[go: up one dir, main page]

CN111635937A - Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111635937A
CN111635937A CN202010605346.XA CN202010605346A CN111635937A CN 111635937 A CN111635937 A CN 111635937A CN 202010605346 A CN202010605346 A CN 202010605346A CN 111635937 A CN111635937 A CN 111635937A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ass1
bckdk
protein
ulcerative colitis
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010605346.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111635937B (zh
Inventor
刘史佳
周伟
陈玉根
陈选青
徐民民
卢晓云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University, Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN202010605346.XA priority Critical patent/CN111635937B/zh
Priority to CN202111026064.5A priority patent/CN113694202B/zh
Publication of CN111635937A publication Critical patent/CN111635937A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111635937B publication Critical patent/CN111635937B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了ASS1或BCKDK抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。本发明发现，在溃疡性结肠炎中，ASS1和BCKDK转录水平、蛋白水平显著升高，通过干扰ASS1或BCKDK基因的表达，可以显著缓解溃疡性结肠炎。因此，ASS1或BCKDK可以作为药物作用靶点用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，可以作为药物作用靶点用于筛选发现防治溃疡性结肠炎的药物，ASS1或BCKDK的抑制剂可以用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，其中：ASS1指ASS1基因或蛋白，BCKDK指BCKDK基因或蛋白；抑制剂的抑制活性为抑制ASS1或BCKDK蛋白的活性，或抑制ASS1或BCKDK基因的表达。

Description

ASS1或BCKDK抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的 应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及已知靶标的抑制剂在治疗溃疡性结肠炎中的应用，具体涉及ASS1或BCKDK抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称慢性非特异性溃疡性结肠炎或特发性溃疡性结肠炎，是一种常见的慢性肠道疾病，也是一种多因素、多层次的原因不明的非特异性炎症。病变主要在结肠的黏膜及黏膜下层，呈连续性弥漫性分布，多数累及直肠和乙状结肠。主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等，部分患者有肠外表现，如关节、肝胆管类疾病及眼睛、皮肤的损伤；病程迁延不愈，轻重不等；发病年龄段主要在20～50岁，但无显著性的性别差异。国内外流行病学统计数据显示，UC的发病率和和患病率均呈现明显的增高趋势，被世卫组织列为现代难治病之一，其病因、病机和治疗药物一直是研究热点。
精氨基琥珀酸合成酶1(ASS1)是一种从瓜氨酸及天冬氨酸催化合成精氨基琥珀酸的酶，其表达的异常升高可导致血液内的氮及其他尿素循环的副产物，如精氨酸，明显上升。支链α-酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)是支链氨基酸(BCAA)分解代谢关键复合酶(BCKDH)的负调控激酶，BCKDK表达异常升高容易导致支链氨基酸-亮氨酸的堆积。
目前，尚未有研究公开ASS1或BCKDK与溃疡性结肠炎治疗的关系。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供ASS1或BCKDK抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
ASS1或BCKDK作为药物作用靶点在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述ASS1指ASS1基因或蛋白，所述BCKDK指BCKDK基因或蛋白。
ASS1或BCKDK作为药物作用靶点在筛选发现防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述ASS1指ASS1基因或蛋白，所述BCKDK指BCKDK基因或蛋白。
