CN111574617A - 一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽及其制备方法，属于胶原蛋白肽制备技术领域。胶原蛋白肽的制备方法包括：预处理、碱处理、加压热处理、过滤除毛除脂、酶水解和灭酶、脱色除味过滤和喷雾干燥等步骤。本发明用碱处理的方法使得到的胶原蛋白肽的等电点在5以下，酰胺化度在5％以下；通过碱处理‑酶水解的方法，有效剪切大分子链，最完整地保留了有效的氨基酸基团和多肽链，分子量为3000～6000Da的胶原蛋白肽的含量占75％以上，得到的多肽具有生物活性，胶原蛋白肽的纯度可达到95％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽及其制备方法，属于胶原蛋白肽制备技术领域。
背景技术
人在25岁左右胶原蛋白的合成最为旺盛，随着年龄的增大，胶原蛋白的合成量逐年减少，到60岁时胶原蛋白的含量只有年轻时的50％，胶原蛋白的减少造成身体结缔组织的抵抗力下降，骨胶原代谢出现异常，从而导致慢性的骨科病，如关节痛、关节炎、风湿性关节炎和骨质疏松症等。
胶原蛋白肽可以减轻骨关节炎(osteoarthritis，OA)症状，并能修复骨关节损伤或减缓退行性变，无副作用。胶原蛋白肽能刺激关节软骨产生Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、黏多糖、蛋白多糖，抑制软骨细胞损害，减轻骨关节炎患者关节疼痛和改善关节功能。胶原蛋白肽还能增加成骨细胞的数量和分化，减少破骨细胞介导的骨吸收。此外，胶原蛋白富含甘氨酸及一般较少存在于其他蛋白质中的脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸，因其特有的羟脯氨酸具有将血液中的钙输送到骨细胞的运载功能，而活性胶原蛋白则是羟基磷酸钙黏合剂，所以钙能较快地到达骨骼部位沉淀而成新的骨骼分子，从而提高骨密度，增强骨强度，防止骨质疏松，同时对关节炎症等骨病都有较好的预防和治疗效果。
近年来，国内外企业为了改善中老年人骨质疏松症，在原保健食品壮骨粉的基础上添加适量的胶原蛋白肽，因胶原蛋白肽中的羟脯氨酸能将血液中的钙送到骨骼中沉积，而达到增加骨骼、增强骨密度的效果，同时由于活性胶原蛋白对水和脂肪的共溶性可起到很好的稳定作用，两者能起到相得益彰的效果。国外研究表明，高纯度的胶原蛋白能治疗由于缺钙引起的早期骨质疏松，分子量3000～6000Da的胶原蛋白能有效地改善和抑制骨密度的下降，维持骨的机能。但现有技术中，制备得到的胶原蛋白肽存在以下问题：分子量低，多在1000Da以下，多以游离氨基酸或寡肽的形式存在；纯度较低，含盐量较高；无生物活性，只作为氨基酸的营养剂补充；氨基酸的种类较少，甘氨酸、羟脯氨酸/脯氨酸和谷氨酸含量较低。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种专门针对防治老年人骨关节炎、骨质疏松的胶原蛋白肽，将不同的皮肤原料(牛、猪或鱼)用碱处理、酶水解、脱色除味、透析沉淀、过滤等方式处理后，得到具有生物活性、纯度高的胶原蛋白肽。
本发明的技术方案如下：
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)预处理：将湿皮片剔除表面长毛，刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用，所述皮片是牛、猪或鱼的皮片；鱼的种类为罗非鱼、河豚鱼、鳕鱼中的一种或多种。
(2)碱处理：将预处理后的皮片，用NaOH水溶液浸泡，浸泡后，用纯化水清洗皮片至中性；所述NaOH水溶液的质量浓度为0.3％～1％，浸泡时间为0.5～2h；
(3)加压热处理：将碱处理后的皮片浸泡在纯化水中，置于高压灭菌锅中，加压热处理；
(4)过滤除毛除脂：将高温高压处理后的皮片过滤除毛及杂质，然后4～10℃冷藏12～24h，过滤除脂肪，得到皮胶质；
(5)酶水解和灭酶：将皮胶质投入到水解酶液中，37℃～50℃下酶解0.5～2h，酶解结束，升温至85℃以上使酶灭活，得到酶解液；
(6)脱色除味过滤：待酶解液冷却至室温后，加入活性炭粉末，常温下，摇晃脱色除味；再用活性炭过滤器过滤除炭，至溶液澄清透明；
(7)喷雾干燥，制得所述胶原蛋白肽。
步骤(2)中，NaOH水溶液的质量浓度为0.5％～0.7％；料液比为1:5～1:10g/mL(优选1:8g/mL)；皮片浸泡时间为1～1.5h。
步骤(3)中，皮片与纯化水的料液比为1:5～1:10g/mL，优选1:8g/mL。
步骤(3)中，压力为0.05～0.1MPa，优选0.08MPa；温度为110℃～130℃，优选115℃～120℃；热处理时间为1～3h，优选1.5～2h。
步骤(5)中，水解酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶的一种或多种。所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、地衣芽孢杆菌中性蛋白酶、淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶、大豆曲霉菌中性蛋白酶的一种或多种。
步骤(5)中，水解酶液的质量浓度为0.5％～2％，优选1％；酶解温度为40～45℃；酶解时间为1～1.5h，酶解pH为2～8，酶解pH优选6～7。
步骤(6)中，活性炭的用量为使其在酶解液中的质量浓度为0.5％～2％，优选1％；脱色时间为4～12h，优选6～8h。
利用本发明提供的制备方法制得的胶原蛋白肽，其有益效果在于：
本发明最完整地保留了有效的氨基酸基团和多肽链，分子量为3000～6000Da的胶原蛋白肽的含量占70％以上(国外研究表明，高纯度的胶原蛋白能治疗由于缺钙引起的早期骨质疏松，分子量3000～6000Da的胶原蛋白能有效地改善和抑制骨密度的下降，维持骨的机能)；
本发明通过脱色除味、透析沉淀、过滤的方式去除杂质，提高纯度，所得胶原蛋白肽的纯度达到95％以上，盐含量极低，炽灼残渣含量在0.5％～1％；
本发明通过高温高压热处理的方式脱毛脱脂，区别于传统的化学方式脱脂，避免化学试剂(如乙醇、乙醚、丙酮的残留)，也避免引入脂肪酶等杂蛋白，影响最终胶原蛋白肽的纯度。
本发明胶原蛋白肽完整保留了有效氨基酸基团的多肽链，肽链上含有十几个至几十个氨基酸，细胞表面的位点能特异识别特殊的氨基酸片段，从而发挥生物活性，促进细胞增殖、分化；
本发明胶原蛋白肽含有9种必需氨基酸中的8种，其中甘氨酸、羟脯氨酸/脯氨酸和谷氨酸含量非常高，占氨基酸总量的50％以上；
本发明胶原蛋白肽可简单且低成本高效地掺入到功能性食品和饮料、营养护肤品和膳食补充剂中，且不影响产品的味道或气味。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例1制得的胶原蛋白肽分子量分布图。
具体实施方式
本发明的工艺流程图如图1所示。下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将湿牛皮用剃毛器提取表面长毛，用刮刀尽量刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用。
(2)将预处理完成的牛皮100g，用1000mL NaOH水溶液(质量浓度0.5％)浸泡，浸泡时间为1h，浸泡后，用纯化水清洗牛皮至中性。
(3)将牛皮浸泡在纯化水中(料液比1:5g/mL)，置于高压灭菌锅中，115℃、0.05MPa下加压热处理3h。
(4)然后趁热用滤布袋过滤除毛和杂质，4℃冷藏12h，纱布过滤除脂肪，制得牛皮胶质。
(5)将牛皮胶质，用2M HCl溶液调节pH至6.0±0.2，加入1％(以牛皮胶质的干品计)的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，50℃下，酶解50min，酶解结束，升温至85℃使酶灭活，得到酶解液。
(6)待酶解液冷却至室温后，加入2％的活性炭粉末，常温下，80rpm下摇晃6h，脱色结束，用活性炭过滤器(0.22μm滤膜)过滤除炭，至溶液澄清透明。最后喷雾干燥即得胶原蛋白肽。
实施例2
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将湿猪皮用剃毛器提取表面长毛，用刮刀尽量刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用。
(2)将预处理完成的猪皮100g，用800mL NaOH水溶液(质量浓度0.6％)浸泡，浸泡时间为1.2h，浸泡后，用纯化水清洗猪皮至中性。
(3)将猪皮浸泡在纯化水中(料液比1:6g/mL)，置于高压灭菌锅中，118℃、0.1MPa下加压热处理2.5h。
(4)然后趁热用滤布袋过滤除毛和杂质，6℃冷藏18h，纱布过滤除脂肪，制得猪皮胶质。
(5)将猪皮胶质，用2M HCl溶液调节pH至7.0±0.2，加入0.5％(以猪皮胶质的干品计)的胰蛋白酶和0.5％的无花果酶，45℃下，酶解1h，酶解结束，升温至85℃使酶灭活，得到酶解液。
(6)待酶解液冷却至室温后，加入1％的活性炭粉末，常温下，80rpm下摇晃7h，脱色结束，用活性炭过滤器(0.22μm滤膜)过滤除炭，至溶液澄清透明。最后喷雾干燥即得胶原蛋白肽。
实施例3
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将湿鱼皮，清洗干净后切成碎片，冷冻备用。
(2)将预处理完成的鱼皮100g，用500mL NaOH水溶液(质量浓度0.5％)浸泡，浸泡时间为0.5h，浸泡后，用纯化水清洗鱼皮至中性。
(3)将鱼皮浸泡在纯化水中(料液比1:10g/mL)，置于高压灭菌锅中，120℃、0.05MPa下加压热处理2h。
(4)然后趁热用滤布袋过滤除杂质，8℃冷藏24h，纱布过滤除脂肪，制得鱼皮胶质。
(5)将鱼皮胶质，用2M HCl溶液调节pH至6.5±0.2，加入0.5％(以鱼皮胶质的干品计)的木瓜蛋白酶和1％的地衣芽孢杆菌中性蛋白酶，40℃下，酶解1.5h，酶解结束，升温至85℃使酶灭活，得到酶解液。
(6)待酶解液冷却至室温后，加入2％的活性炭粉末，常温下，80rpm下摇晃10h，脱色结束，用活性炭过滤器(0.22μm滤膜)过滤除炭，至溶液澄清透明。最后喷雾干燥即得胶原蛋白肽。
实施例4
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将湿牛皮用剃毛器提取表面长毛，用刮刀尽量刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用。
(2)将预处理完成的牛皮100g，用600mL NaOH水溶液(质量浓度0.7％)浸泡，浸泡时间为1h，浸泡后，用纯化水清洗牛皮至中性。
(3)将牛皮浸泡在纯化水中(料液比1:8g/mL)，置于高压灭菌锅中，115℃、0.08MPa下加压热处理3h。
(4)然后趁热用滤布袋过滤除毛和杂质，10℃冷藏18h，纱布过滤除脂肪，制得牛皮胶质。
(5)将牛皮胶质，用2M HCl溶液调节pH至6.0±0.2，加入0.5％(以牛皮胶质的干品计)的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和0.5％的地衣芽孢杆菌中性蛋白酶，50℃下，酶解1.5h，酶解结束，升温至85℃使酶灭活，得到酶解液。
(6)待酶解液冷却至室温后，加入1％的活性炭粉末，常温下，80rpm下摇晃12h，脱色结束，用活性炭过滤器(0.22μm滤膜)过滤除炭，至溶液澄清透明。最后喷雾干燥即得胶原蛋白肽。
实施例5
一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)将湿猪皮用剃毛器提取表面长毛，用刮刀尽量刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用。
(2)将预处理完成的猪皮100g，用1000mL NaOH水溶液(质量浓度0.6％)浸泡，浸泡时间为2h，浸泡后，用纯化水清洗猪皮至中性。
(3)将猪皮浸泡在纯化水中(料液比1:5g/mL)，置于高压灭菌锅中，118℃、0.1MPa下加压热处理3h。
(4)然后趁热用滤布袋过滤除毛和杂质，4℃冷藏24h，纱布过滤除脂肪，制得猪皮胶质。
(5)将猪皮胶质，用2M HCl溶液调节pH至7.5±0.2，加入0.5％(以猪皮胶质的干品计)的胰蛋白酶、0.5％的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和0.5％的木瓜蛋白酶，50℃下，酶解50min，酶解结束，升温至85℃使酶灭活，得到酶解液。
(6)待酶解液冷却至室温后，加入1.5％的活性炭粉末，常温下，80rpm下摇晃8h，脱色结束，用活性炭过滤器(0.22μm滤膜)过滤除炭，至溶液澄清透明。最后喷雾干燥即得胶原蛋白肽。
测试例1
各实施例制得的胶原蛋白肽的等电点、酰胺化度、蛋白含量及羟脯氨酸含量见表1。由表1可知，本发明用碱水解的方法使得到的胶原蛋白肽的等电点在5以下，酰胺化度在5％以下，不同于酸水解的方法得到的胶原蛋白肽等电点在6以上，酰胺化度在15％以上。
表1
测试例2
实施例1条件下制得的胶原蛋白肽的分子量分布见表2和图2。通过计算可以知道，分子量为3 000～6 000Da的胶原蛋白肽的含量占75％以上，说明本发明通过碱处理-酶水解的方法，有效剪切大分子链，最完整地保留有效的氨基酸基团和多肽链。其他实施例的分子量分布如表3所示。
表2
| 保留时间 | Mn | Mw | MP | 面积 | ％面积 | |
| 1 | 13.017 | 12491 | 12939 | 9988 | 2262557 | 7.65 |
| 2 | 13.849 | 6725 | 6986 | 6275 | 6674710 | 22.57 |
| 3 | 14.943 | 3770 | 3858 | 3406 | 7035799 | 23.79 |
| 4 | 15.167 | 2516 | 2551 | 3007 | 4509520 | 15.25 |
| 5 | 17.015 | 1355 | 1424 | 1071 | 4320451 | 14.61 |
| 6 | 17.133 | 761 | 786 | 1003 | 3104047 | 10.50 |
| 7 | 18.998 | 322 | 336 | 354 | 1586662 | 5.37 |
| 8 | 20.792 | 135 | 137 | 130 | 77239 | 0.26 |
表3
| 试样M<sub>w</sub> | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| ＞13.5kDa | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7.5-13.5kDa | 6.65％ | 7.73％ | 7.19％ | 10.20％ | 10.02％ |
| 3.5-7.5kDa | 47.36％ | 47.11％ | 39.46％ | 41.56％ | 45.41％ |
| 1.4-3.5kDa | 29.86％ | 27.45％ | 32.05％ | 31.3％ | 28.2％ |
| 0.5-1.4kDa | 10.5％ | 10.22％ | 13.34％ | 10.81％ | 9.94％ |
| ＜0.5kDa | 5.63％ | 7.50％ | 7.96％ | 6.12％ | 6.42％ |
| 平均分子量 | 4082Da | 4507Da | 3773Da | 4454Da | 4559Da |
测试例3
各实施例制得的胶原蛋白肽的部分性能指标见表4。本发明提供的胶原蛋白肽可简单且低成本高效地掺入到功能性食品和饮料、营养护肤品和膳食补充剂中，且不影响产品的味道或气味。
表4
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，所述胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
(1)预处理：将湿皮片剔除表面长毛，刮掉脂肪层，清洗干净后切成碎片，冷冻备用，所述皮片是牛或猪或鱼的皮片；
(2)碱处理：将预处理后的皮片，用NaOH水溶液浸泡，浸泡后，用纯化水清洗皮片至中性；所述NaOH水溶液的质量浓度为0.3％～1％，浸泡时间为0.5～2h；
(3)加压热处理：将碱处理后的皮片浸泡在纯化水中，置于高压灭菌锅中，加压热处理；
(4)过滤除毛除脂：将高温高压处理后的皮片过滤除毛及杂质，然后4～10℃冷藏12～24h，过滤除脂肪，得到皮胶质；
(5)酶水解和灭酶：将皮胶质投入到水解酶液中，37℃～50℃下酶解0.5～2h，酶解结束，升温至85℃以上使酶灭活，得到酶解液；
(6)脱色除味过滤：待酶解液冷却至室温后，加入活性炭粉末，常温下，摇晃脱色除味；再用活性炭过滤器过滤除炭，至溶液澄清透明；
(7)喷雾干燥，制得所述胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(2)中，NaOH水溶液的质量浓度为0.5％～0.7％；料液比为1:5～1:10g/mL；皮片浸泡时间为1～1.5h。
3.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(3)中，皮片与纯化水的料液比为1:5～1:10g/mL。
4.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(3)中，压力为0.05～0.1MPa；温度为110℃～130℃；热处理时间为1～3h。
5.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(5)中，水解酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、地衣芽孢杆菌中性蛋白酶、淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶、大豆曲霉菌中性蛋白酶的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(5)中，水解酶液的质量浓度为0.5％～2％；酶解温度为40～45℃；酶解时间为1～1.5h，酶解pH为2～8。
8.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(6)中，活性炭的用量为使其在酶解液中的质量浓度为0.5％～2％；脱色时间为4～12h。
9.根据权利要求1所述的防治老年人骨质疏松的胶原蛋白肽，其特征在于，步骤(1)中，鱼的种类为罗非鱼、河豚鱼、鳕鱼中的一种或多种。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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