CN111647606B

CN111647606B - 靶向afp全抗原的dc细胞、ctl细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111647606B
Application number: CN202010780655.0A
Authority: CN
Inventors: 张欢; 程铧
Original assignee: Beijing Yibo Puhui Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Beijing Yibo Biological Group Co ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111647606A

Abstract

本发明提供了一种靶向AFP全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。本发明的AFP全抗原为包括两条以上的蛋白片段和/或多肽片段的组合物，AFP蛋白中所有可能的与不同MHC结合的多肽的氨基酸序列完整地被包含于至少一条所述蛋白片段或多肽片段中。本发明中将编码AFP全蛋白抗原的基因克隆至慢病毒载体上，用以转染树突状细胞，得到的呈递AFP全抗原的DC细胞，将其与自体来源的PBMC细胞混合培养，获得大量CTL细胞。通过杀伤实验表明，此群CTL细胞可高效杀灭携带AFP抗原的靶细胞，且其杀伤作用与HLA分子的匹配程度成正相关。

Description

靶向AFP全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体而言，是关于一种靶向AFP全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，细胞免疫治疗在癌症治疗中大放异彩。以CAR-T、TCR-T为首的T细胞治疗成为最具前景的特异性T细胞治疗手段。二者的共同点是以T细胞为载体，通过基因修饰制备获得靶向某类癌症抗原个别位点的工程化T细胞。为增加T细胞的特异性，寻找合适的抗原靶点成为最具有挑战性的工作。此外，就目前的临床试验数据显示，靶向癌抗原上某个单一位点的T细胞，在面对高度异质性的实体瘤治疗时，容易发生肿瘤细胞逃逸，最终导致癌症复发。

借助二代测序以及计算机模拟测算寻找新生抗原以制备肽疫苗或经由DC细胞负载后制备DC治疗性疫苗，成为最近的研究热点。该方法高度依赖计算机算法，不同研发团队针对某个具体案例所得到的新生抗原肽组合可能有很大差异，这就导致了疗效的不确定性。因此，临床上对于特异性强、多抗原靶点的细胞治疗方法或技术的需求仍然十分迫切。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的应用于细胞免疫治疗的DC细胞。

为达上述目的，本发明提供了一种靶向甲胎蛋白（AFP）全抗原的DC细胞。

甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，来源于胚胎内胚层组织细胞。胎儿血清中AFP含量高，而成人血清中AFP的含量则非常低。AFP具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。研究发现，AFP在肝癌中呈现高度表达状态。AFP在目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。同时，AFP已经成为肝癌免疫治疗的靶点。虽然根据报道其免疫原性较弱，并且具有抑制树突状细胞、NK细胞以及T细胞的作用，但仍然有针对AFP的细胞疫苗、肽疫苗、CAR-T以及TCR-T等技术进入临床研究阶段。越来越多的证据显示，AFP在胃癌、结直肠癌、胰腺癌以及生殖系统的恶性肿瘤中也常常有升高的状况，因此上述靶向AFP的疫苗或技术未来可能拓展到其他癌种的应用中。

本发明首先提供了一种靶向AFP全蛋白抗原的方法，将AFP基因序列分成两条以上片段，AFP蛋白中所有可能的与不同MHC结合的多肽的氨基酸序列完整地被包含于至少一条基因片段所编码的氨基酸片段中，由此可涵盖整个AFP蛋白抗原的所有可能的多肽-MHC片段，避免了现有技术细胞免疫治疗在抗原靶点选择上的难度和单一靶点可能导致的免疫逃逸问题，并且同时能尽量降低或消除AFP完整抗原对DC细胞、T细胞以及NK细胞的免疫抑制作用。根据本发明的一些具体实施方案，是将AFP基因序列分成两个片段：AFP-1段（其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示）与AFP-2段（其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示），这些片段所编码的抗原片段的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 4所示。

根据本发明的进一步实施方案，本发明通过慢病毒转染的方式使DC细胞高效负载AFP全抗原，使其通过消化加工并呈递AFP的多种多肽片段，进而与HLA部分匹配或完全匹配的PBMC细胞进行共培养，以得到AFP抗原特异性的T细胞群，该群T细胞是涵盖多个抗原肽位点的T细胞的组合物，经验证具有高效的杀伤作用。

