CN111575167A - 一种核酸检测设备及其使用方法 - Google Patents
一种核酸检测设备及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111575167A CN111575167A CN202010445936.0A CN202010445936A CN111575167A CN 111575167 A CN111575167 A CN 111575167A CN 202010445936 A CN202010445936 A CN 202010445936A CN 111575167 A CN111575167 A CN 111575167A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- layer
- detection
- nucleic acid
- detecting apparatus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 106
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 113
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 74
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000001993 wax Substances 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 3
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001012 protector Effects 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 2
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000553 indicators and reagents Substances 0.000 description 1
- 208000037801 influenza A (H1N1) Diseases 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明解决了目前核酸检测设备不能便携或者集成度不高，检测流程复杂、耗时长、检测人员要求高的问题，提供了一种简单便携、快速、低成本进行有效检测的设备以及该设备的使用方法，一种核酸检测设备，其特征在于，由多层结构集成的一体化结构，具体包括：加样层；通道层；检测层；所述的加样层、通道层、检测层为多孔纤维材料，所述的加样区、转样区、通道、样品检测区、阴性对照孔为亲水区且以外区域均为疏水的屏障区；所述的加样层、通道层、检测层依次集成；一种核酸检测设备的使用方法，具体使用步骤如下：制备样品溶液；加样；观测。
Description
技术领域
本发明涉及即时检测技术领域，具体涉及一种核酸检测设备及其使用方法。
背景技术
流行性疾病尤其是病毒性流行性疾病如人类免疫缺陷病毒（HIV），寨卡病毒（ZIKV），甲型流行性感冒（H1N1），新型冠状病毒（SARS-CoV-2）等正在世界范围内威胁着人类的健康。针对流行性疾病最有效的防治措施则是早检测，早诊断。
目前临床用于流行性疾病的病原体检测主要是基于核酸扩增的基因诊断技术，如聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增 (LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等。这些技术的主要实施流程主要包括从样品中提取核酸，纯化核酸，扩增核酸，检测信号，这往往需要特定的实验室，熟练的实验人员以及昂贵的实验仪器，且通常也很费时。为了在更大范围内对病原体进行检测，尤其是资源匮乏的地区或人流量较大的区域，发明人认为，为了对流行性疾病进行更有效的防治，我们需要建立成本更低，操作更简洁的检测设备/方法。
微流控芯片技术作为新兴的技术，目前已逐渐向集成化的方向发展，将其应用于核酸检测技术中，会带来重要的革新。其中，纸基微流体芯片加工简单，成本低廉、轻便易携、可生物降解，其多孔结构可进行自发地毛细孔虹吸作用无需额外流体驱动力，可以作为良好的核算检测平台，目前已有多种不同设计的纸基芯片应用于核酸检测中。但是，暂时还没有高度集成一体化的装置，通常需要核酸提前进行提取纯化，需要提前混合扩增试剂或者后续添加反应试剂，扩增反应与信号检测分离，这些缺陷均会限制其使用环境，且对使用人员能力要求较高。发明人基于对微流控技术的研究经验与学术基础，建立了一种具有高度的集成化，轻便、简单的核酸检测设备，其可以实现更快速、更方便的核酸检测。
发明内容
本发明解决了目前核酸检测设备不能便携或者集成度不高，检测流程复杂、耗时长、检测人员要求高的问题，提供了一种简单便携、快速、低成本进行有效检测的设备以及该设备的使用方法。
根据本发明的第一个方面，提供了一种核酸检测设备，其特征在于，由多层结构集成的一体化结构，具体包括：
加样层，中间为加样区；
通道层，中间为转样区，所述转样区与至少两条狭长通道相连，所述转
样区与所述的加样区大小、位置一致；
检测层，至少包括一个样品检测孔以及至少一个阴性对照孔，所述的样品检测孔、阴性对照孔与所述的通道末端相连，所述的样品检测孔包括LAMP扩增反应试剂、指示剂、目标检测物的引物，所述的阴性对照孔区别于所述样品检测孔的部分是不含有所述的目标检测物的引物；
所述的加样层、通道层、检测层为多孔纤维材料，孔径为0.2-30μm，所述的加样区、转样区、通道、样品检测区、阴性对照孔为亲水区且以外区域均为疏水的屏障区；
所述的加样层、通道层、检测层依次集成。
进一步的，所述多孔纤维材料包括亲水性的滤纸，或者是由以下一种或多种组成的滤膜：醋酸纤维素、硝酸纤维素、混合纤维素；所述的疏水的屏障区包括以下一种或多种材料：石蜡、聚羟基丁酸脂。
进一步的，所述的检测层还包括：至少一个的阳性对照孔，所述的阳性对照孔与所述的样品检测孔的区别是增加了目标核酸的阳性对照物，所述的阳性对照孔为亲水性区域，所述的阳性对照孔与所述的通道末端相连。
进一步的，还包括两层保护层，分别与所述的加样层和所述的检测层的自由面固定在一起，所述的保护层为透明塑料疏水薄膜，所述的透明塑料疏水薄膜包括以下的一种或者多种：PP、PET、醋酸酯。
进一步的，所述的多层结构的集成方式包括：胶粘、针钉，所述的加样区与所述的转样区的形状包括：圆形、椭圆形、正方形、菱形。
进一步的，所述的通道的宽度为1-8mm，所述的核酸检测设备的尺寸为10-60mm。
进一步的，所述的LAMP扩增反应试剂包括：DNA扩增酶，RNA逆转录酶、dNTPs，MgSO4，Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, Triton X-100, MnCl2，所述的指示剂包括：荧光探针、PH敏感型指示剂、钙黄绿素。
进一步的，所述的加样层、通道层和检测层是用热腊打印加工而成的，具体方法是：
步骤一：用CAD软件进行结构设计；
步骤二：使用热腊打印机打印；
步骤三：置于120℃环境加热5分钟使蜡融化并向下渗透整张滤纸，其无腊区域构成亲水区。
根据本发明的第二个方面，提供了一种核酸检测设备的使用方法，其特征在于，用到权利要求1-4任意一项的核酸检测设备，具体使用步骤如下：
（1）制备样品溶液：
将待检样品浸泡/混合于无酶水、生理盐水、细胞裂解液中形成样
品溶液；
（2）加样：
将样品溶液滴加在核酸检测设备的加样区，待液滴被全部吸收后，将设
备置于65℃的加热装置中进行恒温加热；
（3）观测：
每10 min对检测层进行观察比对，直至获得比对结果。
进一步的，所述的待检样品包括：拭子样品、血液样品、尿液样品，所述的细胞裂解液包括：Triton，尿素，SDS，甲酰胺。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明的核酸检测设备高度集成，集纯化、扩增、检测为一体，只
需一次加样，即可完成检测；
（2）检测设备使用时只需要对样品进行配液处理即可，因此，只需要配
备生理盐水/细胞裂解液即可，无需实验室环境和操作熟练的检测员；
（3）检测速度快，实验室检测一般要半天左右，本发明的检测设备作为
POCT设备的一种，可以实现快速检测，最快30min即可获得结果；
（4）材料环保，反应试剂、检测试剂均集成在设备上，检测时不需要再
额外配置试剂，也可以减少试剂的污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图
图1为本发明实施例4的核酸检测设备的示意图。
具体符号说明：
1-第一保护层；2-加样层；3-通道层；4-检测层；5-第二保护层。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1：
核酸检测设备，设备包括加样层、通道层、检测层，其按照顺序集成在一起，形成一体化的结构。其中，加样层的中间有一个加样区；通道层的中间为转样区，转样区连接出来至少两条的狭长通道，另外需要注意的是，转样区与加样区大小、上下位置一致，可以完全重合在一起；检测层，至少包括一个样品检测孔以及至少一个阴性对照孔，样品检测孔、阴性对照孔与加样层通道末端相连，样品检测孔包括LAMP扩增反应试剂、指示剂、目标检测物的引物，阴性对照孔区别于所述样品检测孔的部分是不含有目标检测物的引物。加样层、通道层、检测层为多孔纤维材料构成，纤维孔径0.2-30μm，加样区、转样区、通道、样品检测区、阴性对照孔均为亲水区且以外区域均为疏水的屏障区。LAMP扩增反应试剂可以选择以下的一种：DNA扩增酶，RNA逆转录酶、dNTPs，MgSO4，Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, Triton X-100,MnCl2，指示剂可以选择以下的一种：荧光探针、PH敏感型指示剂、钙黄绿素。
多孔纤维材料作为亲水的材料，经过图案设计跟加工做成亲水区和疏水区，疏水区作为屏障，避免液体溶液流动到亲水区以外的区域，通过将三层多孔纤维材料处理成特定的图案进行叠加组合，构建一条液体样品流动的渠道，即可实现样品通过加样区、转样区、通道分别流入样品检测孔和阴性对照孔，检测孔跟对照孔均含有扩增试剂和指示剂，不同的是检测孔含有引物，最后通过对比样品检测孔和隐形对照孔的检测结果即可确定阴性/阳性。
多孔纤维的亲水区因其多孔结构可进行自发地毛细孔虹吸作用无需额外流体驱动力，即可完成加样区的样品进入转样区后沿着通道进入检测层的样品检测孔和阴性对照孔；此外在溶液样品流动的整个过程中，样品溶液中尺寸较大的杂质如细胞碎片等会被滤纸纤维吸附过滤，从而达到核酸纯化的效果。据本领域技术人员的知识和经验，凡是能够达到上述效果的多孔纤维均能得到检测结果；只要能够在多孔纤维材料上制造出疏水区的材料均可选择。多孔材料可以选择亲水性的滤纸、醋酸纤维素滤膜、硝酸纤维素滤膜、混合纤维素滤膜；疏水区的材料可以选择石蜡、聚羟基丁酸脂。至于扩增反应试剂和指示剂的选择可以根据具体的病毒核酸特性结合文献以及经验选择合适的。
实施例2：
为了实验结果更加准确，在实施例1的基础上检测层增加了至少一个的阳性对照孔，阳性对照孔与样品检测孔的区别是增加了目标核酸的阳性对照物，阳性对照孔为亲水性区域，且同样与通道末端相连。
实施例3：
为了使用方便、保护样品，在实施例1加样层的上面增加第一保护层，在检测层的下面增加第二保护层，第一、第二保护层是疏水的透明塑料薄膜，可以方便溶液样品流动以及检测层的对比效果观察。
实施例4：
使用核酸检测设备检测zikv病毒。
（1）核酸检测设备的制作与组装
如附图1所示，设备有五层，尺寸为30mm，第一层为第一保护层1和第五层为第二保护层5，两者均是透明疏水的PDMS薄膜。
第二层为加样层2、第三层为通道层3和第四层为检测层4，第一至第五层按照顺序依次胶粘在一起，加样层2、通道层3和检测层4均采用醋酸纤维素的滤膜通过热蜡打印加工而成，其中，醋酸纤维素的滤膜孔径是15μm，具体方法是：使用CAD软件进行结构设计，然后使用热蜡打印机进行蜡印，最后将滤膜置于120 ℃环境加热5分钟使蜡融化并向下渗透整张滤纸。所得到的无蜡的亲水区构成了加样区，微通道以及反应区，其余部分则是有蜡的疏水区。
加样层2加工后中间有一圆形的加样孔，周边为石蜡区；通道层3亲水部分包括两个部分，一是中间同样有一圆形的加样孔，且大小、位置一致，组装完成后，上下重叠在一起，二是通道层的周围包括三条狭长通道，通道的宽度为4mm；检测层4的亲水部分是样品检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔，检测层4的亲水部分与通道层3的通道末端是连在一起的。
检测层4的样品检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔，均通过冻干法固定有不同的反应试剂，具体成份如下：
样品区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉，引物混合物；
阴性对照区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉；
阳性对照区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉，引物混合物，病毒标准品，
其中，引物混合物包括：
F3（正向外引物）：5'-CGGATGGGATAGGCTCAAAAAA-3'
B3（反向外引物）：5'-ATGGACCTCCCGTCCTTG-3'，
FIP（正向内引物）：
5'- CCTGAGGGCATGTGCAAACCTAGAATGGCAGTCAGTGGAGAT-3'
BIP（反向内引物）：
5'-ACCCTCAACTGGATGGGACAACTGGAGCTTGTTGAAGTGGTG-3
LoopF（正向环引物）：5'-CATCAATTGGCTTCACAACGC-3
LoopB（反向环引物）环引物：5'- GGGAAGAAGTTCCGTTTTGCTC-3'。
（2）使用核酸检测设备进行检测的方法
S1：将检测样品为zika RNA标样与血液样品混合得到样品溶液；
S2：揭开第一保护层1PDMS膜，将样品溶液滴加至第二层的加样区，待溶液被完全吸收以后，重新粘贴PDMS膜；
S3：15分钟以后，将设备至于加热板上，加热板温度设置为68 ℃，加热30分钟后倒置观察检测层4的颜色变化。
（3）实验结果
样品检测孔为黄色，阴性对照孔为红色，阳性对照孔为黄色，说明样品为阳性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种核酸检测设备，其特征在于，由多层结构集成的一体化结构，
具体包括：
加样层，中间为加样区；
通道层，中间为转样区，所述转样区与至少两条狭长通道相连，所述转
样区与所述的加样区大小、位置一致；
检测层，至少包括一个样品检测孔以及至少一个阴性对照孔，所述的样品检测孔、阴性对照孔与所述的通道末端相连，所述的样品检测孔包括LAMP扩增反应试剂、指示剂、目标检测物的引物，所述的阴性对照孔区别于所述样品检测孔的部分是不含有所述的目标检测物的引物；
所述的加样层、通道层、检测层为多孔纤维材料，孔径为0.2-30μm，所述的加样区、转样区、通道、样品检测区、阴性对照孔为亲水区且以外区域均为疏水的屏障区；
所述的加样层、通道层、检测层依次集成。
2.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述多孔纤维
材料包括亲水性的滤纸，或者是由以下一种或多种组成的滤膜：醋酸纤维素、硝酸纤维素、混合纤维素；所述的疏水的屏障区包括以下一种或多种材料：石蜡、聚羟基丁酸脂。
3.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述的检测层
还包括：至少一个的阳性对照孔，所述的阳性对照孔与所述的样品检测孔的区别是增加了目标核酸的阳性对照物，所述的阳性对照孔为亲水性区域，所述的阳性对照孔与所述的通道末端相连。
4.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，还包括两层保
护层，分别与所述的加样层和所述的检测层的自由面固定在一起，所述的保护层为透明塑料疏水薄膜，所述的透明塑料疏水薄膜包括以下的一种或者多种：PP、PET、醋酸酯。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸检测设备，其特征在于，所述
的多层结构的集成方式包括：胶粘、针钉，所述的加样区与所述的转样区的形状包括：圆形、椭圆形、正方形、菱形。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸检测设备，其特征在于，所述
的通道的宽度为1-8mm，所述的核酸检测设备的尺寸为10-60mm。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸检测设备，其特征在于，所述
的LAMP扩增反应试剂包括：DNA扩增酶，RNA逆转录酶、dNTPs，MgSO4，Tris-HCl, KCl,(NH4)2SO4, Triton X-100, MnCl2，所述的指示剂包括：荧光探针、PH敏感型指示剂、钙黄绿素。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸检测设备，其特征在于，所述
的加样层、通道层和检测层是用热腊打印加工而成的，具体方法是：
步骤一：用CAD软件进行结构设计；
步骤二：使用热腊打印机打印；
步骤三：置于120℃环境加热5分钟使蜡融化并向下渗透整张滤纸，其无腊区域构成亲水区。
9.一种核酸检测设备的使用方法，其特征在于，用到权利要求1-4任意
一项的核酸检测设备，具体使用步骤如下：
（1）制备样品溶液：
将待检样品浸泡/混合于无酶水、生理盐水、细胞裂解液中形成样
品溶液；
（2）加样：
将样品溶液滴加在核酸检测设备的加样区，待液滴被全部吸收后，将设
备置于65℃的加热装置中进行恒温加热；
（3）观测：
每10 min对检测层进行观察比对，直至获得比对结果。
10.根据权利要求9所述的核酸检测设备的使用方法，其特征在于，所
述的待检样品包括：拭子样品、血液样品、尿液样品，所述的细胞裂解液包括：Triton，尿素，SDS，甲酰胺。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010445936.0A CN111575167A (zh) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | 一种核酸检测设备及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010445936.0A CN111575167A (zh) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | 一种核酸检测设备及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111575167A true CN111575167A (zh) | 2020-08-25 |
Family
ID=72123449
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010445936.0A Pending CN111575167A (zh) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | 一种核酸检测设备及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111575167A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416632A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-09-21 | 上海交通大学 | 一种可燃环保的核酸检测微型集成装置 |
| CN114609388A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-06-10 | 广州华澳生物科技有限公司 | 微流控免疫检测方法及装置 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009228091A1 (en) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | President And Fellows Of Harvard College | Three-dimensional microfluidic devices |
| CA2872915A1 (en) * | 2012-05-09 | 2013-11-14 | The Governors Of The University Of Alberta | Solid gel amplification method and apparatus for platform molecular diagnostics |
| CN104293945A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-01-21 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法 |
| CN104583226A (zh) * | 2012-07-25 | 2015-04-29 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 通过图案化转移片材的试剂靶向递送 |
| CN107384769A (zh) * | 2017-08-24 | 2017-11-24 | 李峰 | 基于纸的核酸检测装置及其应用 |
| CN108486262A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-09-04 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种检测肺炎支原体的lamp引物组合物、试剂盒及其方法 |
-
2020
- 2020-05-25 CN CN202010445936.0A patent/CN111575167A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009228091A1 (en) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | President And Fellows Of Harvard College | Three-dimensional microfluidic devices |
| CA2872915A1 (en) * | 2012-05-09 | 2013-11-14 | The Governors Of The University Of Alberta | Solid gel amplification method and apparatus for platform molecular diagnostics |
| CN104583226A (zh) * | 2012-07-25 | 2015-04-29 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 通过图案化转移片材的试剂靶向递送 |
| CN104293945A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-01-21 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法 |
| CN107384769A (zh) * | 2017-08-24 | 2017-11-24 | 李峰 | 基于纸的核酸检测装置及其应用 |
| WO2019038706A2 (en) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Brock University | PAPER-BASED MOLECULAR DIAGNOSTIC DEVICE AND USES THEREOF |
| CN108486262A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-09-04 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种检测肺炎支原体的lamp引物组合物、试剂盒及其方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王菊英: "《海洋生态环境监测技术方法培训教材 化学分册》", 30 September 2018, 海洋出版社 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416632A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-09-21 | 上海交通大学 | 一种可燃环保的核酸检测微型集成装置 |
| CN114609388A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-06-10 | 广州华澳生物科技有限公司 | 微流控免疫检测方法及装置 |
| CN114609388B (zh) * | 2022-05-11 | 2022-07-19 | 广州华澳生物科技有限公司 | 微流控免疫检测方法及装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11986820B2 (en) | Point-of-care diagnostic methods using capillary-action microfluidic devices | |
| KR102310223B1 (ko) | 랩온페이퍼칩을 포함하는 구조물에 적용하기 위한 세포용해용 조성물 | |
| US11904314B2 (en) | System and self-metering cartridges for point of care bioassays | |
| US11007519B2 (en) | Chip structure for multiple molecular diagnoses | |
| CN111575167A (zh) | 一种核酸检测设备及其使用方法 | |
| KR20230062345A (ko) | 페이퍼 미세유체칩 용 왁스 베리어, 이를 포함하는 랩온페이퍼를 이용한 진단 방법 | |
| CN105483293A (zh) | 烈性传染病病原体检测引物组及试剂盒 | |
| US20240181444A1 (en) | Multiplex devices and methods for pathogen detection | |
| KR20200013932A (ko) | 종이기반 핵산검출용 키트 및 pcr 증폭산물을 분석하기 위한 방법 | |
| CN111575354A (zh) | 一种核酸检测设备及其使用方法 | |
| US20230235312A1 (en) | Detection method using lateral-flow paper chip capable of multi-nucleic acid colorimetric detection with one-step | |
| US11898197B2 (en) | System and self-metering cartridges for point of care bioassays | |
| Mahdavi et al. | Design and fabrication of multiplex microfluidic LAMP PCR for simultaneous detection of opportunistic protozoa | |
| KR102437064B1 (ko) | 측방 유동성의 일체형 시스템에 기반으로 정제 및 검출이 동시에 이루어지는핵산 검출용 랩-온-페이퍼 플랫폼 | |
| CN213951203U (zh) | 快速核酸检测系统及装置 | |
| CN113025474A (zh) | 恒温核酸扩增反应管及其应用 | |
| US20250001417A1 (en) | At-Home Covid Nucleic Acid Detection Kit for Rapid Molecular Diagnostics | |
| US20230046974A1 (en) | Detection method using paper chip capable of multi-nucleic acid colorimetric detection with one-step | |
| US20230285965A1 (en) | Microfluidic device for detecting nucleic acids | |
| US20230126580A1 (en) | Apparatus and method for rapid monitoring of pathogens in water | |
| CN112899143B (zh) | 一种用于遗传毒性评估的集成化三维折纸器件与应用 | |
| CN113512606A (zh) | 基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒及检测方法 | |
| US20250389715A1 (en) | Point-of-care bioassay systems and methods of making and using the same | |
| US12428674B2 (en) | System and self-metering cartridges for point of care bioassays | |
| US20250034631A1 (en) | Systems and methods for nucleic acid extraction and visual detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200825 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |