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CN111615399A - 一种使流感病毒适应Vero细胞的方法 - Google Patents

一种使流感病毒适应Vero细胞的方法 Download PDF

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CN111615399A
CN111615399A CN201880086578.XA CN201880086578A CN111615399A CN 111615399 A CN111615399 A CN 111615399A CN 201880086578 A CN201880086578 A CN 201880086578A CN 111615399 A CN111615399 A CN 111615399A
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virus
influenza
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Y·严
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Yisheng Biotechnology Hong Kong Holding Co Ltd
Original Assignee
Yisheng Biopharma Singapore Pte Ltd
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Abstract

本公开提供一种使流感病毒适应Vero细胞的方法。所述方法包括用流感病毒感染Vero细胞，培养感染的Vero细胞，收获各代的流感病毒，其中一代流感病毒的感染剂量大于或等于上一代流感病毒的感染剂量。本公开还涉及一种组合物。所述组合物包含聚肌苷酸‑聚胞苷酸、至少一种抗生素或聚酰胺化合物、至少一种正离子、流感病毒和/或流感病毒抗原，其中所述流感病毒和/或流感病毒抗原通过Vero细胞适应的流感病毒产生。

Description

一种使流感病毒适应Vero细胞的方法
技术领域
本申请涉及医疗领域，更特别地，涉及一种使流感病毒适应Vero细胞的方法。所述方法用于产生对Vero细胞适应的流感病毒。本申请还涉及一种组合物，所述组合物包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyriboinosinic acid-polyribocytidylic acid,PIC)、至少一种抗生素或聚酰胺化合物、至少一种正离子、流感病毒和/或流感病毒抗原，其中所述流感病毒和/或流感病毒抗原通过Vero细胞适应的流感病毒产生。
背景技术
流感病毒感染是一种重大全球性呼吸道感染，导致大量的生命丧失。流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒。甲型流感病毒是引起重症呼吸道疾病和大流行死亡的主要毒性病原体。流感病毒感染的流行病学特征是快速爆发、迅速蔓延、宽宿主范围，以及任何年龄组的人群均易感。因此，需要提高流感疫苗的生产。
世界卫生组织(WHO)或疾病控制和预防中心(CDC)每年会提供鸡胚来源(ECE-来源)的流感病毒种子用于流感疫苗的生产。因此目前大多数流感疫苗是使用鸡胚生产的。这种传统的制备疫苗的方法费时且成本高。而且，鸡胚中的病原体易于造成交叉感染。
流感病毒的主要抗原血凝素(HA)，显现出高频的病毒变异性和重配。季节性流行的流感病毒在各季节可能彼此有所不同，需要流感病毒种子的定期替换。
由于WHO可以每年替换流感病毒种子，因此每年用于疫苗生产的流感病毒也可不同。在短时间内用鸡胚生产足够量的季节性疫苗是困难的。因此，解决疫苗的供应与需求的矛盾，开发抗原量需求低、施用途径简单、快速诱发强烈免疫应答的疫苗是极为紧迫的公共卫生课题。
Vero细胞系是WHO推荐用于人疫苗生产的唯一细胞系。Vero细胞用于人疫苗的生产已有数十年，已经成功的用于开发脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗。但ECE-来源的流感病毒在Vero细胞上不能生长至高的滴度。现有技术也没有提供可以使得ECE-来源的流感病毒快速适应Vero细胞的方法，更特别地，现有技术没有提供使ECE-来源的流感病毒传代5-10代即适应Vero细胞的方法。因此急需开发一种使流感病毒快速适应Vero细胞的方法。
