CN111601607A - 蛋白质工程化的细胞外囊泡 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种作为治疗溶酶体贮积症(LSD)的新方法的细胞外囊泡(EV)。更具体地，本发明涉及各种蛋白质工程策略在改善难以装载的LSD相关蛋白的装载和所得的EV对感兴趣组织和器官的靶向方面的用途。

Description

蛋白质工程化的细胞外囊泡

技术领域

本发明涉及作为治疗溶酶体贮积症(LSD)的新方法的工程化的细胞外囊泡(EV)。更具体地，本发明涉及各种蛋白质工程策略在改善难以装载的LSD相关蛋白质的装载和所得的EV对感兴趣组织和器官的靶向方面的用途。

背景技术

溶酶体贮积病是先天性代谢错误的一个重要亚组。据估计，每5000名活产儿中有1名患有LSD，但是，由于存在未确诊和误诊的病例，这一数字被认为会更大。所有LSD都是在核内体-自噬-溶酶体系统的细胞器内积累了特定大分子或单体化合物所引起的。除了基质储存的错误外，LSD通常与神经障碍和精神异常相关联，在全世界的神经变性病例中占有很大比例。在过去的二十年中，对抗LSD的研究已经取得了进展，特别是由于酶替代疗法得到了发展。然而，仍有几种疾病要求目前的疗法要进一步发展，或者更糟的是，尚不存在。C型尼曼-匹克(Niemann-Pick)病就是这样一种LSD的示例，该病是NPC-1蛋白缺失或功能失常引起的。NPC-1蛋白参与了诸如胆固醇、糖脂质之类的较大水不溶性分子的共定位和细胞内转运。因此，在疾病环境下，游离胆固醇和鞘糖脂会积聚在多个组织和器官中。尼曼-匹克病的临床表现广泛，可表现为肝肿大、脾肿大或肝脾肿大。LSD所特有的，尼曼-匹克病会导致进行性神经病变，从而导致在所有病例之中除了幼儿期有早产儿死亡。C型尼曼-匹克病(NPC)目前尚无法治愈，当前的治疗方案需要疾病管理。

以前的NPC治疗策略包括减轻症状的药物，诸如抗癫痫药、抗胆碱药或抗抑郁药。自此，一些旨在修正不同阶段脂质代谢途径的候选药物已经或正在临床环境中评估，包括美格鲁特和羟丙基-β-环糊精(CD)。美格鲁特是一种亚氨基糖，它可抑制葡糖神经酰胺合成酶的活性，从而减少鞘糖脂的产生。最初，美格鲁特是为治疗高雪氏病而研发的，并于2009年在欧洲被批准用于NPC患者。目前，CD也正在进行经由鞘内或静脉内给药途径治疗NPC的临床试验。人们认为CD与胆固醇相互作用，并且要么将其从循环中去除要么改变其分布。所有现有的NPC疗法都与一些挑战相关联，并且最重要的是，它们没有充分解决潜在的疾病病理。

诸如蛋白质生物学(其中一种重要但往往不足的药物是上述酶替代疗法)和RNA疗法之类的生物制药可为治疗LSD提供更有效的替代手段。在20世纪90年代早期将ERT引入临床实践中导致了在如何治疗某些LSD(例如，高雪氏病)方面发生变革性的变化，但ERT仍然存在明显的弊端，这意味着许多LSD患者类别仍然严重地缺医少药。尽管许多ERT会在靶细胞内发挥其治疗作用，但这些基于蛋白质的药物的内化并不是特别有效。此外，由于实质上所有蛋白质生物的体积和电荷都比较大，ERT无法穿过血脑屏障，因此会被阻碍进入中枢神经系统(CNS)，这是治疗几种LSD的关键，因为这些疾病的神经性表现非常严重。WO2016/044947描述了利用外泌体作为LSD治疗方式的尝试，并且所述申请涉及治疗性干预的各种方法，但是在设计策略中存在一些明显的缺陷。事实上，虽然WO2016/044947表面地描述了通过使用含有(i)融合到(ii)外泌体蛋白的溶酶体靶向序列的融合蛋白构建体来修饰外泌体以靶向靶细胞的溶酶体，所述申请明显缺乏与实际治疗性mRNA和/或基于蛋白质的制剂的装载和生物活性递送相关的披露。显然，尽管外泌体已经被证明是各种类型生物分子货物的优异载体，但其体内递送治疗性蛋白质和/或mRNA的实际功效并不是微不足道的，并且要求进行深思熟虑的囊泡工程。

发明内容

因此，本发明的目的是克服上述与工程化用于递送用于LSD的蛋白质治疗剂的EV相关联的问题。本发明解决了基于EV的LSD治疗的几个关键方面，即将复杂的蛋白质药物货物包装和装载到EV中；优化EV本身的药代动力学；利用EV的再生效应；以及在体内将药物货物(在该例中为溶酶体蛋白，例如转运蛋白和酶)生物活性地递送至靶细胞中。

本发明通过在生物活性状态和构型中利用新EV工程技术包装和装载治疗LSD所需的复杂且通常非常大的溶酶体蛋白来实现这一目的。此外，本发明还涉及从细胞源中偶然选择和分析具有特定分子特性的EV，该细胞源在适宜的药代动力学和再生特性之间提供最佳平衡，以及提供包含额外蛋白质和在各种LSD中具有治疗活性的核酸成分的EV。本发明的发明人已经意识到，(i)某些意想不到的细胞源在产生正确折叠和因此产生活性的溶酶体蛋白方面具有优势；(ii)将这种溶酶体蛋白转运到EV中的能力高度依赖细胞类型，这可以通过在治疗性溶酶体蛋白和外泌体蛋白之间使用融合蛋白构建体而得到改善；(iii)某些EV蛋白成分是货物蛋白和EV自身的生物活性的关键；以及(iv)源自本文的产生EV细胞源的EV能够使生物活性递送至正确的细胞内室。相反，现有技术，例如WO2016/044947，完全不涉及选择最佳细胞源以进行溶酶体蛋白的生物活性递送，并且所述文献也显然没有意识到使EV富集多肽与治疗性溶酶体蛋白自身融合的重要性。WO2016/044947确实提出了利用融合蛋白技术，但仅针对靶向靶细胞的溶酶体室。WO2016/044947的融合基于短肽序列，该短肽序列将外泌体靶向至靶细胞的溶酶体，但所述融合蛋白不能将实际治疗性溶酶体蛋白自身生物活性地装载到EV中。因此，现有技术显然没有意识到(1)细胞源选择作为靶向至恰当的细胞内位置的手段的重要性；(2)如果溶酶体蛋白被工程化至任何给定的细胞源，则其通常不能正确折叠和/或不具有生物活性这一事实；以及(3)将治疗性溶酶体蛋白装载到EV中常常需要与EV富集多肽/结构域进行融合，以在EV(重要的是在靶细胞)中实现任何酶和/或转运体活性这一事实。

在第一方面中，本发明因此涉及一种EV，该EV可从间充质干细胞(MSC)、羊膜上皮(AE)细胞或胎盘来源(P)的细胞中获得，其中该EV包含包含至少一种溶酶体蛋白的多个多肽构建体。根据本发明的AE-EV、MSC-EV以及P-EV可工程化为含有各种多肽构建体，用以优化至EV的包装和装载，以使EV靶向至感兴趣的组织和/或细胞类型中，和/或增强EV运输到其用于治疗不同LSD的靶室，即，通常为靶细胞的溶酶体室中。

