CN111657267A - 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法，所述保存液包括乙烯乙二醇1.0‑6.0mol/L、丙二醇1.0‑7.0mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1‑2.5mol/L、Caspase抑制剂Z‑VAD‑FMK 10‑50μmol/L、2‑10mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X。本发明公开的保存液可以有效提高软骨，肌腱，半月板组织冷冻保存后的组织内活细胞数、细胞活率，更重要的是在冷冻复苏时和在储存期间能防止冰晶重新生长，防止去玻璃化。这种新型的无冰晶冷冻保护液使软骨，肌腱，半月板可以保存更长的时间，在小于‑130℃环境下永久保存。

Description

一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻 方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法。

背景技术

软骨，肌腱，半月板作为一种结构相似的组织，由细胞、基质和纤维组成，它的主要生理功能是提供一个摩擦轴承表面，保护关节连接性，降低关节在活动中的负荷，减少关节接触压力，在冷冻保存时也经常可以采用相同的保存方法。可用于临床软骨，肌腱，半月板损伤和病变时的修复，置换术。在临床实践中，选择软骨，肌腱，半月板组织移植治疗疾病通常涉及到供体软骨，肌腱，半月板组织的离体保存。目前软骨，肌腱，半月板组织的离体保存方法有两种，一种是软骨，肌腱，半月板冷藏保存，一种是软骨，肌腱，半月板冷冻保存。软骨，肌腱，半月板组织冷藏保存时间一般不超过8周，延长软骨，肌腱，半月板保存时间需要使用软骨，肌腱，半月板冷冻保存技术，但传统常规的软骨，肌腱，半月板组织冻存技术不可避免的会对软骨，肌腱，半月板组织产生极大的破坏，有文献显示使用常规的冻存技术冻存软骨，肌腱，半月板时，软骨，肌腱，半月板内活细胞数低于50％，并且空间结构遭到严重破坏。而且常规冷冻保存的软骨，肌腱，半月板通常会因为软骨，肌腱，半月板细胞不足、软骨，肌腱，半月板空间结构的破坏而导致软骨，肌腱，半月板移植失败。

细胞冻存时细胞内的水分会在降温过程中形成大量冰晶，冰晶的形成会导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤(细胞膜被冰晶刺破)、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等。加入冻存保护剂(如甘油或DMSO等)，可使细胞质中的水冰点降低，在缓慢降温的过程中，细胞质内的水分可以通过细胞膜透出细胞，减少细胞内冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存时出现的损伤种类及损伤程度。无冰晶冷冻通过增加温度传导的速度和冷冻保护剂的浓度，使细胞内外液由液态转化为类似玻璃状的非晶体化固体状态，形成透明的玻璃状固体，保留细胞内液体正常的分子和离子分布，减少冰晶形成，提高细胞存活。因软骨，肌腱，半月板这三类组织结构，细胞，间质成分都类似，冻存保护剂渗透，组织热传导，冰晶的形成在这些组织都相似，对组织的损伤都相同，一种无冰晶冷冻保存的方法通常可适用于所有这些组织。

众所周知，冷冻保护剂的浓度越高对细胞和组织造成的毒性就越大。所以现存的玻璃化冷冻保护液都采用最小浓度的冷冻保护剂，只要在冷冻降温是可形成玻璃化即可。但这种玻璃化状态是极不稳定的，在冷冻降温时形成的极小的，肉眼看不见的，无害的冰晶，一旦遇到环境的变化就会重新生长，冰晶变大变多，甚至出现去玻璃化。这种环境的变化随时都可发生，可以是在样本离开进入储存容器时，可以是在运输样本时，可以是在储存期间开启关闭储存容器时，温度的变化。特别是在复温时，细胞在通过冷冻保护液冰点时重新再结晶。因现存的这种无冰晶冷冻玻璃化状态十分不稳定，随时可出现重新结冰(Recrystallization)，去玻璃化(Devitrification)，极大地影响着储存的样本活率和功能。

