CN111647075A - 催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，利用多孔陶瓷颗粒制备成的正电荷多孔陶瓷颗粒可以在层析过程中特异性的吸附含病毒单克隆抗体溶液中的带负电荷的病毒颗粒，去除效果达到了6logs以上，而且单克隆抗体溶液的蛋白浓度未降低，达到了很好的病毒去除效果，比现有的先经过阴离子层析或亲和层析再加入纳滤去除病毒的方法，节约时间及纳滤耗材，并且蛋白溶液在层析设备及纳滤设备上总体时间大大减少，蛋白溶液的活性降低及总量增加。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品安全性领域，尤其涉及一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法。
背景技术
治疗用生物制品是指采用不同表达系统的工程细胞（如细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞）所制备的蛋白质、多肽及其衍生物，包括细胞因子、纤维蛋白溶解酶原激活因子、重组血浆因子、生长因子、融合蛋白、酶、受体、激素和单克隆抗体等。以上目的蛋白（主要是单克隆抗体）包括细胞外分泌或细胞内表达为主，且需要一系列的分离目的蛋白与各种杂质，例如细胞碎片，宿主细胞内蛋白、酶类、核酸物质等。目前在生产中的应用主要包括一个或者多个层析步骤来清除以上杂质。典型的单克隆抗体纯化方法一般为三步：首先利用亲和层析捕获培养收获液中的目的蛋白，再利用两步骤离子交换层析或者离子交换加疏水层析进行精细纯化。一般来说每个步骤都具有一定量的病毒去除效果，但是通常情况下不能完全去除掉病毒。因此，在生产工艺中一般都会加入一步额外的纯化步骤（纳米过滤）来保证病毒的完全去除。但是利用现有的层析步骤和纳米过滤步骤可以确保单克隆抗体中的病毒完全被去除，但是损耗的时间成本以及材料成本巨大，并且单克隆抗体在工艺中的处理时间越长，蛋白的活性成分损失越高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，旨在解决利用现有的层析步骤和纳米过滤步骤可以确保单克隆抗体中的病毒完全被去除，但是损耗的时间成本以及材料成本巨大，并且单克隆抗体在工艺中的处理时间越长，蛋白的活性成分损失越高的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，包括：
对硅藻土多孔陶瓷颗粒进行预处理后室温干燥；
将干燥后的硅藻土多孔陶瓷颗粒浸泡在用NaOH和YCl3·6H2O制备成的溶胶体溶液中，超声波涂膜反应0.5小时，置于100℃干燥箱中干燥，Y为钇；
重复上述操作三次后，再置于马弗炉中干烤700℃并保温1小时，制备得到正电荷多孔陶瓷颗粒；
通过筛网筛选正电荷多孔陶瓷颗粒；
将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱；
制备单克隆抗体样本模拟溶液，所述单克隆抗体样本模拟溶液包括牛血清白蛋白标准溶液和病毒，其中，所述牛血清白蛋白标准溶液和所述病毒的比例为500:1，所述病毒为鼠细小病毒或呼肠孤病毒3型；
将所述单克隆抗体样本模拟溶液流穿由正电荷多孔陶瓷颗粒为填料的层析柱；
收集流穿液、冲洗液、洗脱液、清洗液，分别测定其中的滴度。
在一实施方式中，在将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱之中，所述空层析柱的直径为1cm~1.5cm，颗粒基重的填充密度为0.5kg/l。
在一实施方式中，将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱，具体包括：
取10ml沉降的正电荷多孔陶瓷颗粒加入到空层析柱中；
用50ml去离子水进行冲洗至平衡。
在一实施方式中，用50ml去离子水进行冲洗至平衡之后，所述方法还包括：
用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱。
在一实施方式中，用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱之后，所述方法还包括：
用120ml平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡填充后的层析柱，当紫外280nm波长处吸光度值基线平稳后，将紫外吸光度值置零。
本发明的一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，通过利用多孔陶瓷颗粒制备成的正电荷多孔陶瓷颗粒可以在层析过程中特异性的吸附含病毒单克隆抗体溶液中的带负电荷的病毒颗粒，去除效果达到了6logs以上，而且单克隆抗体溶液的蛋白浓度未降低，达到了很好的病毒去除效果，比现有的先经过阴离子层析或亲和层析再加入纳滤去除病毒的方法，节约时间及纳滤耗材，并且蛋白溶液在层析设备及纳滤设备上总体时间大大减少，蛋白溶液的活性降低及总量增加。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法的流程示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1，图1是本发明实施例提供的一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法的流程示意图。具体的，所述催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法可以包括以下步骤：
S101、对硅藻土多孔陶瓷颗粒进行预处理后室温干燥；
本发明实施例中，硅藻土多孔陶瓷颗粒由多孔陶瓷材料制成，多孔陶瓷材料是在材料成型与烧结过程中控制孔径的大小和分布而形成的一类多孔隙陶瓷产品。由于有共价键及复杂的离子键的键合以及复杂的晶体结构，当流体流经孔隙时，可以特异性的吸附蛋白及其他物质。对硅藻土多孔陶瓷颗粒进行预处理后室温干燥，具体步骤包括：将硅藻土多孔陶瓷颗粒浸泡在1mol/L的HNO3中进行酸化处理，其中，硅藻土多孔陶瓷颗粒的规格为123mm×10mm，孔径为0.3~1.0微米，孔径大的颗粒容易在使用中逃逸粒径小的病毒，此孔径规格大小的硅藻土多孔陶瓷颗粒可以吸附较小粒径的病毒。使用1mol/L的HNO3使所述硅藻土多孔陶瓷颗粒完全浸泡在其中，进行酸化处理，使下一步骤的NaOH和YCl3·6H2O更容易在颗粒表面反应成膜。
S102、将干燥后的硅藻土多孔陶瓷颗粒浸泡在用NaOH和YCl3·6H2O制备成的溶胶体溶液中，超声波涂膜反应0.5小时，置于100℃干燥箱中干燥；
本发明实施例中，具体作用是使颗粒表面形成一层氢氧化钇材料为主的正电荷涂膜层，便于吸附病毒颗粒。钇，化学符号为Y，是稀土金属元素，是一种灰黑色金属，有延展性。YCl3·6H2O是氯化钇（Ⅲ）六水合物。
S103、重复上述操作三次后，再置于马弗炉中干烤700℃并保温1小时，制备得到正电荷多孔陶瓷颗粒；
本发明实施例中，重复上述操作三次，上述操作指预处理后室温干燥、浸泡后超声波涂膜反应后干燥。
S104、通过筛网筛选正电荷多孔陶瓷颗粒；
本发明实施例中，可根据基于准确清除的病毒粒子大小决定正电荷多孔陶瓷颗粒的直径，可以最大程度捕获病毒粒子，正电荷多孔陶瓷颗粒的外径不超过40微米，颗粒大小可通过400目的筛网进行筛选，优选正电荷多孔陶瓷颗粒的直径为20nm至100nm。
S105、将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱；
本发明实施例中，所述空层析柱的直径为1cm~1.5cm，颗粒基重的填充密度为0.5kg/l。将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱，具体步骤包括：取10ml沉降的正电荷多孔陶瓷颗粒加入到空层析柱中；用50ml去离子水进行冲洗至平衡。用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱。用120ml平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡填充后的层析柱，当紫外280nm波长处吸光度值基线平稳后，将紫外吸光度值置零。
S106、制备单克隆抗体样本模拟溶液，所述单克隆抗体样本模拟溶液包括牛血清白蛋白标准溶液和病毒，其中，所述牛血清白蛋白标准溶液和所述病毒的比例为500:1，所述病毒为鼠细小病毒（MVM）或呼肠孤病毒3型（ReoV-3）；
本发明实施例中，所述病毒的滴度均在7.0logs以上，所述单克隆抗体样本模拟溶液的浓度为2.0mg/ml。
S107、将所述单克隆抗体样本模拟溶液流穿由正电荷多孔陶瓷颗粒为填料的层析柱；
本发明实施例中，所述柱流速为0.2ml/min。
S108、收集流穿液、冲洗液、洗脱液、清洗液，分别测定其中的滴度。
本发明实施例中，收集流穿液，冲洗液，洗脱液，清洗液，分别测定其中的滴度，具体包括：将单克隆抗体样本模拟溶液以2.0ml/min流速进行上样，当紫外吸光度值（UV值）开始上升时，开始收集流穿液；上样结束后，用60ml的平衡缓冲液以2.0ml/min流速进行冲洗填充后的层析柱，当紫外吸光度值（UV值）开始下降至趋于平缓时结束收集冲洗液；用50ml洗脱液以2.0ml/min流速进行洗脱，当紫外吸光度值（UV值）开始上升时开始收集洗脱液，等紫外吸光度值（UV值）下降至趋于平缓时结束收集洗脱液；用50ml去离子水以2.0ml/min流速清洗填充后的层析柱，然后用50ml0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱，再用120ml去离子水以2.0ml/min流速清洗填充后的层析柱，收集清洗液；用25ml20%乙醇保存层析柱；将流穿液，冲洗液，洗脱液，清洗液进行10倍数的倍比稀释，并加入到前一天已制好的96孔细胞培养板中进行检测。
