CN111568935B - 赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，该应用是将赤苍藤的乙醇提取物及其制剂应用于制备治疗肺癌、宫颈癌、肝癌和/或胃癌的药物。本发明首次将赤苍藤提取物应用于制备抗肿瘤药物技术领域，为治疗和治愈肿瘤提供一种新的途径和手段。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤医药技术领域，具体是一种赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
赤苍藤(学名:Erythropalum scandens Bl.)为铁青树科(Olacaceae)赤苍藤属(Erythropalum)多年生常绿大型木质藤本植物。赤苍藤具有较高的食用、药用及园林绿化观赏价值，主产于云南、贵州、广西、广东等地。赤苍藤根中含酚性成分、树脂及三萜，树脂的主要成分为苏门树脂酸、桂皮酸松柏醇酯。赤苍藤味苦，性平，入肝、肾二经，具有清热利尿的功效，用于肝胆湿热、腹痛、腹泻、尿频、尿急、尿痛、小便不利等症。
至今，对于赤苍藤的研究不是很多，本申请人前期对赤苍藤的化学成分进行了分析并研究了其提取物的利尿作用。在“赤苍藤叶挥发油化学成分分析，《时珍国医国药》2014年第6期”中采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，利用GC-MS联用仪对其化学成分进行了分离鉴定，利用面积归一化法计算出各组分的相对含量。结果，从赤苍藤挥发油共鉴定出36个化合物，占挥发油总量的 81.74％，挥发油中的主要成分是二十七烷 (10.54％)、1-辛烯-3-醇 (10.20％)、环己二烯 (6.29％)、叶绿醇(7.02％)、二十五烷(7.4l％)、二十八烷(5.16％)。在“赤苍藤化学成分的GC-MS分析，《广西中医药》2019年第4期”中采用硅胶柱色谱分离赤苍藤药材乙酸乙酯部位的油状物，对其进行甲酯化反应，采用气相色谱-质谱联用分析技术分析其化学成分。结果：从组分1中鉴定出8个化学成分，主要含十七烷酸甲酯(22.29%)、油酸甲酯(18.29%)；从组分2中鉴定出5个化学成分，主要含有11,14-十八碳二烯酸甲酯(28.95%)、硬脂酸甲酯(21.71%)。在专利申请CN109045081A公开了赤苍藤的提取方法及利尿作用。提取方法为水煎煮法和乙醇回流提取法；赤苍藤粗粉，以水或乙醇为溶剂，料液比5～50倍，浸渍10～200min，置电炉上加热煎煮1～3次，每次30～240min，滤取合并药液，浓缩为赤苍藤水提膏状或醇提膏状。经小鼠试验表明：赤苍藤水提物、赤苍藤醇提物均有显著的利尿作用。
除了本申请人前期的研究外，专利申请CN106581091A公开了赤苍藤的提取方法，包括以下步骤：（1）将赤苍藤根茎洗净，干燥，粉碎至100目以下，按赤苍藤粉重量加入2-3倍的水，加入混合酶，进行酶解，（2）将酶解后的药渣分离；得到赤苍藤酶解液；（3）药渣加入1倍重量的水，浸泡10-30分钟以后压榨取药液，与赤苍藤酶解液合并，药渣作为饲料添加剂或肥料；（4）低温真空浓缩，将第（3）步的合并赤苍藤酶解液浓缩为膏状，得到赤苍藤酶解物。本发明还公开了赤苍藤提取物在作为治疗痛风药物的用途。
专利申请CN106511408A公开了赤苍藤作为治疗前列腺疾病药物的用途。将赤苍藤晒干打粉或者提取物用于治疗男性前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺增生，对前列腺疾病出现的尿频、尿急、尿痛、血尿、排尿困难、尿失禁、尿线分叉、尿后沥滴和夜尿次数增多等症状有显著的效果。
专利申请CN108743634A提供一种民间药食两用赤苍藤的颗粒制备方法，该方法包括备料、水提醇沉、醇提醇沉、混料、制软材、造粒、干燥、整粒等步骤。该方法采用水提和醇提相结合，配合醇沉、浓缩得到水提清膏和醇提清膏，将赤苍藤原料制作成颗粒，提取条件温和，最大限度地保留赤苍藤的有效药用成分，使得有效成分提取更完全、含量更高、稳定性更好，制得的赤苍藤颗粒可药食两用，其中的有效物质可在人体内充分发挥作用，具有改善前列腺和痛风等症状的效果，同时，该方法工艺简单，易于操作，且提取周期短，成本低，适合现有中药厂的生产设备，值得大力推广。
潘乔丹等人在“赤苍藤和密蒙花多糖的含量测定及抗氧化研究，《食品研究与开发》 2016年第22期”采用苯酚一硫酸比色法测定两种药食同源植物赤苍藤和密蒙花多糖的含量，并采 用DPPH法、水杨酸法、ABTS法以及FRAP 法测定其粗多糖的抗氧化性能。结果表明，赤苍藤和密蒙花的多糖含量分别为30.78、190.89mg/g；赤苍藤多糖和密蒙花多糖清除·OH 和ABTS+·的能力均强于VE，其 Fe3+还原/抗氧化能力均强于VE，且赤苍藤多糖的清除DPPH·能力和 Fe3+还原/抗氧化能力均强于VE，密蒙花多糖清除·OH 能力强于Vc。
黄元河等人在“赤苍藤醇提物的急性毒性及对小鼠高尿酸血症的影响，《中国民族民间医药》2017年第5期”采用最大耐受剂量法评价赤苍藤醇提物对小鼠的急性毒性；通过氧嗪酸钾灌胃复制高尿酸血症动物模型，赤苍藤和别嘌醇干预治疗，检测小鼠血清尿酸值和血清肌酐水平。结果：赤苍藤醇提物灌胃小鼠的最大给药量为40.0g (生药)/kg，该剂量对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏均无显著影响。赤苍藤高、中、低剂量醇提物均能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸浓度 (P<0.01)，并能显著抑制高尿酸血症小鼠血清肌酐水平的升高 (P <0.01)。表明：赤苍藤醇提物毒性低，对高尿酸血症小鼠具有良好的治疗作用，对小鼠肾脏具有保护作用，临床用药安全。
