果输出构件含有结果输出器。

所述的输出器包含任何可以将数据处理结果显示为可阅读的内容的设备或仪器或装置。

在一些实施方案中，所述的甲基化检测构件还含有所述的多基因的甲基化联合检测试剂。

在一些实施方案中，所述的结果输出器包含屏幕、纸质报告中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述的数据处理器被配置于a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待测样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于测试者罹患肺癌的概率或者可能性。

在一些实施方案中，所述的结果输出构件用于输出测试者罹患肺癌的概率或者可能性。

在一些实施方案中，数据处理构件的判断标准为：根据界值判断肺癌标本和正常标本。

在一些实施方案中，本申请的HOXB4与SRCIN1联合检测，还可以通过多重PCR的方式实现。

在一些实施方案中，根据目标基因即HOXB4、SRCIN1的Cp值和/或ΔCp值(ΔCp值＝Cp_靶向基因-Cp_内参基因)来判断标本的甲基化水平。

在一些实施方案中，标本中的Cp值的界值取值范围为35～39，ΔCp值的界值取值范围为4～12。

在一些实施方案中，HOXB4与SRCIN1联合检测，在组织标本中，HOXB4的ΔCp值的界值为5.4，SRCIN1的ΔCp值的界值6.5；只要其中一个基因在所述组织标本中的ΔCp值小于所述ΔCp值的界值则判断为肺癌标本，只有两个基因在所述组织标本的ΔCp值同时大于等于所述ΔCp值的界值则判断为正常标本。

在一些实施方案中，HOXB4与SRCIN1联合检测，在痰液标本中，HOXB4与SRCIN1的阈值线Cp值分别为：36.9和37.0。当单个基因检测结果中的一项小于前述阈值，则可判定为阳性(即肺癌标本)，若检测结果中2项结果均大于或等于相对应的阈值，则可判定为阴性(即正常标本)。

在一些实施方案中，HOXB4与SRCIN1多重PCR检测，在痰液标本中的Cp值的界值为36.7，在灌洗液标本中的Cp值的界值为37.2和ΔCp值的界值为9。

在一些实施方案中，HOXB4与SRCIN1多重PCR检测，在所述痰液标本的Cp值小于所述Cp值的界值则判断为肺癌标本，所述痰液标本的Cp值大于等于所述Cp值的界值则判断为正常标本。

在一些实施方案中，HOXB4与SRCIN1多重PCR检测，在所述灌洗液标本的Cp值和ΔCp值任何一个数值小于所述Cp值和ΔCp的界值则判断为肺癌标本，所述灌洗液标本的Cp值和ΔCp值均大于等于所述Cp值和ΔCp值的界值则判断为正常标本。

在一些实施方案中，所述肿瘤为肺癌。

在一些实施方案中，所述肿瘤为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。

在一些实施方案中，所述针对的待测样本或者样本类型选自肺泡灌洗液、组织、胸水、痰液、血液、血清、血浆、尿液、前列腺液或粪便中的至少一种。

在一些实施方案中，本发明所述的样本选自肺泡灌洗液、组织、痰液中的至少一种。

在一些实施方案中，本发明所述的样本选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。

本发明通过研究发现：在一些具体的实施方案中，通过检测HOXB4和SRCIN1基因组合，可以很好的从样本中区分出肺癌样本。对肺癌的检测敏感性和特异性极高。

附图说明

图1为不同标志物组合在组织样本中检测的ROC曲线；

图2为不同标志物组合在痰液样本中检测的ROC曲线；

图3为HOXB4与SRCIN1联合检测灌洗液标本中检测的扩增曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

本申请中，“正常”样本指分离自已知无所述癌症或肿瘤的个体的相同类型的样本。

本申请甲基化检测的样本包括但不限于DNA，或RNA，或含mRNA的DNA和RNA样品、或DNA-RNA杂交体。其中DNA或者RNA可为单链或双链。

本申请中，“甲基化水平”同“甲基化程度”，通常可以表示为甲基化胞嘧啶的百分比，其为甲基化的胞嘧啶数量除以甲基化胞嘧啶的数量与未甲基化胞嘧啶数量的总和；以及目前普遍采用甲基化靶向基因数量除以内参基因数量的方法来表示甲基化水平；以及其他现有技术中甲基化水平表示方法。

本申请中“样本”同“标本”。

实施例1

发明人筛选了数百个基因，在组织样本中进行筛选，以β-actin基因作为内参基因，比较HOXB4、SRCIN1、PCDHGA12、HOXD8基因的两两联合检测结果，各基因检测引物探针如下：

HOXB4的检测引物和探针为：

SEQ ID NO：1HOXB4-F1引物F：TTCGTCGTTTTCGTTATCATTC

SEQ ID NO：2HOXB4-R1引物R：TACTAACCGCCTCGCTAC

SEQ ID NO：3HOXB4-P1探针P：

FAM-CGGGTTTTTGCGTCGTTATTCGTC-BQ1

SRCIN1的检测引物和探针为：

SEQ ID NO：4SRCIN1引物F：TCGTGTGTCGTCGTTCAGAC

SEQ ID NO：5SRCIN1引物R：GAAATACCCGCGAAAATACTG

SEQ ID NO：6SRCIN1探针P：

FAM-AGTTTTACGTTGGAGAAGCGTCGG-BQ1

PCDHGA12的检测引物和探针为：

SEQ ID NO：7PCDHGA12引物F：TTGGTTTTTACGGTTTTCGAC

SEQ ID NO：8PCDHGA12引物R：AAATTCTCCGAAACGCTCG

SEQ ID NO：9PCDHGA12探针P：

FAM-ATTCGGTGCGTATAGGTATCGCGC-BQ1

HOXD8的检测引物和探针为：

SEQ ID NO：10HOXD8引物F：TTAGTTTCGGCGCGTAGC

SEQ ID NO：11HOXD8引物R：CCTAAAACCGACGCGATCTA

SEQ ID NO：12HOXD8探针P：

FAM-AAAACTTACGATCGTCTACCCTCCG-BQ1

β-actin的检测引物和探针为：

SEQ ID NO：13β-actin引物F：GGAGGTTTAGTAAGTTTTTTGGATT

SEQ ID NO：14β-actin引物R：CAATAAAACCTACTCCTCCCTTA

SEQ ID NO：15β-actin探针P：FAM-TTGTGTGTTGGGTGGTGGTT-BQ1实验过程：

1、提取DNA

收集确诊肺癌患者的标本和非肺癌患者的标本，分别包括石蜡组织标本、痰液标本、灌洗液标本。样品经过预处理及分离细胞后，按美基生物公司试剂盒HiPure FFPE DNAKit(D3126-03)说明书进行DNA提取。

2、DNA修饰

以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation^TM KIT(D5002)说明进行重亚硫酸氢盐修饰。

3、扩增与检测

表1配液体系

扩增体系：各检测基因的扩增体系见表2、表3。

表2 HOXB4、SRCIN1和β-actin扩增体系

表3 PCDHGA12和HOXD8的扩增体系

4、检测结果

样本信息：肺组织样本共计169例，其中正常组织样本91例，癌组织样本78例，78例癌症组样本中有鳞癌27例，腺癌38例，小细胞癌3例，大细胞癌4例，复合型癌1例，未明确分类的肺癌5例，其中癌和癌旁对照样本77对。

以ACTB作为内参基因，根据靶向基因即HOXB4、SRCIN1的ΔCp值(ΔCp值＝Cp_靶向基因-Cp_ACTB)来判断标本的甲基化水平，HOXB4与SRCIN1的阈值线分别为：ΔCp值＝5.4，ΔCp值＝6.5。当检测结果中的一项小于以上阈值，则可判定为阳性，若检测结果中2项结果均大于或等于相对应的阈值，则可判定为阴性。

PCDHGA12的阈值线为Cp值＝25.9，HOXD8的阈值线为Cp值＝27.4，当各标志物检测结果大于或等于对应的阈值线时则可判定为阴性；若标志物检测结果小于对应的阈值线则可判定为阳性。

HOXB4与SRCIN1联合、HOXB4与PCDHGA12联合、HOXB4与HOXD8联合在所有组织标本中检测的ROC曲线图1所示。各基因在组织中检测的统计结果表3所示。

表3组织中的检测结果

表3(续)

从以上结果可以看出，在组织样本中HOXB4与SRCIN1联合检测，正常组和全部癌症组比较，特异性为97.8％，灵敏度89.7％，与另外两组联合检测相比，HOXB4与SRCIN1联合检测在特异性一致的情况下有更高的灵敏度。此外，HOXB4与SRCIN1联合检测相较于HOXB4、SRCIN1单独检测，非显而易见地，显著提升了灵敏度。

根据以上结果，HOXB4和SRCIN1在组织样本中，在高特异性下，仍然具有较高的灵敏度。特别是通过联合检测，在基本不影响特异性的情况下，灵敏度有非常大的提升。痰液作为无创性的检测样本，在肺癌诊断上更具重要意义，为此，发明人对HOXB4和SRCIN1这2个标志物在痰液中进行检测。