CN104938478A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨保存方法，采用的冷冻保护液，每1000ml包含：99.9％二甲基亚砜150～250ml、乙酰胺110～200g、1,2-丙二醇70～120ml、聚乙二醇10～80g、海藻糖20～100g，余为去离子水。使软骨细胞存活率在冷冻保存第8周时仍保持在一个较高水平(由传统组的60％提高到68％)。

CN108835105A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及制备方法，所述的关节软骨玻璃化冷冻保护液包括以下重量份数的组分：二甲基亚砜200-300份、角鲨烯25-60份、分心木多糖20-35份、四氢澳洲茄胺12-25份、虾青素2-7份、水10-30份；其制备的冷冻保护液，在第8周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达76％，在第10周将关节软骨复温后，关节软骨的细胞存活率依然可达71％。

CN109644989A公开了一种关节软骨玻璃化冷冻保护液及软骨冷冻保存方法，所述冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉18-22份、鼠李糖2-3份、鲸蜡烯1-2份、微晶纤维素2-4份、半乳甘露糖4-6份、胞壁酰二肽4-6份、三棕榈酰五肽3-5份、α-熊果苷0.5-1.5份、去离子水70份。还提供一种采用关节软骨冷冻保护液进行软骨冷冻保存方法，包括淋洗、滴加部分冷冻保护液、加入剩余冷冻保护液、程序降温。说明不使用二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；所述关节软骨冷冻保存方法，冷冻保存第8周取出复温后，关节软骨的细胞成活率为82-85％，第10周关节软骨的细胞成活率为78-80％。

上述专利虽然在玻璃化低温保存关节软骨中取得一定的进展，但仍然存在以下不足：

(1)细胞成活率波动较大(从第8周68％，76％到82-85％；第10周的71％到78-80％)，说明玻璃化状态很不稳定。在储存和复苏过程中出现了去玻璃化(Devitrification)和/或冰晶重新生长(Recrystallization)的现象，导致细胞活率的变化；

(2)复苏后关节软骨的细胞活率仍然较低，保存时间较短。

(3)难以适用于具有长时间震动状态的运输环境。在震动状况下，样本同样容易去玻璃化(Devitrification)和/或冰晶重新生长(Recrystallization)。

此外，目前没有公开的肌腱，半月板组织的玻璃化冷冻保护液及保存方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于长期保存关节软骨，肌腱，半月板的新的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法。

本发明提供一种软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液，包括乙烯乙二醇1.0-6.0mol/L、丙二醇1.0-7.0mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1-2.5mol/L、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK 5-80μmol/L、0.5-20mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X。

优选的，本发明所述的软骨无冰晶冷冻保存液，包括乙烯乙二醇2.0-5.0mol/L、丙二醇0.5-5.5mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1-1.0mol/L、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK 10-50μmol/L、2-10mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X。

本发明所述的GM6001是广谱的基质金属蛋白酶抑制剂，CAS号为142880-36-2。

在一些实施例中，本发明所述的成分X优选为0.05-1％(w/v)的聚乙烯醇、0.1-5％(w/v)的聚乙二醇、0.5-10％(w/v)的右旋糖苷或0.3-7％(w/v)的羟乙基淀粉中的一种或多种；进一步优选为0.05-2％(w/v)的聚乙烯醇。发明人发现加入X成分可以明显改善软骨，肌腱，半月板的保存质量，明显减少冰晶的形成。

作为本发明的进一步改进，乙烯乙二醇含量为2.5mol/L。

作为本发明的进一步改进，丙二醇含量为2.5mol/L。

作为本发明的进一步改进，羟乙基哌嗪乙硫磺酸含量为0.5mol/L。

作为本发明的进一步改进，所述无冰晶冷冻保存液的其他成分为溶剂，进一步优选的，所述的溶剂为Euro-Collin溶液。

本发明还提供一种软骨，肌腱，半月板保存和复苏方法，冻存时，利用步进式方式向软骨，肌腱，半月板组织中导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液；复苏时，利用步进式方式从软骨，肌腱，半月板组织中洗脱本发明所述的无冰晶冷冻保存液。

