CN111662387A

CN111662387A - 抗人脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111662387A
Application number: CN202010671636.4A
Authority: CN
Inventors: 易维京; 蔡方琴; 汤定斌; 张艳军; 张丽华; 罗嘉
Original assignee: Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2020-09-15

Abstract

本发明公开了抗Lp‑PLA2单克隆抗体及其应用，所公开的抗Lp‑PLA2单克隆抗体，具有良好的稳定性和特异性，能够作为制备Lp‑PLA2诊断试剂的关键原料，且具有抗脂蛋白和同族蛋白干扰的能力，与脂蛋白结合或与PLA2同族蛋白混合都不会影响检测结果。采用该单克隆抗体可开发出特异性好、准确度高的诊断检测试剂盒，能够成功检测出健康人与心血管疾病患者血清中Lp‑PLA2的区别，特别是在阿尔兹海默症患者血清中存在PLA2同族蛋白干扰的情况下，也能检测出正确结果。

Description

抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipaseA2(Lp-PLA2))，是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶A2(PLA2)超家族中的一员，Lp-PLA2的基本功能是催化多种氧化磷脂Sn-2位上醋键水解，产生游离脂肪酸和溶血磷脂。此外，Lp-PLA2还能水解血小板活化因子等致炎因子。Lp-PLA2的浓度能够反映动脉粥样硬化斑块的形成及严重程度，因此临床上用于预警心血管突发事件，评估冠心病、脑卒中的发生及复发风险。

目前基于Lp-PLA2酶活性的检测试剂盒在临床上得到了广泛应用。但由于Lp-PLA2同家族的其它磷脂酶所具有的酶活性的干扰，以及受检测环境的影响等因素，使得酶法特异性不够高。同时由于酶法方法学的局限性使得酶法的检测灵敏度也不高。基于蛋白浓度测定的检测方法因为基于抗原抗体的特异性相互作用，所以检测特异性更高。但在临床使用对比中发现，基于酶活性的检测方法以及基于蛋白浓度的检测方法所得结果相关性较差。研究表明血液中的Lp-PLA2蛋白主要与富含载脂蛋白(Apo)B的脂蛋白结合。与Lp-PLA2结合的脂蛋白会掩盖Lp-PLA2上的抗体结合表位，直接干扰抗体与Lp-PLA2的特异性结合，从而使得检测结果不能反映Lp-PLA2的真实浓度。

除此以外，对于阿尔兹海默症以及精神分裂症确诊的情况下，会伴随着大脑的氧化应激反应、炎症等状况出现，同时伴随PLA2G3或者PLA2G12A表达量的升高。这两种都是属于磷脂酶A2家族的成员，其升高会带来对Lp-PLA2诊断检测的干扰。并最终导致与酶法的检测结果相关性差。

因此，能够耐受脂蛋白和其他磷脂酶A2家族的蛋白的特异性抗人Lp-PLA2的单克隆抗体，或抗体对，对于开发更精准更简便的心脑血管疾病检测试剂具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供对人Lp-PLA2有高亲和力的抗体，该抗体能抗脂蛋白和同家族其他蛋白的干扰。

本发明的目的之一在于提供一种分离的DNA分子，编码所述抗Lp-PLA2人源抗体的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。

抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；

b)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；

c)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；

d)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；

e)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；

f)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；

上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-A

或

a)如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；

b)如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；

c)如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；

d)如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；

e)如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；

f)如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；

上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-B

优选地，所述单克隆抗体LP-A或LP-B特异性结合人Lp-PLA2蛋白，结合位点位于PLA2G3或PLA2G12A蛋白的结合区域之外。

优选地，所述单克隆抗体LP-A或LP-B结合位点位于脂蛋白结合区域之外。

本发明另一方面提供一种Lp-PLA2的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有上述单克隆抗体LP-A或LP-B。

优选地，所述检测试剂盒利用LP-A和LP-B同时识别Lp-PLA2蛋白，测定Lp-PLA2蛋白浓度。

本发明的另一方面提供一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的上述单克隆抗体。

本发明还涉及一种偶联物，由上述单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

本发明还涉及上述单克隆抗体、结合物或偶联物在制备检测LP-A或LP-B表达的产品中的应用。

有益效果：

本发明的单克隆抗体LP-A或LP-B都能够抗脂蛋白和磷脂酶A2同族蛋白的干扰，所以对Lp-PLA2有很高的亲和力，减少假阳性结果。在动物细胞中高效表达，可用于工业化生产。

