CN111588836A - Cd40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于鱼类免疫技术领域，具体涉及CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。本发明还提供包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。本发明又提供CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体在制备抵御罗非鱼抗链球菌感染的制品中的应用和在制备降低罗非鱼体内的链球菌载量的制品中的应用。本发明通过在罗非鱼体内过表达罗非鱼CD40蛋白胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力，使得感染链球菌的罗非鱼的死亡率降低28％。另外，本发明通过在罗非鱼体内过表达CD40还可以降低罗非鱼体内的链球菌载量。

Description

CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用

技术领域

本发明属于鱼类免疫技术领域，具体涉及CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。

背景技术

罗非鱼，隶属于鲈形目，罗非鱼属，具有生长快、繁殖力高等特点，适合集约化养殖，并且罗非鱼产品价格适中，深受广大消费者青睐，是联合国粮农组织推荐养殖的优质鱼类。我国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国，罗非鱼产业对于我国乃至世界的粮食供应都有十分重要的意义。然而，近年来，罗非鱼病害频发，尤其是链球菌病的流行，严重阻碍了罗非鱼产业的健康发展。据调查，以往多用氟苯尼考来控制罗非鱼链球菌的流行，但近年来的病害来势凶猛，加上耐药菌株的出现，导致药物控制效果差，养殖业损失惨重。因此，探索安全有效的链球菌防控措施对于拯救罗非鱼养殖业显得至关重要。

目前，在国内已有一些与链球菌防控的相关专利。例如，申请号为201710686718.4的中国发明专利“一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用”公开了一种鱼链球菌病的弱毒活疫苗；申请号为201310375813.4的中国发明专利“一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗”公开了一种融合蛋白疫苗，该疫苗能够显著提高Th17细胞活化的水平，达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的作用；申请号为201410087045.7的中国发明专利“罗非鱼源无乳链球菌弱毒株及应用”公开了一种防治罗非鱼链球菌病的弱毒活疫苗；申请号为 201410121138.7的发明专利“一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法”公开了一种链球菌口服疫苗。

然而，链球菌是典型的胞内细菌，能够逃避宿主吞噬细胞的杀灭，进而在机体内广泛传播。由于灭活疫苗免疫保护率较低，亚单位疫苗的制作成本较高，且以上疫苗也都无法有效诱导机体的细胞免疫，因此免疫效果并不甚理想。

CD40是肿瘤坏死因子超家族成员，属于I型跨膜糖蛋白，在B细胞的活化、分化、Ig的分泌及类型转换，T细胞的激发、定向分化，抗原呈递细胞的激发、分化及功能调节等方面起关键作用。CD40在机体免疫应答反应中执行生物学效应的前提是与其特异性配体CD40L结合形成共刺激途径。当机体受到抗原刺激时，由抗原呈递细胞表面的组织相容复合物作为第一信号，促使T细胞上调表达 CD40L，然后CD40与CD40L结合，并开启特异性免疫应答的“序幕”，激活抗原呈递细胞表面的其他粘附分子，由这些分子为T细胞的激活提供第二信号，从而产生效应及记忆细胞，放大免疫效应功能。然而，目前罗非鱼CD40对无乳链球菌的免疫应答还未见报道。

发明内容

本发明为了解决现有技术中罗非鱼链球菌疫苗不能有效诱导机体细胞免疫的问题，提供CD40蛋白或包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼(Oreochroms mossambcus)抗链球菌免疫力制品中的应用，该方法进一步通过过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明首先提供CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。具体可将制品通过向罗非鱼体内注射的方式使用。

CD40是尼罗罗非鱼肿瘤坏死超家族成员，CD40基因的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO:1所示。

本发明还提供包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。所述的表达载体可以是真核表达载体。

包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体的制备，包括以下步骤：

(1)提取尼罗罗非鱼脾脏总RNA，

(2)合成cDNA第一链，

(3)克隆尼罗罗非鱼CD40基因全长，

(4)扩增CD40胞外段的cDNA序列，

(5)构建含CD40胞外段的cDNA的重组真核表达质粒。

表达CD40胞外段的真核表达载体可以为pcDNA3.1-CD40EC或 pEGFP-N1-CD40EC，其中CD40EC是指CD40基因的胞外段序列；其中pcDNA3.1 是指pcDNA3.1质粒，其中pEGFP-N1是指pEGFP-N1质粒。

作为优选方案，可将CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体用于制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中。

进一步的，表达CD40胞外段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

本发明还提供了CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体在制备抵御罗非鱼链球菌感染的制品中的应用。

本发明还提供了CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体在制备降低罗非鱼体内的链球菌载量的制品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供CD40蛋白或包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的真核表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用，作为优选方案，可以将CD40 胞外段或包含表达CD40胞外段的核苷酸序列的表达质粒用于该制品的制备，通过体内注射方式用于罗非鱼，该制品制备简单易操作，成本低。