ASS1或BCKDK的抑制剂在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，抑制剂的抑制活性为抑制ASS1或BCKDK蛋白的活性，或抑制ASS1或BCKDK基因的表达。
进一步地，所述抑制剂包括小分子化合物、核酸分子以及包含所述核酸分子的表达载体。
有益效果：
本发明研究发现，在溃疡性结肠炎中，ASS1和BCKDK转录水平、蛋白水平显著升高，通过腺相关病毒载体构建目的蛋白shRNA片段，干扰ASS1或BCKDK基因的表达，可以显著缓解溃疡性结肠炎。本领域技术人员据此可以确定ASS1或BCKDK可以作为药物作用靶点用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，可以作为药物作用靶点用于筛选发现防治溃疡性结肠炎的药物，ASS1或BCKDK的抑制剂可以用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，其中：ASS1指ASS1基因或蛋白，BCKDK指BCKDK基因或蛋白；抑制剂的抑制活性为抑制ASS1或BCKDK蛋白的活性，或抑制ASS1或BCKDK基因的表达。
附图说明
图1为各组小鼠的体重折线图。
图2为各组小鼠的DAI评分结果。
图3为各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平；其中：A为不同组小鼠血清中IL-1β的表达水平，B为不同组小鼠血清中TNF-α的表达水平，C为不同组小鼠血清中IL-6的表达水平。
图4为各组小鼠的结肠长度测定结果。
图5为各组小鼠的结肠病理学切片及组织学评分结果；其中：A为各组小鼠结肠病理切片图，B为各组小鼠组织学评分结果。
图6为各组小鼠结肠组织中BCKDK、BCKDHA、P-BCKDHA蛋白表达水平和BCKDK mRNA相对表达水平测定结果；其中：A为Q-PCR检测各组小鼠结肠组织中BCKDK mRNA相对表达水平测定结果，B为Westernblot检测各组小鼠结肠组织中BCKDK的蛋白表达情况，C为Westernblot检测各组小鼠结肠组织中BCKDHA和P-BCKDHA的蛋白表达情况。
图7为Western blot检测各组小鼠结肠组织中ASS1的蛋白表达水平和ASS1 mRNA相对表达水平测定结果；其中，A为Q-PCR检测各组小鼠结肠组织中ASS1 mRNA相对表达水平测定结果，B为Western blot检测各组小鼠结肠组织中ASS1的蛋白表达水平。
图8为Westernblot检测各组小鼠结肠组织中S6K和P-S6K的蛋白表达情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料和方法
1、分组、造模和给药
材料：C57BL/6型小鼠；葡聚糖硫酸钠(DSS)；PBS缓冲溶液(PH 7.4)；
目的基因：BCKDK-鼠(Gene ID:12041)、ASS1-鼠(Gene ID:11898)每个基因对应靶向位点：BCKDK(ID：12041)shRNA序列：5’-CCTAGACACTCCCTACAAT-3’；ASS1(ID：11898)shRNA序列：5’-GCCCAGATGTCCTTGAGAT-3’。
载体构建(见上海吉凯基因科技有限公司)：
腺相关病毒载体信息：pAAV-U6-shRNA-CMVbGlobin-eGFP-3Flag(GV390)。
包被病毒(见上海吉凯基因科技有限公司)：
吉凯基因AAV Helper-Free System由病毒载体(携带目的基因干扰片段：GV390)、pAAV-RC载体(携带病毒衣壳蛋白，即血清9型)、pHelper载体(包含AAV-293细胞生产高滴度病毒必须的腺病毒基因VA、E2A和E4的集合)共三个质粒组成。
选取C57BL6型小鼠为实验对象，购自南京市江宁区青龙山动物农场，周龄为8周-12周，在中国药科大学动物实验中心适应性饲养一周左右，待体重至20g左右进行实验。随机分为空白组、模型组、ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组，每组10只小鼠。
实验周期为10天，空白组小鼠饮用正常水10天，其他组别在第一天开始饮用含3％的DSS水溶液至十天进行溃疡性结肠炎(UC)造模。ASS1病毒干扰组第一天一次灌胃给予含有干扰ASS1基因表达的shRNA片段的包被病毒，病毒滴度为1E+11。BCKDK病毒干扰组第一天一次灌胃给予含有干扰BCKDK基因表达的shRNA片段的包被病毒，病毒滴度为1E+11。模型组只造模不给药。最后一天实验结束五个小时后杀小鼠。
2、体重测定
在小鼠开始正式实验的第一天，每天同个时间点称量小鼠体重，记录在表格中，在第10天实验结束后将所有体重整理，做成折线图，以体重来反馈小鼠的疾病严重程度。
3、疾病活动度指数(DAI)评分的测定
实验期间，每天记录小鼠体质量变化、粪便性状及便血情况，进行疾病活动度指数(DAI)评分的测定。DAI由体重减失率分数，大便性状分数和便血分数相加而得，分值在0～12之间。评分标准如下：1)体重减失率评分：体重无减轻，0分；减轻5％～9％，1分；减轻10％～14％，2分；减轻15％～20％，3分；减轻大于20％，4分。2)大便性状评分：正常，0分；松散，1分；半成型稀，2分；不成型稀，3分；水样泄，4分。3)大便便血评分：便血阴性(－)，0分；便血弱阳性(+)，1分；便血阳性(++)，2分；便血强阳性(+++)，3分；肉眼可见血便，4分。在第10天实验结束后，以第10天的DAI评分作为反映小鼠疾病严重程度一个指标。
4、血清炎症因子表达水平的测定
材料：IL-6高敏酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒；IL-1β高敏酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒；TNF-α高敏酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒。