美国专利申请US 20080187546 A1提供一种选择在组织培养细胞上生长的流感病毒以产生组织培养物适应的病毒分离株的方法。该方法包括首先将流感病毒连续稀释为多个流感病毒亚群，用所述流感病毒亚群感染组织培养细胞，选择产生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的具有低感染复数(multiplicity of infection,MOI)的亚群，从被具有低MOI的亚群感染的细胞收获流感病毒，用收获的流感病毒感染组织培养细胞，和重复步骤。该方法公开了在每次传代前对流感病毒进行连续稀释，以获取低MOI(小于0.01)，并通过观察CPE来确定下一代感染的剂量。这表示当确定下一代的感染剂量时，具有非常大的可变性。该方法也没有探索其中下一代的感染剂量大于或等于这一代的感染剂量的方法。同时，该方法使用流感病毒接触单层细胞，这仅产生少量流感病毒量(不足以用于大规模生产)。另外，该申请并未公开为获得对组织培养细胞适应的病毒的传代次数，或者没有公开该方法可以在5-10代内获得对组织培养细胞适应的病毒。美国专利申请US20080187546 A1的全部内容并入本文作为参考。
发明内容
根据本公开的一方面，提供一种使流感病毒适应Vero细胞的方法，所述方法包括：
-用第一感染剂量的流感病毒感染Vero细胞；
-在摇瓶中培养感染的Vero细胞，以产生病毒活性；
-收获第一流感病毒；
-用第二感染剂量的所述第一流感病毒感染Vero细胞，以产生病毒活性，收获第二流感病毒，其中所述第二感染剂量大于或等于第一感染剂量；和
-重复以上步骤，收获对Vero细胞适应的流感病毒。
根据本公开的另一方面，提供一种使流感病毒适应Vero细胞的方法，所述方法包括：
-用第一感染剂量的流感病毒感染Vero细胞；
-在摇瓶中培养感染的Vero细胞，以产生病毒活性；
-收获第一流感病毒；
-用第二感染剂量的所述第一流感病毒感染Vero细胞，以产生病毒活性，收获第二流感病毒；和
-重复以上步骤，收获对Vero细胞适应的流感病毒，其中所述第一感染剂量和第二感染剂量中的至少一个以0.00001-2.0之间的MOI表示。
在一些实施方案中，所述MOI可以是0.00001、0.00005、0.00010、0.00050、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、或2.0。在一些特别的实施方案中，所述MOI可以是0.00001、0.00004、0.00013、0.0002、0.0011、0.0013、0.002、0.0022、0.0026、0.0072、0.008、0.018、0.019、0.030、0.033、0.05、0.16、0.22、0.25、0.47、0.5、0.63、1.0、1.58、1.6、或2.0。
在一些实施方案中，所述第一感染剂量可以是第二感染剂量的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。
本公开进一步提供一种生产流感病毒的方法。所述生产流感病毒的方法可包括大规模生产流感病毒感染的细胞的方法。在一些实施方案中，所述生产流感病毒的方法可包括通过一次性使用生物反应器大规模生产流感病毒感染的细胞。
本公开进一步提供了一种疫苗，其中所述疫苗由对Vero细胞适应的流感病毒生产。在一些实施方案中，所述疫苗可以包括灭活的病毒、减毒的病毒、和/或流感病毒抗原(例如，血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等)。
本公开进一步提供了一种组合物，其中所述组合物可以包含PIKA(包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素或聚酰胺化合物、至少一种正离子的组合物)、流感病毒和/或流感病毒抗原，以及其它用于实施该组合物的成分。所述流感病毒抗原包含但不限于血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、或其衍生物等。所述聚酰胺化合物可以包括：亚精胺盐、亚精胺、N-(3-氨基丙基)、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺、精胺BR、精胺、OS-二甲基硫代磷酰胺酯、多聚赖氨酸、氨基糖苷或其任意组合。所述正离子可以包括钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、锌或其任意组合。所述组合物可以用于生产鼻内喷雾疫苗或任何其它形式的疫苗。
相对于现有技术，本公开的方法、疫苗和组合物提供诸多技术改善。例如，本公开建立了使ECE-来源的流感病毒适应Vero细胞的方法。更特别地，本公开建立了在5-10传代中使ECE-来源的流感病毒适应Vero细胞的方法。再例如，本公开提供在摇瓶中培养感染的Vero细胞的方法，其有益于大规模生产流感病毒。再例如，本公开的组合物可以降低抗原使用量，减少成本。在一些实施方案中，本公开的组合物可以通过鼻内喷雾施用给受试者，这可以诱导系统免疫应答和粘膜免疫应答，解决肌内注射的疫苗不能产生足够粘膜免疫应答的问题。
附图说明
本公开将进一步通过示例性实施方案的形式阐述。一些示例性实施方案将参考附图进行详细说明。这些实施方案是非限制性示例性实施方案，其中参考数字在附图的多个视图中表示相似的结构，其中：
图1阐述根据本公开的一些实施方案的流感病毒A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09各传代的TCID50测定结果(50％组织培养感染剂量)；
图2阐述根据本公开一些实施方案的流感病毒B/布里斯班/60/2008各传代的TCID50测定结果；
图3阐述根据本公开的一些实施方案的用A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09的E1V5病毒感染的Vero细胞的CPE；
图4阐述根据本公开一些实施方案的用B/布里斯班/60/2008的E1V5病毒感染的Vero细胞的CPE。
具体实施方式
在以下的详细描述中，许多具体细节是通过举例的形式进行描述，以便于提供对相关公开的全面理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，可以无需这些细节就可以实现本公开。对本领域技术人员显而易见的是，对于已公开的实施方案可以有许多修改，在不背离本公开的精神和范围的情况下，本公开定义的一般性原理可以应用于其它实施方案和应用。
应当理解，除非另有定义，本文使用的所有技术性和科学性术语与本领域技术人员通常理解的一致。
应当理解，除非上下文明确指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”包含了复数指代。如本文所用，术语“和/或”包含了一个或多个相关列举事物的任何和所有组合。进一步地，应理解术语“包含”和/或“包括”，当在本公开中使用时，阐明元件、步骤、操作、和/或成分的存在，但是并不排除一个或多个其他元件、步骤、操作、和/或成分的存在或者添加。
本公开提供一种使流感病毒适应Vero细胞的方法，所述方法包括：
-用第一感染剂量的流感病毒感染Vero细胞；
-在摇瓶中培养感染的Vero细胞，以产生病毒活性；
-收获第一流感病毒；
-用第二感染剂量的所述第一流感病毒感染Vero细胞，以产生病毒活性，收获第二流感病毒，其中所述第二感染剂量大于或等于所述第一感染剂量；和
-重复以上步骤，收获对Vero细胞适应的流感病毒。
根据本公开的另一方面，提供一种使流感病毒适应Vero细胞的方法，其中所述方法包括：
-用第一感染剂量的流感病毒感染Vero细胞；
-在摇瓶中培养感染的Vero细胞，以产生病毒活性；
-收获第一流感病毒；
-用第二感染剂量的所述第一流感病毒感染Vero细胞，以产生病毒活性，收获第二流感病毒；和
-重复以上步骤，收获对Vero细胞适应的流感病毒，其中所述第一感染剂量和所述第二感染剂量中的至少一种以0.00001至2.0之间的MOI表示。
在一些实施方案中，所述MOI可以是0.00001、0.00005、0.00010、0.00050、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、或2.0。在一些特别的实施方案中，所述MOI可以是0.00001、0.00004、0.00013、0.0002、0.0011、0.0013、0.002、0.0022、0.0026、0.0072、0.008、0.018、0.019、0.030、0.033、0.05、0.16、0.22、0.25、0.47、0.5、0.63、1.0、1.58、1.6、或2.0。
在一些实施方案中，所述第一感染剂量可以为第二感染剂量的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。
根据本公开的一些实施方案，所述流感病毒可以从细胞、组织(例如，肺等)和/或受试者(例如，人受试者等)获得。在一些实施方案中，所述流感病毒可以从鸡胚(例如，从鸡胚的尿囊腔、或从鸡胚的羊膜)和/或肺、或任何其它细胞或组织获得。在一些实施方案中，所述流感病毒可以从咽喉拭子、鼻拭子和/或第三方(例如,WHO或CDC)获得。所述流感病毒可以被鉴定为型、亚型、和/或收集流感病毒的来源地。在一些实施方案中，所述流感病毒可以收集自甲型流感病毒(例如，H1N1、H1N2、H3N2、H3N8、H5N1、H7N7、H7N9等)、乙型流感病毒、丙型流感病毒等，或其任意组合。仅仅作为举例，所述流感病毒可以是A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09、A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)、A/香港/4801/2014(H3N2)、B/布里斯班/60/2008、或B/普吉岛/3073/2013、或其任意组合。
根据本公开的一些实施方案，所述第一感染剂量和第二感染剂量是指用于产生下一代流感病毒的任何两个连续的流感病毒传代的感染剂量。例如，第一感染剂量可以指用于产生第一代流感病毒的ECE-来源的流感病毒的感染剂量，和第二感染剂量可以指用于产生第二代的第一代病毒的感染剂量。再例如，第一感染剂量可以指用于产生第二代的第一代病毒的感染剂量，和第二感染剂量可以指用于产生第三代的第二代病毒的感染剂量。再例如，第一感染剂量可以指用于产生第三代的第二代病毒的感染剂量，和第二感染剂量可以指用于产生第四代的第三代病毒的感染剂量。再例如，第一感染剂量可以指用于产生第四代的第三代病毒的感染剂量，和第二感染剂量可以指用于产生第五代的第四代病毒的感染剂量。
根据本公开的一些实施方案，所述第一感染剂量和/或第二感染剂量可以通过多种参数来定义。在一些实施方案中，第一感染剂量和/或第二感染剂量可以通过收获的液体形式的流感病毒体积、TCID50、MOI、或任何其它参数来定义。本文使用的术语“收获”是指以下操作中的至少一个，包括获得用流感病毒感染的细胞，获得感染细胞内容物中的流感病毒，分离/纯化流感病毒，和分离/纯化流感病毒抗原。在一些特别的实施方案中，所述第一感染剂量和/或第二感染剂量通过用于感染细胞的流感病毒的MOI来定义。仅作为举例的方式，第一感染剂量和/或第二感染剂量可以表示为0.00001至2.0之间的MOI。应当注意的是，第一感染剂量和/或第二感染剂量可以根据传代次数、一代病毒的病毒活性(例如，HA滴度、CPE等)、每代流感病毒感染的Vero细胞的数量、和/或任何其它参数来确定。
在一些实施方案中，第一感染剂量和第二感染剂量可以通过MOI定义，MOI可以是0.00001、0.00005、0.00010、0.00050、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、或2.0。更特别地，MOI可以为0.00001、0.00004、0.00013、0.0002、0.0011、0.0013、0.002、0.0022、0.0026、0.0072、0.008、0.018、0.019、0.030、0.033、0.05、0.16、0.22、0.25、0.47、0.5、0.63、1.0、1.58、1.6、或2.0。在本公开的一些实施方案中，第一感染剂量可以为第二感染剂量的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。
本公开的病毒活性包括但不限于病毒复制、病毒生产、血凝素(HA)滴度或神经氨酸酶(NA)滴度。
术语“适应(adapting)”和/或“适应(adapted)”是指使流感病毒能够粘附和进入宿主细胞、在宿主细胞内复制、和/或完成病毒组装的性能和/或能力。
本公开进一步提供一种生产流感病毒的方法。所述生产流感病毒的方法可以包括大规模生产感染的细胞。在一些实施方案中，所述生产流感病毒的方法可以包含使用一次性使用的生物反应器进行大规模细胞培养。
本公开进一步提供了一种疫苗。本公开的疫苗可以由对Vero细胞适应的流感病毒生产。在一些实施方案中，所述疫苗可以包含灭活的流感病毒、减毒的流感病毒、和/或流感病毒抗原(例如，HA、NA等)。
本公开进一步提供了一种组合物。本公开的组合物包含但不限于PIKA(包含PIC、至少一种抗生素或聚酰胺化合物、至少一种正离子等的组合物)、流感病毒和/或流感病毒抗原，和/或用于实施组合物的任何其它成分。所述流感病毒抗原包含但不限于HA、NA、HA或NA的衍生物等。所述正离子可选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、锌、或其组合。所述组合物可以用于生产鼻内喷雾的流感疫苗或使用利用任何其它施用方式(例如，肌肉内递送、静脉内递送、口服施用等)的流感疫苗。
在以下的详细说明中，通过实施例的方式说明一些具体的细节，以提供对相关公开内容的完全理解。应当注意的是，对于本领域技术人员，可以无需这些细节就可以实现本公开。可以在不违背本公开的精神和范围的情况下对公开的实施方案和其它实施方案进行各种修改和变化。
实施例
实施例1：Vero细胞培养
在本公开的一些实施方案中，用于流感病毒适应的连续细胞系是Vero细胞系。Vero细胞被WHO推荐用于生产流感病毒疫苗。更特别地，Vero细胞系是WHO推荐的用于生产人流感病毒疫苗的唯一细胞系。
在一些实施方案中，Vero细胞传代次数不超过160代次。在一些更特别的实施方案中，Vero细胞的传代次数为121代次。
本领域技术人员已知，有许多培养基可以用于Vero细胞的培养。在一些实施方案中，Vero细胞可以在包含有胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium，DMEM)中进行培养。例如，Vero细胞可以于37℃在含有5％胎牛血清的DMEM中培养。
Vero细胞可以在许多容器中培养。在一些实施方案中，Vero细胞可以在摇瓶中培养。Vero细胞可以不仅在容器中贴壁生长。例如，Vero细胞可能吸附于培养物中悬浮的生长培养基。术语“生长培养基”是指利用其物理特性(例如，孔洞的结构)、或其化学特性(例如，具有细胞亲和性的化学分子)支持细胞生长的培养基。在一些实施方案中，所述生长培养基为球形微载体(例如，Cytodex1)。
应当注意，对于本领域技术人员，用于流感病毒适应的细胞可以并不仅限于Vero细胞。许多细胞都可以用于流感病毒的适应，所述细胞包括但不限于MDCK细胞、PER.C6细胞、BHK-21、BSC、HEK、MDBK、BK21和CV-1。
实施例2：获得流感病毒的方法
根据本公开的一些实施方案，所述流感病毒可以从多种来源获得。在一些实施方案中，流感病毒可以从鼻内拭子、咽喉拭子、活体检测标本、死体检测标本、或任何其它来源获得。在一些实施方案中，流感病毒可以从受感染的受试者、组织(例如，WHO、CDC、美国典型培养物中心(ATCC)等)、和/或实验室获得。所述受感染的受试者可能包括动物受试者或人类受试者。例如，流感病毒可以从由WHO提供的鸡胚获得。所述流感病毒可通过分离和纯化流感病毒的任何方法从所述来源中获得。通过定性分析和/或定量分析确定流感病毒的病毒活性(例如，HA滴度、NA滴度、病毒生产等)。
实施例3：传代与收获
通过感染剂量的ECE-来源的流感病毒感染Vero细胞。感染剂量可以通过流感病毒的MOI来表示。在一些实施方案中，感染剂量可以在0.00004至0.5之间。在一些特别的实施方案中，感染剂量可以为0.00004、0.0013、0.0026、0.008、0.04、或0.5。在一些实施方案中，在Vero细胞感染中，可以使用两种或两种以上的感染剂量的值。例如，可以使用两种感染剂量的值，其中一个值可以是另一个值的1％至100％(例如，10％、25％、50％、75％或100％)。
在细胞培养基中培养感染的Vero细胞。在一些实施方案中，经感染的Vero细胞可以在VP培养基中、在34℃进行培养。在一些实施方案中，向细胞培养物中添加一种或多种物质。例如，基于细胞代谢，添加谷氨酰胺。
可以培养感染的Vero细胞用于获得第一代的流感病毒。在一些实施方案中，可以通过获取一些参数来确定收获流感病毒的时间和/或ECE-来源的流感病毒的感染剂量值，所述参数包括细胞病变效应(CPE)、细胞粘附至生长培养基或容器的能力、和/或HA滴度。CPE是指流感病毒感染产生的任何作用，包括但不限于细胞变圆、退化、细胞从支持物(例如，生长培养基、组织培养皿、T-瓶等)脱落、或凋亡。在一些实施方案中，可以从Vero细胞获取第一代的流感病毒，所述Vero细胞被流感病毒以ECE-来源病毒的感染剂量的两个值中的一个感染。
可以使用第一代感染剂量的第一代流感病毒感染Vero细胞。进一步培养Vero细胞，用于获得第二代的流感病毒。在一些实施方案中，可以使用两种或两种以上的第一代感染剂量的值感染Vero细胞，用于获得高病毒活性的流感病毒。类似地，可以使用第二代感染剂量的第二代流感病毒感染Vero细胞，并且可以进一步培养感染的Vero细胞用于获得第三代流感病毒。
在一些实施方案中，第一代感染剂量小于或等于第二代感染剂量。在一些实施方案中，第一代感染剂量为第二代感染剂量的1％至100％。在一些特别的实施方案中，第一代感染剂量为第二代感染剂量的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。
重复上述步骤，持续几个传代。在一些实施方案中，流感病毒的传代次数为5至10代。在一些特别的实施方案中，流感病毒的传代次数为5代、6代、7代、8代、9代、或10代。
收获对Vero细胞适应的流感病毒。所述对Vero细胞适应的流感病毒可以通过一个或多个参数确定。所述参数包括但不限于：传代次数、HA和TCID50滴度、CPE、HA基因突变、或其组合。在一些实施方案中，所述对Vero细胞适应的流感病毒可以通过传代次数确定。在一些实施方案中，当传代次数为5至10代时(例如，传代次数可以为5代、6代、7代、8代、9代、10代)，可以获得对Vero细胞适应的流感病毒。在一些实施方案中，当某一代的病毒活性大于从鸡胚获得的流感病毒的病毒活性时(例如，TCID50滴度的增加)，和当某一代的病毒活性达到或大于预期值(例如，HA滴度达到32、64、128、256、512或更大)时，或至少两个连续传代保持相同的值(例如，一代的HA滴度为前一代HA滴度的80％至120％)时，可以获得对Vero细胞适应的流感病毒。例如，可以在某一代的TCID50滴度大于从鸡胚中获得的流感病毒的TCID50滴度(例如，从4Log10TCID50/ml增加到5、6、7、8甚至9Log10TCID50/ml等)的条件下，某一代的HA滴度达到或大于预期值(例如，HA滴度达到32、64、128、256、512或更高)的条件下，或者HA滴度在至少两个连续的传代中保持相同的值(例如，一代的HA滴度为前一代的HA滴度的80％-120％)的条件下，和CPE(例如80％-100％的细胞显示CPE)的条件下，获得对Vero细胞适应的流感病毒。在一些实施方案中，可以在几个传代(例如，两个连续的传代、三个连续的传代、四个连续的传代、五个连续的传代等)中仅仅鉴定出少数(例如1、2、3等)非同义突变位点(此类非同义突变位点不在HA基因的切割位点内或附近)的条件下获得对Vero细胞适应的流感病毒。
实施例4：对Vero细胞适应的流感病毒
根据本公开的一些实施方案，用于使流感病毒适应Vero细胞的方法可以适用于多种流感病毒。表1阐明了根据本公开的一些实施方案的示例性流感病毒各代的感染剂量。
表1各代的感染剂量
Figure BDA0002585006140000111
Figure BDA0002585006140000121
根据表1，六种示例性流感病毒用于产生对Vero细胞适应的流感病毒。用小于或等于5的传代次数获得对Vero细胞适应的流感病毒。根据表1，第一代的感染剂量值、第二代的感染剂量值、第三代的感染剂量值、第四代的感染剂量值保持增加。特别是，对于A/加利福尼亚/7/2009(Hl NI)pdm09、B/普吉岛/3073/2013和B/布里斯班/60/2008，第一代的感染剂量值、第二代的感染剂量值、第三代的感染剂量值、第四代的感染剂量值保持增加。对于流感病毒A/密歇根/45/2015(H1Nl)pdm09、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)和A/香港/4801/2014(H3N2)，第一代的感染剂量值、第二代的感染剂量值、和第三代的感染剂量值保持增加。
实施例5：对Vero细胞适应的A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09甲型流感病毒A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09是从2010-2017年WHO推荐的用于生产在北半球使用的流感疫苗的毒株。使从CDC获得的原始A/加利福尼亚/7/2009(H1Nl)pdm09病毒(称为E1病毒)适应于鸡胚，当在Vero细胞中培养时，其显示低的TCID50值(仅为4.5Log10TCID50/ml)。将本公开的方法应用于A/加利福尼亚/7/2009(H1Nl)pdm09病毒，以获得对Vero细胞适用的病毒。经过在Vero细胞中的5代传代后，A/加利福尼亚/7/2009(H1Nl)pdm09病毒适应于Vero细胞，并可用于生物反应器中的大规模生产，其具有增加的TCID50滴度值(从4.5Log10TCID50/ml至7.65Log10TCID50/ml)，和增加的HA滴度值(从4或8至32或64)。
在一些实施方案中，使A/加利福尼亚/7/2009(H1Nl)pdm09病毒适应Vero细胞的方法如下进行：
将15ml灭菌的微载体Cytodex 1(2％，w/v)分别添加到两个100ml摇瓶中。用25ml的5％FBS-DMEM(即，含有5％胎牛血清的DMEM)洗涤Cytodex 1一次，让培养基静置5-10分钟。小心除去上清液，添加5％FBS-DMEM培养基至总体积为40ml，将摇瓶放在CO2孵育箱中的磁力搅拌器上，将微载体在37℃、5％CO2和30rpm下孵育1小时或过夜。
在T-300烧瓶中培养Vero细胞以形成单层。将Vero细胞用胰蛋白酶消化，然后转移到含有微载体的摇瓶中。Vero细胞的接种密度为2.5x105/ml，添加5％FBS-DMEM至100ml的总体积。将摇瓶放在CO2孵育箱中的磁力搅拌器上，并在37℃、5％CO2和30rpm下培养Vero细胞。当Vero细胞在微载体上汇合时，Vero细胞的密度约为1x106/ml。取出摇瓶，使其放置5分钟。小心除去上清液，用PBS(80mlx2)洗涤微载体两次，用VP培养基(50mlx1)洗涤一次，添加30ml VP培养基(总体积应为约40ml)，并添加胰蛋白酶至终浓度为20μg/ml。
使用两种不同的感染剂量(以MOI表示：0.00065和0.0013)感染Vero细胞。将两个摇瓶放置在CO2孵育箱中的磁力搅拌器上。将感染的Vero细胞在34℃、5％CO2和30rpm下培养。将感染的Vero细胞培养1-2小时或过夜后，添加包含胰蛋白酶(20μg/ml)的VP培养基至100ml的总体积，并在34℃、5％CO2和30rpm下培养Vero细胞。用显微镜观察CPE并每天检测HA滴度。感染后第3天，添加5-l0μg/ml胰蛋白酶。如果必要，基于细胞代谢情况添加谷氨酰胺(1mM)。感染后第5天，约80％-100％的Vero细胞显示出CPE(例如，细胞变圆、从微载体上脱落)。选择其中Vero细胞在培养物中显示出更严重的CPE和更高的HA滴度的摇瓶，将培养物和微载体转移至50ml无菌离心管中，以1000rpm离心5分钟，小心取出上清液。收获的流感病毒称为E1VI病毒。检测TCID50和HA的滴度，并在-80℃储存。
根据相同的细胞培养、培养基置换和病毒感染的方法，将E1V1病毒进一步传代至下一代(称为E1V2病毒)，只是病毒的感染剂量可以不同。用于在摇瓶中生产E1V2病毒的E1VI病毒的感染剂量(用MOI表示)分别为0.000065和0.00013。类似地，用于生产E1V3病毒的E1V2病毒的感染剂量(以MOI表示)为0.0037和0.0072，用于生产E1V4病毒的E1V3病毒的感染剂量(以MO1表示)为0.015和0.03，并且用于生产ElV5病毒的ElV4病毒的感染剂量(以MOI表示)为0.11和0.22。
序列分析显示，与从鸡胚中获得的流感病毒相比，E1V5病毒的HA基因只有一个非同义突变位点(所述非同义突变位点不位于HA基因的切割位点内或附近)。该突变不影响HA抗原的基本特征(例如，引起免疫应答的能力)。图1显示A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09的各代的TCID50滴度。图3显示用A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09的E1V5病毒感染的细胞的细胞病变效应(CPE)。如图3所示，在感染当天(使用ElV4病毒感染Vero细胞的那一天)之后，在感染期间，HA滴度随着CPE变得更严重而增加。
实施例6：B/布里斯班/60/2008对Vero细胞的适应
B/布里斯班/60/2008是WHO推荐的作为生产在北半球使用的流感病毒疫苗的毒株的B型流感病毒。当在Vero细胞中培养时，从鸡胚中获得的B/布里斯班/60/2008病毒显示出较低的TCID50滴度(仅5.6Log10TCID50/ml)。将本公开的方法应用于B/布里斯班/60/2008病毒以获取对Vero细胞适应的病毒。B/布里斯班/60/2008病毒在Vero细胞中经过5代传代后，适应了Vero细胞，可用于在生物反应器中的大规模生产，其具有增加的TCID50滴度值(约8.1Log10TCID50/ml)和增加的HA滴度值(约64或更高)。
在一些实施方案中，使B/布里斯班/60/2008病毒适应Vero细胞的方法如下述进行：
从鸡胚中获得初始的B/布里斯班/60/2008病毒(称为El病毒)，用于在两个摇瓶中感染Vero细胞。初始的B/布里斯班/60/2008病毒对摇瓶的感染剂量分别为0.004和0.008。将两个摇瓶置于CO2孵育箱中的磁力搅拌器上。Vero细胞在34℃、5％CO2和30rpm下培养。将Vero细胞培养1-2小时或过夜后，添加包含胰蛋白酶(20μg/ml)的VP培养基至总体积为100ml，并在34℃、5％CO2和30rpm下培养Vero细胞。感染后每天观察CPE并检测HA滴度。感染后第3天加入5-10μg/ml胰蛋白酶。如果必要，基于细胞代谢情况添加谷氨酰胺(1mM)。感染后第5天，约80％-100％的Vero细胞显示出CPE(例如，细胞变圆、从微载体上脱落)。选择其中Vero细胞在培养物中显示出更严重的CPE和更高的HA滴度的摇瓶，将培养物和微载体转移到50ml无菌离心管中，以1000rpm离心5分钟，小心取出上清液。收获的流感病毒被称为ElV1病毒。检测TCID50和HA滴度，并在-80℃储存。根据相同的细胞培养、培养基置换和病毒感染方法，将E1V1病毒进一步传代至下一代(称为E1V2病毒)，只是病毒的感染剂量可以不同。用于生产E1V2病毒的E1V1病毒的感染剂量(由MOI表示)为0.001和0.002。类似地，用于生产E1V3病毒的E1V2病毒的感染剂量(由MOI表示)为0.0011和0.0022，用于生产E1V4病毒的E1V3病毒的感染剂量(由MOI表示)为0.05和0.10，用于生产ElV5病毒的ElV4病毒的感染剂量(由MOI表示)为0.5和1.0。
序列分析显示，与从鸡胚中获得的流感病毒相比，E1V5病毒的HA基因只有两个非同义突变位点(所述非同义突变位点不位于HA基因的切割位点内或附近)。这些突变不影响HA抗原的基本特征。图2显示B/布里斯班/60/2008的各代的TCID50滴度。图4显示用B/布里斯班/60/2008的E1V5病毒感染的细胞的细胞病变效应(CPE)。如图4所示，在感染当天(使用ElV4病毒感染Vero细胞的那一天)之后，在感染期间，HA滴度随着CPE变得更严重而增加。
尽管已经参考特定实施方案描述了本公开，但是将理解，实施方案是说明性的，并且范围不受限制。对于本公开所属领域的普通技术人员来说，本公开的替代实施方案将变得显而易见。这样的替代实施方案被认为包含在本公开的精神和范围内。

Claims (13)

1.一种使流感病毒适应Vero细胞的方法，所述方法包括：
-用第一感染剂量的流感病毒感染Vero细胞；
-在摇瓶中培养感染的Vero细胞，以产生病毒活性；
-收获第一流感病毒；
-用第二感染剂量的所述第一流感病毒感染Vero细胞，以产生病毒活性，其中所述第二感染剂量大于或等于所述第一感染剂量；
-收获第二流感病毒；和
-重复以上步骤，收获对Vero细胞适应的流感病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一感染剂量和所述第二感染剂量中的至少一种用MOI表示，所述MOI为0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0或0.00001至2.0之间的任何值。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一感染剂量和所述第二感染剂量中的至少一种用MOI表示，流感病毒的MOI为0.00001、0.00004、0.00013、0.0002、0.0011、0.0013、0.002、0.0022、0.0026、0.0072、0.008、0.018、0.019、0.030、0.033、0.05、0.16、0.22、0.25、0.47、0.5、0.63、1.0、1.58、1.6、或2.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一感染剂量为所述第二感染剂量的1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述病毒活性包含病毒复制、病毒生产、血凝素(HA)滴度或神经氨酸酶(NA)滴度。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括使流感病毒在Vero细胞中传代5-10次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述传代的次数为5代、6代、7代、8代、9代、或10代。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述流感病毒从鸡胚、鸡胚尿囊腔、或鸡胚羊膜获得。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述流感病毒选自A/加利福尼亚/7/2009(H1N1)pdm09、A/密歇根/45/2015(H1N1)pdm09、A/瑞士/9715293/2013(H3N2)、A/香港/4801/2014(H3N2)、B/布里斯班/60/2008和B/普吉岛/3073/2013。
10.根据权利要求8所述的方法，其包含使用所述对Vero细胞适应的流感病毒生产组合物，其中所述组合物包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、至少一种抗生素、或聚酰胺化合物、至少一种正离子、流感病毒和/或流感病毒抗原。
11.根据权利要求10所述的方法，其中至少一种所述流感病毒抗原选自HA和NA，其中所述聚酰胺化合物选自：亚精胺盐、亚精胺、N-(3-氨基丙基)、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺、精胺BR、精胺、OS-二甲基硫代磷酰胺酯、多聚赖氨酸和氨基糖苷；其中所述正离子选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁和锌。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其包括通过鼻内喷雾、肌肉内递送、静脉内递送、和/或口服施用所述组合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其包括在一次性使用的生物反应器中培养Vero细胞。
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