从而，一方面，本发明提供了一种AFP全抗原，该AFP全抗原为包括两条以上的蛋白片段和/或多肽片段的组合物，AFP蛋白中所有可能的与不同MHC结合的多肽的氨基酸序列完整地被包含于至少一条所述蛋白片段或多肽片段中。

根据本发明的具体实施方案，本发明的AFP全抗原中，各蛋白片段或多肽片段的氨基酸序列之和涵盖了AFP蛋白全长氨基酸序列，并且按照AFP蛋白的氨基酸序列顺序，前一蛋白片段或多肽片段的末端与后一蛋白片段或多肽片段的起始端有至少9个氨基酸残基的重叠。

根据本发明的优选实施方案，本发明的AFP全抗原包括两条蛋白片段，两条蛋白片段的氨基酸序列之和涵盖了AFP蛋白全长氨基酸序列，并且按照AFP蛋白的氨基酸序列顺序，前一蛋白片段的末端与后一蛋白片段的起始端有至少9个、优选9-50个、更优选30-40个氨基酸残基的重叠。优选地，前一蛋白片段为280-330个氨基酸残基组成的片段，更优选为SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的片段。

更进一步优选地，所述的AFP全抗原包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白片段和SEQ ID No. 4所示氨基酸序列组成的蛋白片段。

根据本发明的一些具体实施方案，所述的AFP全抗原包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白片段和SEQ ID No. 4所示氨基酸序列组成的蛋白片段。

另一方面，本发明还提供了编码所述AFP全抗原的基因。即，本发明所述的编码所述AFP全抗原的基因为包括了编码本发明的AFP全抗原的各条蛋白片段或多肽片段的多核苷酸片段的组合物。

根据本发明的优选实施方案，本发明的编码所述AFP全抗原的基因包括两条多核苷酸片段，按照AFP基因序列顺序，前一多核苷酸片段的末端与后一多核苷酸片段的起始端有至少27bp碱基的重叠，例如可以有27-150、更优选90-120个碱基的重叠。优选地，前一多核苷酸片段为SEQ ID No. 1所示序列组成的多核苷酸。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的编码所述AFP全抗原的基因为包括SEQID No. 1所示序列组成的多核苷酸和SEQ ID No. 3所示序列组成的多核苷酸的组合物。

另一方面，本发明还提供了本发明所述的AFP全抗原或编码其的基因在制备负载AFP全抗原的DC细胞和/或靶细胞中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种负载本发明所述AFP全抗原的DC细胞（DC-AFP细胞）。AFP全抗原分成两段以上在DC细胞内同时表达，可减少或避免全AFP蛋白对DC及其效应细胞的免疫抑制作用。

另一方面，本发明还提供了所述的负载AFP全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：

构建含有本发明所述的编码所述全抗原的基因的慢病毒载体，转染DC细胞，得到的呈递AFP全抗原的DC细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所用的慢病毒载体例如可以是pCDH系列、pLVX系列载体。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所用的DC细胞为可扩增树突状细胞。可以采用商购的具有可扩增性能的DC细胞，也可以按照现有技术记载的方法自行制备具有可扩增性能的DC细胞，例如，可将PBMC经PHA刺激后，经STLV1-4病毒中任一病毒的Tax基因转导后筛选得到DC细胞，该DC细胞即可具有可扩增性能，可以进一步培养扩增。本发明中对DC细胞的其他性能无特殊要求。

根据本发明的具体实施方案显示，本发明的AFP全抗原在DC细胞内的稳定、高效表达。区别于现有方法选择AFP蛋白内部一个或几个预测的可以和某一种HLA分子结合的多肽作为靶点，本发明的方法通过DC细胞自身表达、加工并形成的多肽-MHC的复合物，涵盖了该DC细胞所有HLA分子针对AFP蛋白的所有可能的多肽-MHC组合，最终使该DC疫苗或由其诱导生成的CTL细胞具备靶点多样性，有利于对癌细胞的彻底清除。

本发明的方法制备的DC-AFP细胞，不仅可以用于自体T细胞的诱导，还可以用于诱导异体配型的T细胞。在本发明的一些具体实施方案中，验证了HLA-0201和HLA-A2402两种类型，其中HLA-A0201在中国人群中的占比为18-45%，HLA-2402在人群中的占比为25%，而同时表达HLA A0201和HLA-A240的人群约为11.5%。这些人群应用本法中的异体DC细胞理应取得一定的效果。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带AFP全抗原的DC细胞可制备为癌症治疗性疫苗，针对AFP阳性的癌症，主要是原发性肝癌进行治疗。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的携带AFP全抗原的DC细胞，可在体外诱导的AFP特异性细胞毒T细胞，用于过继性T细胞治疗癌症。