附图说明

图1：重组蛋白Lp-PLA2纯化；

图2：单克隆抗体的生产纯化；

图3：单克隆抗体稳定性鉴定；

图4：胶体金免疫层析标曲；

图5：Lp-PLA2含量胶体金免疫层析抗脂蛋白干扰实验；

图6：Lp-PLA2含量胶体金免疫层析抗同族蛋白干扰实验；

图7：胶体金免疫比浊试剂盒标曲；

图8：Lp-PLA2含量胶体金免疫比浊试剂盒抗脂蛋白干扰实验；

图9：Lp-PLA2含量胶体金免疫比浊试剂盒抗同族蛋白干扰实验。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案。实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

实施例1：重组蛋白Lp-PLA2的表达纯化

将人Lp-PLA2基因序列克隆至原核表达载体构建原核表达质粒，该表达质粒转化大肠杆菌BL21后用含有抗生素的LB平板培养。挑取单克隆接种至LB培养基。培养至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG诱导蛋白的表达。诱导16小时之后离心收集菌液。菌体经破碎以后离心收集上清，并采用离子交换以及分子筛纯化得到抗原蛋白。

如图1所示，泳道1：购买的Lp-PLA2蛋白；泳道2：本研究中表达纯化得到的Lp-PLA2抗原蛋白，结果显示市面上销售的Lp-PLA2蛋白，存在杂带，且有明显拖带情况，说明蛋白存在杂质，纯度不高，而本发明纯化的Lp-PLA2蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白条带大小正确，与市面上销售的蛋白相比条带干净，无拖带和杂带的产生，纯度达到90％以上后，可用于单抗的制备。

实施例2：小鼠免疫及抗体检测

挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上(表1)。筛选血清效价10⁶以上的小鼠，取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。

表1 ELISA检测血清效价

实施例3：细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆

分离免疫小鼠的淋巴细胞与培养的SP2/0细胞进行PEG1500介导的融合或者进行电融合。融合细胞培养在包含20％FBS血清的HAT-1640培养基中筛选培养。一周之后更换培养基，再培养4天之后取培养上清用于阳性克隆筛选。为了增加筛选到不受脂蛋白和磷脂酶A2同族蛋白干扰的抗Lp-PLA2抗体，采用结合脂蛋白、PLA2G3和PLA2G12A蛋白的Lp-PLA2进行阳性孔筛选。选取ELISA阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆。分别用结合脂蛋白以及不结合脂蛋白、结合PLA2G3不结合PLA2G3、和结合PLA2G12A蛋白以及不结合PLA2G12A的Lp-PLA2蛋白包被ELISA板。取亚克隆的培养上清筛选在6种抗原包被条件下都能表现相同亲和力的单克隆，从中选出亲和力最高的单克隆杂交瘤细胞，最终得到两株能够分泌耐脂蛋白、PLA2G3和PLA2G12A干扰的抗LpPLA2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为LP-A和LP-B。

实施例4单克隆抗体的生产纯化

选择两组6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向一组小鼠腹腔内注入0.5ml的LP-A杂交瘤细胞，细胞密度约1×10⁶数量；另一组小鼠腹腔内注入0.5ml的LP-B杂交瘤细胞，细胞密度约1×10⁶数量。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体用PAGE电泳鉴定纯化效果。

结果如图2所示，泳道1为LP-A抗体还原处理；泳道2为LP-A抗体非还原处理；泳道3为LP-B抗体还原处理；泳道4为LP-B抗体非还原处理。从图中可以看出纯化后的抗体在经过还原剂和高温处理之后经电泳分析呈现分子量约为55kDa和25kDa的重链和轻链条带而在非还原胶上呈现分子量约为150kDa的单一条带。这说明经亲和柱层析后单克隆抗体达到了相当高的纯度，可以用于进一步的研究

