CN111560033A - 一种光控释化合物的合成方法及在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

一种光控释化合物的合成方法，该先导化合物由BODIPY母核和苯丁酸氮芥构成，在同一分子结构中集光控释药、光动力治疗与化疗于一体。本发明还公开了在肿瘤治疗中的应用。本发明中的先导化合物结构简单、分子量小，具有确定的化学结构，易于制备、纯化和进一步修饰，且对小鼠毒性低等显著特点满足临床用药的基本要求。通过体外内实验证明，该先导化合物在可见光辐射下具有精准控释化疗药物苯丁酸氮芥，且光辐射时间与释药量成正相关关系，实现了单分子通过光刺激精准释放化疗药物及单线态氧，并且实现了活体肿瘤的化疗/光动力疗法的协同治疗。因此，本发明涉及的光控释化疗协同光动力治疗的先导化合物在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。

Description

一种光控释化合物的合成方法及在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及一种光控释化合物的合成方法及在肿瘤治疗中的应用，属于医药化工合成领域。

背景技术

目前，癌症已经成为威胁人类健康的重大疾病之一。因此，有效的预防和治疗癌症一直是医药学研究领域重点关注的课题。当前，临床用于肿瘤的治疗包括化学治疗、手术治疗、光动力治疗及放射治疗等[Zhou J,Yu G,Huang F.Chemical Society Reviews,2017,46:7021-7053]。在这些治疗方案中，化疗是目前临床肿瘤治疗的主体，然而单一化疗药物由于生物利用度低、毒副作用大、易产生多药耐药，尤其在肿瘤后期或发生转移时，不能满足临床治疗要求，因此临床上常采用联合用药的方式。化疗药物联合使用能够产生增加或协同作用，提高治疗效果；而且由于化疗药物作用机制不同，可在一定程度上预防多药耐药的产生。但化疗联合治疗并不能解决传统化疗药所固有的缺点，如特异性差、非期望的药动学和生物分布等，使得化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时对正常组织也造成严重损害；且联合治疗对癌症的治疗作用不一定是协同作用，也有可能是拮抗作用，从而导致毒副作用增强，很多患者因不能耐受不得不终止治疗，大大限制了联合治疗在临床的应用[Parhi P,Mohanty C, Sahoo S K.Drug Discovery Today,2012,17:1044-1052；张波, 张娜.中国新药杂志,2014,23:2514-2520]。因此，迫切需要提高抗癌药物与其他治疗方案联合治疗的“智能”控释性。

刺激响应型药物释放能实现药物的定时、定位释放，被称是一种无创、高效的个性化“智能”给药新方式，有望实现“量体裁衣”的精准释药。它是利用某些环境或条件的因素刺激下，致使物质自身的某些物理或化学性质发生相应改变，进而起到释放药物分子的作用。又有人形象地将其称为“智能物质”或“环境敏感型物质”。智能型刺激响应前药能实现维持稳定的血药浓度、减少给药次数、降低毒副作用等优点，尤其适用毒副作用较大的抗肿瘤药物进行前药设计。因而，具刺激响应的抗肿瘤前药研发是近年来研究抗肿瘤药物的热门领域之一。具刺激响应的抗癌前药设计主要依据癌细胞内环境和一些化学物质受一定外环境影响而发生改变，其又有内源性刺激和外源性刺激两种策略。内源性刺激响应策略包括肿瘤组织的弱酸环境(pH＝5.0～6.0)的pH响应、酶响应、还原谷胱甘肽(GSH) 的氧化-还原响应、葡萄糖响应型等[Liu M G,Du H L,Zhang W J, et al.Materials Science andEngineering:C,2017,71: 1267-1280]。而外源性刺激响应策略主要通过施加外界条件如光激活使化学键断裂、光辐射产生热量致使前药的物理化学性质改变而释放药物，或诸如温度响应型、场响应等策略[张留伟,钱明,王静云.化学学报,2017,75:770-782]。

与内源性刺激响应相比，外源性刺激响应策略具有诸如外界人为可控、不需要组织内部化学环境的变化等优势。其中，光是一种清洁, 无创和有效的刺激源，其已被人类认识并能“随心(智能)”控制。这是由于光作为电磁波，具有波长、强度、光辐射时间及辐射地点等外界人为可控的特点，如将其作为刺激响应释药可望实现定点(可通过光辐射特定组织部位)、定量(可通过光辐射时间、光源强度控制)等的精准“智能”式个性化精准释药。

鉴于光调控的显著优势，研究基于光调控化疗药物以实现化疗药物于靶点的“智能化”精准可控释药具有重要应用意义和临床价值。

发明内容

本发明所要解决的是针对现有临床对未来个性化医疗需求靶向药物、多种疗法联用药物，以克服目前恶性肿瘤诊治领域出现的成像与治疗模式单一、诊治效果差、单一疗法对肿瘤的不敏感性等缺点，实现针对恶性肿瘤原位化疗药物光控释放和光动力治疗与化疗协同治疗的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种光控释化合物的合成方法，包括以下步骤：(i)将4-苯甲酰氯(2mmol)溶解到含100mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，并通入氩气 15min，往圆底烧瓶内加入2,4-二甲基-3-乙基-1H-吡咯4mmol，随后滴入少量三氟乙酸，混合物在室温下搅拌约12h，加入2,3- 二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌4mmol，继续搅拌4h后，再加入10mmol 的三乙胺并继续搅拌15min，于冰浴下缓慢滴加三氟化硼乙醚15 mmol，滴毕，混合物于室温下继续搅拌过夜；反应液用二氯甲烷(15 mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用二氯甲烷/石油醚v:v＝1:7洗脱，得先导化合物中间体BOD-Cl或BOD-OH的橙红色固体粉末；(ii)称取先导化合物中间体BOD-Cl0.25mmol，苯丁酸氮芥0.25mmol溶解于含10mL无水DMF的圆底烧瓶中，再加入碳酸钾，于60℃下反应6h后，经TLC监测反应完毕后，用乙酸乙酯15mL×3萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用乙酸乙酯 /石油醚v:v＝1:7洗脱，得红色粉末先导化合物BOD-BLB，产率45％；，见以下反应路线：

所述光控释化合物为有机小分子，在同一分子结构中具有光控释药、光动力治疗与化疗多个功能，其分子结构由BODIPY母核和苯丁酸氮芥偶联而成；其分子结构中的BODIPY母核为光动力基团；苯丁酸氮芥为化学治疗基团；酯键为光响应基团，其功能结构式如式I所示，

所述光控释化合物用于肿瘤治疗。

采用上述技术方案的有益效果是：

本发明所述的光控释化疗协同光动力治疗的先导化合物能够通过光控制化疗药物释放,并于肿瘤病灶的光动力产生大量ROS，达到光动力治疗和化学治疗协同治疗,有效改善了疗效。

附图说明

图1为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的¹H NMR。

图2为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的¹³C NMR。

图3为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的高分辨质谱图。

图4为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的红外光谱图。

图5为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的紫外-可见吸收光谱图(红线)。

图6为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的荧光光谱图 (红线)。

图7为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物光辐射产生单线态氧(黑色线)。

图8为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在不同光辐射时间下释放苯丁酸氮芥。

图9为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在光刺激下释放苯丁酸氮芥峰面积变化。

图10为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在4T1细胞不同孵育时间下的摄取荧光成像(10×)。

图11为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物对4T1细胞的暗毒性(a全黑)与光毒性(b全黑)。

图12为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物在不同光照时间下对荷瘤小鼠对肿瘤的治疗效果；(a)治疗期间各组荷瘤小鼠的肿瘤体积变化；(b)治疗期间各组荷瘤小鼠体重的变化；(c)第 15天各治疗组离体肿瘤大小；(d)第15天各治疗组在不同光照时间下肿瘤重量的变化(n＝4)。

图13为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物暗室及不同光辐射下的肿瘤组织的H&E染色图像(×40)。

图14为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的荷瘤小鼠主要脏器组织切片的H&E染色图像(×40)。

图15为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物组A、B、C、 D在光辐射15分钟和暗室的血液学参数(n＝4)。

图16为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物组E在光辐射 15分钟和暗室的血液学参数(n＝4)。

图17为本发明所述单分子多功能诊疗联用先导化合物的溶血实验照片。

具体实施方式

下面将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下文所述是对本发明的解释而不是限定。

1、本发明所述光控释化合物的合成方法；

包括以下步骤：(i)将4-苯甲酰氯(2mmol)溶解到含100mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，并通入氩气15min，往圆底烧瓶内加入2,4- 二甲基-3-乙基-1H-吡咯4mmol，随后滴入少量三氟乙酸，混合物在室温下搅拌约12h，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌4mmol，继续搅拌4h后，再加入10mmol的三乙胺并继续搅拌15min，于冰浴下缓慢滴加三氟化硼乙醚15mmol，滴毕，混合物于室温下继续搅拌过夜；反应液用二氯甲烷(15mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用二氯甲烷/石油醚v:v＝1:7洗脱，得先导化合物中间体BOD-Cl或BOD-OH的橙红色固体粉末；(ii)称取先导化合物中间体BOD-Cl0.25mmol，苯丁酸氮芥0.25mmol溶解于含10mL 无水DMF的圆底烧瓶中，再加入碳酸钾，于60℃下反应6h后，经TLC监测反应完毕后，用乙酸乙酯15mL×3萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用乙酸乙酯/石油醚v:v＝1:7洗脱，得红色粉末先导化合物BOD-BLB，产率45％；，见以下反应路线：

2、本发明所述光控释化合物的吸收波长为524nm，荧发射波谱长为542nm，为可见光吸收区。

本发明所述光控释化合物是由BODIPY和苯丁酸氮芥构成，实现同一分子具有光控释药、光动力治疗与化疗多个功能为一体。

将本发明所述光控释化合物用甲醇溶解后，在紫外-可见分光光度计测其吸光度值，在Vary Eclipse荧光分光光度计上测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，结果见图5和图6，其激发波长为524nm，发射波长为542nm,符合可见光荧光染料的光学特征。

3、本发明所述光控释化合物光辐射产生单线态氧。

本发明所述光控释化合物光辐射产生单线态氧是用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)漂白法测试。DPBF与单线态氧可发生定量反应，反应后其在410nm处的吸光度下降。分别取浓度为1×10^-3mol/L的先导化合物中间体50μL刻度具塞比色管中，再向其中加入50μL 浓度为1×10^-3mol/L的DPBF溶液，定容后摇匀。使用524nm的二极管激光灯功率密度为500mW/cm²照射不同时间，测定吸收光谱并记录在410nm的吸光度值。

4、本发明所述光控释化合物体外释药性能。

取少量先导化合物储备液用甲醇水(8:2,v:v)稀释至浓度为20 μmol/L置于进样瓶中，使用激光灯对进样瓶分别照射0min，5 min，10min，20min，30min，40min，50min，60min(λ＝524 nm，500mW/cm²)，随后取10μL进样至高效液相色谱系统，液相条件为：甲醇/水(9:1)做为流动相，流速为0.8mL/min，检测波长为254nm。此外，为了确定先导化合物是只通过光刺激释放苯丁酸氮芥，将先导化合物周期性的进行光照与暗室放置 10分钟，接着将样品进样至高效液相色谱系统，记录先导化合物的峰面积变化。

5、本发明所述光控释化合物细胞成像。

将4T1细胞复苏后，培养在含有10％胎牛血清、1％双抗的RPMI 1640 培养基中，培养环境为37℃、饱和湿度和5％CO₂的二氧化碳培养箱。当细胞生长到对数期时，则可以进行细胞试验。

实验操作：将培养好的4T1细胞用PBS小心清洗2～3遍，加入1mL 胰蛋白酶消化处理，当观察到细胞形态呈现透亮的圆形时，加入3mL 新鲜的RPMI 1640培养基，用一次性消毒吸管小心吹打，使细胞分散均匀，随后将细胞液转移至15mL离心管中，使用低速离心机离心3min(1000r/min)，倒去上清液，再加入新鲜的培养基吹打混匀，用移液枪吸取10μL细胞悬浮液在细胞计数板上，使用细胞计数仪进行计数，再加入培养基将细胞稀释成浓度为5000cell/mL。将此浓度的细胞悬浮液以500μL/孔接种于24孔板中，置于二氧化碳培养箱中孵育24h后，在显微镜下观察到细胞贴壁后，即可加入化合物先导化合物。

将要考察的两种化合物用细胞级DMSO溶解，并用培养基进行稀释，加入到孔板中使化合物的最终浓度为1μmol/L，随后继续放在二氧化碳培养箱中孵育0.5h,1h,3h,6h及12h，当孵育时间到后，小心吸去孔板中的含有化合物的培养基，并用PBS轻轻清洗2遍，再加入少量培养基，将孔板置于荧光显微镜下观察拍照。荧光显微镜的蓝色通道(Bluechannel)的激发片波长为420nm-485nm，发射片波长为515nm，激发出绿色荧光；绿色通道(Green channel) 的激发片波长为460nm-550nm，发射片波长为590nm，激发出红色荧光。

6、本发明所述光控释化合物的细胞光毒性实验。

将培养好的细胞消化、计数完毕后，取100μL/孔细胞悬浮液置于 96孔板中，并设置好调零孔、空白组及加药组。将96孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育24h后，加入化合物，再继续孵育6h，用 524nm的二极管激光灯(500mW/cm²)照射96孔板，10min/孔。照射完后，接着孵育18h，将含有化合物的细胞培养液小心吸出，用 PBS轻轻清洗两遍，再加入含有MTT的培养液，孵育4h，小心吸出培养液，最后在每个孔中加入DMSO 100μL，用酶标仪检测在490nm处的吸光度值。

7、本发明所述光控释化合物的细胞光照依赖性实验。

将光照时间改为0min,5min,10min,15min及20min，其余步骤同上。

8、本发明所述光控释化合物的体内抗肿瘤活性实验。

选取肿瘤小鼠40只，并随机分为10组：①和②空白组：PBS光照组与暗室组；③和④化疗对照组：苯丁酸氮芥光照组与暗室组；⑤和⑥阳性对照组：市售光敏剂Ce 6光照组和暗室组；⑦和⑧对照组： BOD-OH给药光照组与暗室组；⑨和⑩刺激释药组：BOD-CLB光照组与暗室组。接着称量每组每只小鼠的体重并用游标卡尺测量肿瘤的长宽，随后将PBS、苯丁酸氮芥、Ce 6、BOD-OH、BOD-CLB注射100 μL到各组小鼠的肿瘤内，注射的化合物浓度均为2μmol/L，注射完后，将各个光照组使用二极管激光灯(524nm,500mW/cm²)对肿瘤部位照射10分钟，每隔4天注射一次化合物并进行光照，暗室组只注射化合物则不进行光照，每天称量每组小鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤的长宽，总治疗时长为15天。

15天后，将各组小鼠处死，取眼底动脉处血样置于1.5mL EP管中，同时将肿瘤剥离并称重拍照，取小鼠心脏、肝、脾、肺、肾脏、肿瘤按标准方案进行H&E染色切片，切片使用奥林巴斯CX41显微镜观察拍照。

9、本发明所述光控释化合物的体内光依赖性实验。

选取肿瘤小鼠，在瘤内注射100μL浓度为2μmol/L的先导化合物，分别光照5min、15min。其余实验操作与8部分一致。

10、本发明所述光控释化合物的肝肾毒性考察。

将上述取的小鼠眼底动脉血静置30min后，将EP管置于低温高速离心机中，以转速为12000r/min离心15min，取出离心管，用移液枪吸取上清液(血清)于25μL EP管中，将样品送至检验科检验肝功能标记物及肾功能标记物。

11、本发明所述光控释化合物的生物相容性。

取小鼠血液于1.5mL肝素管中，随后，置于低温高速离心机中，以转速为2000r/min离心10min，用移液枪吸去上清液，保留下层的血细胞，加入新配置的PBS，轻轻用移液枪吹打混匀，继续离心，重复上述步骤直到上清液不显出黄色为止。用新配置的PBS将下层血细胞稀释至10mL，随后从中依次取0.2mL加入到以下提前配置好的1mL溶液中，浓度分别为2μmol/L、8μmol/L、32μmol/L、 64μmol/L。加完后，轻轻摇匀，室温下静置2h后照相。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (3)

1.一种光控释化合物的合成方法，包括以下步骤：(i)将4-苯甲酰氯(2mmol)溶解到含100mL二氯甲烷的圆底烧瓶中，并通入氩气15min，往圆底烧瓶内加入2,4-二甲基-3-乙基-1H-吡咯4mmol，随后滴入少量三氟乙酸，混合物在室温下搅拌约12h，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌4mmol，继续搅拌4h后，再加入10mmol的三乙胺并继续搅拌15min，于冰浴下缓慢滴加三氟化硼乙醚15mmol，滴毕，混合物于室温下继续搅拌过夜；反应液用二氯甲烷(15mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用二氯甲烷/石油醚v:v＝1:7洗脱，得先导化合物中间体BOD-Cl或BOD-OH的橙红色固体粉末；(ii)称取先导化合物中间体BOD-Cl0.25mmol，苯丁酸氮芥0.25mmol溶解于含10mL无水DMF的圆底烧瓶中，再加入碳酸钾，于60℃下反应6h后，经TLC监测反应完毕后，用乙酸乙酯15mL×3萃取，无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析，用乙酸乙酯/石油醚v:v＝1:7洗脱，得红色粉末先导化合物BOD-BLB，产率45％；，见以下反应路线：

2.根据权利要求1所述的光控释化合物的应用，其特征在于：所述光控释化合物为有机小分子，在同一分子结构中具有光控释药、光动力治疗与化疗多个功能，其分子结构由BODIPY母核和苯丁酸氮芥偶联而成；其分子结构中的BODIPY母核为光动力基团；苯丁酸氮芥为化学治疗基团；酯键为光响应基团，其功能结构式如式I所示，

3.根据权利要求1所述的光控释化合物的应用，其特征在于：光控释化合物用于肿瘤治疗。

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