许崇摇等人在“赤苍藤茎叶水提物抗痛风作用的实验研究，《中国药房》2019年第30卷第24期”中通过小鼠试验研究了赤苍藤茎叶水提物（ASLE）的抗痛风作用。结果表明ASLE的抗痛风作用可能与促进尿酸代谢、抗炎以及保护或改善肾功能等有关。
以上是关于赤苍藤的现有技术，但从现有技术中可以看出，对于赤苍藤的提取物的用途研究较少，而且至今还没有将赤苍藤提取物应用于抗肿瘤的报道。恶性肿瘤是严重危害人类健康及生命的常见病，其死亡率居各种疾病之首。有研究进展表明，肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，肿瘤细胞过度增殖形成肿瘤，故抑制肿瘤细胞的增殖是治疗肿瘤的有效途径之一，也是抗肿瘤药物的基本要求。虽然最近几十年来已经发现了很多单方或者复方药材或者其提取物具有抗肿瘤作用，但由于肿瘤细胞的类型多，肿瘤的病理复杂，而且现有抗肿瘤药物的药效存在一定的局限，药物长期使用会有副作用或者肿瘤细胞产生耐药性；因此，不断研究和开发新的药物、打破药效局限、降低药物副作用及肿瘤细胞的耐药性仍是治疗和预防肿瘤的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明首次将赤苍藤提取物应用于制备抗肿瘤药物技术领域，为治疗和治愈肿瘤提供一种新的途径和手段。
本发明的技术方案如下：
一种赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述赤苍藤提取物是赤苍藤的乙醇提取物及其制剂；所述的抗肿瘤药物为治疗肺癌、宫颈癌、肝癌和/或胃癌的药物。
所述抗肿瘤是指抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞可选自以下4种：人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901。
所述赤苍藤的乙醇提取物是由赤苍藤经乙醇连续浸渍提取并浓缩后得到的浸膏，提取方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为20～100％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍3-5次，每次4-8天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液；
（2）将以上得到的合并滤液至置于50-60℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于50-60℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
进一步，还能将以上得到的赤苍藤的乙醇提取物加入医学上许可的辅料，制成口服制剂或注射制剂，得到赤苍藤的乙醇提取物制剂。
所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸或口服液体制剂。
本发明的有益效果是：
本发明首次将赤苍藤提取物及其制剂应用于制备抗肿瘤药物的技术领域，为治疗和治愈肿瘤提供一种新的途径和手段。经血清药理学验证，本发明的赤苍藤的乙醇提取物对人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901的增殖均有较为明显的抑制作用，为进一步深入研究赤苍藤抗肿瘤作用机制提供了理论基础，对揭示赤苍藤抗肿瘤有效活性成分研究具有重要意义。
在本发明中，采用浸渍提取法提取赤苍藤，可以尽可能多地浸出赤苍藤中的药效物质，最大限度地减少无效物质和有害成分的浸出，得到的赤苍藤乙醇提取物药效强、毒性低，为本发明中的赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用提供了有力的保障。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1
赤苍藤的乙醇提取物的提取方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为70％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍4次，浸渍时间依次为7天、5天、5天、5天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液。
（2）将以上得到的合并滤液置于55℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于55℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
实施例2
赤苍藤的乙醇提取物的提取方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为20％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍5次，浸渍时间依次为6天、4天、4天、4天、4天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液。
（2）将以上得到的合并滤液置于50℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于50℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
实施例3
赤苍藤的乙醇提取物的提取方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为100％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍3次，浸渍时间依次为8天、6天、6天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液。
（2）将以上得到的合并滤液置于60℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于60℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
实施例4
赤苍藤的乙醇提取物制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为70％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍4次，浸渍时间依次为7天、5天、5天、5天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液。
（2）将以上得到的合并滤液置于55℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于55℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
（3）以上得到的赤苍藤的乙醇提取物加入适量淀粉或微晶纤维素混合均匀，在压片机中压成药片。
应用实施例
采用血清药理学验证实施例1的赤苍藤的乙醇提取物对人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901的增殖影响。
1、试验动物：健康SD大鼠10只，雌性，体重（200±20）g（由广西医科大学动物实验中心提供）。
2、试验肿瘤细胞株：人宫颈癌细胞Hela，人肝癌细胞Bel-7402，人胃癌细胞SGC-7901由广西中药药效研究重点实验室提供；人非小细胞肺癌A549细胞株由广西中医药大学高红伟博士实验室提供。
3、试验试剂：
PBS（SOlarbio公司，批号：20190228），1640不完全培养液（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20190508），DMEM不完全高糖培养液（赛默飞世尔苏州仪器有限公司，批号：8118189），Bio-Life CCK-8细胞活力检测试剂盒（广州博徕斯生物科技有限公司，批号：20180917），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：19010501），青链霉素混合液（100X）（SOlarbio公司，批号：20180927），胰蛋白酶-EDTA消化液（SOlarbio公司，批号：20190430），二甲基亚砜( DMSO，博大泰克公司，批号：1029B038)，胰蛋白酶（Solarbio公司，批号：20190430），0.4%台盼蓝染液（Solarbio公司，批号：C0040），5-氟尿嘧啶（Solarbio公司，批号：711C021），环磷酰胺(CTX,山东西亚化学股份有限公司，批号Z98974）。
4、试验过程：
（1）赤苍藤的乙醇提取物含药血清的制备
将10只健康SD大鼠分为5组，每组2只，给药前，禁食8-12h。设赤苍藤的乙醇提取物低剂量组（187.5mg/kg）、中剂量组(375mg/kg)、高剂量组(750mg/kg)，环磷酰胺(CTX)组(剂量20mg/kg），空白组（生理盐水）；连续灌胃给药3d，2次/d，给药体积1mL/100g；第3天给药后1h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.4mL/100g（400mg/kg），然后于腹主动脉采血；血液置于37℃水浴15min后，在常温下以3000r/min的转速离心15min。小心吸出血清，放置于水浴中56℃灭活30min，用0.22μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，放于冰箱-20℃存放备用。
（2）赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响
人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela使用DMEM完全培养基，人肝癌细胞Bel-7402和人胃癌细胞SGC-7901使用1640完全培养基，将接种了肿瘤细胞株的完全培养基置于37℃、5%CO2满湿度的培养箱中培养。当细胞处于对数生长期、满度为80%以上时，用0.25%胰酶消化，以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液。在人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela的培养基沉淀中分别加入含1%青链霉素混合液的DMEM完全培养液重悬，在人肝癌细胞Bel-7402和人胃癌细胞SGC-7901的培养基沉淀中分别加入含1%青链霉素混合液的1640完全培养液重悬，重悬后使用血球计数板和台盼蓝染色剂染色计数，调整为3.0×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔细胞悬液体积为100μL，在培养板最外围用每孔200mL PBS缓冲液以维持湿度。设置环磷酰胺组（含药血清浓度为10%），5-氟尿嘧啶（5-fu）对照组（用DMSO助溶，终浓度不能超过千分之三，以防止损害细胞，5-氟尿嘧啶终浓度为75μg/mL）和3个不同剂量赤苍藤组（每个剂量分别设3个浓度，含药血清浓度为2.5%、5%、10%），每组6个复孔；肿瘤细胞株接种后，于37℃、5%CO2培养箱孵育24h，弃去原培养液，加入药液或含药血清继续培养，5-氟尿嘧啶对照组加入浓度为75μg/mL的5-氟尿嘧啶药液，各含药组加入相应浓度的含药血清，每孔100μL。继续培养24h，然后按照CCK-8检测法取样检测OD值：每孔加入10μL CCK-8放于37℃培养箱中孵化1-4h染色，然后于450nm处测定OD值，测得各复孔OD值取平均值，计算细胞生长抑制率。
细胞生长抑制率的计算公式：抑制率=（1-给药组OD值/对照组OD值）*100%。
实验数据运用SPSS21.0统计软件进行统计分析，结果以均数±标准差(
)表示，各组间进行比较用t检验，方差不齐时采用t检验校正公式，P<0.05为差异有统计学意义。结果如下[（
)总血清含量均为10%]：
1）赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人肺癌细胞A549增殖的影响
CCK-8法检测赤苍藤的乙醇提取物作用于人肺癌细胞A549在24h时的抑制率，如表1所示，根据t检验得出，各含药组与空白组比较，CTX阳性抑制作用表达弱，苍藤的乙醇提取物低剂量组10%浓度的含药血清的抑制作用明显（P<0.05）；5-氟尿嘧啶组和苍藤的乙醇提取物中、高剂量组10%浓度的含药血清的抑制作用均有显著性差异（P<0.01）；具有统计学意义。
2）赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人宫颈癌细胞Hela增殖的影响
CCK-8法检测赤苍藤的乙醇提取物作用于人宫颈癌细胞Hela在24h时的抑制率，如表2所示，根据t检验得出，各含药组与空白组比较，各浓度对人宫颈癌细胞Hela的抑制作用均有显著性差异（P<0.01），具有统计学意义。
3）赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人肝癌细胞Bel-7402增殖的影响
CCK-8法检测赤苍藤的乙醇提取物作用于人肝癌细胞Bel-7402在24h时的抑制率，如表3所示，根据t检验得出，各含药组与空白组比较，5-氟尿嘧啶组、CTX组、赤苍藤乙醇提取物低剂量组2.5%浓度的含药血清以及赤苍藤乙醇提取物高剂量组2.5%、5%、10%浓度的含药血清的抑制作用均有显著性差异（P<0.01）；赤苍藤的乙醇提取物低剂量组5%、10%浓度的含药血清的抑制作用明显（P<0.05）；具有统计学意义。
4）赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响
CCK-8法检测赤苍藤的乙醇提取物作用于人胃癌细胞SGC-7901在24h时的抑制率，如表4所示，根据t检验得出，各含药组与空白组比较，赤苍藤乙醇提取物中剂量组2.5%、10%浓度的含药血清的抑制作用明显（P<0.05）；CTX组和赤苍藤的乙醇提取物高剂量组5%、10%浓度的含药血清的抑制作用有显著性差异（P<0.01），具有统计学意义。
以上研究结果显示：与空白对照组比较，赤苍藤的乙醇提取物含药血清对人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901的增殖均有抑制作用，抑制程度不同，对人宫颈癌细胞Hela的增殖抑制作用最明显；可以通过调整赤苍藤的乙醇提取物剂量和含药血清的浓度达到更为明显的抑制作用。综上所述，赤苍藤的乙醇提取物对人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901有明显体外抗肿瘤活性，其抗肿瘤机制及其对于其他类型的肿瘤细胞的抑制作用，有待进一步深入探究。本发明通过进行赤苍藤的乙醇提取物含药血清体外抗肿瘤活性筛选，为研究新的抗肿瘤药物提供了基础理论依据。
Claims (5)
1.一种赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物为治疗肺癌、宫颈癌、肝癌和/或胃癌的药物；所述赤苍藤提取物是赤苍藤的乙醇提取物，所述赤苍藤的乙醇提取物是由赤苍藤经乙醇连续浸渍提取并浓缩后得到的浸膏，提取方法包括以下步骤：
（1）取赤苍藤饮片放置于浸渍容器中，加入体积浓度为20～100％的乙醇没过赤苍藤饮片，连续浸渍3-5次，每次4-8天，每次浸渍结束后进行过滤，分离出滤液，合并滤液；
（2）将以上得到的合并滤液置于50-60℃的旋蒸仪上浓缩并回收乙醇，得到浓缩液放置于50-60℃的水浴锅上进一步浓缩至浸膏，即得赤苍藤的乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述赤苍藤提取物还包括赤苍藤的乙醇提取物制剂。
3.根据权利要求2所述赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述赤苍藤的乙醇提取物制剂由赤苍藤的乙醇提取物加入医学上许可的辅料制成口服制剂或注射制剂得到。
4.根据权利要求3所述赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂或口服液体制剂。
5.根据权利要求1～4任一项所述赤苍藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤是指抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞可选自以下4种：人肺癌细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞SGC-7901。
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