另一方面，本发明还提供了所述的负载AFP全抗原的DC细胞在制备AFP蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种免疫细胞，其是由本发明的负载AFP全抗原的DC细胞诱导产生的。

根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞包括CTL细胞；

根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫细胞是由本发明所述的负载AFP全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得的。

根据本发明的一些具体实施方案，所述的负载AFP全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合培养。更优选地，可向培养体系中加入200~1000unit/ml的白介素2。

另一方面，本发明还提供了所述的免疫细胞在制备具有杀灭携带AFP抗原的靶细胞的试剂中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括：本发明所述的全抗原，编码所述全抗原的基因或扩增该基因的引物，含有所述基因的慢病毒载体，和/或本发明所述的负载AFP全抗原的DC细胞。所述试剂盒还可包括转染试剂或所属领域中的常规试剂等。

综上所述，本发明提供了一种靶向AFP全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用。本发明中，AFP全抗原分成两段以上在DC细胞内同时表达，减少或避免全AFP蛋白对DC及其效应细胞的免疫抑制作用。本发明中将编码AFP全蛋白抗原的基因克隆至慢病毒载体上，用以转染可扩增高活性树突状细胞，得到的呈递AFP全抗原的DC细胞，将其与自体来源的PBMC细胞混合培养，获得大量可扩增CTL细胞。通过杀伤实验表明，此群CTL细胞可高效杀灭携带AFP抗原的靶细胞，且其杀伤作用与HLA分子的匹配程度成正相关。本发明的方法在验证时，仅选择了两条HLA-A匹配的靶细胞，而DC-CTL全自体体系产生的CTL细胞，其能够发挥作用的还包括HLA-B、C等位点。因此，理论上说，所产生的杀伤效用会高于本法已经产生的效用。

附图说明

图1显示本发明的DC细胞负载并表达AFP抗原检测结果。

图2显示DC-AFP诱导产生的免疫细胞类型检测结果。

图3显示DC-AFP诱导扩增免疫细胞数量的检测结果。

图4显示分选后的细胞免疫表型鉴定结果。

图5显示靶细胞流式分析实验结果。

图6显示靶细胞AFP抗原表达检测结果。

图7显示DC-AFP诱导产生的CTL细胞对靶细胞的杀伤作用的实验结果。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1、负载AFP抗原的DC细胞和靶细胞

靶细胞构建、DC细胞和靶细胞负载抗原

1、设计引物，PCR克隆AFP基因，构建慢病毒载体

（1）根据NCBI nucleotide内公布的AFP核酸序列，本发明中，设计了两段具有重叠部分的AFP核酸序列：AFP-1段核酸序列（其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示）与AFP-2段核酸序列（其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示），委托第三方进行引物合成（引物序列参见SEQ IDNo. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7以及SEQ ID No. 8）。

AFP-1段核酸序列（SEQ ID No. 1）：

Agaacactgcatagaaatgaatatggaatagcttccatattggattcttaccaatgtactgcagagataagtttagctgacctggctaccatattttttgcccagtttgttcaagaagccacttacaaggaagtaagcaaaatggtgaaagatgcattgactgcaattgagaaacccactggagatgaacagtcttcagggtgtttagaaaaccagctacctgcctttctggaagaactttgccatgagaaagaaattttggagaagtacggacattcagactgctgcagccaaagtgaagagggaagacataactgttttcttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccacttttccaagttccagaacctgtcacaagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattcatgaacaaattcatttatgagatagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaattcttctttgggctgctcgctatgacaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgcagttgaatgcttccaaacaaaggcagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttgttaaatcaacatgcatgtgcagtaatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccataactgttactaaactgagtcagaagtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaactagtcctggatgtggcccatgtacatgagcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctgcaggatggggaaaaaatcatgtcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaaataacagaatgctgcaaactgaccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaaaatgat

AFP-1段氨基酸序列（SEQ ID No. 2）：

RTLHRNEYGIASILDSYQCTAEISLADLATIFFAQFVQEATYKEVSKMVKDALTAIEKPTGDEQSSGCLENQLPAFLEELCHEKEILEKYGHSDCCSQSEEGRHNCFLAHKKPTPASIPLFQVPEPVTSCEAYEEDRETFMNKFIYEIARRHPFLYAPTILLWAARYDKIIPSCCKAENAVECFQTKAATVTKELRESSLLNQHACAVMKNFGTRTFQAITVTKLSQKFTKVNFTEIQKLVLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAEND

AFP-2段核酸序列（SEQ ID No. 3）：

tcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaaataacagaatgctgcaaactgaCcacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaaaatgatgaaaaacctgaaggtctAtctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagattttaaccaattttcttcaggggaaAaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatattcaagaagacatcctcagcttgctgtCtcagtaattctaagagttgctaaaggataccaggagttattggagaagtgtttccagactgAaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaagaagaattacagaaatacatccaggagagcCaagcattggcaaagcgaagctgcggcctcttccagaaactaggagaatattacttacaaaaTgcgtttctcgttgcttacacaaagaaagccccccagctgacctcgtcggagctgatggccaTcaccagaaaaatggcagccacagcagccacttgttgccaactcagtgaggacaaactattgGcctgtggcgagggagcggctgacattattatcggacacttatgtatcagacatgaaatgactCcagtaaaccctggtgttggccagtgctgcacttcttcatatgccaacaggaggccatgcttCagcagcttggtggtggatgaaacatatgtccctcctgcattctctgatgacaagttcatttTccataaggatctgtgccaagctcagggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaagagtttctcAttaaccttgtgaagcaaaagccacaaataacagaggaacaacttgaggctgtcattgcagatTtctcaggcctgttggagaaatgctgccaaggccaggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaactgatttcaaaaactcgtgctgctttgggagtttaa

AFP-2段氨基酸序列（SEQ ID No. 4）：

SYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAENDEKPEGLSPNLNRFLGDRDFNQFSSGEKNIFLASFVHEYSRRHPQLAVSVILRVAKGYQELLEKCFQTENPLECQDKGEEELQKYIQESQALAKRSCGLFQKLGEYYLQNAFLVAYTKKAPQLTSSELMAITRKMAATAATCCQLSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQCCTSSYANRRPCFSSLVVDETYVPPAFSDDKFIFHKDLCQAQGVALQTMKQEFLINLVKQKPQITEEQLEAVIADFSGLLEKCCQGQEQEVCFAEEGQKLISKTRAALGV*

AFP-1段引物序列：

5’cgcggatccagaacactgcatagaaatgaatat（SEQ ID No. 5）

3’gagtctagattaatcattttctgcatgaattat（SEQ ID No. 6）

AFP-2段引物序列：

5’gcgggatcctcctacatatgttctcaacaagac（SEQ ID No. 7）

3’ tgttctagattaaactcccaaagcagcacgagt（SEQ ID No. 8）。

（2）TE缓冲液溶解引物，稀释至工作浓度备用。以HepG2细胞的mRNA反转录后获得cDNA模板。设置PCR体系，对两段AFP基因（AFP-1段核酸序列与AFP-2段核酸序列）进行PCR。

（3）PCR产物与6×loading buffer混合，1%琼脂糖凝胶上样，130V，35min。切割目的条带并进行胶回收。

（4）分别用BamHI和XbaI位点对胶回收产物以及载体质粒进行双酶切，37℃，2h。

（5）将酶切后产物跑胶，分别切割PCR产物片段以及载体得大片段，胶回收，按照摩尔比载体：片段=1：3进行连接，常温静置2小时。

（6）连接产物加入到50μl stbl3感受态内混匀，冰上放置20min。42℃，热激90s。迅速放回冰上，静置2min。

（7）向EP管内加入500μl LB液体培养基，置于37℃摇床内，180rpm，30min。

（8）取出转化后感受态细胞，5000rpm，3min。弃大部分上清，留底部100μl LB培养基以重悬菌液。将菌液转移至LB固体培养基平板上，涂布均匀。

（9）37℃培养箱，培养过夜。

（10）次日，挑取单克隆摇菌。

（11）收集菌体，按照质粒小提试剂盒的说明书，提取质粒。

（12）所得质粒以及商业化pCDH慢病毒骨架载体，分别用BamH1和XbaI进行双酶切，跑胶验证。

（13）取条带位置正确的克隆质粒，送第三方测序。

（14）测序显示正确后，取目的质粒大提，备用。

2、AFP抗原、荧光素酶（luciferase）、HLA等分子慢病毒包装及浓缩

（1）复苏293细胞，培养传代。

（2）转染前一天胰酶消化，按照5×10⁶个细胞/皿接种于10cm培养皿内，37℃，培养过夜。

（3）转染：慢病毒包装质粒与目的基因载体按照1:1质量比混合，加入转染试剂，质量比:质粒=3:1，室温放置30min。

（4）用RPMI1640培养基替换培养皿内的培养基，将转染混合液轻轻加入培养皿内，轻柔混匀。

（5）4小时后，弃转染上清，替换成含FBS的培养基继续培养细胞。

（6）分别于24小时、48小时和72小时收集病毒。

（7）加入病毒浓缩液，混匀后4℃冰箱静置过夜。

（8）3000rpm，4℃，1小时，弃上清，按照原体积1/10的量加入新鲜培养基重悬病毒，分装后储存于-80℃冰箱。

3、靶细胞构建、DC细胞和靶细胞负载AFP抗原

（1）NIH 3T3细胞按照5×10⁵个细胞接种于6孔板内，贴壁3小时。配制500μl浓缩后的luciferase病毒液+500μl完全培养基+1μl 10mg/ml 聚凝胺（polybrene）混合液，加入到细胞内培养过夜；

（2）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用luciferase病毒混合液进行二次转染。

（3）按照（1）和（2）的步骤再次转染β2M病毒，得到3T3L细胞。

（4）消化并按照5×10⁵个3T3L细胞接种于6孔板内，分别转入HLA-2402, HLA-0201以及HLA2402+HLA A0201病毒，各组细胞均转染3次，后经流式检测HLA分子表达情况。

（5）分别取2-5×10⁶个DC细胞（CelArtics®–DC细胞）或5×10⁵个靶细胞（3T3L、3T3L HLA-A2402、3T3L HLA-A0201 以及3T3L HLA-A224）接种于6孔板内。

（6）配制浓缩后的AFP病毒液+1μl 10mg/ml polybrene混合液，加入到细胞内培养过夜。

（7）次日早上，更换新鲜培养基培养细胞。下午，再次替换培养基，继续用AFP病毒混合液进行二次转染。

（8）重复步骤（6），培养细胞至足够数量。

（9）配制10% SDS PAGE胶备用。

（10）收集慢病毒转染后的靶细胞，同时收集转染AFP前的3T3L细胞作为对照。

（11）根据细胞总量加入一定比例的蛋白裂解液，冰上裂解细胞。

（12）裂解后蛋白经95℃高温煮20min，备用。

（13）蛋白上样，80V，30min。120V，60min。

（14）转膜，300mA，60min。

（15）一抗孵育，置于4℃摇床上过夜。

（16）次日，PBST洗涤膜3次，孵二抗，室温，1小时。

（17）PBST细膜3次。加入ECL发光液，曝光。

（18）数据整理及分析。

本实施例中，为验证DC负载AFP抗原后的表达情况，取部分原始DC细胞以及转入抗原的DC细胞，经裂解后通过western blot检测细胞内AFP蛋白的表达情况。结果请参见图1所示，结果显示，DC细胞表达AFP蛋白（ AFP两条多肽序列大小相近，图中无法明显区分开），可用于后续验证。

靶细胞HLA分子表达的流式分析结果参见图5。NIH3T3先后放入Luciferase基因、β2M基因后，分别或联合放入HLA2402、HLA0201等基因，通过流式分析检测HLA-A2402和HLA-A0201的表达情况。由图可知，所有靶细胞在慢病毒转染后表达HLA-2402分子和（或）HLA-A0201分子。

为验证靶细胞AFP抗原表达情况，取部分3T3L系列的靶细胞，经裂解后通过western blot检测各细胞内AFP蛋白的表达情况。结果请参见图6，结果显示，每种靶细胞均表达AFP蛋白，且各靶细胞间AFP的表达水平相当，可用于后续验证。

实施例2、DC-AFP诱导扩增免疫细胞

本实施中，采用DC-AFP诱导扩增免疫细胞，制备了AFP蛋白抗原特异性CTL细胞。制备过程主要包括：

（1）取负载抗原的DC细胞和自体PBMC细胞，计数。

（2）用含5%人血清的X-VIVO培养基，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合DC细胞和PBMC细胞，静置培养过夜。

（3）次日，向培养体系内加入200~1000unit/ml的白介素2，混合后培养。

（4）根据细胞生长状况，添加适量的培养基和白介素2。

（5）第12-14天时，收集部分细胞进行流式分析。

（6）取1-5×10⁵个细胞，2500rpm，离心5min。

（7）PBS洗涤2次，2500rpm，离心5min。

（8）向细胞内加入100ul 含BSA的封闭液，冰上封闭10-15min。

（9）将细胞分成两份，一份加入CD3+CD56抗体，另一份加入两个抗体的同型对照抗体，冰上孵育30min。

（10）PBS洗涤3次，2500rpm，5min。

（11）500ul PBS重悬细胞，过滤后上流式细胞仪检测。

（12）检测结果显示CD3-CD56-区域细胞少于3%时，收集部分细胞进行磁珠分选，另一部分细胞继续培养至21天，记录免疫细胞扩增倍数。

（13）根据细胞密度和CD3细胞比例，取足量的细胞置于15ml离心管内，1000rpm，3min。

（14）弃上清，PBS洗涤，1000rpm，3min。

（15）弃上清，500ul X-VIVO15培养基重悬细胞，加入100ul CD3磁珠，混匀。

（16）放置细胞悬液于摇床上，室温，低速运行15min。

（17）向细胞悬液内加入5mlPBS，充分颠倒混匀后置于磁力架上，静置2min。

（18）小心将上清转移至干净的15ml离心管内，将原离心管从磁力架上取下，加入5ml PBS，颠倒混匀以洗涤磁珠。

（19）重复（18）步骤1次。

（20）用含5% 人血清的X-VIVO15培养基重悬磁珠，加入500unit/ml IL2，置于6孔板内培养过夜。

（21）收集孔板内磁珠于离心管内，充分吹打磁珠，置于磁力加上以使T细胞和磁珠分离。

（22）收集并合并上清，1000rpm，5min。

（23）用含5% 人血清的X-VIVO15培养基细胞继续培养3-5天，此细胞即为T细胞。

（24）T细胞数量足够后，用于后续研究。

本实施例中，检测了DC-AFP诱导产生的免疫细胞类型。用DC-AFP细胞（HLA-A0201+HLA-A2402）与自体PBMC细胞按照1:300比例进行共培养，培养基中按照500unit/ml添加重组IL2，分别于诱导后的第14天和第21天，取少量细胞进行流式分析，检测扩增的免疫细胞的类型。结果如图2所示，在第14天时，免疫细胞内包含CD3+的T细胞、CD56+ NK细胞以及部分CD3+CD56+细胞。在第21天时，NK细胞的比例显著增加，细胞状态良好。

本实施例中，将DC-AFP细胞与自体PBMC细胞按照1：300比例进行共培养，培养基为含5%自体血浆的X-VIVO15，每日按照培养基总体积添加500 unit/ml IL2进行培养。实验结果参见图3，结果表明，在本培养体系下，免疫细胞增殖良好，细胞形态饱满，健康。第21天时，细胞扩增了1000倍以上。

本实施例中，在DC-AFP与PBMC按照1:300比例共培养，培养基为含5%自体血浆的X-VIVO15，每日按照培养基总体积添加500 unit/ml IL2进行培养。至第11天时，取部分免疫细胞，用CD3磁珠进行分选以获取T细胞。分离磁珠上的T细胞并继续培养，于以经westernblot的第14天时用流式检测分选出的T细胞的纯度。由图4可知，分选后，CD3+的细胞比例达95%，可用于后续研究。

实施例3、AFP抗原特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤作用

本实施例中，考察了AFP抗原特异性CTL细胞对靶细胞的杀伤作用。相关方法包括如下操作：

（1）消化靶细胞3T3L/AFP、3T3L/2402/AFP、3T3L/224/AFP，计数，按照5x104个细胞/孔接种于24孔板内，贴壁2-3小时；

（2）细胞计数，按照效应细胞：靶细胞分别为1:1,2:1,5:1和10:1的比例将效应细胞加入到靶细胞内，混合培养4小时；

（3）吸弃悬浮的T细胞，PBS轻柔洗涤1~3次以去除漂浮的死亡靶细胞，吸干孔内液体；

（4）每孔加入100μl的细胞裂解液，冰上裂解，使细胞释放出luciferase蛋白；

（5）转移裂解液至1.5ml EP管内，3000rpm，离心3min；

（6）取luciferase报告基因底物100μl加至酶标板内，分别取裂解液上清20μl加入底物中；

（7）样品上机检测，根据荧光强度计算靶细胞杀伤效率。

本发明的技术方案，3T3L细胞经AFP和HLA A0201和HLA-A2402表达检测后，即可用于T细胞的杀伤效果检测。按照效靶比为1:1，2：1，5：1和10:1的条件进行三种靶细胞的杀伤测试，结果如图7所示，CTL细胞对于不表达HLA分子的3T3L/AFP细胞杀伤作用较弱，效靶比10：1状况下的杀伤可能由CTL细胞中少量的NK细胞引起。CTL细胞展现出很强的针对表达HLA-A2402和AFP的靶细胞的杀伤作用，10：1比例下的杀伤作用可达70%，杀伤效果强。并且，在同时表达HLA-A2402和HLA-0201时，可发现CTL细胞对靶细胞的杀伤作用更强，具有统计学差异。该结果说明，HLA分子匹配的数量越高，CTL细胞的杀伤作用越强。

序列表

<110> 北京翊博普惠生物科技发展有限公司

<120> 靶向AFP全抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用

<130> GAI20CN3663

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(906)

<400> 1

aga aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct 48

Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser

1 5 10 15

tac caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt 96

Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe

20 25 30

ttt gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg 144

Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met

35 40 45

gtg aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag 192

Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln

50 55 60

tct tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt 240

Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu

65 70 75 80

tgc cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc 288

Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys

85 90 95

agc caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag 336

Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr

180 185 190

aaa gaa tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta 624

Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val

195 200 205

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210 215 220

ctg agt cag aag ttt acc aaa gtt aat ttt act gaa atc cag aaa cta 720

Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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210 215 220

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<211> 975

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(975)

<400> 3

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Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala

20 25 30

gaa aat gat gaa aaa cct gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt 144

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65 70 75 80

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Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly

100 105 110

gaa gaa gaa tta cag aaa tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag 384

Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys

115 120 125

cga agc tgc ggc ctc ttc cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat 432

Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn

130 135 140

gcg ttt ctc gtt gct tac aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg 480

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165 170 175

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245 250 255

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130 135 140

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<220>

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 6

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<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 7

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<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 8

tgttctagat taaactccca aagcagcacg agt 33

Claims

1.一种负载AFP全抗原的DC细胞，其是通过包括以下步骤的方法制备得到的：

构建两种载体：插入编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白片段的基因的慢病毒载体，和插入编码SEQ ID No. 4所示氨基酸序列组成的蛋白片段的基因的慢病毒载体；

将上述两种载体共转染可扩增DC细胞，得到呈递AFP全抗原的DC细胞。

2. 根据权利要求1所述的负载AFP全抗原的DC细胞，其中，编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白片段的基因为SEQ ID No. 1所示序列组成的多核苷酸，编码SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的蛋白片段的基因为SEQ ID No. 3所示序列组成的多核苷酸。

3.权利要求1或2所述的负载AFP全抗原的DC细胞的制备方法，该方法包括：

4.权利要求1或2所述的负载AFP全抗原的DC细胞在制备AFP蛋白抗原特异性的免疫细胞组合物中的应用。

5.一种免疫细胞，其是由权利要求1或2所述的负载AFP全抗原的DC细胞诱导产生的，所述免疫细胞包括CTL细胞，其中CD3+的细胞比例达95%。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞，所述免疫细胞是由权利要求1或2所述的负载AFP全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养获得的；所述的负载AFP全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，按照DC细胞：PBMC=1:5~1:500的量混合培养。

7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其中，所述的负载AFP全抗原的DC细胞与自体PBMC细胞共培养时，培养体系中加入200~1000unit/ml的白介素2进行混合培养。

8.权利要求5-7任一项所述的免疫细胞在制备具有杀灭携带AFP抗原的靶细胞的试剂中的应用。

9.一种试剂盒，其包括：权利要求1或2所述的负载AFP全抗原的DC细胞。