方法：第10天实验结束后，小鼠眼眶取血，置于血清管内，晃匀静置。以3500rpm/min离心10min，吸取上层血清于1.5mL EP管中，-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。测定前室温混匀。
1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，其余孔分别加标准品或待测样品溶液100μL。加样时将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1h。
2)弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μL(使用前一小时内配制，取lμL检测溶液A加99μL检测稀释液A，轻轻混匀)，37℃，60min。
3)温育60min后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，350μL/孔，甩干。
4)每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μL，37℃孵育1h。
5)温育60min后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2min，350μL/孔，甩干。
6)依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光孵育反应15min。
7)依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。
8)用酶标仪在450nm波长下测量各孔的光密度(OD值)。
5、结肠长度测定
在第10天处死小鼠后，解剖小鼠，取其结肠部分，放置在白色纸张上，用直尺量取长度，记录下来，以结肠长度作为一个方面来反应疾病严重程度。
6、结肠病理学切片及组织学评分
材料：4％多聚甲醛；乙二胺四乙酸EDTA；HE染液；中性树脂；二甲苯；乙醇
方法：实验小鼠处死后，剪取约1cm长含有病变部位的结肠固定于4％多聚甲醛，用乙二胺四乙酸EDTA脱钙，石蜡包埋，切片4～5μm(纵切)，常规二甲苯、各级乙醇、蒸馏水脱蜡至水；HE染色。苏木素染核，伊红染胞浆；中性树脂封片，光学显微镜观察病理组织学变化。结肠切片组织学评分标准分为上皮损伤及黏膜炎细胞浸润2个方面：上皮损伤分5级：0级，无损伤；1级，少量杯状细胞丢失；2级，大量杯状细胞丢失；3级，少量隐窝消失及大量杯状细胞丢失；4级大量隐窝消失。炎症浸润分5级：0级，无浸润；1级，浸润到隐窝底部；2级，浸润到黏膜肌层；3级，黏膜肌层大量浸润伴水肿；4级，浸润到黏膜下层。以上2部分得分之和为组织学评分。
7、Western blot测定结肠组织中ASS1、BCKDK、BCKDHA、P-BCKDHA蛋白表达水平、Q-PCR检测结肠组织中ASS1 mRNA、BCKDK mRNA的相对表达情况
材料：Trizol Reagent；异丙醇；氯仿；乙醇；M-MLV逆转录酶；dNTP；DEPC水；随机引物；牛血清白蛋白(BSA)；RIPA强蛋白提取裂解液；PMSF；BCA蛋白定量试剂；蛋白预染marker；PVDF膜；脱脂奶粉；ECL发光液；GAPDH抗体；BCKDK抗体；BCKDHA抗体；P-BCKDHA抗体；
方法：小鼠杀死后取结肠组织，放于-80度冰箱保存。提取RNA及Q-PCR操作步骤如下：
1)提取组织总RNA：
①收集结肠组织于EP管，加入1mL Trizol液，用匀浆仪将组织磨成匀浆状态(注意需在冰上操作，以防温度过高RNA降解)。
②加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。
③4℃，12000rpm离心15min，取上清移入新EP管中。
④加入等体积异丙醇，温和混匀，-20℃放置30min。
⑤4℃，12000rpm离心10min，弃去上清。
⑥加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀。4℃，12000rpm离心2min，弃上清。
⑦室温晾干3min，干燥RNA沉淀。
⑧加入适量DEPC水，充分溶解RNA。
2)逆转录
①向0.2mL EP管中，加入16μL总RNA，10μL随机引物，65℃水浴5min，然后冰浴3min。
②加入5x M-MLVBuffer 10μL，10mM dNTPs 4μL，M-MLV逆转录酶2μL，DEPC水8μL。总体积50μL。
③逆转录条件：30℃，10min；42℃，1h；95℃，10min。此反应液即为cDNA。
表1目的基因扩增引物序列
Figure BDA0002560879500000051
3)荧光定量PCR反应
取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系如下：
Figure BDA0002560879500000052
Figure BDA0002560879500000061
反应条件：95℃，5min；95℃，30s；引物退火温度，30s；72℃，1min。
72℃，10min共30个循环。
实验结果利用2-△△Ct进行计算。
Western blot方法如下：取保存的结肠组织，称量，按0.1g组织加1mLRIPA的比例添加，之后匀浆机冰上匀浆，冰上裂解30min，每间隔5min涡旋一次，保证组织充分裂解。4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，使用天根公司的BCA定量试剂盒来检测总蛋白浓度。加入5x蛋白质Loading Buffer上样缓冲液，沸水浴5min，取出室温放置几分钟，以备上样。
1)BCA蛋白定量：
①配制标准曲线：
表2 BSA标准浓度配制
Figure BDA0002560879500000062
②配制工作液：以体积比50:1将试剂A和试剂B充分混匀。