根据本发明的某些关键的EV富集策略包括利用EV蛋白和部分EV蛋白(诸如内居蛋白、内居蛋白的N端部分，或非常令人惊讶的，CD63)作为治疗性溶酶体蛋白的融合伴侣。在有益的实施例中，本发明提供了递送极难递送的溶酶体跨膜蛋白(诸如NPC1蛋白、胱氨酸转运蛋白、CLN蛋白和/或LAMP2蛋白)的EV。

在进一步的方面，本发明涉及包含至少一种溶酶体蛋白和至少一种EV富集多肽的多肽构建体，以及在额外的方面，包含编码这种多肽构建体的多核苷酸构建体。

更具体地，本发明的多肽构建体的溶酶体蛋白可以为NPC1、LAMP2、唾液酸转运蛋白、CIC5、CLN3、胱氨酸转运蛋白或GM2-激活蛋白中的一种或多种。多肽构建体的至少一种EV富集多肽可以为内居蛋白、内居蛋白的N端部分和/或CD63。此外，本发明的多肽可进一步包含至少一种靶向肽和/或多肽。

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸构建体的载体，其中载体为质粒、微环和/或任何其它类型的基本上圆形化的多核苷酸；病毒，诸如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和/或无衣壳病毒；线性DNA和/RNA多核苷酸；信使RNA(mRNA)；和/或修饰的RNA。

在再一方面，本发明还涉及包含这种多肽和/或多核苷酸构建体的细胞。这种细胞优选地为MSC、AE和/或胎盘来源的细胞，优选地，可用这种多核苷酸构建体稳定地转染和/或转导这些细胞，以允许连续且可重复地产生内源性地装载有多个多肽构建体的EV。

在进一步的方面，本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的多个EV、和/或本发明的多肽构建体、和/或本发明的多核苷酸构建体、和/或根据本发明的任何类型的载体。本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。EV和/或这种药物组合物特别适用于治疗LSD，但也可用于治疗溶酶体功能、形态等受到干扰的各种疾病，例如，帕金森氏病、阿尔兹海默病等。

在再一方面，本发明涉及增加溶酶体中和/或哺乳动物的任何其它细胞室中溶酶体蛋白的量的方法，以及用于治疗有需要的受试者中的LSD的创造性方法。这种方法包含能以最佳的方式为患者选择、分析、给药以及施用EV。

在优选的实施例中，增加溶酶体中和/或哺乳动物的任何其它细胞室中溶酶体蛋白的量的方法包含向哺乳动物施用包含根据本发明的EV、根据本发明的至少一种多肽构建体、根据本发明的至少一种多核苷酸和/或根据本发明的至少一种载体的组合物。

综上，本发明提供一种具有高度创造性的EV工程技术，以在生物活性状态和构型下包装和装载治疗LSD所需的复杂且通常非常大的溶酶体蛋白，并选择具有足够货物稳定和递送能力的最佳再生细胞源。

附图说明

图1.NPC1羊膜来源的EV通过将大量的生物活性NPC1蛋白细胞递送至细胞中而显著降低了靶细胞内的胆固醇水平。

图2.用编码包含溶酶体蛋白胱氨酸转运蛋白和EV富集蛋白CD63的多肽构建体的多核苷酸构建体对华顿氏胶MSC来源的EV(WJ-MSC-EV，可从华顿氏胶中获得)进行基因工程化，显示出有效的体外半胱氨酸转运效应。

图3.在尼曼-匹克病的双基因敲除小鼠模型中体内评估对CD44、SSEA4、CD133、CD24呈阳性并且工程化为包含多个NPC1-内居蛋白多肽构建体的AE-EV。工程化的AE-EV对肝和CNS病变均显示出明显的治疗作用。

具体实施方式

通过使用创新的EV工程技术，结合对生物活性EV种群的选择性设计和分析，本发明解决了基于EV的LSD治疗的几个关键方面。

为了方便和清楚，下文收集并描述了本文采用的某些术语。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的含义。

根据Markush组来描述本发明的特征、方面、实施例或替代方案，本领域技术人员将认识到，本发明因此也根据Markush组成员中的任何单个成员或子组来描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明因此也根据Markush组成员的单个成员或子组的任何组合来描述。另外，应当注意，与本发明的一个方面和/或实施例有关的实施例和特征也经必要修改适用于本发明的所有其它方面和/或实施例。例如，本文所描述的例如与包含这种溶酶体蛋白的EV有关的溶酶体蛋白应被理解为是公开的、相关的且与本文中的所有其它方面、教导和实施例兼容，例如与用于产生包含这种溶酶体的EV的方法相关的方面和/或实施例，或者与本文的多肽和/或多核苷酸构建体相关的方面。此外，本文所鉴定的所有多肽和蛋白质都可使用用于融合多肽的常规策略自由地组合在多肽构建体中。作为非限制性示例，本文所述的所有溶酶体蛋白可与一种或多种EV富集多肽以任何组合自由地组合。而且，本文所述的任何和所有溶酶体蛋白可自由地与一种或多种EV富集多肽组合。而且，本文的任何和所有溶酶体蛋白可与任何其它溶酶体蛋白组合，以生成包含一种以上的溶酶体蛋白的多肽和/或相应的多核苷酸、构建体。而且，任何和所有特征(例如，Markush组的任何和所有成员)可自由地与任何和所有其它特征(例如，任何其它Markush组的任何和所有成员)组合。另外，当本文中的教导是指单数形式的EV和/或将EV称为离散的天然纳米粒子样囊泡时，应当理解，所有这种教导都与多个EV和EV种群同等相关并且适用于该多个EV和EV种群。一般而言，溶酶体蛋白、EV富集多肽、靶向肽和/或多肽、产生EV的细胞源和所有其它方面、实施例以及根据本发明的替代方案可在不脱离本发明的范围和主旨的情况下以任何和所有可能的组合自由地组合。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)可大大偏离原始多肽、多核苷酸以及序列，只要任何给定的分子仍具有能保留与之相关联的预期技术效应的能力。只要它们的生物学特性保持不变，根据本申请的多肽和/或多核苷酸序列与天然序列相比可偏离多达50％(使用例如BLAST或ClustalW计算)，尽管优选尽可能高的序列同一性(例如60％、70％、80％，或者例如90％或更高)。例如，至少一种溶酶体蛋白与至少一种EV富集多肽的组合(融合)自然意味着各种多肽的某些区段可被替换和/或修饰，和/或可通过插入其它氨基酸延伸来中断序列，也就是说，只要保存了关键特性(例如，溶酶体蛋白的天然效应、EV的运输和富集、靶向特性等)，与天然序列的偏离可以很大。因此，类似的推理自然适用于编码这种多肽的多核苷酸序列。本文提及的与肽、多肽以及蛋白质有关的所有登录号和序列号应仅被视为示例并且仅供参考，并且所有肽、多肽以及蛋白质应按照本领域技术人员的理解赋予它们一般的含义。因此，如上所述，本领域技术人员还将理解，本发明不仅涵盖本文所述的特定序列号和/或登录号，而且还涵盖其变体和衍生物。根据2017年11月10日版本的数据库，本文提及的所有登陆号均为UniProtKB登陆号，并且本文提及的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸以及多核苷酸均应根据技术人员所理解的常规含义进行解释。

术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”可在本文互换使用，并应理解为涉及任何类型的囊泡，该囊泡可以任何形式从细胞中获得，例如微囊泡(例如，从细胞血浆膜中脱落的任何囊泡)、外泌体(例如，源自溶酶体内路径的任何囊泡)、凋亡小体(例如，从凋亡细胞中获得)、微粒(其可源自例如血小板)、核外颗粒体(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺体(例如，可从前列腺癌细胞中获得)或者心脏体(例如，可源自心脏细胞)等。外泌体和微粒代表特别优选的EV。EV的尺寸可有很大变化，但EV通常具有纳米级的流体动力学半径，即，半径为1000纳米以下。清楚地，EV可体内、离体以及体外地源自任何细胞类型。然而，本发明主要集中于可从羊膜上皮(AE)细胞、间充质干细胞(MSC)以及胎盘来源的细胞中获得的EV。此外，术语“EV”和/或“外泌体”和/或“微囊泡”也应理解为涉及细胞外囊泡模拟、通过例如膜挤出、超声或其它技术等获得的基于细胞膜的囊泡。清楚的是，本领域技术人员将清楚，当描述EV的医疗和科学用途及应用时，本发明通常涉及多个EV，即可包含数千、数百万、数十亿或甚至万亿个EV的EV种群。由以下实验部分可知，EV可以以下浓度存在，诸如10⁵、10⁸、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁸、10²⁵、10³⁰个EV(常常称为“粒子”)/单位体积(例如，每ml)，或任何其它更大、更小的数字或在其之间的数字。同样地，术语“种群”(其可例如涉及包含某种溶酶体蛋白的EV)应理解为涵盖构成这种种群的多个实体。换言之，当存在多个中时，单个EV构成EV种群。因此，本发明自然涉及单个EV和包含EV的种群，如本技术人员将清楚的。EV在体内应用时的剂量可根据要治疗的疾病、给药途径、感兴趣的溶酶体蛋白的活性和作用、EV上存在的任何靶向部分、药物剂型等自然地发生很大变化。

术语“EV富集多肽”、“EV蛋白”、“EV多肽”、“外泌体多肽”以及“外泌体蛋白”在本文可交换使用，并且应被理解为涉及可用于将多肽构建体转运(除了EV富集蛋白以外，其通常包含溶酶体蛋白)至适宜的囊泡结构(即，适宜的EV)中的任何多肽。更具体地，这些术语应被理解为包含能将融合蛋白构建体转运、运输或运送至诸如EV之类的囊泡结构的任何多肽。这种外泌体多肽的示例为，例如，CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也称为转铁蛋白受体)及其核内体分选结构域(即转铁蛋白受体核内体分选结构域(如SEQ ID NO 3例证的非限制性示例所示))、CD133、CD138(粘结蛋白聚糖-1)、CD235a、ALIX、内居蛋白(如SEQ ID NO 1例证的非限制性示例所示)(也称为内居蛋白-1)、内居蛋白Lamp2b的N端部分(如SEQ ID NO 2例证的非限制性示例所示)、粘结蛋白聚糖-2、粘结蛋白聚糖-3、粘结蛋白聚糖-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、ARRDC1、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合，但能够将多肽构建体转运到EV中的许多其它多肽包含在本发明的范围内。通常，在本发明的许多实施例中，至少一种EV富集多肽包含在包含溶酶体蛋白的多肽构建体中，该融合多肽构建体还可有利地包含各种其它成分，包括接头、跨膜结构域、细胞溶质结构域、多聚化结构域、释放结构域等。

术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲本细胞”或“细胞源”或“产生EV的细胞”或任何其它类似的术语应被理解为涉及任何类型的细胞，该任何类型的细胞能够在适宜的条件下(例如在悬浮培养物、贴壁培养物或任何其它类型的培养体系中和/或体内、离体和/或体外地)产生EV。根据本发明的源细胞还可包括在体内产生外泌体的细胞，例如，经由将多肽构建体递送至受试者以进行后续的翻译和在体内(例如在肝脏中)产生EV。本发明最有益的细胞为MSC、AE细胞和/或胎盘来源的细胞，所有这些细胞都来自哺乳动物，最优选地来自人类。可从例如骨髓、脂肪组织、华顿氏胶、围产期组织(例如，羊膜(amnion)、羊膜(amnioticmembrane)、羊水、绒毛膜、胎盘、脐带、华顿氏胶)、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得MSC。一般来说，EV可实质上源自任何细胞源，无论是原代细胞源还是永生的细胞系。EV源细胞可以是任何胚胎、胎儿以及成人体干细胞类型，包括诱导的多能干细胞(iPSC)和通过任何方法得到的其它干细胞以及任何成人细胞源。在本质上，源细胞对待治疗患者可以是同种异体的、自体的、甚至是异种异体的，即，细胞可来自患者本人或来自无关或相关、匹配或不匹配的供体。在某些情况下，从医学角度来看，可优选同种异体细胞，因为它们可以具有免疫调节作用，该免疫调节作用无法从患有某种适应症的患者的自体细胞获得。

在第一方面，本发明涉及可从MSC、AE细胞或胎盘来源的细胞获得的EV，所以被称为MSC-EV、AE-EV以及P-EV。此外，根据本发明的EV被内源性地工程化为包含包含至少一种溶酶体蛋白的相当多个多肽构建体，以增强其在各种不同LSD中的治疗活性。“内源性地工程化”意味着产生EV的AE、MSC和/或胎胚来源的细胞可被基因工程化为含有多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体编码在细胞机制的辅助下并入EV中的治疗性溶酶体蛋白。产生EV的细胞源的选择是利用治疗性溶酶体蛋白实现EV的种群广泛、高效率的装载的关键。相反，现有技术，例如WO2016/044947，仅涉及经由电穿孔介导的外源性地装载用GAA酶来装载的外泌体(来自树状细胞)。蛋白质的外源性装载有几个缺点，包括(i)效率低，(2)整个EV种群分布不均，以及(3)蛋白质错误折叠的风险增加，特别是因为治疗性溶酶体蛋白对构象变化高度敏感。

MSC-EV、AE-EV以及P-EV的选择基于意外的发现，即，来自这些细胞源的EV能够携带大量正确折叠的溶酶体蛋白的拷贝，仍保留有治疗活性，无论是酶活性或转运体活性或所述治疗性溶酶体蛋白所携带的任何其它活性。而且，发明人还意外地意识到，所述细胞源(AE、MSC以及胎盘来源的细胞)可产生正积极地将溶酶体蛋白递送至其在靶细胞中的正确动作位置的工程化EV。在不希望受任何理论约束的情况下，可以推测这些特性是由于在来自这些细胞源和所述细胞体现出的蛋白质组指纹的EV中、特别是外泌体中发现了高含量的热休克蛋白，特别是热休克70kda蛋白8(也被称为Hsp70-8，由HSPA8基因编码)。

在有益的实施例中，包含在AE-EV、MSC-EV以及P-EV中的多肽构建体可被工程化为进一步包含至少一种EV富集多肽，以驱动内化到溶酶体蛋白的EV中。这种EV富集多肽可实质上选自任何EV多肽，例如，选自EV富集多肽的以下群组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、内居蛋白-1、内居蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、ARRDC1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、Hsp70、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其任何衍生物和/或结构域及其任何组合。

发明人已经意识到，最有益的EV富集多肽为内居蛋白、内居蛋白的各种N端部分以及CD63。这是非常令人惊讶的，因为内居蛋白是一种可溶的腔内EV蛋白，而CD63是一种存在于EV膜中的跨膜四蛋白。两种不同类别的EV蛋白对将各种类型(跨膜、可溶等)的溶酶体蛋白包装至EV中具有如此深远的影响，这一事实是非常偶然的发现并且似乎与如产生EV的细胞源的AE、MSC以及胎盘来源的细胞的明智选择相关。内居蛋白的N端部分和内居蛋白本身是特别有益的EV富集多肽，因为它们能够将极其大量的溶酶体蛋白转运到EV，几乎不考虑将其插入融合多肽构建体中的位置。此外，它还能够将膜相关、跨膜以及可溶性溶酶体蛋白转运到EV中，并保持生物活性。

在本发明进一步的实施例中，溶酶体蛋白选自包含α-D-甘露糖苷酶、N-天门冬氨酰-β-氨基葡萄糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、胱氨酸转运蛋白、溶酶体相关膜蛋白-2(LAMP2)、α-半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、α-岩藻糖苷酶、组织蛋白酶A、酸性β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、GlcNAc-1-磷酸转移酶、β-半乳糖神经鞘氨醇酶、溶酶体酸性脂肪酶、芳基硫酸酯酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、帕兰磺酰胺酶、乙酰α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoA:α-氨基葡萄糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、透明质酸酶、乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-N-乙酰神经氨酸酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、甲酰甘氨酸生成酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶I、半胱氨酸链蛋白、CLN3p、CLN5p、CLN6p、CLN7p、CLN8p、酸性鞘磷脂酶、NPC1、NPC2、酸性α-葡萄糖苷酶、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白、α-N-乙酰半乳糖胺酶、GM2激活剂、溶酶体酸性脂肪酶及其衍生物、区域、结构域和/其任何组合的群组。

在根据本发明的特别优选的实施例中，溶酶体蛋白是溶酶体膜蛋白，优选地NPC1。NPC1可被工程化并装载到在其天然状态下的AE-EV、MSC-EV和/或P-EV中，但也可通过使用包含NPC1蛋白以及内居蛋白、内居蛋白的N端部分和/或CD63中的一种或多种的融合多肽构建体被装载到所述的EV中。本发明其它优选的实施例包括包含多肽构建体的EV，该多肽构建体包含溶酶体蛋白LAMP2(用于治疗例如达农(Danon)病)、唾液酸转运蛋白(用于治疗例如萨拉(Salla)病、小儿游离唾液酸贮积病)、ClC5(用于治疗X连接的高钙肾结石)、CLN3(用于治疗巴藤(Batten)病)或胱氨酸转运蛋白(用于治疗胱氨酸病)和/或GM2-激活蛋白(用于治疗GM2神经节苷脂贮积症)中的一种或多种。

在进一步的实施例中，选择根据本发明的EV以对各种蛋白标记物呈阳性，令人惊讶的是，这些蛋白标记物似乎与再生和免疫调节作用以及与用于治疗LSD的适宜药代动力学类型相关联。最具生物活性的EV对以下多肽中的一种(但通常至少有三种)呈阳性：CD63、CD81、CD44、SSEA4、CD133、CD24。

在再一进一步的实施例中，发明人已意识到，即使未被基因工程化，来自本文EV源的EV在各种LSD中仍具有固有作用。据推测，这是在EV中存在各种来自不同Hsp蛋白家族的热休克蛋白(Hsp)的结果，例如，Hsp90、Hsp70(所述家族中最重要的蛋白是热休克70kDa蛋白8(由基因HSPA8编码，也称为Hsp70-8))和/或Hsp40。但是，似乎还存在对未修饰的AE-EV、MSC-EV以及P-EV的这种固有活性来说很重要的其它因素，因为在来自其它细胞源的EV中还未观察到类似的治疗作用。

人们已知，热休克蛋白可作为伴侣分子来辅助蛋白被折叠至其恰当的构象中。本发明的发明人首次描述了产生含有特别高水平的热休克蛋白的EV的特定细胞类型，该热休克蛋白在被修饰以内源性地产生溶酶体蛋白并将该溶酶体蛋白装载到EV中时会导致内源性地产生的溶酶体蛋白被恰当地折叠，因此具有高度的生物活性。该策略的第二个益处在于用天然富含热休克蛋白的EV治疗患有溶酶体贮积症的病人被认为是还改善病人细胞中已经存在的任何突变的溶酶体蛋白(其具有产生EV的细胞本身创建的翻译后修饰并在EV的受保护环境下转运到靶细胞中)的折叠。这可以说明在来自这些细胞源的未工程化EV中看到的固有有益效果的原因。

与现有技术不同，例如，WO2016/044947，产生EV的细胞源的选择是利用正确折叠的治疗性溶酶体蛋白实现EV的种群广泛、高效率的装载的关键。与WO2016/044947相反，本发明的发明人已经意识到，利用治疗性溶酶体蛋白对EV进行内源性装载是实现生物活性递送正确折叠且功能化的治疗性溶酶体蛋白(溶酶体酶和溶酶体转运蛋白)的有益方法。WO2016/044947中提到，在其形成后可人工地、外源性地添加至外泌体中的伴侣分子(诸如热休克蛋白)可促进治疗，但是从WO2016/044947中采用的外源性装载方法可清楚地知道，天然热休克蛋白和其它天然EV成分在产生具有正确折叠的蛋白质的EV中所发挥的作用还不了解，该正确折叠的蛋白质随后定位至恰当的细胞室中，其中溶酶体蛋白在热休克蛋白的辅助下维持在正确的折叠中。

因此，在优选的实施例中，本发明的产生EV的细胞和由这些细胞产生的EV均包含多肽构建体，该多肽构建体包含治疗性溶酶体蛋白以及至少一种热休克蛋白，优选地，热休克蛋白70kDa蛋白8。不同于WO2016/044947，热休克蛋白天然地存在于产生EV的细胞中这一事实意味着这些内源性热休克蛋白从其生物起源之时就存在于EV中，因此确保了复杂且敏感的治疗性溶酶体蛋白从一开始就被正确折叠，即，在并入EV中之前就被正确折叠，并且确保了在细胞产生EV的过程中，甚至在从细胞分泌EV之后以及在纯化过程期间，它们仍能保持正确折叠的构象，这有望延长所生产的产品的保质期。

此外，事实上，热休克蛋白本身是内源性的，因此被产生EV的细胞恰当地翻译后修饰产生较好伴侣分子活性，因此有可能产生较好的溶酶体蛋白治疗活性。一并考虑，事实上，本发明的细胞采用内源性地产生的溶酶体蛋白，结合内源性地存在于所选择的生产者细胞类型中的热休克蛋白，这会导致溶酶体蛋白被装载到EV中，该溶酶体蛋白与外源性地装载的溶酶体蛋白相比被显著地更好折叠，因此更加稳定，存活的更长，更具生物活性。此外，内源性地装载且内源性地伴随的溶酶体蛋白一旦再次被递送至细胞中，它们会继续保持在该恰当折叠的构象中，从而延长了治疗性蛋白质的生物活性。