实施例1：催化生物陶材料去除单克隆抗体中的MVM去除验证工艺。
装柱：取沉降后的硅藻土多孔陶瓷颗粒（颗粒是由技术方案中的方法得到的）10ml加入到有机玻璃层析柱中，柱体直径是1cm，柱高20cm，并组装至全自动AKTA蛋白纯化系统上，用50ml去离子水进行冲洗至平衡。填料清洗：用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗柱子。离子交换层析平衡：用120ml平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡层析柱，A280（紫外280nm波长处吸光度值）基线平稳后，将UV值（紫外吸光度）置零。上样：取100ml市售的BSA（牛血清白蛋白）标准溶液（0.48mg/ml）,按1：500的比例加入MVM病毒液，混匀后调节PH至4.0（使BSA蛋白呈正电荷），取样标记为待检样品1，将剩余样品以2.0ml/min流速进行上样。当UV值开始上升时，开始收集流穿液。冲洗：上样结束后，用60ml的平衡缓冲液以2.0ml/min流速进行冲洗柱子，当UV值开始下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的流穿液为待检样品2。洗脱：用50ml洗脱液以2.0ml/min流速进行洗脱，当UV值开始上升时开始收集洗脱液，等UV值下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的洗脱液为待检样品3。清洗：用50ml去离子水以2.0ml/min流速清洗柱子，然后用50ml0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗柱子，再用120ml去离子水以2.0ml/min流速清洗柱子，最后用25ml20%乙醇保存层析柱。检测：将上述待检样品进行10倍数的倍比稀释，将稀释好的样品加入到前一天已制好的96孔细胞培养板中进行检测，计算方法按照karber方法。观察结果：结果可知上样前样品中MVM滴度为5logs，流穿液中MVM的滴度未检出，洗脱液中MVM的滴度为4logs，流穿液经过大体积测定及盲传三代测定均未检出病毒，由此可知，本次层析验证工艺中MVM被多孔陶瓷材料特异性吸附并且病毒去除效果超过了《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求的4logs，保证了工艺的生物安全性的要求。
实施例2：催化生物陶材料去除单克隆抗体中的ReoV-3去除验证工艺。
装柱：取沉降后的硅藻土多孔陶瓷颗粒（颗粒是由技术方案中的方法得到的）10ml加入到有机玻璃层析柱中，柱体直径是1cm，柱高20cm，并组装至全自动AKTA蛋白纯化系统上，用50ml去离子水进行冲洗至平衡。填料清洗：用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗柱子。离子交换层析平衡：用120ml平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡层析柱，A280（紫外280nm波长处吸光度值）基线平稳后，将UV值（紫外吸光度）置零。上样：取100ml市售的BSA（牛血清白蛋白）标准溶液（0.48mg/ml），按1：500的比例加入ReoV-3病毒液，混匀后取样标记为待检样品1，将剩余样品以2.0ml/min流速进行上样。当UV值开始上升时，开始收集流穿液。冲洗：上样结束后，用60ml的平衡缓冲液以2.0ml/min流速进行冲洗柱子，当UV值开始下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的流穿液为待检样品2。洗脱：用50ml洗脱液以2.0ml/min流速进行洗脱，当UV值开始上升时开始收集洗脱液，等UV值下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的洗脱液为待检样品3。清洗：用50ml去离子水以2.0ml/min流速清洗柱子，然后用50ml0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗柱子，再用120ml去离子水以2.0ml/min流速清洗柱子，最后用25ml20%乙醇保存层析柱。检测：将上述待检样品进行10倍数的倍比稀释，将稀释好的样品加入到前一天已制好的96孔细胞培养板中进行检测，计算方法按照karber方法。观察结果：结果可知上样前样品中ReoV-3滴度为5.7logs，流穿液中ReoV-3的滴度未检出，洗脱液中ReoV-3的滴度为4.3logs，流穿液经过大体积测定及盲传三代测定均未检出病毒，由此可知，本次层析验证工艺中ReoV-3被多孔陶瓷材料特异性吸附并且病毒去除效果超过了《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求的4logs，保证了工艺的生物安全性的要求。
结果为流穿液中未测出病毒滴度，冲洗液及清洗液中可以检测到较高的病毒滴度，原因是无包膜病毒带负电荷可以很好的吸附在由带正电荷多孔陶瓷颗粒制备成的填料上，由于采用了惰性材料，蛋白溶液不太容易吸附在填料上，测定流穿液中蛋白浓度未降低。其中，测定病毒滴度的方法为50%组织细胞感染量（TCID50）的终点稀释滴定法。利用多孔陶瓷颗粒制备成的正电荷多孔陶瓷颗粒可以在层析过程中特异性的吸附含病毒单克隆抗体溶液中的带负电荷的病毒颗粒，去除效果达到了6logs以上，而且单克隆抗体溶液的蛋白浓度未降低，达到了很好的病毒去除效果，比现有的先经过阴离子层析或亲和层析再加入纳滤去除病毒的方法，节约时间及纳滤耗材，并且蛋白溶液在层析设备及纳滤设备上总体时间大大减少，蛋白溶液的活性降低及总量增加。本发明的层析柱与现有技术工艺中存在阴离子交换层析柱进行比对如表1：
表1 本发明的层析柱与现有技术工艺中存在阴离子交换层析柱进行比对
现有技术一般是将蛋白溶液中的蛋白吸附到层析柱上，然后再进行平衡冲洗，最后进行洗脱把蛋白从层析柱上洗脱下来，但是不可避免的溶液中的病毒也会随之一起吸附到层析柱上随之在冲洗时会去除一部分，但是洗脱后蛋白溶液中往往会带有病毒。本发明是将蛋白溶液中的病毒颗粒特异性的吸附到层析柱上，蛋白不结合层析柱上的惰性材料，随着流穿液一起流下，达到去除病毒粒子的效果。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (5)
1.一种催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，其特征在于，包括：
对硅藻土多孔陶瓷颗粒进行预处理后室温干燥；
将干燥后的硅藻土多孔陶瓷颗粒浸泡在用NaOH和YCl3·6H2O制备成的溶胶体溶液中，超声波涂膜反应0.5小时，置于100℃干燥箱中干燥，Y为钇；
重复上述操作三次后，再置于马弗炉中干烤700℃并保温1小时，制备得到正电荷多孔陶瓷颗粒；
通过筛网筛选正电荷多孔陶瓷颗粒；
将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱；
制备单克隆抗体样本模拟溶液，所述单克隆抗体样本模拟溶液包括牛血清白蛋白标准溶液和病毒，其中，所述牛血清白蛋白标准溶液和所述病毒的比例为500:1，所述病毒为鼠细小病毒或呼肠孤病毒3型；
将所述单克隆抗体样本模拟溶液流穿由正电荷多孔陶瓷颗粒为填料的层析柱；
收集流穿液、冲洗液、洗脱液、清洗液，分别测定其中的滴度。
2.如权利要求1所述的催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，其特征在于，在将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱之中，所述空层析柱的直径为1cm~1.5cm，颗粒基重的填充密度为0.5kg/l。
3.如权利要求1所述的催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，其特征在于，将筛选后的正电荷多孔陶瓷颗粒在空层析柱中装柱，具体包括：
取10ml沉降的正电荷多孔陶瓷颗粒加入到空层析柱中；
用50ml去离子水进行冲洗至平衡。
4.如权利要求3所述的催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，其特征在于，用50ml去离子水进行冲洗至平衡之后，所述方法还包括：
用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱。
5.如权利要求4所述的催化生物陶材料从含目的蛋白的样品中去除病毒的方法，其特征在于，用50ml的0.5M NaOH溶液以1.0ml/min的速度清洗填充后的层析柱之后，所述方法还包括：
用120ml平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡填充后的层析柱，当紫外280nm波长处吸光度值基线平稳后，将紫外吸光度值置零。
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| CN102060561A (zh) * | 2010-11-19 | 2011-05-18 | 西安理工大学 | 一种硅藻土基多孔AgO陶瓷材料的制备方法 |
| CN102154228A (zh) * | 2009-12-16 | 2011-08-17 | 米利波尔公司 | 大生物分子流通纯化方法 |
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