在一些实施例中，在进行冷冻保存过程时，导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，本发明还可以使用液体Y中的一种或多种覆盖冻存体系表层及周边，防止冻存液及冻存样本与空气接触，防止去玻璃化，成分Y是一类低温下不易形成固体的的液体，在一些实施例中，成分Y选自甲基丙烷、异丁烷、溴丙烷、2-甲基丁烷、二溴丙烷或溴代辛烷中的一种或几种。进一步优选为2-甲基丁烷。

在一些实施方式中，本发明导入无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入本发明所述的无冰晶冷冻保存液。

在一些优选的实施方式中，本发明导入无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向软骨，肌腱，半月板组织中导入无冰晶冷冻保存液。

在一些实施方式中，本发明所述的软骨，肌腱，半月板保存方法，在采用步进式导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。

在一些优选的实施方式中，本发明第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；进一步优选的，为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃。

在一些优选的实施方式中，本发明第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃；进一步优选的，为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。

在一些实施方式中，本发明洗脱无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以2～25min步进逐量，按6～25步将软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液置换、洗脱。

在一些优选的实施方式中，本发明洗脱无冰晶冷冻保存液的步进式方式具体为在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向软骨，肌腱，半月板组织中减量去除无冰晶冷冻保存液，每次5min。

在一些实施方式中，当复苏时，将冻存样本从储存环境中取出后，以10～50℃/分钟的速率第一次升温至-70℃～-120℃，然后以140～350℃/分钟的速度第二次升温至1～10℃，然后利用步进式方式从软骨，肌腱，半月板组织中洗脱本发明所述的无冰晶冷冻保存液。

在本发明的一些实施方式中，本发明第一次升温为以30±0.2℃/分钟的速率升温至-100℃。

在本发明的一些实施方式中，本发明第二次升温为以225±15℃/分钟的速度快速复温至4℃。

本发明还提供所述的无冰晶冷冻保存液在软骨，肌腱或半月板冷冻保存中的应用。

在一些实施例中，在进行冷冻保存过程时，导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，本发明还可以使用液体Y中的一种或多种覆盖冻存体系表层及周边，防止冻存液及冻存样本与空气接触，防止去玻璃化，成分Y是一类低温下不易形成固体的的液体，在一些实施例中，成分Y选自甲基丙烷、异丁烷、溴丙烷、2-甲基丁烷、二溴丙烷或溴代辛烷中的一种或几种。进一步优选为2-甲基丁烷。

本发明还提供本发明所述的无冰晶冷冻保存液的使用方法：保存软骨，肌腱，半月板组织时，利用步进式方式向软骨，肌腱，半月板组织中导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液；所述步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入本发明所述的无冰晶冷冻保存液。

在一些优选的实施方式中，所述的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向软骨，肌腱，半月板组织中导入无冰晶冷冻保存液。

在一些实施方式中，本发明所述的使用方法，在采用步进式导入本发明所述的无冰晶冷冻保存液后，首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。

在一些优选的实施方式中，本发明第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；进一步优选的，为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃。

在一些优选的实施方式中，本发明第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃；进一步优选的，为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。

本发明所述的单位w/v表示质量体积分数，如0.05-2％(w/v)表示“质量浓度为0.5～20g/L”。

本发明相对于现有技术的有益效果：

(1)本发明公开一种无冰晶低温保护剂，有效提高软骨，肌腱，半月板组织冷冻保存后的组织内活细胞数、细胞活率，更重要的是在冷冻复苏时和在储存期间能防止冰晶重新生长，防止去玻璃化。这种新型的无冰晶冷冻保护液使软骨，肌腱，半月板可以保存更长的时间，在小于-130℃环境下永久保存。

(2)玻璃化冻存的样本在冷冻，储存和解冻时存在冰晶重新生长的可能，造成对细胞的二次损伤。对于已被玻璃化的样本，冰可以在通过接近冷冻保护剂溶液冰点时再结晶，这种晶体再生长可以对细胞造成机械损伤，也可因冰晶重生长造成细胞内外渗透压急剧改变从而损害细胞膜。本发明在采用步进式降温和复温的同时，通过使用冰再结晶抑制剂来控制这一过程已经被证明可以增强解冻后的细胞恢复，可大大提高组织复苏后细胞的活率，从而提高组织的整体功能。