因此，在本发明中，有助于细胞内递送至正确的室的EV蛋白质组指纹、正确折叠的治疗性溶酶体蛋白以及广泛存在的大量溶酶体蛋白的组合代表了一种独特的方法，在增强高效力治疗性蛋白质的细胞内递送、改善固有免疫调节作用和降低商品成本方面具有广泛的意义。

因此，在一个有益的实施例中，本发明涉及包含AE、MSC和/或P来源的EV的种群的组合物，其中至少50％、60％或70％的EV对治疗性溶酶体蛋白呈阳性，更优选地其中至少75％的EV对治疗性溶酶体蛋白呈阳性，甚至更优选地其中至少90％的EV对治疗性溶酶体蛋白呈阳性，和/或甚至更优选地其中至少95％的EV对治疗性溶酶体蛋白呈阳性。重要的是，本发明的治疗性溶酶体蛋白可以正确折叠，由于所述蛋白质内源性地装载到包含热休克蛋白的EV中，这有助于保持讨论中的蛋白质的正确折叠。

根据本发明的用于治疗LSD的高效力EV的非限制性示例包括：

MSC-EV或AE-EV，包含多肽构建体的多个拷贝，该多肽构建体包含治疗性溶酶体蛋白以及至少一种天然的热休克蛋白，诸如热休克蛋白70kDa蛋白8。

AE-EV，包含多肽构建体，该多肽构建体包含溶酶体蛋白-内居蛋白、溶酶体蛋白-内居蛋白的N端部分或溶酶体蛋白-CD63。特别优选的示例为包含多肽构建体的AE-EV，该多肽构建体包含NPC1-内居蛋白、NPC1-内居蛋白的N端部分或NPC1-CD63。

AE-EV，包含多肽构建体，该多肽构建体包含NPC1-内居蛋白、NPC1-内居蛋白的N端部分或NPC1-CD63，并且对CD63、CD81、CD44、SSEA4、CD133、CD24中的至少一种呈阳性。在开发用于其它LSD的疗法时，其它溶酶体蛋白可自然地替代NPC1蛋白质。

AE-EV，包含如上所述的多肽构建体，并且进一步包含至少一种Hsp，优选地Hsp40、Hsp70(优选地Hsp70-8)和/或Hsp90或其衍生物或结构域中的一种或多种。

AE-EV和/或MSC-EV被工程化为包含多肽构建体，该多肽构建体包含多种溶酶体蛋白，优选地跨膜溶酶体蛋白，诸如LAMP2、唾液酸转运蛋白、CIC5、CLN3、胱氨酸转运蛋白、GM2-激活蛋白或NPC1。

天然AE-EV和MSC(可从例如羊膜组织、胎盘组织、华顿氏胶、骨髓或脂肪组织中获得)也可以未经修饰的形式有疗效地使用，特别是如果它们包含至少一种Hsp。

重要的是，本发明用于优化产生EV的AE、MSC以及胎盘来源的细胞的工程策略会导致溶酶体蛋白高效地装载到AE-EV、MSC-EV以及P-EV中。通常，根据本发明的每个EV包含多肽构建体(因此包含溶酶体蛋白)的至少5至10个拷贝，但通常远高于10个拷贝，例如大约20至30个拷贝，或30至50个拷贝，或也高于50个拷贝，例如，讨论中的溶酶体蛋白的大约75个或大约100个拷贝。显然，这对治疗作用非常重要，并且如果没有有目的地选择最佳工程策略、细胞源和EV谱以及产生和获得这种EV的发明方法，就无法实现。

在进一步的实施例中，EV可进一步包含器官、组织或细胞靶向肽和/或多肽。在将EV转运到大脑和CNS方面已被证明是有效的靶向肽的示例是狂犬病毒素糖蛋白(RVG)肽，但其它肽和多肽也在本发明的范围内。重要的是，组织靶向肽和/或多肽可包含在也包含溶酶体多肽(以及任选地EV富集多肽)的多肽构建体中和/或可作为单独的多肽构建体存在于EV中。当靶向肽和/或多肽是单独的多肽构建体的一部分时，其优选地与外泌体蛋白融合，以确保有效地装载到EV中。

在进一步的方面，本发明涉及一种包含至少一种溶酶体蛋白和至少一种EV富集多肽的多肽构建体。如上所述，尽管某些诸如CD63和内居蛋白的EV富集多肽以及内居蛋白的某些区域是高度优选的，但这种多肽构建体可包含任何EV蛋白(即，EV富集多肽)。此外，如上所述，根据本发明的多肽构建体中可包括额外的元件，例如，(i)靶向肽和/或多肽；(ii)多聚结构域，诸如折叠结构域或亮氨酸拉链结构域；(iii)接头和切割或释放结构域等。在有益的实施例中，多肽构建体包含溶酶体蛋白，诸如NPC1、LAMP2、唾液酸转运蛋白、CIC5、CLN3、胱氨酸转运蛋白或GM2激活蛋白中的一种或多种。

在再一方面，本发明涉及编码根据本发明的多肽构建体的多核苷酸构建体。可在体内、离体和/或体外，使用各种载体自然地表达这种多核苷酸构建体。在再一方面，包含根据本发明的多核苷酸构建体的适宜载体包括：质粒；微环；任何类型的基本上圆形化的多核苷酸；病毒，诸如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和/或无衣壳病毒；线性DNA和/或RNA多核苷酸；信使RNA(mRNA)；和/或修饰的mRNA。

在再一进一步的方面中，本发明涉及包含如本文所述的多肽构建体、多核苷酸构建体或载体中的一种或多种的细胞。自然地，根据本发明的产生EV的细胞优选地为间充质干细胞(MSC)、羊膜上皮细胞(AE)和/或胎盘来源的细胞，但也可以使用任何其它细胞。产生EV的细胞可以存在于体外，例如，存在于细胞培养物中，或者存在于任何离体或体内系统中。根据本发明的细胞可以任选地永生化，以使EV能够持续地产生。

在本发明的优选实施例中，产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞包含包含至少一种治疗性溶酶体蛋白的至少一种多肽构建体、编码所述多肽构建体的至少一种多核苷酸构建体和/或根据本发明的至少一种载体。本发明的细胞通常被工程化为包含多核苷酸构建体(其可以诸如质粒、mRNA、线性DNA分子、病毒或病毒基因组等之类的载体的形式存在)，它通过细胞机制表达到相应的多肽构建体中，从而并入EV中，通常是由细胞产生的外泌体和/或微囊泡。因此，细胞通常最初包含多核苷酸构建体(或包含所述构建体的载体)，一旦完成多肽构建体的表达和翻译，细胞就会包含多核苷酸和相应的多肽构建体两者，后者通常经由EV介导的胞外分泌从细胞中分泌，其中每个EV包含多肽构建体的多个拷贝。

多肽构建体包含至少一种治疗性溶酶体蛋白，并且任选地其包含治疗性溶酶体蛋白，该治疗性溶酶体蛋白可与至少一种EV富集多肽(例如，CD63、内居蛋白、粘结蛋白聚糖、Alix或可在多核苷酸和多肽水平两者上可操作性地与治疗性融合蛋白连接的任何其它EV富集多肽)组合在一种多肽构建体中。

本发明的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞可优选地包含：(a)多核苷酸构建体，编码包含可稳定地插入产生EV的细胞中的至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体；和/或(b)多肽构建体，包含至少一种溶酶体蛋白，如上所述，该多肽构建体可任选地进一步包含至少一种EV富集多肽。从化学、制造和控制(CMC)的观点来看，稳定(基因)工程化的产生EV的细胞源的创建是具有可重复治疗作用和可重复特性的EV的持续高产的关键。稳定的细胞通常是永生化的，例如，使用hTERT永生化、病毒永生化和/或条件永生化策略。为了能够大规模地产生EV，在一定数量的群体倍增(PDL)上，优选地至少20个PDL，更优选地至少50个PDL，甚至更优选地至少70个PDL，甚至更优选地至少100个或甚至至少200个PDL，优选产生EV的细胞稳定地包含多核苷酸构建体(优选地在适宜的载体中)。

在本发明的优选方面，由产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞产生的至少50％或60％、优选地至少70％或80％、甚至更优选地90％或95％以上的EV包含包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体。在本发明的另一优选方面，由产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞产生的EV包含溶酶体蛋白的至少10、20、30或40、优选地至少50个拷贝，更优选地，包含溶酶体蛋白的多肽构建体的至少70、80或100个拷贝。EV中治疗性溶酶体蛋白的高拷贝数和治疗性溶酶体蛋白的广泛存在的原因是本发明细胞源的创新选择，也由于在需要时可包括EV富集多肽，以及通过创建稳定的工程细胞以用于EV的连续产生。

在另一方面，产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞优选地包含以下天然蛋白质中的一种或多种：CD63、CD81、CD44、CD49e、CD105、SSEA4、CD133、CD24和/或热休克70kDa蛋白8。进一步优选地，产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞包含以下天然蛋白质：CD63、CD81以及热休克70kDa蛋白8。这三种天然蛋白质在细胞及其相应的EV两者中的组合(更一般地，与Hsp70-8组合的tetraspanins)与高产EV的产生、和溶酶体蛋白在延长的时间周期中的正确折叠和活性以及高效的生物活性递送至靶细胞的右室中密切相关。

热休克蛋白，例如来自Hsp70家族的热休克蛋白，诸如热休克70kDa蛋白8，在细胞及其相应的EV两者中的天然、持续存在对所有治疗性溶酶体蛋白的折叠和活性来说都很重要，但对于跨膜治疗性溶酶体蛋白(诸如NPC1、胱氨酸转运蛋白、唾液酸转运蛋白、LAMP1、LAMP2、LAMP2A、PPT1、TPP1、CLN3、CLN6、CLN8、MFSD8、葡糖神经酰胺酶、LIMP2、Lgp85、阀蛋白-1、ATP6V1B1、ATP13A2、CLCN7、OSTM1、HGNSAT、LMBRD1、TRPML1、TRPML3、DIRC2、SPPL2A、DIRC2、DNAJC5和/或CLN5等)尤为重要。在不希望受任何理论约束的情况下，推测在溶酶体跨膜蛋白翻译后，在细胞和细胞的EV中的天然热休克蛋白(诸如Hsp70-8)的存在是生成和随后维持蛋白质正确折叠的关键。随后外源性地添加热休克蛋白或诸如小分子伴侣之类的其它伴侣分子将无法挽救已经错误折叠的蛋白质，这因此将对讨论中的治疗性溶酶体跨膜蛋白的活性产生明显的负面后果。因此，在本发明中，选择在细胞和由所述细胞产生的相应EV两者中都具有高水平天然热休克蛋白的产生EV的细胞源。

在进一步的方面，本发明进一步涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的多个EV、至少一个多肽构建体、至少一种多核苷酸和/或至少一个载体，以及药学上可接受的载体。重要的是，本文的所有生物学成分(EV、多肽、多核苷酸、载体、细胞等)都可单独地或以任何组合的形式一起有利地包含在药物组合物中。通常，本发明的药物组合物包括EV的种群和适宜的药物载体、助剂和/或赋形剂。

在另一实施例中，药物组合物还可有利地包含药物制剂，诸如美格鲁特、阿瑞洛莫、肝素、海藻糖和/或环糊精、和/或其任何衍生物。这些类型的组合可以导致高度协同的治疗作用，因为EV递送了功能性溶酶体蛋白，然后这种药物制剂会增强该功能性溶酶体蛋白的作用。有趣的是，本发明的发明人还意识到可将美格鲁特、阿瑞洛莫以及环糊精添加到产生EV的细胞的培养物中，导致所述制剂内源性地装载到EV中以及治疗作用得到增强。这是一种用于将药物装载到EV中的非常简单的方法，实质上包含：在存在讨论中的适宜浓度的药物的情况下培养产生EV的AE、MSC或胎盘来源的细胞。自然地，本发明的药物组合物特别地适用于治疗溶酶体贮积症，但也可使用本文所述的发明治疗有溶酶体介入的其它疾病。这种疾病包括帕金森氏病、帕金森氏病伴GBA、阿尔兹海默病、克罗恩病等。

使用根据本发明的EV进行治疗的特别感兴趣的LSD包括以下非限制性疾病列表：α-甘露糖苷症，β-甘露糖苷症、天门冬氨酰基葡萄糖胺尿、胆固醇酯贮积病、膀胱酸病、达农病、法布里(Fabry)病、法伯(Farber)病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、I型高雪氏病、II型高雪氏病、III型高雪氏病、I型GM1神经节苷脂贮积症、II型GM1神经节苷脂贮积症、III型GM1神经节苷脂贮积症、GM2-山德霍夫氏(Sandhoff)病、GM2-黑蒙性白痴病、GM2-神经节苷脂贮积症、AB变异、II型粘脂贮积症、克拉伯(Krabbe)病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、MPS I-赫勒氏(Hurler)综合征、MPS I-施艾氏(Scheie)综合征、MPSI-赫勒氏-施艾氏综合征、MPS II-亨特氏(Hunter)综合征、MPS IIIA-A型沙费利波(Safilippo)综合征、MPS IIIB-B型沙费利波综合征、MPS IIIB-C型沙费利波综合征、MPSIIIB-D型沙费利波综合征、MPS IV-A型莫基奥症(Morquio)、MPS IV-B型莫基奥症、MPS IX-透明质酸酶缺乏症、MPS VI-粘多糖病(Maroteaux Lamy)、MPS VII-赖斯(Sly)综合征、粘脂贮积症I-唾液酸贮积症、粘脂贮积症NIC、IV型粘脂贮积症、多发性硫酸酯酶缺乏症、神经元型蜡样脂褐素贮积症T1、神经元型蜡样脂褐素贮积症T2、神经元型蜡样脂褐素贮积症T3、神经元型蜡样脂褐素贮积症T4、神经元型蜡样脂褐素贮积症T5、神经元型蜡样脂褐素贮积症T6、神经元型蜡样脂褐素贮积症T7、神经元型蜡样脂褐素贮积症T8、神经元型蜡样脂褐素贮积症T9、神经性蜡样脂褐质贮积症T10、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C型尼曼-匹克病、庞贝(Pompe)病、致密成骨不全症、萨拉病、辛德勒(Schindler)病以及沃尔曼(Wolman)病。

