CN111588732A

CN111588732A - 岩藻多糖在抗新型冠状病毒中的应用

Info

Publication number: CN111588732A
Application number: CN202010561812.9A
Authority: CN
Inventors: 朱蓓薇; 宋爽; 董秀萍; 王立龙; 董玉婷; 启航; 艾春青; 邓安福; 温成荣
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-08-28

Abstract

本发明公开了岩藻多糖在抗新型冠状病毒中的应用，属于生物医学技术领域。本发明证实了岩藻多糖能够通过与SARS‑CoV‑2病毒表面的S蛋白结合，防止机体细胞的细胞膜对SARS‑CoV‑2病毒进行吸附和内化，从而阻止SARS‑CoV‑2病毒感染机体细胞，这表明岩藻多糖具有预防和治疗新型冠状病毒所致肺炎的效果。岩藻多糖可制备吸入剂，进入鼻腔、气管、肺部，防止病毒感染机体组织，用于预防和治疗新型冠状病毒；岩藻多糖加入护手乳液配方，可增加护手乳液抗新型冠状病毒的效果；岩藻多糖制成的口服液可抑制SARS‑CoV‑2病毒从消化系统侵入，起到预防和辅助治疗新型冠状病毒所致肺炎的作用，并具有清除幽门螺杆菌、降血脂、减肥、改善肠道菌等作用。

Description

岩藻多糖在抗新型冠状病毒中的应用

技术领域

本发明涉及岩藻多糖在抗新型冠状病毒中的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)，正式分类命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，简称新冠病毒(novel coronavirus)。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

新冠病毒通过皮肤黏膜进入体内后，通过病毒表面的刺突蛋白(简称S蛋白)，与细胞上的血管紧张素转化酶酶2(简称ACE2)受体结合，然后细胞膜将对病毒进行吸附和内化，病毒进入细胞质后脱壳，释放基因组。基因组被释放入细胞质以后，病毒的RNA会与宿主细胞的核糖体结合，翻译出两组蛋白质，紧接着，蛋白质水解酶会把这两组蛋白质切开，生成病毒继续组装、复制的酶和蛋白质。新生成的酶包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，它的作用就是复制形成新的病毒RNA。新的病毒RNA将和水解酶产生的蛋白质结合，组装成新的病毒，释放出原宿主细胞，继续感染其它细胞。

根据新冠病毒的染病机理，抗新冠病毒药物的研发主要从两方面入手，一是阻止病毒和宿主细胞结合，作用靶点为S蛋白或者ACE2；二是阻止新病毒在宿主细胞内的产生，作用靶点为RdRp或者蛋白质水解酶。

岩藻多糖又称为岩藻聚糖硫酸酯、褐藻糖胶、褐藻多糖硫酸酯等，主要来源于褐藻，是一类含有岩藻糖和硫酸基团的多糖，此外，还可能会含有其他单糖(甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸等)。岩藻多糖具有清除幽门螺杆菌、降血脂、减肥、改善肠道菌群等多种功效。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是缺乏有效抑制新型冠状病毒的物质。

[技术方案]

本发明提供了岩藻多糖在抗新型冠状病毒中的用途，所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒SARS-CoV-2。所述的抗新型冠状病毒是指预防或治疗新型冠状病毒所致肺炎，包括与 SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白结合、阻止SARS-CoV-2病毒侵入机体细胞。岩藻多糖的这种用途可用于制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物、食品、日化产品。

所述岩藻多糖来源于褐藻。

所述岩藻多糖的硫酸基含量为20％～35％，总糖为含量45％～65％，岩藻糖在单糖组成中的比例大于30％或岩藻糖含量大于20％。

本发明提供了岩藻多糖在制备用于预防或治疗冠状病毒感染的药物中的用途，所述药物以岩藻多糖为抑制冠状病毒进入机体细胞的活性成分。

所述药物还包括药学上可以接受的辅料，包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

所述药物的剂型可以是：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、搽剂、喷鼻剂、泡腾片、含漱剂、散剂、乳剂、混悬剂、溶液剂。