③测定方法：吸取25μL样液到96孔板，加入200μL/孔的BCA工作液，37℃孵育30min，酶标仪590nm检测吸光度。参照标准曲线，在其线性范围内计算各样本蛋白浓度。
2)Western Blot检测
①取30μg蛋白质样品进行10％SDS-PAGE电泳。
②湿转电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜。
③封闭液室温封闭PVDF膜2h。
④TBST洗膜，加入一抗孵育，4℃过夜。
⑤TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗孵育，室温1h。
⑥TBST洗膜3次，每次10min。ECL发光液和曝光仪显影。
用凝胶图像分析软件Quantity One分析显影结果，用目的蛋白条带的光密度与内参条带光密度比值作为目的蛋白表达定量指标。
8、Western blot测定结肠组织中S6K和P-S6K蛋白表达水平
材料：牛血清白蛋白(BSA)；RIPA蛋白提取裂解液；PMSF；BCA蛋白定量试剂；蛋白预染marker；PVDF膜；脱脂奶粉；ECL发光液；GAPDH抗体；S6K抗体；P-S6K抗体。
方法：取保存的结肠组织，称量，按0.1g组织加1mLRIPA的比例添加，之后匀浆机冰上匀浆，冰上裂解30min，每间隔5min涡旋一次，保证组织充分裂解。4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，使用天根公司的BCA定量试剂盒来检测总蛋白浓度。加入5x蛋白质Loading Buffer上样缓冲液，沸水浴5min，取出室温中放置几分钟，以备上样。
1)BCA蛋白定量：
①配制标准曲线：
表3 BSA标准浓度配制
Figure BDA0002560879500000071
②配制工作液：以体积比50:1将试剂A和试剂B充分混匀。
③测定方法：吸取25μL样液到96孔板，加入200μL/孔的BCA工作液，37℃孵育30min，酶标仪590nm检测吸光度。参照标准曲线，在其线性范围内计算各样本蛋白浓度。
2)Western Blot检测
①取30μg蛋白质样品进行10％SDS-PAGE电泳。
②湿转电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜。
③封闭液室温封闭PVDF膜2h。
④TBST洗膜，加入一抗孵育，4℃过夜。
⑤TBST洗膜3次，每次10min。加入二抗孵育，室温1h。
⑥TBST洗膜3次，每次10min。ECL发光液和曝光仪显影。
⑦用凝胶图像分析软件Quantity One分析显影结果，用目的蛋白条带的光密度与内参条带光密度比值作为目的蛋白表达定量指标。
9、数据处理
实验结果采用(Mean±SEM)表示，采用Student’s t进行两组之间的比较，One-wayANOVA和post hoc检验进行多组之间比较。*P<0.05具有统计学差异，**P<0.01具有统计学显著性差异，***P<0.001具有统计学极显著性差异。
三、实验结果
1、体重测定结果
各组小鼠的体重折线图如图1所示，空白组小鼠在实验周期内的体重无明显变化，与空白组相比，模型组小鼠在实验周期内的体重呈明显下降趋势；与模型组相比，ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组小鼠在实验周期内的体重下降趋势均得到有效控制。
2、疾病活动度指数(DAI)评分结果
各组小鼠的DAI评分结果如图2所示，与空白组相比，模型组小鼠的DAI评分显著升高；与模型组相比，ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组小鼠的DAI评分显著降低。
3、血清炎症因子表达水平测定结果
各组小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平如图3所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平显著升高；与模型组相比，ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平显著降低。
4、结肠长度测定结果
各组小鼠的结肠长度测定结果如图4所示，与空白组相比，模型组小鼠的结肠长度显著降低；与模型组相比，ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组小鼠的结肠长度显著升高。
5、结肠病理学切片及组织学评分结果
各组小鼠的结肠病理学切片及组织学评分结果如图5所示，与空白组相比，模型组小鼠的结肠出现明显病变，炎性浸润增强；与模型组相比，ASS1病毒干扰组和BCKDK病毒干扰组小鼠的结肠病变明显缓解，炎性浸润改善。
6、结肠组织中BCKDK mRNA水平、BCKDK、BCKDHA、P-BCKDHA蛋白表达水平测定结果
各组小鼠结肠组织中BCKDK mRNA水平以及BCKDK、BCKDHA、P-BCKDHA蛋白表达水平测定结果如图6所示，从该结果可以看出：与空白组相比，模型组BCKDK mRNA水平、BCKDK蛋白水平均显著上调，其底物P-BCKDHA/BCKDHA也显著上升，从而抑制了BCKDH酶的活性；与模型组相比，BCKDK病毒干扰组可以显著降低BCKDK mRNA水平以及BCKDK、P-BCKDHA/BCKDHA蛋白表达水平，从而激活BCKDH酶的活性。
7、结肠组织中ASS1 mRNA、蛋白表达水平测定结果
各组小鼠结肠组织中ASS1 mRNA、ASS1蛋白表达水平测定结果如图7所示，与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中ASS1 mRNA水平、ASS1蛋白表达水平显著上调；与模型组相比，ASS1病毒干扰组小鼠结肠组织中ASS1 mRNA水平、ASS1蛋白表达水平显著下调。
8、结肠组织中S6K和P-S6K蛋白表达水平测定结果