在额外的方面，本发明涉及增加哺乳动物的溶酶体和/或任何其它细胞室中溶酶体蛋白的量的方法，包含向哺乳动物施用包含以下中的一种或多种的成分：(i)EV、(ii)至少一种多肽构建体、(iii)至少一种多核苷酸构建体和/或(iv)至少一种载体。此外，本发明还涉及治疗有需要的受试者中的LSD的方法，包含以下步骤：(i)提供包含根据本发明的EV种群的药物组合物和(ii)向患者施用至少10^6EV/kg体重的剂量。重要的是，如上所述，治疗性干预可另选地包含向患者施用多肽构建体、多核苷酸构建体和/或包含这种多核苷酸构建体的载体。这可使用各种递送载体进行，例如，脂质纳米粒子或聚合或基于肽的递送载体。可经由各种给药途径(例如，皮下给药、血管内和/或静脉内给药、口服给药、腹膜内给药、鞘内给药、脑室给药等)向受试者施用组合物、EV、多核苷酸和/或多肽构建体。

实验与示例

材料与方法

构建体设计与克隆：包含至少一种溶酶体蛋白和任选地其它多肽结构域(诸如EV富集多肽)的各种多肽构建体已被构建，克隆至载体内并在几种不同的产生EV的细胞源中产生，特别是AE细胞、MSC以及胎盘来源的细胞。ORF通常通过合成生成并克隆至哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp中。简单地，根据厂商说明书(NEB)，用酶Notl和Sail消化合成的DNA和载体质粒。根据厂商说明书(NEB)，用T4连接酶将限制性纯化DNA片段连接在一起。通过在补充了氨苄西林的平板上进行细菌转化来选择成功的连接事件。根据厂商说明书，通过“maxi-prep”生成转染用质粒。

细胞培养与转染

根据实验设计与分析，在某些情况下，在常规的2D细胞培养物中进行非病毒瞬时转染和外泌体产生，而在其它情况下，采用病毒介导的转导技术创建通常是在不同类型的生物反应器中培养的稳定细胞系。还可使用本发明的多核苷酸构建体的非病毒转染技术和/或其中包含多核苷酸构建体的适宜载体来产生稳定工程化的产生EV的细胞。为了简洁起见，本文仅提到几个示例。

就对溶酶体蛋白和EV多肽的各种组合进行病毒转导和稳定细胞系的病毒创建而言，通常使用慢病毒(LV)对BM-MSC、WJ-MSC、羊膜上皮细胞、羊膜间充质干细胞或胎盘来源的细胞等细胞源进行病毒转导。通常，向细胞培养物中加入2ul的LV和任选地聚凝胺(或海美溴铵，最终孔浓度为8ug/mL)，并在转导后24小时将被转导细胞的细胞培养物改为新鲜的完全培养基。在转导后72小时，进行嘌呤霉素选择(4-6μg/ml)，通常持续7天，然后分析感兴趣蛋白(通常为包含溶酶体蛋白和任选地诸如EV富集多肽之类的其它多肽的多肽构建体)的稳定表达。还可使用非病毒性方法(例如，采用基于化学的转染和/或物理的转染方法)来创建稳定修饰的MSC(例如来自骨髓、华顿氏胶、脂肪组织、羊膜组织，诸如羊膜、羊水等)、AE细胞或胎盘来源的细胞。化学转染方法包含：使用例如诸如阳离子脂质和/或脂质体(通常称为脂质体转染)、阳离子聚合物、树状大分子、磷酸钙、二乙氨基乙基葡聚糖和/或其任何组合之类的基于脂质的制剂引入多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体。物理方法包括电穿孔、细胞挤压、微注射等，以及本领域技术人员已知的用于创建稳定细胞系的各种其它物理方法。也可将用于创建稳定细胞系的物理和化学方法结合在一起，例如，将脂质转染或阳离子聚合物与电穿孔结合，或如技术人员所知的用于创建稳定细胞的任何其它类型的组合。

在二维培养物或生物反应器中培养稳定的细胞，通常为中空纤维生物反应器和/或搅拌槽生物反应器和/或振荡生物反应器(诸如波袋)，随后收获条件培养基用于外泌体制备。当细胞悬浮生长(例如，羊膜来源的细胞)时，进行各种制备和纯化步骤。标准工作流程包含以下步骤：预清上清液、基于过滤的浓缩、基于色谱法去除蛋白污染物以及在用于体外和/或体内检测的适宜缓冲液中任选地制备所得的外泌体成分。

检测与分析

Western blot是一种评估EV中富集多肽构建体的高度便捷的分析方法。简单地，根据厂商的说明书(Invitrogen，Novex PAGE 4-12％凝胶)进行SDS-PAGE，从而每孔中装载1×10¹⁰个外泌体和20ug细胞裂解物。根据厂商的说明书(Immobilon，Invitrogen)将来自SDS-PAGE凝胶的蛋白质转移到PVDF膜上。根据供应商的说明书，膜在Odyssey封闭缓冲液(Licor)中被封闭并用抗溶酶体蛋白和/或外泌体蛋白的抗体(一级抗体-Abcam，二级抗体-Licor)进行探测。分子探针在680和800nm波长下可见。对于EV尺寸的测定，使用配备有分析软件的NanoSight仪器进行纳米粒子跟踪分析(NTA)。对于所有记录，所有收集后设置均使用13或15级摄像机和自动功能。电子显微镜和荧光显微镜经常被用来了解细胞内的位置和释放，以及定量和分析EV。

EV的分离和纯化使用多种方法，通常为组合过滤，诸如TFF和LC，特别是微珠洗脱液LC和离子交换色谱。通常，采集含有EV的培养基，以300g低速旋转5分钟，然后以2000g旋转10分钟，以去除较大的粒子和细胞碎片。另选地，用各种过滤器预清上清液，特别是有悬浮细胞的情况下。然后，上清液用0.22μm针管过滤器过滤并进行不同的纯化步骤。使用带有100kDa截止过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(Sartorius)或带有100或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs)对大体积进行渗滤并浓缩至大致20ml。随后，将预浓缩的培养基装载到微珠洗脱液柱(HiScreen或HiTrap Capto Core700柱，GE医疗生命科学(GE Healthcare Life Sciences))上，连接到

plus或

Pure 25色谱系统(GE医疗生命科学)。根据厂商的说明书，针对柱平衡、样品装载和柱就地清洗程序选择流速设置。根据紫外吸光度色谱图收集样品，并使用Amicon Ultra-15 10 kDa分子量截止旋转过滤器(Millipore)浓缩至最终体积100μl，并在-80℃下储存以进行进一步的下游分析。为了评估蛋白质和RNA洗脱曲线，采用KR2i TFF系统对培养基进行浓缩和渗滤，该系统采用100kDa和300kDa中空纤维过滤器和在Tricorn 10/300 Sepharose 4快速流动(S4FF)柱(GE医疗生命科学)上分析的样品。