本发明提供了岩藻多糖在制备用于防护冠状病毒感染的防护用品中的用途，所述的防护用品包括：护手乳液、洗手液、漱口水。

所述岩藻多糖来源于褐藻。

本发明提供了利用泡叶藻岩藻多糖制备冠状病毒感染防护用品的方法，是在制备防护用品的过程中加入岩藻多糖。

本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的吸入剂的制备方法，在无菌环境中，分别用 8～50倍量的纯净水将30～50克氯化钠、70～120克枸橼酸、70～120克枸橼酸钠、0.5～2克苯扎氯铵搅拌溶解；用500mL的纯净水将5～20克岩藻多糖搅拌溶解；合并以上溶液后，用纯净水稀释至5～20升，用0.5微米滤膜过滤后，罐装。

本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的口服液的制备方法，取1～2公斤枸杞子、1～2 公斤桂圆加12～20升水煮开，文火保持0.5～3小时，过滤取滤液，浓缩至8～15升，加入40～100 克岩藻多糖，8～16克果胶，500～1000克蜂蜜，搅拌均匀，自然冷却，静置2～6小时，使沉淀完全；采用压滤取滤液，添加500～1500克白糖、35～80克柠檬酸、3～10克食盐、15～60克维生素C混匀，以硅藻土加压过滤，再经孔径为5微米和0.5微米的两级微孔滤膜过滤，再将滤液进行巴士杀菌(70～90摄氏度，20～50分钟)，即可罐装。

本发明提供了一种用于预防冠状病毒感染的护手乳液的制备方法，护手乳液的配方如下，以质量比计：油相：3～6份硬脂酸，1～4份硬脂酸单甘酯，1～5份棕榈酸异丙酯，1～4份凡士林，5～10份白矿油，1～4份十六醇，0.1～0.5份香精，0.1～0.4份尼泊金甲酯，0.1～0.4份尼泊金丙酯；水相：5～10份甘油，0.1～0.5份尿素囊，0.1～0.4份二甲基对氯苯酚，0.5～1份三乙醇胺，0.05～0.5份岩藻多糖，65～75水；

将油相(硬脂酸、硬脂酸单甘酯、棕榈酸异丙酯、凡士林、白矿油、十六醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)加热搅拌溶解；将岩藻多糖溶于水中，再加入甘油和三乙醇胺，加热搅拌溶解；然后在剧烈搅拌下将水相慢慢倒入油相；均质器处理后，开始加热搅拌，冷却至45～55℃时加入尿囊素、二甲基对氯苯酚和香精，继续搅拌冷却至25～35℃时出料；陈放2～3天没有变化，检验合格后包装。

[有益效果]

本发明提供了岩藻多糖的新用途，岩藻多糖在0.01mg/mL及以上浓度能够通过与SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白结合，防止机体细胞的细胞膜对SARS-CoV-2病毒进行吸附和内化，从而阻止SARS-CoV-2病毒感染机体细胞，达到预防和治疗新型冠状病毒所致肺炎的效果。

岩藻多糖外用有保湿作用，食用岩藻多糖具有清除幽门螺杆菌、降血脂、减肥、改善肠道菌群等作用，外用和口服均对人体有益无害。因此，岩藻多糖可制备吸入剂(喷鼻剂)，进入鼻腔、气管、肺部，防止病毒的感染机体组织，用于预防和治疗新型冠状病毒；岩藻多糖加入护手乳液配方，可增加护手乳液抗新型冠状病毒的效果，预防新型冠状病毒感染；岩藻多糖制成的口服液可抑制SARS-CoV-2病毒从消化系统侵入，起到预防和辅助治疗新型冠状病毒所致肺炎的作用，并具有清除幽门螺杆菌、降血脂、减肥、改善肠道菌等作用。

岩藻多糖来源于食物、无毒性，用于防治新冠病毒时，无毒副作用。

附图说明

图1不同浓度的泡叶藻岩藻多糖对新冠病毒的抑制作用，横坐标：泡叶藻岩藻多糖的浓度，纵坐标：感染细胞率(％)＝进入细胞的病毒数量/总病毒数量×100。

图2将SARS-CoV-2病毒与不同浓度的岩藻多糖混合处理后的细胞免疫荧光图。岩藻多糖的浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6μg/mL。阴性对照为空白培养基。

具体实施方式

实施例1制备泡叶藻(褐藻)岩藻多糖

泡叶藻岩藻多糖的制备方法如下：

S1、将泡叶藻(Ascophyllum nodosum)洗净、沥干、自然风干、粉碎并过80目筛，得泡叶藻粉A；

S2、将步骤S1所述泡叶藻粉A置于25℃无水乙醇中浸泡4h，纱布过滤取沉淀A，将所述沉淀A置于25℃无水乙醇中搅拌4h，纱布过滤取沉淀B，将所述沉淀B置于25℃无水乙醇中浸泡4h，纱布过滤取沉淀C室温晾干，从而除去脂类及脂溶性小分子，得泡叶藻粉B；其中，所述泡叶藻粉A、沉淀B和本步骤所述无水乙醇的重量体积比均为1:4g/mL；

S3、取步骤S2所述泡叶藻粉B，加入pH＝5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，搅拌混匀，50℃水浴振荡酶解4h，使岩藻多糖解离，后加热至98℃，保持10分钟以钝化酶活，所得混合物于4500r/min室温离心15min，取上清液；其中，所述泡叶藻粉B和所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量体积比为1:30g/mL；所述泡叶藻粉B、纤维素酶(比酶活100units/mg)、果胶酶(比酶活50units/mg)和木瓜蛋白酶(比酶活2units/mg) 的重量比为12500:42:6:6；

S4、向步骤S3所述上清液中边搅拌边加入过量的CaCl₂，于4500r/min室温离心15min，将褐藻胶沉淀除去，取上清液；使用的步骤S3的上清液和CaCl₂体积重量比是20:1mL/g；

S5、向步骤S4所述上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，使岩藻多糖沉淀，将所得混合物在4500r/min室温离心15min收集沉淀，将沉淀溶解于3mol/L CaCl₂溶液中，再加无水乙醇，4℃放置24h，使岩藻多糖沉淀，4500r/min、4℃离心15min，收集沉淀；使用的步骤S4的上清液和CTAB体积重量比是50:1mL/g；所述沉淀和所述3mol/L CaCl₂溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述CaCl₂溶液和所述无水乙醇的体积比为2:3；

S6、将步骤S5所述沉淀用体积分数为80％的乙醇洗涤3次，再使用体积分数为95％乙醇洗沉淀3次，室温晾干，超纯水溶解，使用分子量3500Da的透析袋自来水流水透析24小时，然后使用超纯水作为透析液透析48小时，除去岩藻多糖中含有的氯化钙及其它盐离子，其中每2小时换透析液，在真空度为1pa和温度为-60℃的条件下冻干72小时，得到泡叶藻岩藻多糖(ANP)；所述沉淀和所述体积分数为80％的乙醇溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述沉淀和所述体积分数为95％的乙醇溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述沉淀和所述超纯水的重量体积比是1:150g/mL。

本实施例还可以包括溶液配制、超纯水的制备等前处理步骤。

实施例2确定实施例1所制备的泡叶藻岩藻多糖的结构特性和组成

具体方法如下：

采用明胶比浊法进行泡叶藻岩藻多糖硫酸基含量的测定；

采用BCA法进行泡叶藻岩藻多糖蛋白含量的测定；

采用间羟基联苯法进行泡叶藻岩藻多糖糖醛酸含量的测定；

采用苯酚硫酸法进行泡叶藻岩藻多糖总糖含量的测定；

采用凝胶渗透色谱法进行泡叶藻岩藻多糖分子量的测定；

采用高效液相色谱+PMP衍生化法进行泡叶藻岩藻多糖单糖组成的测定；

采用傅里叶红外光谱法进行泡叶藻岩藻多糖官能团的测定。

结果表明，泡叶藻岩藻多糖的分子量为490kDa；糖醛酸含量为2.9～3.2％；蛋白含量为 3.8～4.0％；硫酸基含量为28～30％；总糖含量为54％；所述褐藻岩藻多糖的单糖组成为：摩尔比为6.5:1.1:1的岩藻糖、甘露糖和半乳糖；官能团包括羟基、羧基和硫酸基等官能团。

实施例3验证泡叶藻岩藻多糖阻止SARS-CoV-2病毒侵入机体细胞的用途

将编码HCoV-19刺突蛋白的基因的全长序列克隆到pCAGGS载体用于假病毒的生产，所得到的重组载体称为pCAGGS-HCoV-19-S。通过DNA测序确认pCAGGS-HCoV-19-S构建成功。将pCAGGS-HCoV-19-S和pNL4-3的质粒共转染到HEK 293T细胞，培养48h后，收集含有SARS-CoV-2假病毒模型的上清液，并通过感染Huh7细胞确定假病毒的50％组织细胞感染量(TCID₅₀)。

使用该SARS-CoV-2假病毒模型评价泡叶藻岩藻多糖的抗新型冠状病毒的作用，具体步骤如下：

(1)选择生长状态良好的Huh7细胞，胰酶消化后，96孔铺板，培养过夜，至18-24h时细胞达到80-100％；

(2)每孔100TCID₅₀假病毒，与含有泡叶藻岩藻多糖的无血清培养基混合，混合后泡叶藻岩藻多糖的终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL，37摄氏度孵育30min。EK1肽作为阳性对照，空白无血清培养基作为阴性对照。

(3)以PBS洗涤Huh7细胞去除血清后，用3倍倍比稀释病毒与泡叶藻岩藻多糖的混合物感染Huh7细胞，每个孔100μL，每个样品设置三个平行孔，4-6h后，补加含有5％FBS 血清的培养基100μL。

(4)48h测定Luciferase值。参考Promega公司Luciferase Assay SystemProtocol或 Dual Luciferase Reporter Assay System Protocol。具体操作：倒扣96孔板，用PBS洗2遍，确保吸干PBS，然后加入30μL的裂解液，常温裂解30min，吸出10μL于白板上，底物50μL，测定luciferase值。

如下表1所示，泡叶藻岩藻多糖在浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL时，都能够有效的抑制SARS-CoV-2病毒感染细胞。

表1

又进一步采用相同实验方法检测了多个浓度的泡叶藻岩藻多糖对新冠病毒的抑制作用，计算了IC50值。结果如图1所示，泡叶藻岩藻多糖抑制新冠病毒的IC50为0.327mg/mL。

而且，由于所使用的模型为仅具有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒，可以推出泡叶藻岩藻多糖的作用靶点为S蛋白。

实施例4泡叶藻岩藻多糖喷鼻剂的制备方法

在无菌环境中，分别用10倍量的纯净水将40克氯化钠、100克枸橼酸、100克枸橼酸钠、 1克苯扎氯铵搅拌溶解。用500mL的纯净水将10克泡叶藻岩藻多糖搅拌溶解。合并以上溶液后，用纯净水稀释至10升，用0.5微米滤膜过滤后，罐装。

实施例5泡叶藻岩藻多糖护手乳液的制备方法

护手乳液的配方如下表2：

表2

成分	比例	成分	比例
				油相		水相
硬脂酸	5	甘油	6
				硬脂酸单甘酯	2	尿囊素	0.3
棕榈酸异丙酯	3	二甲基对氯苯酚	0.1
				凡士林	2	三乙醇胺	0.7
白矿油	8	泡叶藻岩藻多糖	0.1
				十六醇	2	水	70.4
香精	0.3
				尼泊金甲酯	0.2.
尼泊金丙酯	0.1

将油相(硬脂酸、硬脂酸单甘酯、棕榈酸异丙酯、凡士林、白矿油、十六醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)加热搅拌溶解。将泡叶藻岩藻多糖溶于水中，再加入甘油和三乙醇胺，加热搅拌溶解。然后在剧烈搅拌下将水相慢慢倒入油相。均质器处理后，开始加热搅拌，冷却至50℃时加入尿囊素、二甲基对氯苯酚和香精，继续搅拌冷却至30℃时出料。陈放2～3天没有变化，检验合格后包装。

实施例6泡叶藻岩藻多糖口服液的制备方法

具体如下：

取1.6公斤枸杞子、1.6公斤桂圆加16升水煮开，文火保持1小时，过滤取滤液，浓缩至12升，加入60克泡叶藻岩藻多糖，12克果胶，840克蜂蜜，搅拌均匀，自然冷却，静置 3小时，使沉淀完全。采用压滤取滤液，添加910克白糖、52克柠檬酸、6.5克食盐、26克维生素C混匀，以硅藻土加压过滤，再经孔径为5微米和0.5微米的两级微孔滤膜过滤，再将滤液进行巴士杀菌(80摄氏度，30分钟)，即可罐装。

实施例7购买的商品化岩藻多糖的组成分析与抗新冠病毒研究

参考中华人民共和国水产行业标准SC/T 3404-2012，测得青岛明月海藻集团有限公司的商品化岩藻多糖中硫酸基含量为28.5±0.1％，总糖含量为63.2±2.6％，岩藻糖含量为36.9±3.8％。

将SARS-CoV-2真病毒(来源于第二军医大学)和岩藻多糖用含有5％胎牛血清的DMEM 培养基混匀，37摄氏度放置1小时，加入提前12小时接种Vero E6细胞的96孔板(加入以前吸除原细胞培养液)，培养24小时，然后用免疫荧光检测病毒蛋白，DAPI染色细胞核。采用免疫荧光显微镜观测了终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/mL的岩藻多糖对病毒的抑制作用，结果如图2所示，在浓度范围15.6～500μg/mL浓度范围内，岩藻多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.岩藻多糖在制备用于治疗或预防冠状病毒感染的药物或日化用品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括新型冠状病毒SARS-CoV-2。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗或预防冠状病毒感染，包括岩藻多糖与SARS-CoV-2表面的S蛋白结合、阻止SARS-CoV-2病毒侵入机体细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述岩藻多糖来源于褐藻。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可以接受的辅料；所述药物的剂型包括：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、搽剂、喷鼻剂、泡腾片、含漱剂、散剂、乳剂、混悬剂、溶液剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的日化用品包括：护手乳液、洗手液、漱口水。

7.用于治疗或预防冠状病毒感染的药物或吸入剂或喷鼻剂或护手乳液或洗手液或漱口水，其特征在于，以岩藻多糖为抑制冠状病毒进入机体细胞的活性成分。

8.一种用于预防冠状病毒感染的吸入剂，其特征在于，在无菌环境中，分别用8～50倍量的纯净水将30～50克氯化钠、70～120克枸橼酸、70～120克枸橼酸钠、0.5～2克苯扎氯铵搅拌溶解；用500mL的纯净水将5～20克岩藻多糖搅拌溶解；合并以上溶液后，用纯净水稀释至5～20升，微滤后，罐装。

9.一种用于预防冠状病毒感染的口服液，其特征在于，取1～2公斤枸杞子、1～2公斤桂圆加12～20升水煮开，文火保持0.5～3小时，过滤取滤液，浓缩至8～15升，加入40～100克岩藻多糖，8～16克果胶，500～1000克蜂蜜，搅拌均匀，自然冷却，静置2～6小时，使沉淀完全；采用压滤取滤液，添加500～1500克白糖、35～80克柠檬酸、3～10克食盐、15～60克维生素C混匀，以硅藻土加压过滤，再经两级微孔滤膜过滤，再将滤液进行巴士杀菌，即可罐装。

10.一种用于预防冠状病毒感染的护手乳液，其特征在于，护手乳液的配方如下，以质量比计：

油相：3～6份硬脂酸，1～4份硬脂酸单甘酯，1～5份棕榈酸异丙酯，1～4份凡士林，5～10份白矿油，1～4份十六醇，0.1～0.5份香精，0.1～0.4份尼泊金甲酯，0.1～0.4份尼泊金丙酯；水相：5～10份甘油，0.1～0.5份尿素囊，0.1～0.4份二甲基对氯苯酚，0.5～1份三乙醇胺，0.05～0.5份岩藻多糖，65～75水。