实施例5：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆

采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：

1、用包被液(0.05M pH9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。

2、用稀释液(1％BSA,0.1％PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP,IgG1-HRP,IgG2a-HRP,IgG2b-HRP,IgG3-HRP,IgM-HRP,kappa-HRP,lamda-HRP)1:3000稀释。

3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。

经过鉴定，两株抗体的重链均为IgG2b，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用成熟的技术路线克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用Thermo公司的Trizol提取杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的PrimeScript II ReverseTranscriptase说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，于-20℃冻存备用。

反转录具体操作流程如下：

首先配制10μL总体积的模板RNA/引物DNA的预混液，其中包括1μL 10μM浓度的特异引物(序列为atgggtgccagtgtctcttagga以及gaagcctccaagaccttagaagggaa)，4μL浓度为2.5mM的dNTP混合液，5μL RNA(总量小于5μg)。混匀之后于65℃处理5分钟，立即放于冰上。

向预混液中加入4μL 5×PrimeScript II缓冲液，20单位的RNA酶抑制剂，1μLPrimeScript II RTase(200单位)，混匀之后于42℃反应60分钟，再于70℃处理15分钟，之后放于冰上冷却备用。

以cDNA为模板，采用文献报道的抗体基因扩增引物分别独立进行扩增尝试，筛选出能够高效扩增抗体基因的引物。按南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase说明书的操作方案进行PCR

PCR反应体系为：

25μL 2×Phanta

1μL dNTP

4μL 10uM引物对

4μL杂交瘤细胞cDNA

1μL DNA polymerase

15μL dd H2O

总反应体积为50μL。扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，2min。按照OMEGA公司OMEGA Gel Extraction Kit说明书对PCR产物进行胶回收，扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。

实施例6：单克隆抗体稳定性鉴定

将纯化后的抗Lp-PLA2单克隆抗体LP-A和LP-B置于-20℃、4℃和37℃环境中，浓度为100ng/mL，每5天取样一次，间接ELISA检测其免疫反应活性的变化。结果显示在-20℃、4℃和37℃孵育5天后，效价无差别，超过10天后，保存在4℃和37℃的效价开始下降，而在检测的25天范围内，-20℃保存的效价几乎没有降低，说明LP-A(图3A)和LP-B(图3B)单克隆抗体具有良好的稳定性。

实施例7：Lp-A和Lp-B应用到胶体金免疫层析中

1、试纸条的制备

本实施例所用人Lp-PLA2生物素-链霉亲和素免疫层析试纸条，所述的检测试纸包括底板，所述的底板上衔接样品垫，第一标记垫、第二标记垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，所述的标记垫包括第一标记垫和第二标记垫，所述的第一标记垫偶联胶体金的LP-A，所述的第二标记垫偶联生物素LP-B；所述的包被膜上设有一条链霉亲和素检测线T线和一条羊抗鼠多克隆抗体质控线C线，两条线平行排列。

当样品中有Lp-PLA2时，样品中的Lp-PLA2首先与第一标记垫中偶联胶体金的LP-A特异性结合，继续层析，再与第二标记垫偶联生物素LP-B发生特异结合，形成双抗体夹心结构；然后继续移动与包被在硝酸纤维素膜上的链霉亲和素结合，从而形成链霉亲和素-生物素-LP-A-Lp-PLA2抗原-胶体金LP-B复合物。

2、标曲的建立

取实施例8中制备的试剂盒6个试纸条，分别将6个浓度(0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)的校准品加入试纸条的样品垫上，每个浓度点进行三次重复测试，加样量为120μl，反应3分钟后再中元汇吉Q7上检测，以校准品浓度为X轴。每个点测试所得3此信号值平均值为Y轴，绘制标准曲线，如图4。

实验结果表明，胶体金免疫层析法和胶体金免疫比浊法，线性回归系数都是5左右，线性回归直线斜率达到了0.99以上，说明用不同的方法学相关性很好，即，本发明的抗体适合被用到不同方法学中，检测效果均好。

3、Lp-PLA2含量检测试剂盒的假阳性实验

取不含Lp-PLA2的血清为阴性对照，来自不同来源的Lp-PLA2的样本血清为阳性对照。每种样本50例，共检测150例样本(如下表2)无假阳性情况出现，检测效果良好。

表2 Lp-PLA2含量检测试剂盒的假阳性实验

实验结果表明，只要在含有Lp-PLA2的样本中，无论含量高低，都能被检测，显示阳性检测结果，而在不含有Lp-PLA2的样本中，不会出现错检，出现假阴性结果，利用免疫层析实现了准确且快速的检测。

4、Lp-PLA2含量检测试剂盒抗脂蛋白干扰实验

将浓度为1mg/ml纯化的重组Lp-PLA2蛋白与浓度为5mg/ml的氧化型低密度脂蛋白混匀孵育，制备脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白。用不含Lp-PLA2的血清作为稀释液，分别配制浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的重组Lp-PLA2蛋白和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白。按照上述实验条件，用上述制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒分别测定各稀释样品的浓度。结果表明制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒测定纯化的重组Lp-PLA2蛋白(图5A)和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白浓度(图5B)的线性回归直线斜率达到了0.99以上且回归系数均为5.3左右，说明用LP-A和LP-B单克隆抗体制备的Lp-PLA2检测试剂盒测定脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白时没有差异，试纸条能够耐受脂蛋白结合对Lp-PLA2含量测定的干扰。

5、Lp-PLA2含量检测试剂盒抗磷脂酶A2同族蛋白干扰实验

将浓度为1mg/ml纯化的重组Lp-PLA2蛋白与浓度为2.5mg/ml的PLA2G3和2.5mg/mlPLA2G12A形成混合液。用不含Lp-PLA2的血清作为稀释液，分别配制浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的重组Lp-PLA2蛋白和混合液。按照上述实验条件，用上述制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒分别测定各稀释样品的浓度。结果表明制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒测定纯化的重组Lp-PLA2蛋白(图6A)和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白(图6B)浓度的线性回归直线斜率均达到了0.99以上，且回归系数均为5.3左右，说明用LP-A和LP-B单克隆抗体制备的Lp-PLA2检测试剂盒测定混合液和单纯Lp-PLA2蛋白时没有差异，试剂盒能够耐受磷脂酶A2同族蛋白对Lp-PLA2含量测定的干扰。

实施例8：Lp-A和Lp-B应用到乳胶免疫比浊法中

1、试剂盒的制备

本试剂盒包含R1和R2两种试剂，R1为胶乳反应缓冲液，R2为包被了抗Lp-PLA2单克隆抗体的胶乳颗粒。

其中R1试剂为pH值为7.5的磷酸盐缓冲液，包含浓度为1.6％的PEG6000作为促凝剂。

R2试剂的制备方法为用孔径大小为120nm的羧基化胶乳与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺于室温摇床上反应30分钟。反应完成后，将反应混合液分成两份，分别加入LP-A抗体、LP-B抗体震荡混匀，于室温下旋转反应2小时。抗体反应完成之后再同时向两份混合液之中加入6-氨基己酸和BSA并混匀，反应2小时。之后，采用16000g离心力条件离心30分钟，去掉上清。用pH 7.2的Tris缓冲液重悬清洗胶乳，并再次离心。用pH7.2的Tris缓冲液再次重选胶乳，将包被了LP-A和LP-B的胶乳按照等体积混合。使用超声处理使得胶乳足够分散而得到R2试剂。

2、标曲的建立

a.Lp-PLA2校准品的制备：校准品稀释液溶剂为人血清基质，包括NaCl 1％、Tween-20 5％、BSA 2％、上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。将Lp-PLA2重组蛋白溶于上述人血清基质，制备不同浓度的校准品(0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)

b.析方法为两点终点法，即试剂R1、试剂R2的用量分别是40μl和10μl，样本量为2μl。采用实施例上述试剂盒的测定方法，采用中元汇吉ZS400生化分析仪测得的上述6种不同含量的Lp-PLA2标准品的曲线(图7)，每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示Lp-PLA2含量(ng/ml)；Y轴表示吸光度。

3、Lp-PLA2含量检测试剂盒的临床实验

分别选取10例健康人血清、10例临床确诊阿尔兹海默病人的血清和10例即患有动脉动脉粥样化和阿尔兹海默病人的血清，按照上述条件，用上述制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒分别测定各血清中Lp-PLA2蛋白的含量。结果上述制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒能够明显区分出正常组和病理组样本(表3),说明基于LP-A和LP-B单克隆抗体制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒能够对病人体内的Lp-PLA2准确检测，满足临床检测的需求，不会因为动脉动脉粥样化病人、阿尔兹海默病人血清中的干扰，而不能检测。

目前判断风险的范围：Lp-PLA2＜200ng/ml为正常健康人群，200≤Lp-PLA2＜223ng/ml为中度风险，223≤Lp-PLA2为高度风险。从表中可以看出，阿尔兹海默病人血清中多数病人Lp-PLA2的浓度会增加，因为精神疾病会伴随一些炎症反应，导致Lp-PLA2的上升，但并没有达到高度风险的范围，但在同时具有动脉粥样化病人的体内含量多数，超过223，处于高度风险，也以此证明了Lp-PLA2是动脉粥样化的标志物。

表3：不同样本血清中Lp-PLA2的浓度(ng/ml)

4、Lp-PLA2含量检测试剂盒抗脂蛋白干扰实验

方法与实施例7中第5个实验相同，结果表明制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒测定纯化的重组Lp-PLA2蛋白(图8A)和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白浓度(图8B)的线性回归直线斜率达到了0.99以上且回归系数均为5.1左右，说明用LP-A和LP-B单克隆抗体制备的Lp-PLA2检测试剂盒测定脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白时没有差异，试剂盒能够耐受脂蛋白结合对Lp-PLA2含量测定的干扰。

5、Lp-PLA2含量检测试剂盒抗磷脂酶A2同族蛋白干扰实验

实验方法与实施例7相同，结果表明制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒测定纯化的重组Lp-PLA2蛋白(图9A)和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白(图9B)浓度的线性回归直线斜率均达到了0.99以上，且回归系数均为5.1左右，说明用LP-A和LP-B单克隆抗体制备的Lp-PLA2检测试剂盒测定混合液和单纯Lp-PLA2蛋白时没有差异，试剂盒能够耐受磷脂酶A2同族蛋白对Lp-PLA2含量测定的干扰。

序列表

<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司

<120> 抗人脂蛋白相关磷脂酶A2单克隆抗体及其应用

<130> 2020

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Asn Ser Asn Thr Arg Asp Cys Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Cys Tyr Asn Asp Ser Ser

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Val Thr Ser Leu Leu Arg Pro Ser Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

His Val Asp Thr Ser Pro

1 5

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Ser Pro Cys Thr

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Leu His His Tyr Ser Thr Ala Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 7

Ala Tyr Ser Tyr Thr Glu Tyr Ser

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 8

Asn Lys Ala Tyr Ile Gly Arg Pro

1 5

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 9

Ala Arg Ala Arg Tyr Asn Tyr Ala Ser Cys Asn Tyr Gly Met His Phe

1 5 10 15

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 10

Leu Glu Ile Gly Lys Pro

1 5

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 11

Leu Thr Ser Arg

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> MUS MUSCULUS

<400> 12

His Gln Arg Ile Thr His Arg Cys Thr

1 5

Claims

1.抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；

b)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；

c)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；

d)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；

e)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；

f)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；

上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-A

或

a)如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；

b)如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；

c)如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；

d)如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；

e)如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；

f)如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；

上述抗人Lp-PLA2单克隆抗体或其抗原结合部分，命名为LP-B。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体LP-A或LP-B，其特征在于，所述单克隆抗体LP-A或LP-B特异性结合人Lp-PLA2蛋白，其识别Lp-PLA2蛋白不受PLA2G3和PLA2G12A蛋白的干扰。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体LP-A或LP-B，其特征在于，所述单克隆抗体LP-A或LP-B结合位点位于脂蛋白结合区域之外。

4.一种包含权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体LP-A或LP-B的Lp-PLA2的检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采取LP-A和LP-B同时识别Lp-PLA2蛋白，测定Lp-PLA2蛋白浓度。

6.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体。

7.一种偶联物，由权利要求1所述的单克隆抗体、和/或权利要求6所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

8.根据权利要求1所述的单克隆抗体和/或权利要求6所述的结合物和/或权利要求7所述的偶联物在制备检测LP-A或LP-B表达的产品中的应用。