本发明通过在罗非鱼体内过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力，使得感染无乳链球菌的罗非鱼的死亡率降低28％。另外，通过在罗非鱼体内过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段还可以降低罗非鱼体内的无乳链球菌载量，由此可以看出，本发明技术方案可以有效诱导罗非鱼机体细胞免疫。

附图说明

图1重组质粒pEGFP-N1-CD40EC的电泳图，其中泳道1为pEGFP-N1-CD40EC 重组质粒，泳道2为Marker:DL10000 Marker。

图2重组质粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-CD40EC的表达验证结果，A:PBS空白对照组；B:pEGFP-N1对照组；C:pEGFP-N1-CD40EC组。

图3过表达CD40胞外段明显降低无乳链球菌的致死率。

图4过表达CD40胞外段后明显减少罗非鱼脾脏中的无乳链球菌载量。

具体实施方式

实施例1尼罗罗非鱼CD40基因的克隆

1、尼罗罗非鱼脾脏总RNA的提取

取健康的尼罗罗非鱼，于冰上麻醉3分钟，取脾脏组织，采用Trizol试剂提取其总RNA。

2、cDNA第一链的合成

取1μg尼罗罗非鱼脾脏总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA 的污染，利用全式金反转录试剂盒制备cDNA，所得产物置于-20℃保存备用。

3、尼罗罗非鱼CD40基因全长的克隆

根据已公布的尼罗罗非鱼全基因组数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov /genome/197)，设计用于扩增CD40基因的ORF片段的特异性引物CD40-F和 CD40-R，分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，利用引物扩增得到CD40基因的ORF，片段大小为933bp。切胶回收目的条带并纯化产物。将产物连接至 pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经BLAST同源性分析表明，目的产物确为CD40基因的cDNA序列片段。

4、CD40胞外段的cDNA序列的扩增

通过分析，发现CD40拥有跨膜结构域，根据所获得的CD40基因的ORF序列，设计用于扩增CD40胞外段的特异引物CD40EC-F和CD40EC-R，分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，扩增得到498bp的序列，通过测序验证，所得序列确为CD40胞外段的cDNA。

实施例2重组质粒pEGFP-CD40EC的构建及其验证

根据CD40胞外段cDNA序列的两端序列合成一对引物，上游引物 (pEGFP-CD40EC-F:5’-CGGAATTCATGGGAGACAAAAGGTGC-3’)含有Xho I切割位点，下游引物(pEGFP-CD40EC-R:

5’-GGGGTACCACAAACTGCATCACTT TTATTG-3’)含有BamH I切割位点。以含有CD40基因ORF片段的pMD-18T质粒为模板，进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在498bp左右。将PCR扩增产物克隆至表达载体pEGFP-N1 上，得到重组表达载体pEGFP-N1-CD40EC(图1)。

实施例3过表达罗非鱼CD40胞外段增强罗非鱼抗链球菌

将从鱼场购买的罗非鱼放置于养殖桶中暂养，平均体重为50±1克，饲养于实验室内，每日按时投喂饲料，并每天观察罗非鱼的健康状况。

将含有空质粒pEGFP-N1的菌液和含pEGFP-N1-CD40EC质粒的菌液，分别接种于含Kana⁺的液体LB培养基中28℃震荡培养过夜，次日按1:100的比例扩大培养，待菌液OD₆₀₀为2.0～3.0时，提取质粒。质粒提取按照Endo-Free PlasmidMaxi Kit 无内毒素大提质粒试剂盒(OMEGA公司)说明书进行。利用Qubit3.0测定质粒的浓度，分别将质粒稀释至100ng/μL。

将健康无病的罗非鱼90尾，随机分为3组，每组30尾，通过腹腔注射进行免疫。分组情况如下：对照组A：腹腔注射PBS组；对照组B：腹腔注射空质粒pEGFP-N1组；实验组C：腹腔注射重组质粒pEGFP-N1-CD40EC组。其中对照组 A注射100μL的PBS溶液，对照组B和实验组C注射10μg质粒(溶于100μL无菌PBS)。免疫一周后，每组随机取三条鱼，取新鲜脾脏组织，利用4％多聚甲醛溶液进行固定。利用冷冻切片及荧光显微镜验证pEGFP-N1和pEGFP-N1-CD40EC在罗非鱼体内的表达情况。结果如图2示，pEGFP-N1和pEGFP-N1-CD40EC在罗非鱼体内成功表达。

将无乳链球菌划线培养在BHI平板上(温度28℃)，然后挑取单菌落接种到 BHI液体培养基中，振荡培养，离心弃上清，PBS洗涤并重悬菌液，然后取一定量菌液，利用分光光度计测定OD₆₀₀值，PBS稀释菌液浓度为1.0×10⁷cfu/mL。免疫接种后第7天，从三组实验鱼中每组随机抽取25尾，每尾腹腔注射0.1mL 1.0×10⁷cfu/mL的活菌悬液进行攻毒，攻毒后每天观察并记录各组鱼发病和死亡情况，连续观察14天，对死鱼进行解剖和病原分离鉴定，确定是否因为无乳链球菌感染致死。实验结束后统计各组的死亡率。

结果表明，当无乳链球菌攻毒后，实验组及对照组罗非鱼，在15天内都出现了不同程度的死亡，相继死亡的时间集中在攻毒后的2-9天，然后情况基本稳定。通过对部分发病鱼的症状观察，以及病灶组织分离，确定了死亡原因的确是因为注射了无乳链球菌而引起鱼体感染发病。死亡率计算结果显示：实验组A的累计死亡率为36％，实验组B的累计死亡率为24％；而实验组C的累计死亡率为8％。结果如图3所示，过表达罗非鱼CD40胞外段可以增强罗非鱼抗链球菌的能力。实施例4重组质粒pEGFP-N1-CD40EC对降低罗非鱼体内无乳链球菌的影响

在攻毒一周后，从三组实验鱼中随机取3条，表面消毒后，取其脾脏组织，各加入100μL的PBS，随后利用组织研磨器将脾脏组织研磨破碎制成组织悬液，梯度稀释组织悬液，涂布于BHI平板上(温度28℃)，过夜培养，进行菌落计数。随机挑取各平板上的单菌落，利用链球菌特异性性引物(F:5’-AAGCGTGTA TTCCAGATTTCCT-3’；R:5’-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’)进行PCR检测，测序显示所分离的菌落确为无乳链球菌，且实验组C中所分离到的无乳链球菌明显少于对照组，约为对照组A的百分之0.45，如图4所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海洋大学深圳研究院；深圳义海生物科技有限公司

<120> CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用

<130> 无

<140> 2020104336746

<141> 2020-05-21

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）

<400> 1

atgggagaca aaaggtgcaa agaagatgag ttcaagtcta atgggcgctg ctgtcaacgc 60

tgtaaagcag gagagtacgt gaggacaccg tgtgatggca caaaaaagac cgagtgtgcc 120

aaatgtgaat atgggtccta catagactct cacaatcatg gggacaaatg ccatccctgc 180

aagcaatgcc ttctcagtaa caaacagcag acattcaatc aatgcaaagc tgatgcaaac 240

acagtgtgca agtgtttgcc aggttcctac tgcaacaatg ccgaatgtga acactgcctg 300

cctgtaactc actgccaagt gggtgaaggg gtcaagactc caggcaatgg cacgaataac 360

gtaatctgtg ctccatgtgg aaaggggacc ttcagcaacg taacagatta cgagtcaccc 420

tgtaaacctc acaccagatg tgaggactat ggaagagtgc tgaaaatccc aggagacaat 480

aaaagtgatg cagtttgtgg aaacttcaaa tctgattgtc actgggtgtt gccagcaggt 540

ttgtggtcag ggctcgtgtt gaccgcaatc gtcatcgcgt tgatttgcat cctttggcga 600

aaaaaatgca aatcgcacag agcagctcga tccagtattt gtgttactcc ggtagcagtg 660

gttcccattc cagatgtgat gcctcgagag gagccttctt actgccaaga aacctgcatc 720

atgtccgact gcaagttacc aatttttaat gaagatgatt cattggtcat tacccgcaca 780

gaggacacct tgaacaccag cctccccata actccactga aggcttccgt ttcctttgtc 840

gactccagtc acacgaatgg aaacgcgggt tactgcaaca acttcttcag gtcgcaatcc 900

gagccgcagg aggacgagta ctgtgggaca taa 933

<210> 2

<211> 498

<212> DNA

<213> 尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）

<400> 2

atgggagaca aaaggtgcaa agaagatgag ttcaagtcta atgggcgctg ctgtcaacgc 60

tgtaaagcag gagagtacgt gaggacaccg tgtgatggca caaaaaagac cgagtgtgcc 120

aaatgtgaat atgggtccta catagactct cacaatcatg gggacaaatg ccatccctgc 180

aagcaatgcc ttctcagtaa caaacagcag acattcaatc aatgcaaagc tgatgcaaac 240

acagtgtgca agtgtttgcc aggttcctac tgcaacaatg ccgaatgtga acactgcctg 300

cctgtaactc actgccaagt gggtgaaggg gtcaagactc caggcaatgg cacgaataac 360

gtaatctgtg ctccatgtgg aaaggggacc ttcagcaacg taacagatta cgagtcaccc 420

tgtaaacctc acaccagatg tgaggactat ggaagagtgc tgaaaatccc aggagacaat 480

aaaagtgatg cagtttgt 498

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

atgggagaca aaaggtgcaa agaag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ttatgtccca cagtactcgt cctcc 25

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atgggagaca aaaggtgc 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

acaaactgca tcacttttat tg 22

Claims (9)

1.CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，表达CD40蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。

3.包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，表达CD40蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD40蛋白为CD40蛋白胞外段。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。

8.CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体在制备抵御罗非鱼抗链球菌感染的制品中的应用。

9.CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体在制备降低罗非鱼体内的链球菌载量的制品中的应用。

Images