各组小鼠结肠组织中S6K和P-S6K蛋白表达水平测定结果如图8所示，从该结果可以看出：与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中蛋白P-S6K/S6K水平显著上调；与模型组相比，BCKDK、ASS1病毒干扰组小鼠结肠组织中蛋白P-S6K/S6K水平显著下调，说明溃疡性结肠炎得到有效缓解。
上述实验结果表明，在溃疡性结肠炎中，ASS1和BCKDK mRNA水平、蛋白表达水平显著升高，通过抑制ASS1或BCKDK基因水平，使蛋白表达降低，可以显著缓解溃疡性结肠炎。本领域技术人员据此可以确定ASS1或BCKDK可以作为药物作用靶点用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，可以作为药物作用靶点用于筛选发现防治溃疡性结肠炎的药物，ASS1或BCKDK的抑制剂可以用于制备防治溃疡性结肠炎的药物，其中：ASS1指ASS1基因或蛋白，BCKDK指BCKDK基因或蛋白；抑制剂的抑制活性为抑制ASS1或BCKDK蛋白的活性，或抑制ASS1或BCKDK基因水平。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (4)

1.ASS1或BCKDK作为药物作用靶点在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述ASS1指ASS1基因或蛋白，所述BCKDK指BCKDK基因或蛋白。
2.ASS1或BCKDK作为药物作用靶点在筛选发现防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，所述ASS1指ASS1基因或蛋白，所述BCKDK指BCKDK基因或蛋白。
3.ASS1或BCKDK的抑制剂在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用，抑制剂的抑制活性为抑制ASS1或BCKDK蛋白的活性，或抑制ASS1或BCKDK基因的表达。
4.根据权利要求3所述的应用，所述抑制剂包括小分子化合物、核酸分子以及包含所述核酸分子的表达载体。
CN202010605346.XA 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 Active CN111635937B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010605346.XA CN111635937B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
CN202111026064.5A CN113694202B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010605346.XA CN111635937B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111026064.5A Division CN113694202B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111635937A true CN111635937A (zh) 2020-09-08
CN111635937B CN111635937B (zh) 2021-10-08

Family

ID=72329161

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010605346.XA Active CN111635937B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
CN202111026064.5A Active CN113694202B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111026064.5A Active CN113694202B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN111635937B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941150A (zh) * 2021-03-25 2021-06-11 安徽医科大学 一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法
US12466803B2 (en) 2021-12-01 2025-11-11 Pfizer Inc. BCKDK inhibitors and/or degraders

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015061467A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN105200158A (zh) * 2015-11-06 2015-12-30 林进 Ass1甲基化检测在骨性关节炎诊断中的应用
CN107356461A (zh) * 2017-05-17 2017-11-17 华中科技大学 Bckdk作为生物标志物在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
OA11759A (en) * 1999-12-08 2005-07-19 Penn State Res Found Branched chain amino acid-dependent aminotransferase inhibitors and their use in the treatment of diabetic retinopathy.
JP2004521637A (ja) * 2001-01-18 2004-07-22 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド キナーゼ及びホスホターゼ
WO2002083709A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-24 Incyte Genomics, Inc. Kinases and phosphatases
US20060229237A1 (en) * 2005-04-07 2006-10-12 Yih-Lin Chung Treatment of gastrointestinal distress
EP1921149A1 (en) * 2006-11-13 2008-05-14 AEterna Zentaris GmbH Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015061467A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
CN105200158A (zh) * 2015-11-06 2015-12-30 林进 Ass1甲基化检测在骨性关节炎诊断中的应用
CN107356461A (zh) * 2017-05-17 2017-11-17 华中科技大学 Bckdk作为生物标志物在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XUEMEI TAO等: "Argininosuccinate synthase 1 suppresses cancer cell invasion by inhibiting STAT3 pathway in hepatocellular carcinoma", 《ACTA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA SINICA》 *
崔慧鹏: "精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)高表达与结直肠癌恶性进展的相关性研究", 《万方数据知识服务平台》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941150A (zh) * 2021-03-25 2021-06-11 安徽医科大学 一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法
US12466803B2 (en) 2021-12-01 2025-11-11 Pfizer Inc. BCKDK inhibitors and/or degraders

Also Published As

Publication number Publication date
CN113694202B (zh) 2023-03-31
CN113694202A (zh) 2021-11-26
CN111635937B (zh) 2021-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Major et al. An update on the genetics of hyperuricaemia and gout
King The role of inflammatory cytokines in diabetes and its complications
Chen et al. 17β-estradiol prevents cardiac diastolic dysfunction by stimulating mitochondrial function: a preclinical study in a mouse model of a human hypertrophic cardiomyopathy mutation
Fei et al. microRNA‐495 reduces visceral sensitivity in mice with diarrhea‐predominant irritable bowel syndrome through suppression of the PI3K/AKT signaling pathway via PKIB
Ji et al. Renoprotective mechanisms of pirfenidone in hypertension-induced renal injury: through anti-fibrotic and anti-oxidative stress pathways
Qin et al. Andrographolide ameliorates sepsis-induced acute lung injury by promoting autophagy in alveolar macrophages via the RAGE/PI3K/AKT/mTOR pathway
Fan et al. Notoginsenoside R1 suppresses inflammatory signaling and rescues renal ischemia-reperfusion injury in experimental rats
CN111635937A (zh) Ass1或bckdk抑制剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
Guo et al. Differential expression of urinary exosomal miRNA in idiopathic membranous nephropathy and evaluation of its diagnostic value
US8309299B2 (en) Combination therapy and method for assessing resistance to treatment
Arner et al. Mapping of biguanide transporters in human fat cells and their impact on lipolysis
Deng et al. Astragalus polysaccharides ameliorates experimental colitis by regulating memory B cells metabolism
Wang et al. Characterization of macrophages in ischemia–reperfusion injury-induced acute kidney injury based on single-cell RNA-Seq and bulk RNA-Seq analysis
Han et al. Nrf2 inhibits M1 macrophage polarization to ameliorate renal ischemia–reperfusion injury through antagonizing NF-κB signaling
Shao et al. MiR‐155‐Mediated Deregulation of GPER1 Plays an Important Role in the Gender Differences Related to Inflammatory Bowel Disease
Liu et al. Chronic kidney disease with comorbid cardiac dysfunction exacerbates cardiac and renal damage
CN105969897A (zh) 一种基于lncRNA-H19的慢性肾脏病肾功能诊断试剂盒及lncRNA-H19的应用
Liu et al. IL-17A's role in exacerbating radiation-induced lung injury: Autophagy impairment via the PP2A-mTOR pathway
Huang et al. Folate alleviated skin inflammation and fibrosis resulting from impaired homocysteine metabolism
Xu et al. Protective role of tenuigenin on sepsis‑induced acute kidney injury in mice
Wang et al. BCAA catabolism targeted therapy for heart failure with preserved ejection fraction
Zhuang et al. High expression of P4HA3 in obesity: a potential therapeutic target for type 2 diabetes
Tang et al. Molecular mechanism of circHIPK3 in mitochondrial function in septic acute kidney injury
Ma et al. Jatrorrhizine retard obesity by modulating transcription factor c-Jun/c-Fos to downregulate Mmp12-mediated inflammation
CN114288388B (zh) 网膜素在制备炎症性肠病治疗药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant