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CN111635898B - 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用 - Google Patents

谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用 Download PDF

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CN111635898B
CN111635898B CN202010554231.2A CN202010554231A CN111635898B CN 111635898 B CN111635898 B CN 111635898B CN 202010554231 A CN202010554231 A CN 202010554231A CN 111635898 B CN111635898 B CN 111635898B
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Abstract

本发明公开了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用。将来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点突变，所获得突变体的催化性能相较于野生型具有明显提升。基于所述突变体构建重组工程菌株，通过全细胞催化法以大宗发酵产品L‑谷氨酸为底物制备γ‑氨基丁酸，γ‑氨基丁酸产量最高达到625.6g/L，催化体系中摩尔转化率接近100％，无副产物生产。本发明所公开的谷氨酸脱羧酶突变体在γ‑氨基丁酸的高效生产制备中具有十分广阔的应用前景。

Description

谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用，在食品、医药保健、饮料加工等领域具有广泛的应用前景和市场需求。据粗略统计，目前全球各类γ-氨基丁酸总产能约6万吨/年，我国添加γ-氨基丁酸的相关产品总市值约25亿～30亿元，市场仍处于缓慢增长期。γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成、微生物发酵和生物转化法等，但是化学合成法成本高、得率低，在生产工艺中使用危险溶剂，且不能被用于食品、药品和饲料加工等领域。微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，使其工业化应用受到限制，而生物转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低等优势，越来越受到青睐。
谷氨酸脱羧酶能不可逆地催化L-谷氨酸(盐)转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ- 氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的应用前景。目前，国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，在环境pH＞6.0时逐步丧失其催化活性，这一特性严重影响了其在全细胞催化工艺上的应用。例如，例如专利CN103484489B记载了来源于大肠杆菌谷氨酸脱羧酶在pH＞6.0时催化活性较低，即便通过分子改造后稍扩展了其pH催化活性范围，但获得的最优突变体在pH 7.0条件下酶活力仍然远小于5U/mg，专利CN103484444B记载了来源于短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶通过分子改造后，在pH 6.0条件下的催化活力仍不到2U/mg。专利CN105255849B记载了一种分子改造后获得的谷氨酸脱羧酶突变体，该酶在pH 4.8条件下酶活力可达到60.6U/mg，但是在近中性环境下的酶活力情况未知。
基于已鉴定的谷氨酸脱羧酶所建立的γ-氨基丁酸生物转化工艺中，γ-氨基丁酸产量多在 250-300g/L间，且需要不同离子缓冲液来控制转化体系pH值。例如根据专利CN105255849B 记载，利用一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，在大肠杆菌中表达该酶，并全细胞转化谷氨酸18h得到283.8g/L的γ-氨基丁酸，在谷氨酸棒菌中表达该酶，并全细胞转化谷氨酸18h 得到126.7g/L的γ-氨基丁酸。专利CN102367432B中记载，利用一种高产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌，通过分批补料进行转化实验，GABA累积浓度可达204.5g/L，摩尔转化率为97.92％。专利CN104830745B中记载，利用分泌表达谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌重组菌，控制转化液的 pH值为4.6～5.0并以谷氨酸钠为底物，γ-氨基丁酸产量可达203.7g/L。
因此，获得具有优良催化性能的谷氨酸脱羧酶将是解决生物转化法高效制备γ-氨基丁酸瓶颈问题的关键环节。通过筛选或改造等获得具有更高催化效率的谷氨酸脱羧酶，并在此基础上构建γ-氨基丁酸高效生产菌株，将为工业高效生产γ-氨基丁酸提供有利条件。
发明内容
本发明的目的在于提供谷氨酸脱羧酶突变体和重组菌株，并使用该菌株建立高效生产γ- 氨基丁酸的全细胞转化方法。
本发明首先提供了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，是将对应于来源自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium CICC 10055)的谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1第94位氨基酸由酪氨酸Y突变为组氨酸H的氨基酸序列，或第249位氨基酸由丝氨酸S突变为苯丙氨酸F的氨基酸序列，或者所述两个位点突变的组合。在一个实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶突变体包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；在另一个实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶突变体包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQID NO:6所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述谷氨酸脱羧酶突变体包括如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。本发明所述谷氨酸脱羧酶突变体编码核苷酸序列可以来源于SEQ IDNO:2所示的野生型谷氨酸脱羧酶的编码核苷酸序列，例如所述突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经突变或特定位点的核苷酸被取代而得到。
本发明还提供表达上述谷氨酸脱羧酶突变体的重组菌株，是将所述突变体的编码核苷酸序列或含有所述编码核苷酸序列的载体导入宿主菌株所得到，所述重组菌株可用于生产γ-氨基丁酸。根据本发明，用于所述突变体表达的载体种类没有特殊限定，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体；用于所述突变体表达的宿主菌株也没有特殊限定，可以为本领域技术人员已知的各种模式菌株。在一个优选的实验方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达质粒系列或谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒系列，例如pET21和pXMJ19表达质粒；所述宿主菌株可以选自棒杆菌属或埃希氏菌属，例如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。
本发明最后还提供一种全细胞催化高效制备γ-氨基丁酸的简便方法。在一个实施方案中，首先采用高密度液体深层发酵培养和诱导重组菌株，制备全细胞催化菌泥，进行催化反应。利用7L发酵罐通过生物转化方法制备γ-氨基丁酸，在纯水相体系中加入L-谷氨酸底物和全细胞催化菌泥，无需再加入无机盐和外源酶催化剂。在一个具体实施方案中，所述催化反应体系中L-谷氨酸或谷氨酸盐底物浓度为700～900g/L；所述全细胞催化菌泥的使用浓度为10～20 g/L，例如为10g/L、12g/L、15g/L、18g/L和20g/L；所述催化反应温度为25～37℃，优选35℃；控制转速为200r/min；催化反应时间为6～12h。
本发明中术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1第94位氨基酸由酪氨酸Y突变为组氨酸H的氨基酸序列”而言，如果在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第94位就可能是突变体的氨基酸序列中第100位。本领域普通技术人员可以采用本领域已知的任何测定序列同源性或相同性的方法测定或比较序列的同源性或相同性，包括但不限于计算机分子生物学等文献中所记载的方法。
本发明获得一种催化性能优良的新型谷氨酸脱羧酶突变体，并成功构建了高效表达该酶的重组菌种，优化了高效制备γ-氨基丁酸的工艺，具有较好的技术应用前景。本发明制备γ- 氨基丁酸的工艺条件易于控制、生产周期短、原料综合利用率高且无副产物，能有效降低企业生产成本，可以为相关γ-氨基丁酸生产企业提供完善的科技服务和技术支持。另外，本发明优选公认的食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌作为生产菌株，该菌株作为传统的主要工业发酵微生物，用于生产味精已有数十年的历史，因此使用该菌生产γ-氨基丁酸可以有效避免食品安全隐患。
附图说明
图1是基于全细胞催化生产γ-氨基丁酸示意图。
图2是全细胞催化液中γ-氨基丁酸含量分析检测图。
具体实施方式
下面的实施进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。以下实施例中，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌均可市售获得，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆，大肠杆菌BL21和谷氨酸棒杆菌ATCC13032用于本发明中基因蛋白表达及全细胞转化生产γ- 氨基丁酸。大肠杆菌感受态细胞与谷氨酸棒杆菌感受态细胞按照实验室常规技术方法制备。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1谷氨酸脱羧酶突变体的构建
通过分析野生型谷氨酸脱羧酶序列与其他菌株来源的同源序列比对结构，结合同源建模和活性位点预测，确定SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第94位酪氨酸Y和第249位丝氨酸S 为突变靶点。采用定点突变策略，根据待突变的氨基酸位点来设计点突变引物，通过PCR方法获得谷氨酸脱羧酶突变序列。
委托苏州金唯智生物科技有限公司进行巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶基因合成，并基于 NdeI/HindIII双酶切位点将其亚克隆至pET21表达质粒，重组质粒命名为pET21-GAD。采用天根快速定点突变试剂盒进行特定位点的突变，具体实验步骤按照说明书进行操作，以pET21-GAD质粒为模板，利用PCR扩增获得相应点突变质粒后，使用DpnI限制性内切酶消化模板质粒，随后转化大肠杆菌感受态并涂布含有氨苄霉素的筛选平板，从而获得含有特定序列的重组突变质粒，将所获质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序确认，突变质粒分别命名为pET21-GAD-Y94H和pET21-GAD-S249F。以构建成功的pET21-GAD-Y94H质粒为模板，采用上述相同的定点突变策略，可获得pET21-GAD-Y94H/S249F双突变体质粒。
上述实施案例中用于第94位酪氨酸Y点突变的引物：Y94-F(5’-GATAAAGATGAGCATCCGCAGACA-3’)和Y94-R(5’-GCGGATGCTCATCTTTATCGATCA-3’)；用于第249位丝氨酸S 点突变的引物：S249-F(5’-TGCTGCTTTCGGAGGTTTTATCGC-3’)和S249-R(5’-ACCTCCGA AAGCAGCATCTACATG-3’).
将巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶基因序列，通过常规克隆方法连接至已经过HindIII和EcoRI 双酶切处理的pXMJ19表达质粒，重组质粒命名为pXMJ19-GAD。使用上述实施例中的引物对 Y94-F/Y94-R进行第94位酪氨酸Y点突变，使用上述实施例中的引物对S249-F/S249-R进行第 249位丝氨酸S点突变，最终获得含有特定序列的重组突变质粒，将所获质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序确认，分别命名为pXMJ19-GAD-Y94H和pXMJ19-GAD-S249F。以构建成功的pXMJ19-GAD-Y94H质粒为模板，采用上述相同的定点突变策略，可获得 pXMJ19-GAD-Y94H/S249F双突变体质粒。
本实施例选取的表达载体pET21b为大肠杆菌诱导表达型载体，该质粒本身含有强启动子T7相关序列和lacO操纵序列，当加入IPTG或乳糖等诱导物时，会促使阻遏蛋白离开操纵序列从而起始基因表达。本实施例选取的表达载体pXMJ19为大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌诱导表达型载体，该质粒本身含有强启动子tac相关序列(包括操纵序列lacO)，当加入IPTG或乳糖等诱导物时，会促使阻遏蛋白离开操纵序列从而起始基因表达。
实施例2谷氨酸脱羧酶突变体的酶活性测定
将上述获得的分别含有pET21-GAD、pET21-GAD-Y94H和pET21-GAD-S249F质粒的重组大肠杆菌进行蛋白诱导表达，具体方法为：分别挑取单克隆接种于含有100mL LB液体培养基 (5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L NaCl)，进行过夜培养。随后，按照起始OD600≈ 0.1将种子液转接于100mL LB液体培养基中，待培养至菌体浓度OD600至0.6左右时，添加终浓度为0.4mM IPTG诱导目的蛋白表达，调整培养温度至28℃，继续诱导培养12h。待诱导完成后，对菌液进行高压匀浆破碎处理后，采用实验室标准的镍柱纯化方法获得谷氨酸脱羧酶纯蛋白。蛋白浓度测定采用Bradford法，即使用考马斯亮蓝G-250检测液与蛋白发生显色反应，以牛血清白蛋白做标准品。
谷氨酸脱羧酶活性测定采用以下方案：取0.4mL样品溶液，依次加入0.1mL 1mol/L碳酸钠溶液，0.5mL 0.2mol/L硼酸盐缓冲液(pH 10)，上下摇动混匀后，加入1mL 6％苯酚溶液，加入1mL次氯酸钠溶液，摇匀后室温放置6min，沸水浴中加热10min，立即置于冰浴中10min，然后加入2mL 60％乙醇，混匀后室温放置10min，测定640nm处吸光度值。标准品溶液经过比色法，测定OD640吸光度值，以吸光度为纵坐标，GABA浓度为横坐标，绘制样品标准曲线。酶活定义：每分钟生成1μmol GABA定义为一个酶活单位U，每毫克蛋白对应的酶活为比酶活U/mg。
通过酶活性测分析，相较于野生型谷氨酸脱羧酶，谷氨酸脱羧酶突变体Y94H和S249F在不同温度和pH条件下都表现出明显提高的酶活性，其中两种谷氨酸脱羧酶突变体在偏中碱性 pH 6.5环境下表现出更优良的催化性能，提示其更适合工业化生产，尤其是Y94H/S249F双突变体酶在35℃、pH 6.5条件下活性比野生型菌株提高了约2.3倍。
表1野生型和突变体在不同条件下酶学性质分析
Figure BDA0002543652800000051
实施例3含谷氨酸脱羧酶突变体的重组菌株构建
本发明所提及的宿主菌株是可以表达所述谷氨酸脱羧酶突变体的菌株，所述宿主菌株可以选自棒杆菌属、埃希氏菌属或者芽孢杆菌属，例如为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。本实施例中提供的其中一个优选宿主分别是大肠杆菌BL21和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
采用实验室常规标准方法分别制备大肠杆菌BL21感受态和谷氨酸棒杆菌ATCC13032 感受态。分别将pET21-GAD、pET21-Y94H、pET21-S249F、pET21-Y94H/S249F质粒转化大肠杆菌BL21感受态，获得含有表达谷氨酸脱羧酶突变体的大肠杆菌重组菌BL21-GAD、BL21-Y94H、BL21-S249F和BL21-Y94H/S249F；分别将pXMJ19-GAD、pXMJ19-GAD-Y94H、pXMJ19-GAD-S249F和pXMJ19-GAD-Y94H/S249F质粒转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态，获得含有表达谷氨酸脱羧酶突变体的谷氨酸棒杆重组菌Cg-GAD、Cg-Y94H、Cg-S249F 和Cg-Y94H/S249F。
实施例4重组表达菌株的培养和高密度发酵
本实施例用于提供一种重组菌株的高密度发酵培养和菌泥制备方法，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：将实施例3中获得的重组表达菌株接种于已含有相应抗生素的种子培养基中，在32℃，200r/min摇床中震荡培养16h，获得种子培养菌。按照2％接种量将种子液接种于已装有5L发酵培养基(100g/L葡萄糖，20g/L玉米粉，5g/L硫酸铵，1g/L磷酸氢二钾，1g/L硫酸镁，1g/L 氯化钠，柠檬酸钠1g/L，0.5g/L胰蛋白胨，调整pH 7.0)发酵罐中，设定培养温度32℃，搅拌转速400r/min，控制培养pH值为7.0，当溶氧降至30％以下时，设置转速与溶氧偶联。监测菌体浓度OD600，待菌体生长至OD600为20时，添加终浓度为0.2mMIPTG诱导目的蛋白表达，诱导时间16～20h。待发酵培养完成后，离心去上清收集菌体细胞，使用无菌ddH2O水洗涤菌体沉淀3次，随后将菌体细胞重悬，即得细胞催化菌泥，放置于4℃冰箱备用。
本领域技术人员应该理解的是，种子培养基和发酵培养基中加入的抗生素作为筛选标记用于重组表达菌株的发酵培养，所述抗生素的浓度没有特别的限制，工作浓度为15μg/L。在本实施例中对培养基pH的调节，所使用的酸碱溶液及浓度没有特别的限制，本实施例采用酸溶液为50％醋酸，碱溶液为50％氨水。
实施例5全细胞催化制备γ-氨基丁酸
本实施例用于提供一种谷氨酸脱羧酶突变体在γ-氨基丁酸制备中的应用。基于上述实施例2中所述谷氨酸脱羧酶突变体，或上述实施例3中所述重组表达菌株，或上述实施例4中所述细胞催化用菌泥，建立γ-氨基丁酸的生物法制备工艺。作为一个优选的实施方案，本发明采用全细胞催化方法制备γ-氨基丁酸，无需再加入外源性的酶催化剂，在一个具体实施方案中，利用发酵罐建立5L全细胞催化体系，在纯水相反应体系中，分别添加700g/L、800g/L 或900g/L终浓度的L-谷氨酸(盐)底物，加入20g/L全细胞菌泥，50μM磷酸吡哆醛PLP，控制发酵罐转速200r/min，催化反应温度35℃，催化反应时间6～12h。待反应结束后，利用液相色谱法(HPLC)对催化反应液组分进行定量分析。
表2基于重组菌的全细胞催化生产γ-氨基丁酸产量分析
Figure BDA0002543652800000061
γ-氨基丁酸制备结果如表2所示，基于谷氨酸脱羧酶突变体构建的重组表达菌株表现出更优异的γ-氨基丁酸生产能力。其中Cg-Y94H/S249F重组表达菌株在900g/L底物浓度条件下，全细胞催化反应12h后，转化液中γ-氨基丁酸的含量可达625.6g/L，底物摩尔转化率仍可达99.2％，与含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌相比，在全细胞催化时间、产物产量及摩尔转化率等方面都具有更好优势，可大大节约生产成本和简化工艺流程，具有更好的工业化应用前景。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 谷氨酸脱羧酶突变体及其在制备γ-氨基丁酸中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> Bacillus megaterium
<400> 1
Met Pro Gln Trp His Pro His Arg Glu Gln Lys Asn Leu Pro Asp Glu
1 5 10 15
Phe Pro Val Asn Pro Leu Phe Ser Arg Gln Gly Glu Val Thr Ile Pro
20 25 30
Arg Leu Arg Ile Gly Asp Gln Gly Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln
35 40 45
Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Leu Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu
50 55 60
Ala Thr Phe Val Thr Thr Trp Met Glu Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Gly Glu Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp Lys Asp Glu Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Ala Ala Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg Ile Leu Ala Asp Leu Trp
100 105 110
Asn Ser Pro Asn Pro Asp Thr Thr Met Gly Val Ser Thr Thr Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln
130 135 140
Lys Leu Arg Lys Ser Lys Gly Leu Ser Thr Asp Arg Pro Asn Ile Val
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ser Val Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Asn Tyr Trp
165 170 175
Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu
180 185 190
Asp Ala Glu Gly Val Ile Asn Ala Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val
195 200 205
Val Pro Ile Leu Gly Val Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Glu Pro Ile Ala
210 215 220
Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
245 250 255
Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser
260 265 270
Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Glu Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asp Leu Ile Phe
290 295 300
Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe
305 310 315 320
Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg
325 330 335
Leu Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Ala Val Gln Lys Thr Ser Gln Glu Asn
340 345 350
Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Met Asp Ala Phe Glu Ile
355 360 365
Leu Ala Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Leu Ala Trp Lys Leu Lys Glu
370 375 380
Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Leu Arg
385 390 395 400
Thr Tyr Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Ala Asp Met Glu
405 410 415
Glu Ile Thr Ile Met Arg Ile Val Val Arg Asn Gly Phe Ser Arg Asp
420 425 430
Leu Ala His Leu Phe Met Val Asn Phe Lys Gln Ala Val Glu Phe Leu
435 440 445
Asn Ser Leu Asp Arg Pro Val Leu Lys Asp Thr Lys Tyr Asp Asn Gly
450 455 460
Phe His His
465
<210> 2
<211> 1404
<212> DNA
<213> Bacillus megaterium
<400> 2
atgcctcaat ggcatccgca tcgtgaacaa aaaaatttac ctgatgaatt tcctgttaat 60
ccgctttttt ctcgacaagg agaagtgaca attccaagac tgcgtatcgg tgatcaaggt 120
atgcttccgg aaacggctta tcaaatcatt catgacgaaa ttgctttaga cggaaatgcc 180
cgcttgaatt tagctacgtt tgttactacg tggatggagc ctgatgcaaa gcgtttgtac 240
ggagaatctt ttgataaaaa tatgatcgat aaagatgagt atccgcagac agcggctatt 300
gaagagagat gtgtacgtat tttagcggat ttgtggaatt cacctaatcc tgataccacg 360
atgggcgttt ctactacagg ttcatctgaa gcatgtatgc ttggtggact agcgttaaaa 420
agacgatggc agaaactgcg taaaagtaaa gggctatcaa cggaccgccc caatattgta 480
tttagttcat cggttcaagt ggtatgggag aagttcgcaa actattggga cgtagagcct 540
cgttatgtga atattaatcc agatcatcct tatttagatg cagaaggcgt gattaatgcg 600
gttgacgaaa atacaattgg cgtcgtaccg attcttggag tcacgtatac agggggttac 660
gaaccaatag ctgctatcgc aaaagcatta gatgagttac aggaaaaaac agggttggat 720
attcctatcc atgtagatgc tgcttctgga ggttttatcg ctccatttct tcaaccagac 780
cttatctggg atttccgctt gccgcgagta aagtccatta acgtgtcagg acacaagtat 840
ggtttagttt accctggctt gggatgggtg atttggagag aaaaagagga cttgcctgaa 900
gatcttattt tccgcgtttc ttatttaggg ggcaacatgc caacttttgc gctcaacttc 960
tctagaccag gagcacaagt ccttttgcag tactacaatt tcttgcgttt aggtaaagac 1020
ggctattatg ccgtgcaaaa aacctcccaa gaaaacgcgc tgtttcttag caaagaaatt 1080
ggagaaatgg acgcattcga aattcttgct gatggttcag atatcccggt tcttgcttgg 1140
aaactgaaag aagactatac accaaactgg actctttatg atttgtctag acaactgcgt 1200
acgtacggat ggcaagttcc tgcttaccca ctcccagcag acatggaaga aatcacaatc 1260
atgcgcattg ttgttagaaa tgggttttca agagaccttg ctcatttatt tatggttaat 1320
ttcaaacaag ccgttgaatt tcttaactcg ttggatagac ctgttcttaa agacacgaaa 1380
tacgacaatg gatttcatca ttaa 1404
<210> 3
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Pro Gln Trp His Pro His Arg Glu Gln Lys Asn Leu Pro Asp Glu
1 5 10 15
Phe Pro Val Asn Pro Leu Phe Ser Arg Gln Gly Glu Val Thr Ile Pro
20 25 30
Arg Leu Arg Ile Gly Asp Gln Gly Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln
35 40 45
Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Leu Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu
50 55 60
Ala Thr Phe Val Thr Thr Trp Met Glu Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Gly Glu Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp Lys Asp Glu His Pro Gln
85 90 95
Thr Ala Ala Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg Ile Leu Ala Asp Leu Trp
100 105 110
Asn Ser Pro Asn Pro Asp Thr Thr Met Gly Val Ser Thr Thr Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln
130 135 140
Lys Leu Arg Lys Ser Lys Gly Leu Ser Thr Asp Arg Pro Asn Ile Val
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ser Val Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Asn Tyr Trp
165 170 175
Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu
180 185 190
Asp Ala Glu Gly Val Ile Asn Ala Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val
195 200 205
Val Pro Ile Leu Gly Val Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Glu Pro Ile Ala
210 215 220
Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
245 250 255
Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser
260 265 270
Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Glu Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asp Leu Ile Phe
290 295 300
Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe
305 310 315 320
Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg
325 330 335
Leu Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Ala Val Gln Lys Thr Ser Gln Glu Asn
340 345 350
Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Met Asp Ala Phe Glu Ile
355 360 365
Leu Ala Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Leu Ala Trp Lys Leu Lys Glu
370 375 380
Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Leu Arg
385 390 395 400
Thr Tyr Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Ala Asp Met Glu
405 410 415
Glu Ile Thr Ile Met Arg Ile Val Val Arg Asn Gly Phe Ser Arg Asp
420 425 430
Leu Ala His Leu Phe Met Val Asn Phe Lys Gln Ala Val Glu Phe Leu
435 440 445
Asn Ser Leu Asp Arg Pro Val Leu Lys Asp Thr Lys Tyr Asp Asn Gly
450 455 460
Phe His His
465
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<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列()
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115 120 125
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130 135 140
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Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Phe Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
245 250 255
Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser
260 265 270
Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Glu Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asp Leu Ile Phe
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<211> 1404
<212> DNA
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gaagagagat gtgtacgtat tttagcggat ttgtggaatt cacctaatcc tgataccacg 360
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agacgatggc agaaactgcg taaaagtaaa gggctatcaa cggaccgccc caatattgta 480
tttagttcat cggttcaagt ggtatgggag aagttcgcaa actattggga cgtagagcct 540
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gttgacgaaa atacaattgg cgtcgtaccg attcttggag tcacgtatac agggggttac 660
gaaccaatag ctgctatcgc aaaagcatta gatgagttac aggaaaaaac agggttggat 720
attcctatcc atgtagatgc tgctttcgga ggttttatcg ctccatttct tcaaccagac 780
cttatctggg atttccgctt gccgcgagta aagtccatta acgtgtcagg acacaagtat 840
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Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Phe Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
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Claims (8)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列选自如下的组：
a)对应于SEQ ID NO:1第94位氨基酸由酪氨酸Y突变为组氨酸H的氨基酸序列，或者b)对应于SEQ ID NO:1第249位氨基酸由丝氨酸S突变为苯丙氨酸F的氨基酸序列，或者c)对应于SEQ ID NO:1第94位氨基酸由酪氨酸Y突变为组氨酸H，并且在对应于SEQ ID NO:1的第249位氨基酸由丝氨酸S突变为苯丙氨酸F的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述a)组氨基酸序列的编码基因可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述b)组氨基酸序列的编码基因可以是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体的编码基因，其特征在于，所述c)组氨基酸序列的编码基因可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
5.一种重组菌株，是将含有权利要求1所述突变体的编码基因，或权利要求2-4任一项所述编码基因的载体导入宿主菌株所得到。
6.权利要求1所述的谷氨酸氧化酶突变体、权利要求2-4任一项所述的编码基因或者权利要求5所述的重组菌株在γ-氨基丁酸生产中的应用。
7.一种制备γ-氨基丁酸的方法，包括培养权利要求5所述的重组菌株。
8.根据权利要求7所述的制备γ-氨基丁酸的方法，所述方法包括以L-谷氨酸或L-谷氨酸盐为底物，在纯水相体系中通过全细胞催化工艺高效制备γ-氨基丁酸。
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