(3)本发明所述的冷冻保护剂，具有低毒性，同时有类似抗冻蛋白的抑制冰晶再生长的功能，它们不会与冰结合导致晶体的动态冰形成，导致针状生长，刺穿细胞并破坏细胞膜，而限制了它们的有效性。相反，可以大幅度减少在冻存和复苏过程中冰晶的再形成，特别是复苏过程中样本的再结晶和去玻璃化，从而降低了冰晶对细胞的二次损伤，相比现有技术有效提高了储存的样本的运输和保存效果。

(4)本发明提供的低温保护剂中，乙烯乙二醇、丙二醇含量较普通冻存保护剂中的含量高很多，且能渗透入细胞内。相对于DMSO,乙烯乙二醇、丙二醇的毒性较低。发明人发现高浓度的渗透性冻存保护剂可有效阻止冻存过程中细胞内外冰晶的形成，降低细胞损伤、死亡。

(5)软骨保存后，移植效果不理想很大因素来自于软骨，肌腱，半月板细胞死亡以及软骨，肌腱，半月板基质破坏，因此能否保持软骨，肌腱，半月板细胞活力以及基质功能完整性是软骨，肌腱，半月板保存的关键。本发明通过各个成分的协同，有效保留软骨，肌腱，半月板细胞的活性，抑制软骨，肌腱，半月板基质降解破坏，同时促进软骨，肌腱，半月板生长，有利于软骨，肌腱，半月板性能保存及其后的移植使用。本发明提供的软骨，肌腱，半月板保存液中Caspase抑制剂Z-VAD-FMK能抑制软骨，肌腱，半月板细胞凋亡，提高软骨，肌腱，半月板细胞的存活率，提高移植后软骨，肌腱，半月板的存活及功能恢复；GM6001作为有益的基质金属蛋白酶抑制剂，可以有效抑制基质金属蛋白酶分解细胞外基质，避免软骨，肌腱，半月板组织功能遭到破坏，提高软骨，肌腱，半月板性能的保存；羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液作为有益的缓冲溶液，其作用是较长时间控制恒定的pH范围，维持细胞内外液体的渗透压。

(6)在传统降温冷冻，特别是低温储存过程中样本都置于空气中，在任何开关储存容器时，热传导通过容器内外空气的对流瞬间造成样本温度的改变，从而使玻璃化状态发生冰晶形成，冰晶再生长，去玻璃化，导致样本再结冰，细胞二次损伤。本发明可以使用一种在低温下不结冰的液体2-甲基丁烷，覆盖在样本的表面。在降温冷冻过程中，在小于-130℃的储存过程中把样本置于2-甲基丁烷液体中。这种低温下不结冰的液体隔绝了空气，可以降低了样本温度随环境的变化，在长期的储存过程中可进一步保护了样本不结冰，减少了对细胞的损伤。

附图说明

图1从猪软骨(左)，肌腱(中)，半月板(右)取样本用于实施案例和对照组的试验。

图2实施例1和对照组1冷冻保存后的组织形态。

图3荧光标记细胞活率测试结果。荧光活细胞染色(钙黄绿素，Calcein-AM)显示对照组2(左)，实施案例1(中)，对照组1(右)的软骨活细胞。

图4荧光标记细胞活率百分比。

图5阿尔玛蓝染色储存8个月的每毫克组织存活率的相对荧光度值。

图6生物力学检测；对照组2、实施例1和和对照组1，半月板组织样品在峰值穿透载荷为10mN时的载荷-压痕深度。

图7猪膝关节软骨缺损模型植入软骨12周后取出大体解剖观察图。显示猪膝关节软骨缺损模型植入实施例1(图7B)和对照组2-新鲜软骨(图7D)与对照组1-常规冷冻软骨(图7A和C)。

图8软骨移植12周后O’Driscoll组织学评分图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中，若无特别说明，所用的样本或组织为猪软骨(左)，肌腱(中)，半月板(右)。

实施例1

1.取2.5mol乙烯乙二醇、2.5mol丙二醇、0.5mol羟乙基哌嗪乙硫磺酸、25μmolCaspase抑制剂Z-VAD-FMK、6mg基质金属蛋白酶抑制剂GM6001以及0.8g的聚乙烯醇，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L，形成保存液一。

2.取适量步骤1的保存液一，冷却到2-4℃。将冷却后的保存液一在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向组织中增量加入保存液一，每次15min)。

3.将上一步骤导入保存液一的组织上面覆2-甲基丁烷。将覆盖了2-甲基丁烷的保存液一和组织的容器置于2-甲基丁烷的液体浴中等待冷冻。

4.将上一步骤导入保存液一和覆盖了2-甲基丁烷的组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至小于-130℃，此后样本保存在2-甲基丁烷的液体浴中，并在此温度下保存8个月。

5.将待复苏的样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃；

6.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向组织中减量去除保存液一，每次5min，在30min内置换、洗脱保存液一。

在这一实施例中，部分经过步骤2～4降温至小于-130℃的保存液一保存的样本从小于-130℃的储存地方取出，放入一个Dry Shipper(一种气相液氮转运罐，温度可保持小于-130℃一周)，将Dry Shipper放在一个震荡器上缓慢摇动，模仿无冰晶冷冻保存的样本运输的情况。保存液一保存的样本在这种模拟样本运输的情形下在Dry Shipper里保存48小时，然后转移回以前-130℃的储存地方。此后样本复苏按第5，6步骤实行。

实施例2

1.取2.5mol乙烯乙二醇、2.5mol丙二醇、0.5mol羟乙基哌嗪乙硫磺酸、25μmolCaspase抑制剂Z-VAD-FMK、6mg基质金属蛋白酶抑制剂GM6001，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L，形成保存液二。

2.取适量步骤1中的保存液二，冷却到2-4℃。将冷却后的保存液二在2-4℃下按6步法逐量加入待冻存的组织中，90min内完成导入(在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向组织中增量加入保存液二，每次15min)。

3.将上一步骤导入保存液二的组织以-43℃/分钟的速率降温至-100℃，再使样本以-3±0.2℃/分钟速率降温至小于-130℃，此后样本保存在2-甲基丁烷的液体浴中，并在此温度下保存8个月。

4.将待复苏的样本取出，以30±0.2℃/分钟的速率恢复至-70℃，再以225±15℃/分钟的速率恢复至4℃；

5.在2-4℃条件下以5min步进逐量，按6步向组织中减量去除保存液二，每次5min，在30min内置换、洗脱保存液二。

在这一实施例中，部分经过步骤2和3降温至小于-130℃的保存液二保存的样本从小于-130℃的储存地方取出，放入一个Dry Shipper(一种气相液氮转运罐，温度可保持小于-130℃一周)，将Dry Shipper放在一个震荡器上缓慢摇动，模仿保存液二保存的样本运输的情况。保存液二保存的样本在这种模拟样本运输的情形下在Dry Shipper里保存48小时，然后转移回以前-130℃的储存地方。此后样本复苏按第4，5步骤实行。

实施例3

1.取2.5mol乙烯乙二醇、2.5mol丙二醇、0.5mol羟乙基哌嗪乙硫磺酸、6mg基质金属蛋白酶抑制剂GM6001以及0.8g的聚乙烯醇，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L，形成保存液三。

其他同实施例1。

实施例4

1.取2.5mol乙烯乙二醇、2.5mol丙二醇、0.5mol羟乙基哌嗪乙硫磺酸、25μmolCaspase抑制剂Z-VAD-FMK以及0.8g的聚乙烯醇，混匀后加入Euro-Collin溶液定容至1L，形成保存液四。

其他同实施例1。

对照组1(常规冷冻对照组)

提供了一种常规冷冻保护剂溶液，以体积百分比计，其中含有10％DMSO。室温下，将此冷冻保护剂加入拟冷冻保存的组织，之后将组织移入含有10％DMSO冷冻液平衡1分钟后放入程序降温仪，以-1℃/min的速度降至-90℃，然后再转移至-196℃液氮中长期保存。

在这一实施例中，部分冷冻保存的样本从小于-130℃的储存地方取出，放入一个Dry Shipper(一种气相液氮转运罐，温度可保持小于-130℃一周)，将Dry Shipper放在一个震荡器上缓慢摇动，模仿冷冻保存的样本运输的情况。冷冻保存的样本在这种模拟样本运输的情形下在Dry Shipper里保存48小时，然后转移回以前-196℃的液氮中储存。

对照组2(新鲜对照组)：未经冷冻处理的新鲜组织，组织获取后放在Euro-Collin溶液中，在2-10℃环境中保存不超过12小时。

另外，针对目前已公开的无冰冷冻方法，按专业领域的常规分了二类：第一类是能渗入细胞内的保护剂，效力高，但高浓度会有很大毒性；第二类是糖类，毒性低，但分子大，进不了细胞，效力低。每一类我们设定了一个代表性对照(第一类的代表为对照组3，第二类的代表为对照组4)：

对照组3(无冰冷冻对照组-采用细胞内冷冻保护剂)：采用的冷冻保护液，每1000ml包含：99.9％二甲基亚砜200ml、乙酰胺160g、1,2-丙二醇100ml、聚乙二醇50g、海藻糖60g，余为去离子水。其他同实施例1。

对照组4(无冰冷冻对照组-采用细胞外冷冻保护剂)：采用的冷冻保护液，以重量份计，包括以下组分：羧甲基淀粉20份、鼠李糖2.5份、鲸蜡烯1.5份、微晶纤维素3份、半乳甘露糖5份、胞壁酰二肽5份、三棕榈酰五肽4份、α-熊果苷1.0份、去离子水70份。其他同实施例1。

效果实验：

决定无冰晶冷冻在不同组织是否有效主要看该组织热传导性，细胞对无冰晶冷冻保护剂的渗透性。虽然效果实验是在一种组织或二种组织中测试或软骨，肌腱，半月板三种组织中同时展开的。但因软骨，肌腱，半月板组织结构，细胞，间质成分都类似，冰晶的形成在这些组织都类似，根据临床常识，因此这个发明在一个组织有效通常在另外的两种组织中也有效。

效果实验1：软骨，肌腱，半月板组织成活率测试实验

本实验采用Alamar-Blue(阿尔玛蓝)检测方法：主要成分是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530-560nm，而散射峰为590nm。

采集的新鲜猪关节半月板，软骨，肌腱组织样本(图1)分别采用实施例1-4，对照组3-4制备的保存液和方法降温保存。运输2天和储存8个月后，进行组织活率测试实验，通过阿尔玛蓝染色，在分光光度计下以固定波长进行测定，对比对照组2-正常新鲜的组织，计算出每毫克组织中的细胞荧光度，判断保存组织中细胞的活性(表1；图5)。

表1.无冰晶冷冻软骨，半月板，肌腱按实施例1-4以及对照组1，3，4运输2天和储存8个月的存活率，存活率(％)＝软骨、半月板、肌腱组织相对荧光度绝对值/对照组2-新鲜软骨，半月板，肌腱的百分比*100。

通过阿尔玛蓝荧光标记法可以看出，通过实施例1的方法保存的组织，运输2天和保存8个月后复温后其细胞活性为对照组2-新鲜组织的90％以上。而使用对照组1-常规方式进行冷冻保存的组织，其中的细胞活性下降严重，仅为新鲜组织的20％以下。通过实施例2的方法保存的组织在运输，储存后组织活性不太稳定，从50％到60％，储存8个月后平均活率60％；对照组3-4的方法保存的组织在运输，储存后组织活性也是较低，在50％到60％之间。这些结果可能是玻璃化状态不稳定，出现了冰晶再形成(Recrystallization)或去玻璃化(Devitrification)对组织造成损伤产生的。

效果实验2：样本运输和储存中有无冰晶形成的实验

样本采用了一种低温替代(Cryosubstition)技术，以1％四氧化锇为溶剂取代已结成冰的水，同时在深低温下固定组织,具体操作为样本在-20℃隔夜脱水，4℃下保存1小时，在室温下完成进一步脱水过程,然后100％丙酮溶液中加树脂，用甲苯胺蓝染色，光镜下观察，用醋酸铀铣与柠檬酸铅染色在电镜下观察，这样冰晶在组织里的位置和大小就在组织切片中显示出来。除新鲜组织(对照组2)，所有实施例和对照组都检测了样本运输和储存中有无冰晶形成，结果见图2和表2。

表2.无冰晶冷冻软骨，半月板，肌腱按实施例1-4以及对照组1，3，4运输2天和储存8个月有无冰晶形成检测结果。

如表2显示实施例1，3，4没有发现冰晶形成。但在对照组1有冰晶形成，实施例2和对照组3中有微量冰晶形成，在对照组4中有小量冰晶形成。

由图2可见，使用对照组1保存液和方法保存的组织明显可见分布在软骨(图2左上)，半月板(图2右上)细胞内及细胞外基质上的大小不一的冰晶，图中白色不规则大小的空隙是冰晶占据的时留下的，软骨细胞被冰晶占据，细胞内物质被推到了一边，软骨组织间质布满了细小冰晶。半月板组织间质冰晶形成较软骨大，可能是半月板组织较软骨组织疏松。可见结冰使得冷冻半月板的结构明显发生了改变，由于组织较疏松冰晶较大较多，冰晶在各层之间的间隙形成破坏了半月板的整体功能，特别是冰晶破坏了纤维组织，这对半月板移植后能否保持纤维组织的完整性有重要意义。相对于对照组1，使用实施例1保存的软骨(图2左下)和半月板组织(图2右下)完整性高，纤维组织形态完好。

效果实验3：荧光标记细胞活率测试实验

钙黄绿素(Calcein AM)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Calcein,从而被滞留在细胞内,发出强绿色荧光。采用钙黄绿素(Calcein-AM)细胞活性分析试剂盒(荧光法)对实施例1和对照组1保存了8个月以及对照组2-新鲜组织的软骨样本细胞活率进行了测试(图3)。对照组2-新鲜组织(图3左)，实施例1-无冰晶冷冻(图3中)和对照组1-传统冷冻组织(图3右)细胞活率比较，实施例1细胞活率大大高于对照组1。组织中活细胞数占所有细胞的比例可计算出细胞活率(图4)，可见实施例1保存的组织中活细胞数远远高于对照组1，与对照组2-新鲜组织接近。

效果实验4：生物力学测试实验

软骨，半月板的生物力学性质和人体其他组织一样，都是以细胞和细胞外基质成分的完整性为基础的。关节部位的组织要能承受压力,弹性要好。各种生物力学试验可用于评估软骨，半月板组织的力学性能。传统的软骨，半月板力学性能测试包括压缩、拉伸和剪切测试。其中大多数需要足够大的组织样本。由于需要测试小的软骨，半月板样本，如猪软骨，半月板，采用了一种深度和负载感应微压头。微压头监测并记录压头的载荷和位移，压头是一个半径为0.25m m、力分辨率约为0.5mN、位移分辨率约为0.1μm的不锈钢锥形销。该方法可评估湿组织样品(软骨，半月板)的压痕阻力，类似于对干固体材料(如金属)进行压痕试验，以测量硬度。通过显微压痕试验可以得到压痕载荷-深度曲线。压痕深度差是衡量机械性能变化的一个指标。

图6显示了对照组2-新鲜组织、实施例1-无冰晶冷冻和和对照组1-传统冷冻软骨保存的软骨和半月板组织样品保存了8个月后的载荷-压痕深度。由图6可见，实施例1对压痕的抗力与对照组2样本相似。对照组1具有最高的压痕深度(相对较低的阻力)，说明实施例1细胞和细胞外基质成分完整性更佳。

效果实验5：猪关节软骨移植实验

实验选用新鲜的猪关节软骨，在洁净的环境(防止样品被微生物污染造成结果失准)下制备成为直径6mm、厚度4-6mm的圆柱体。一组使用实施案例1的保存液一和方法进行冷冻保存，，同时设立一组使用对照组1-常规冷冻方法冷冻保存，保存时间8个月。

制作猪膝关节软骨缺损模型9只，分成三组每组各3只，分别移植对照组2-新鲜软骨、实施例1-保存液一冷冻软骨和对照组1-常规冷冻软骨，图7是猪膝关节软骨缺损模型植入实施例1冷冻软骨(图7B)、对照组2-新鲜软骨(图7D)与对照组1-常规冷冻软骨(图7A和C)。猪膝关节软骨缺损模型植入软骨12周后取出观察，移植无冰晶冷冻软骨与移植新鲜软骨的关节愈合良好；而移植常规冷冻软骨的关节愈合较差。

图8是软骨移植12周后O’Driscoll组织学评分，移植实施例1-无冰晶冷冻软骨与移植对照组2-新鲜软骨没有显著差异。移植对照组1-常规冷冻软骨与实施例1对照组2软骨有显著差异。

Claims (10)

1.一种软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液，其特征在于，包括乙烯乙二醇1.0-6.0mol/L、丙二醇1.0-7.0mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1-2.5mol/L、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK 10-50μmol/L、2-10mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X。

2.根据权利要求1所述的软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液，其特征在于，包括乙烯乙二醇2.0-5.0mol/L、丙二醇2.5-5.5mol/L、羟乙基哌嗪乙硫磺酸0.1-1.0mol/L、Caspase抑制剂Z-VAD-FMK 10-50μmol/L、2-10mg/L的基质金属蛋白酶抑制剂GM6001和成分X；成分X选自0.05-2％(w/v)的聚乙烯醇、0.1-5％(w/v)的聚乙二醇、0.5-10％(w/v)的右旋糖苷或0.3-7％(w/v)的羟乙基淀粉中的一种或多种；优选为0.05-1％(w/v)的聚乙烯醇。

3.根据权利要求1所述的软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液，其特征在于，乙烯乙二醇含量为2.5mol/L；丙二醇含量为2.5mol/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸含量为0.5mol/L。

4.根据权利要求1所述的软骨，肌腱，半月板无冰晶冷冻保存液，其特征在于，所述无冰晶冷冻保存液的其他成分为溶剂，优选的，所述的溶剂为Euro-Collin溶液。

5.权利要求1～4任一项所述的无冰晶冷冻保存液在软骨，肌腱或半月板冷冻保存中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，保存软骨，肌腱，半月板组织时，利用步进式方式向软骨，肌腱，半月板组织中导入权利要求1～4任一项所述的无冰晶冷冻保存液；所述步进式方式具体为在-5～+22℃条件下以10～25min步进逐量，按4～15步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入权利要求1～4任一项所述的无冰晶冷冻保存液，然后首先以-20℃～-70℃/分钟的速率第一次降温至-80℃～-120℃，再以-2℃～-40℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-180℃，并在此温度下保存。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，导入权利要求1～4任一项所述的无冰晶冷冻保存液后，使用液体Y中的一种或多种覆盖冻存体系表层及周边，成分Y选自甲基丙烷、异丁烷、溴丙烷、2-甲基丁烷、二溴丙烷或溴代辛烷中的一种或几种；优选为2-甲基丁烷。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述的步进式方式具体为在2-4℃条件下以15min步进逐量，按6步向软骨，肌腱，半月板组织中增量加入无冰晶冷冻保存液，每次15min，向软骨，肌腱，半月板组织中导入无冰晶冷冻保存液。

9.根据权利要求6所述应用，其特征在于，第一次降温为-38℃～-50℃/分钟的速率降温至-90℃-110℃；优选的，为-43±2℃/分钟的速率降温至-100℃。

10.根据权利要求6所述应用，其特征在于，第二次降温速率为-2℃～-10℃/分钟速率第二次降温至-120℃～-150℃；优选的，为-3±0.2℃/分钟的速率降温至-135℃。

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