示例

示例1.用编码多肽构建体的多核苷酸构建体(使用慢病毒转导)对从产后胎盘获得的羊膜上皮(AE)细胞进行基因工程化，该多肽构建体包含NPC1蛋白和EV富集蛋白内居蛋白(PNC1 S)(SEQ ID NO 2)的N端部分。收获、纯化由AE细胞产生的AE-EV，并在体外评估其增强患者来源的成纤维细胞中的胆固醇转运的能力。从图1可知，NPC1 AE-EV通过向细胞递送大量生物活性NPC1蛋白而显著降低了靶细胞中的胆固醇水平。有趣的是，当仅使用AE-EV和MSC-EV(并且没有其它细胞源)时，有可能通过对AE细胞进行基因工程化以表达NPC1蛋白自身来实现胆固醇累积的剂量依赖性降低，不存在任何EV富集多肽(数据未示出)。产生EV的细胞及其相应的生物活性EV均对各种热休克蛋白(主要来自Hsp70家族，更具体地为Hsp70-8)呈阳性。

示例2.用编码包含溶酶体蛋白胱氨酸转运蛋白和EV富集蛋白CD63的多肽构建体的多核苷酸构建体对华顿氏胶MSC来源的EV(WJ-MSC-EV，可从华顿氏胶中获得)进行基因工程化。从WJ-MSC的中空纤维生物反应器细胞培养物中收获含有胱氨酸转运蛋白的WJ-MSC-EV(CYS-EV)，进行纯化，并在体外对患者来源的皮肤成纤维细胞(PDSF)进行评估，以评定胱氨酸病的体外模型中胱氨酸累积的减少情况。图2示出了在应用包含CD63-胱氨酸转运蛋白多肽构建体的WJ MSC EV时看到半胱氨酸显著减少。如示例1所示，WJ-MSC和WJ-MSC-EV对Hsp70蛋白，特别是Hsp70-8，以及对tetraspanins CD63和CD81呈阳性。

示例3.在尼曼-匹克病的双敲除小鼠模型中体内评估对CD44、SSEA4、CD133、CD24以及Hsp70-8呈阳性并且工程化为包含多个NPC1-内居蛋白多肽构建体的AE-EV。工程化的AE-EV显示出对肝和CNS病变均具有明显的治疗作用(图3)。非工程化的AE-EV也显示出了治疗功效，这可从AE-EV中的各种热休克蛋白的高含量推断得出。

Claims (27)

1.一种细胞外囊泡(EV)，可从间充质干细胞(MSC)、羊膜上皮(AE)细胞或胎盘来源的细胞中获得，其中所述EV包含包含至少一种溶酶体蛋白的多个多肽构建体。

2.根据权利要求1所述的EV，其中所述多肽构建体进一步包含至少一种EV富集多肽。

3.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述溶酶体蛋白选自包含α-D-甘露糖苷酶、N-天门冬氨酰-β-氨基葡萄糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、胱氨酸转运蛋白、溶酶体相关膜蛋白-2、α-半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、α-岩藻糖苷酶、组织蛋白酶A、酸性β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶B、GlcNAc-1-磷酸转移酶、β-半乳糖神经鞘氨醇酶、溶酶体酸性脂肪酶、芳基硫酸酯酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、帕兰磺酰胺酶、乙酰α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoA:α-氨基葡萄糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、透明质酸酶、乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-N-乙酰神经氨酸酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、粘脂蛋白-1、甲酰甘氨酸生成酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶I、半胱氨酸链蛋白、CLN3p、CLN5p、CLN6p、CLN7p、CLN8p、酸性鞘磷脂酶、NPC 1、NPC 2、酸性α-葡萄糖苷酶、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白、α-N-乙酰半乳糖胺酶、GM2激活剂、溶酶体酸性脂肪酶及其衍生物、区域、结构域和/其任何组合的群组。

4.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV富集多肽选自包含CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、内居蛋白(SEQ ID NO 1)、内居蛋白的N端部分(SEQ ID NO 2)、内居蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH 1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、Hsp70、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其任何衍生物和/或结构域及其任何组合的群组。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的EV，其中所述EV富集多肽为内居蛋白、内居蛋白的N端部分或CD63。

6.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述溶酶体蛋白为溶酶体膜蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV对以下多肽中的一种或多种呈阳性：CD63、CD81、CD44、SSEA4、CD133、CD24以及热休克70kDa蛋白8。

8.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV进一步包含至少一种热休克蛋白。

9.根据权利要求8所述的EV，其中所述至少一种热休克蛋白为热休克70kDa蛋白8。

10.根据前述权利要求中任一项所述的EV，进一步包含组织靶向肽和/或多肽。

11.根据权利要求10所述的EV，其中所述组织靶向肽和/或多肽包含在所述多肽构建体中和/或作为单独的多肽构建体而存在。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的EV，其中所述包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体基本上被正确折叠。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的EV，其中单个EV包含：

(i)所述多肽构建体的至少10个拷贝；

(ii)所述多肽构建体的至少50个拷贝；和/或

(iii)所述多肽构建体的至少100个拷贝。

14.一种产生根据权利要求1至13中任一项所述的EV的方法，包含以下步骤：(i)将编码包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体的多核苷酸构建体引入产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞中和(ii)从所述产生EV的细胞中获得包含包含至少一种溶酶体蛋白的多个多肽构建体的EV。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述包含包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体的EV包含：

(i)所述溶酶体蛋白的至少10个拷贝；

(ii)所述溶酶体蛋白的至少50个拷贝；和/或

(iii)所述溶酶体蛋白的至少100个拷贝。

16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体还包含至少一种EV富集多肽。

17.一种产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，包含包含至少一种溶酶体蛋白的至少一种多肽构建体、编码至少一种溶酶体蛋白的至少一种多核苷酸构建体，和/或包含编码至少一种溶酶体蛋白的多核苷酸构建体的至少一种载体。

18.根据权利要求17所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中使编码包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体和/或包含这样一种构建体的载体的多核苷酸构建体稳定地插入产生EV的细胞中。

19.根据权利要求17或18中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中所述包含至少一种溶酶体蛋白的多肽构建体还包含至少一种EV富集多肽。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中：所述细胞产生的

(i)至少50％、

(ii)至少70％、和/或

(iii)至少90％的所述EV包含包含至少一种溶酶体蛋白的所述多肽构建体。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中所述细胞产生的所述EV包含：

(i)所述溶酶体蛋白的至少10个拷贝；

(ii)所述溶酶体蛋白的至少50个拷贝；和/或

(iii)包含所述溶酶体蛋白的所述多肽构建体的至少100个拷贝。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中永生化所述细胞。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中所述细胞和所述细胞产生的所述EV包含以下天然蛋白质中的一种或多种：CD63、CD81、CD44、CD49e、CD105、SSEA4、CD133、CD24和/或热休克70kDa蛋白8。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的产生EV的MSC、AE或胎盘来源的细胞，其中所述细胞和所述细胞产生的所述EV包含以下天然蛋白质中的一种或多种：CD63、CD81和/或热休克70kDa蛋白8。

25.一种药物组合物，包含根据权利要求1至13中任一项所述的多个EV和药学上可接受的载体。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，进一步包含美格鲁特、阿瑞洛莫、肝素、海藻糖和/或环糊精和/或其衍生物。

27.根据权利要求1至13中任一项所述的EV和/或根据权利要求25或26所述的药物组合物，用于治疗一种或多种溶酶体贮积症。

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