实施例2：HOXB4和SRCIN1基因在痰液中的检测

样本信息：测试痰液样本共计107例，其中正常对照组样本51例，癌症组样本56例，56例癌症组样本中有鳞癌20例，小细胞癌8例，腺癌20例，大细胞癌1例，巨细胞癌1例，未明确分类的肺癌6例。

试验过程：

a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的痰液标本，使用NaOH解稠后，离心取沉淀分离细胞，使用PBS洗涤2遍，然后使用美基生物(Magen)公司的DNA提取试剂盒(HiPureFFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。

b.使用ZYMO RESEARCH生物公司的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation Kit，D5002)进行DNA的重亚硫酸氢盐修饰。

c.各基因标志物的引物探针序列、配液体系及扩增体系与实施例1相同。

d.根据靶向基因即HOXB4、SRCIN1的Cp值来判断标本的甲基化水平，HOXB4与SRCIN1的阈值线Cp值分别为：36.9和37.0。当单个基因检测结果中的一项小于前述阈值，则可判定为阳性，若检测结果中2项结果均大于或等于相对应的阈值，则可判定为阴性。

PCDHGA12、HOXD8：PCDHGA12的阈值线为Cp值＝23.48，HOXD8的阈值线为Cp值＝26.4，当各标志物检测结果大于或等于对应的阈值线时则可判定为阴性；若标志物检测结果小于对应的阈值线则可判定为阳性。

e.检测结果如下：

表4痰液中的检测结果

表4(续)

HOXB4和SRCIN1在痰液标本中检测的ROC曲线见图2，统计结果见表4，从以上结果可以看出，在痰液样本中，HOXB4和SRCIN1联合检测时，正常组和全部癌症组比较，对肺癌的灵敏度提达到76.8％；正常组和全部小细胞癌组比较，灵敏度能达到100％。相对于单个基因标志物，HOXB4的检出率为64.3％，SRCIN1的检出率为48.2％，二者联合检测时，对肺癌的灵敏度提升到76.8％，二者具有协同性。

实施例3：HOXB4和SRCIN1基因多重PCR体系优化

基于以上结果显示HOXB4和SRCIN1基因的联合检测可明显提高肺癌的检出率，本发明人通过多重PCR方式对PCR体系进行优化，从而简化检测流程，并在实施例2的样本基础上进行验证。各基因检测引物探针如下：

HOXB4、SRCIN1和β-actin的检测引物和探针序列与实施例1相同。

a.痰液样本处理同实施例2；

b.配液体系如下：

表5配液体系

反应组份	加入量(μl)
		HOXB4-F1(100μM)	0.125
HOXB4-R1(100μM)	0.125
		HOXB4-P1(100μM)	0.05
SRCIN1-F1(100μM)	0.125
		SRCIN1-R1(100μM)	0.125
SRCIN1-P1(100μM)	0.05
		β-actin-F1(100μM)	0.125
β-actin-R1(100μM)	0.125
		β-actin-P2(100μM)	0.05
镁离子(25mM)	6
		dNTPs(10mM)	1
Taq聚合酶(5unit/μl)	0.5
		5X缓冲液	6
灭菌水	10.6
		模板DNA	5
总体积	30

c.扩增体系与实施例1表2的扩增体系相同；

d.根据靶向基因即HOXB4、SRCIN1多重PCR的Cp值来判断标本的甲基化水平，HOXB4与SRCIN1多重PCR检测的阈值线Cp值为：36.7。当单个基因检测结果中的一项小于前述阈值，则可判定为阳性，若检测结果大于或等于阈值，则可判定为阴性。

e.检测结果如下表6：

表6检测结果

结果显示HOXB4与SRCIN1多重PCR体系的检测结果与实施例2中的检测结果基本保持一致。表明该多重PCR体系检测结果可作为HOXB4与SRCIN1基因联合检测肺癌的结果判定。

实施例4：HOXB4和SRCIN1基因在灌洗液液中的检测

样本信息：测试肺泡灌洗液样本共计387例，其中正常对照组样本303例，癌症组对照样本84例，84例癌症组样本中有鳞癌21例，腺癌40例，小细胞癌10例，未明确肺癌类型13例。

HOXB4、SRCIN1和β-actin的检测引物和探针序列与实施例1相同。

试验过程：

a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液标本，离心分离细胞，然后使用美基生物公司的DNA提取试剂盒(HiPure FFPE DNA Kit，D3126-03)提取DNA。

c.配液体系和扩增体系与实施例3相同。

d.检测结果如下：

以ACTB作为内参基因，根据靶向基因即HOXB4、SRCIN1的Cp值和ΔCp值(ΔCp值＝Cp_靶向基因-Cp _ACTB)来判断标本的甲基化水平，HOXB4与SRCIN1的阈值线为：Cp值＝37.2，ΔCp值＝9。当检测结果中的一项小于以上阈值，则可判定为阳性，若检测结果中2项结果均大于或等于阈值，则可判定为阴性。387例灌洗液标本的检测结果如下：

表7检测结果

HOXB4与SRCIN1联合检测在所有灌洗液标本中检测的扩增曲线见图3，统计结果见表7。从以上结果可以看出，HOXB4与SRCIN1联合检测在96.0％的高特异性下，灵敏度达到77.4％；按照肺癌的亚型进行比较分析，鳞癌组HOXB4与SRCIN1联合检测的检出率为71.4％。特别是对腺癌的检测效果，HOXB4与SRCIN1联合检测的灵敏性高达到75.0％，这一突破对腺癌的检测具有重大的意义。因为腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺泡灌洗液不容易接触到肺深部的肺泡或者癌组织。

实施例5不同标志物组合在痰液样本的检测结果

发明人同时比较了不同标志物组合在痰液样本中的检测情况，对比的组别如下：

组合1：HOXB4+SRCIN1

组合2：HOXB4+PCDHGA12

组合3：SRCIN1+PCDHGA12

组合4：HOXB4+HOXD8

组合5：SRCIN1+HOXD8

组合6：SRCIN1+PCDHGA12+HOXD8

组合7：SRCIN1+HOXB4+HOXD8

具体实验条件及操作同实施例2。

在107例痰液样本对不同标志物组合进行检测，其中正常对照组样本51例，癌症组样本56例，各组合的检测结果如表8：

表8(正常组vs.全部癌症组)

组合1

组合2

组合3

组合4

组合5

组合6

组合7

灵敏度

76.8％

64.3％

46.4％

66.1％

53.6％

76.8％

特异性

92.2％

94.1％

90.2％

92.2％

AUC

0.870

0.810

0.848

0.833

0.883

0.832

0.892

表8的结果表明不同标志物组合对痰液样本肺癌检出率有较大的影响。分析组合1、组合2、组合3、组合4和组合5的结果显示，不同标志物两两组合的检测结果差异较大，而组合1中通过HOXB4与SRCIN1联合检测其特异性为92.2％，灵敏度为76.8％，综合检测性能远远高于其他4个组合。分析组合3、组合5、组合6或组合1、组合7，结果显示额外增加标志物并不一定能提高检出率，反而有可能降低其特异性。结果表明，并非任意的基因标志物组合能够如本发明的组合1一样，在灵敏度、特异性及AUC这3个指标上有综合最佳的效果。非显而易见地，增加目标基因标志物的数量进行联合检测(如组合6，7)，也并未相应地提升特异性和灵敏度。

实施例6引物探针组合的选择

引物和探针也对肿瘤标志物的检测效果有极大的影响，发明人在研究过程中，设计了多对引物及其对应的探针，以寻找到尽可能提高检测灵敏度和特异性的探针和引物，以使本发明的检测试剂能够实际应用到临床检测中。

在40例痰液样本对不同引物探针组合进行检测，其中正常对照组样本15例，癌症组对照样本25例。

表9引物和探针

各配液体系均一致，配液体系、各扩增程序均一致，扩增程序同实施例2。

检测结果如表10、11所示。

表10HOXB4在痰液样本中的检测结果(正常组vs.全部癌症组)

组别	特异性	灵敏性
			F1，R1，P1	93.3％	72.0％
F2，R2，P2	93.3％	44.0％
			F3，R3，P3	93.3％	68.0％

表11SRCIN1在痰液样本中的检测结果(正常组vs.全部癌症组)

组别	特异性	灵敏性
			F1，R1，P1	93.3％	56.0％
F2，R1，P1	93.3％	52.0％

结果表明针对同一区域的不同引物对，对检测结果会产生影响。在特异性一致的情况下，HOXB-F1，HOXB-R1，HOXB-P1和SRCIN1-F1，SRCIN1-R1，SRCIN1-P1的引物和探针组合有更高的灵敏性。

序列表

<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司

<120> 一种基因标志物组合及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4 引物F

<400> 1

ttcgtcgttt tcgttatcat tc 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4 引物R

<400> 2

tactaaccgc ctcgctac 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4 探针P

<400> 3

cgggtttttg cgtcgttatt cgtc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SRCIN1 引物F

<400> 4

tcgtgtgtcg tcgttcagac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SRCIN1 引物R

<400> 5

gaaatacccg cgaaaatact g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SRCIN1 探针P

<400> 6

agttttacgt tggagaagcg tcgg 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCDHGA12上游引物

<400> 7

ttggttttta cggttttcga c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCDHGA12下游引物

<400> 8

aaattctccg aaacgctcg 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PCDHGA12探针

<400> 9

attcggtgcg tataggtatc gcgc 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXD8上游引物

<400> 10

ttagtttcgg cgcgtagc 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXD8下游引物

<400> 11

cctaaaaccg acgcgatcta 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXD8探针

<400> 12

aaaacttacg atcgtctacc ctccg 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> β-actin上游引物

<400> 13

ggaggtttag taagtttttt ggatt 25

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> β-actin下游引物

<400> 14

caataaaacc tactcctccc tta 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> β-actin探针

<400> 15

ttgtgtgttg ggtggtggtt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4上游引物

<400> 16

attcgttcgg gtattacgtc 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4下游引物

<400> 17

ccaaaatccc gacaaaccg 19

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4检测探针

<400> 18

cggttagagg cgagagagta gttt 24

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4上游引物

<400> 19

cgggtttcgg gcggcgcgc 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4下游引物

<400> 20

cgaacgataa cgaaaacgac g 21

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOXB4检测探针

<400> 21

amcgtgtatc gtgtagcgtt acgcggb 27

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SRCIN1上游引物

<400> 22

tatcgtgtat cgtcgttcgg ac 22

Claims

1.一种肺癌检测引物对及探针组合，其特征在于，所述引物对及探针组合由定量检测HOXB4和SRCIN1基因的甲基化程度的检测引物对及探针组成，其中，HOXB4基因的甲基化程度的检测引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：3；SRCIN1基因的甲基化程度的检测引物对为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，探针为SEQ ID NO：6。

2.定量检测多基因的甲基化程度的联合检测试剂在制备肺癌检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述基因由HOXB4和SRCIN1组成，所述检测试剂含有如权利要求1所述的引物对及探针组合。

3.一种用于肺癌诊断的多基因甲基化程度的联合检测试剂，其特征在于，所述检测试剂含有如权利要求1所述的引物对及探针组合。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂所针对的待测样本选自肺泡灌洗液、肺部组织、痰液中的至少一种。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂所针对的待测样本选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。

8.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于：所述的肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

9.如权利要求8所述的检测试剂，其特征在于，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。

10.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂所针对的待测样本选自肺泡灌洗液、肺部组织、痰液中的至少一种。

11.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂所针对的待测样本选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。

12.一种肺癌的检测系统，其特征在于，所述的系统包含有以下构件：

(1) 定量检测HOXB4和SRCIN1基因的甲基化程度的联合检测构件；

(2)数据处理构件；

(3)结果输出构件；

所述的定量检测HOXB4和SRCIN1基因的甲基化程度的联合检测构件含有如权利要求3所述的多基因甲基化程度的联合检测试剂。

13.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述的甲基化程度的联合检测构件含有甲基化检测仪器。

14.如权利要求13所述的检测系统，其特征在于，所述的甲基化检测仪器选自荧光定量PCR仪、测序仪。

15.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述的数据处理构件含有数据处理机器。

16.如权利要求15所述的检测系统，其特征在于，所述的数据处理机器选自计算器、计算机。

17.如权利要求16所述的检测系统，其特征在于，所述的计算机包含附载有SPSS、SAS、Excel中一种或多种软件的计算机。

18.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述的结果输出构件含有结果输出器。

19.如权利要求18所述的检测系统，其特征在于，所述的结果输出器选自屏幕、纸质报告。

20.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述的数据处理构件被配置于a.接收待测样本以及正常对照样本的测试数据；b.储存待测样本以及正常对照样本的测试数据；c.比对同种类型的待测样本以及正常对照样本的测试数据；d.根据比对结果，响应于测试者罹患肺癌的概率或者可能性。

21.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述的结果输出构件用于输出测试者罹患肺癌的概率或者可能性。

22.如权利要求12所述的检测系统，其特征在于，所述数据处理构件的判断标准为：通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。

23.如权利要求12-22任一所述的检测系统，其特征在于，所述肺癌选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

24.如权利要求23所述的检测系统，其特征在于，所述的非小细胞肺癌选自鳞状细胞癌、腺癌。

25.如权利要求12-22任一所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统所针对的待测样本选自肺泡灌洗液、肺部组织、痰液中的至少一种。

26.如权利要求12-22任一所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统所针对的待测样本选自肺泡灌洗液或痰液中的至少一种。